CN106614524B - 一种间充质干细胞的保存液以及保存方法 - Google Patents
一种间充质干细胞的保存液以及保存方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106614524B CN106614524B CN201611056450.8A CN201611056450A CN106614524B CN 106614524 B CN106614524 B CN 106614524B CN 201611056450 A CN201611056450 A CN 201611056450A CN 106614524 B CN106614524 B CN 106614524B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- preservation
- cells
- mesenchymal stem
- stem cells
- preservation solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
Abstract
本发明的一种间充质干细胞的保存液以及保存方法,其配方按重量百分比包括如下组分:枸橼酸钠2.63%、枸橼酸0.327%、葡萄糖3.19%、腺嘌呤0.0275%、磷酸二氢钠0.222%和医用纯水余量;利用上述制备的保存液进行保存间充质干细胞,其具有可抗细胞分化、易于操作、低成本的适合实验研究的特点,其可应用于临床进行大批量保存间充质干细胞。
Description
技术领域
本发明涉及医疗技术领域,特别是涉及一种间充质干细胞的保存液以及保存方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)具有多向分化的潜能,能分化成骨、脂肪软骨等多种细胞;同时MSCs具有免疫调节、炎症趋化、组织修复功能及低免疫原性等生物学特性;可广泛用于骨损修复、骨髓重建、神经损伤修复和免疫调控等领域。MSCs可以从人或者动物的骨髓、胎盘、脂肪组织、脐带血、肝脏、牙髓腔等组织器官中分离、培养,而MSCs 普及应用的前提之一是如何体外方便、有效保存。
目前MSCs有三种保存方法:
一、MSC体外培养、传代保存
MSC离体分离后,可以用适当的细胞培养液进行体外培养,然后将体外培养的细胞不间断的进行传代,在需要使用的时候收获细胞备用。由于MSCs 具有分化潜能,在培养过程中有可能发生分化,形成组织如骨头、脂肪、软骨等,因此用细胞培养、传代的方法保存MSCs,可能导致MSCs出现不可预知的分化,进而发生功能改变,对后续的使用产生不利影响。
二、MSC体外深低温冰冻保存
MSC离体分离后,用适当浓度的冷冻保护剂如甘油、二甲亚砜等,与 MSCs充分混匀后,经过程控降温程序,最终放到-196℃的液氮中保存,由此实现MSC的中长期保存。该方法需要液氮罐等特殊装置,人员操作时
三、即用即取
只有在需要使用MSCs的时候,才进行离体分离。即采用不同的方法,从人体或者动物体内分离、得到MSCs后,立即使用,不将MSCs放到任何环境下保存。即用即取的方法虽然目前应用较为广泛,可克服细胞分化和冰冻损失细胞的不利因素,但受到场地、操作条件等诸多限制,且实施过程中,需要完整的流程配合,极易造成MSCs的浪费和丢弃,从而成为MSCs 推广应用的障碍。
发明内容
本发明的目的在于提供一条抗细胞分化、易于操作、低成本的适合实验研究和临床应用的大批量保存MSCs的方法。
为了实现上述目的,本发明采取的技术方案是:
一种间充质干细胞的保存液,其配方按重量百分比包括如下组分:枸橼酸钠2.63%、枸橼酸0.327%、葡萄糖3.19%、腺嘌呤0.0275%、磷酸二氢钠0.222%和医用纯水余量。
一种间充质干细胞的保存方法,步骤如下:
①取部分细胞进行细胞计数,其余细胞离心去上清;以每毫升保存液保存106-107细胞的比例,用上述比例制备的保存液重悬细胞,轻柔充分混匀细胞和保存液;
②将细胞悬液转移至无菌的离心管中,用封口膜密封;
③将离心管转移至2-6℃冰箱中保存,每天至少观察记录冰箱温度4 次,保证冰箱温度控制在2-6℃;
④保存期内的MSCs可随时在无菌环境中取出,在2-6℃条件下低速离心弃上清,收集细胞,供体内外使用。
如上所述的一种间充质干细胞的保存方法,其中,所述间充质干细胞从人或小鼠的骨髓、脂肪、脐血中提取的。
如上所述的一种间充质干细胞的保存方法,其中,每毫升保存液可保存106-107 个间充质干细胞。
如上所述的一种间充质干细胞的保存方法,其中,保存液最低保存该间充质干细胞的保存期限为14天以上。
如上所述的一种间充质干细胞的保存方法,其中,保存过程中用到的保存器皿为封闭式塑料或者玻璃器皿。
与现有技术相比,本发明产生的有益效果主要体现在:
(1)本发明的一种间充质干细胞的保存液以及保存方法,可使MSCs 保存后存活率达到75%以上,高于液氮冻存深低温方法的细胞得率;
(2)本发明的一种间充质干细胞的保存液以及保存方法,用本发明的保存液保存MSCs到14天以后,MSCs没有向其他细胞分化,优于培养传代保存方案;
(3)本发明的一种间充质干细胞的保存液以及保存方法,仅需要使用常见的2-6℃冰箱配置,易于操作,不需要添加液氮或者冷冻保护剂,人员操作时安全性较高,节省液氮罐所占空间;
(4)本发明的一种间充质干细胞的保存液以及保存方法,存储方便,适于MSCs大规模储存;
(5)本发明的一种间充质干细胞的保存液以及保存方法,方便运输,也利于MSCs的中远程转运。
附图说明
附图1 为MSCs在保存液中保存14天后,台盼蓝染色检测死亡细胞的结果,显微镜放大倍率为100×,200×;
附图2 为MSCs在保存液中,随保存时间的变化,细胞存活率的统计图;
附图3 为MSCs在保存液中保存的第1天和第14天,碘化丙啶 (propidium iodide,PI)检测细胞存活率的流式图。
具体实施方式
为了便于理解本发明的目的、技术方案及其效果,现将结合实施例对本发明做进一步详细阐述。
一种间充质干细胞的保存液,其配方按重量百分比包括如下组分:枸橼酸钠2.63%、枸橼酸0.327%、葡萄糖3.19%、腺嘌呤0.0275%、磷酸二氢钠0.222%和医用纯水余量。
本发明的一种间充质干细胞的保存方法,步骤如下:
①取部分细胞进行细胞计数,其余细胞离心去上清;以每毫升保存液保存106-107细胞的比例,用上述比例制备的保存液重悬细胞,轻柔充分混匀细胞和保存液;
②将细胞悬液转移至无菌的离心管中,用封口膜密封;
③将离心管转移至2-6℃冰箱中保存,每天至少观察记录冰箱温度4 次,保证冰箱温度控制在2-6℃;
④保存期内的MSCs可随时在无菌环境中取出,在2-6℃条件下低速离心弃上清,收集细胞,供体内外使用。
本发明的一种间充质干细胞的保存方法,所述间充质干细胞从人或小鼠的骨髓、脂肪、脐血中提取的。
本发明的一种间充质干细胞的保存方法,每毫升保存液可保存106-107 个间充质干细胞。
本发明的一种间充质干细胞的保存方法,保存液最低保存该间充质干细胞的保存期限为14天以上。
本发明的一种间充质干细胞的保存方法,保存过程中用到的保存器皿为封闭式塑料或者玻璃器皿。
本发明还提供了MSCs中长期保存后存活率的验证,具体如下:
(1)以骨来源的MSCs为例,制备MSCs
①取8-12周龄的C57BL/6小鼠股骨和胫骨,手术刀片清理去除所有肌肉组织。骨头放于研磨杯内研磨至骨髓释放,加入PBS冲洗骨头以去除骨髓,再次研磨和冲洗,直到骨头全部变成白色。加入0.5%胶原酶混匀后,摇床上37℃消化1h,然后取70μm孔径滤网,过滤消化后骨混合物,收集过滤液。离心,用PBS重悬后,进行细胞计数。
②用抗-CD45和抗-Ter119的免疫磁珠,按照试剂盒的方法对上述细胞悬液富集MSCs;
(2)MSCs的保存
①用1ml保存液重悬(1)中制备的MSCs,混匀,进行细胞计数。
②以每毫升保存液保存106-107细胞的比例,用保存液重悬细胞,轻柔充分混匀细胞和保存液;
③取20μl细胞悬液与等量的0.8%的台盼蓝(生理盐水作为溶剂配置的)混匀,在3分钟之内压片,光学显微镜下计数未染色的细胞(为活细胞),计算活细胞数量。
④其余细胞悬液转移至无菌离心管中,用封口膜密封,置于2-6℃冰箱中保存。
(3)MSCs保存效果的检测
①在保存的第1,4,7,14天,对细胞使用台盼蓝拒染法测定细胞活力。取0.8%的台盼蓝20μl与等量的细胞悬液混匀,在3分钟之内压片,光学显微镜下成像,并计数未染色的细胞(为活细胞)与染色细胞(染成蓝色,为死细胞),计算活细胞占细胞总数的百分数。结果如附图1 和2 。
②在第1天和第14天,取100μl保存MSCs,加入1mlPBS混匀后,1500 rpm离心5min,弃上清,加入流式缓冲液500μl,混匀。加入5μlPI(200 μg/ml),2-8℃避光染色15min,在1h内流式检测PI阴阳性细胞。PI嵌入核酸双链中并可以发荧光。它不能进入活细胞,但是可以进入正在或者已经死亡的细胞。因此PI阳性细胞为死细胞,PI阴性细胞为活细胞。结果如附图3 。
上面结合实施例对本发明做了进一步的叙述,但本发明并不限于上述实施方式,在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内,还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
Claims (3)
1.一种间充质干细胞的保存方法,步骤如下:
①取部分细胞进行细胞计数,其余细胞离心去上清;以每毫升保存液保存106-107个细胞的比例,用保存液重悬细胞,轻柔充分混匀细胞和保存液;所述保存液的配方按重量百分比由以下组分组成:枸橼酸钠2.63%、枸橼酸0.327%、葡萄糖3.19%、腺嘌呤0.0275%、磷酸二氢钠0.222%和医用纯水余量;
②将步骤①中制备得到的细胞悬液转移至无菌的离心管中,用封口膜密封;
③将离心管转移至2-6℃冰箱中保存,每天至少观察记录冰箱温度4次,保证冰箱温度控制在2-6℃;
④保存期内的MSCs可随时在无菌环境中取出,在2-6℃条件下低速离心弃上清,收集细胞,供体内外使用;
保存液最低保存该间充质干细胞的保存期限为14天。
2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞的保存方法,其特征在于:
所述间充质干细胞从小鼠的骨髓、脂肪或脐血中提取。
3.根据权利要求2所述的一种间充质干细胞的保存方法,其特征在于:
保存过程中用到的保存器皿为封闭式塑料或者玻璃器皿。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201611056450.8A CN106614524B (zh) | 2016-11-26 | 2016-11-26 | 一种间充质干细胞的保存液以及保存方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201611056450.8A CN106614524B (zh) | 2016-11-26 | 2016-11-26 | 一种间充质干细胞的保存液以及保存方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106614524A CN106614524A (zh) | 2017-05-10 |
CN106614524B true CN106614524B (zh) | 2020-10-09 |
Family
ID=58812270
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201611056450.8A Active CN106614524B (zh) | 2016-11-26 | 2016-11-26 | 一种间充质干细胞的保存液以及保存方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN106614524B (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109892320A (zh) * | 2019-03-20 | 2019-06-18 | 浙江省人民医院 | 一种细胞保存液及其制备方法和应用 |
US20230189790A1 (en) * | 2019-11-08 | 2023-06-22 | Bioverde Inc. | Non-freezing refrigerated storage liquid for stem cells |
EP4338590A1 (en) * | 2021-05-11 | 2024-03-20 | Bmg Incorporated | Cold storage solution and storage method for stem cells |
CN114651811A (zh) * | 2022-02-22 | 2022-06-24 | 张亮 | 一种牙髓间充质干细胞保存用添加剂及其应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1186596A (zh) * | 1996-12-31 | 1998-07-08 | 陈怀勇 | 血液保存液 |
CN102422835A (zh) * | 2011-10-20 | 2012-04-25 | 中国人民解放军军事医学科学院附属医院 | 一种血液保养液及其制备方法与应用 |
CN105028389A (zh) * | 2015-07-08 | 2015-11-11 | 苏州苏大赛尔免疫生物技术有限公司 | 一种红细胞保存液 |
CN105284787A (zh) * | 2015-10-23 | 2016-02-03 | 深圳爱生再生医学科技有限公司 | 骨髓间充质干细胞的保存试剂及其应用 |
-
2016
- 2016-11-26 CN CN201611056450.8A patent/CN106614524B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1186596A (zh) * | 1996-12-31 | 1998-07-08 | 陈怀勇 | 血液保存液 |
CN102422835A (zh) * | 2011-10-20 | 2012-04-25 | 中国人民解放军军事医学科学院附属医院 | 一种血液保养液及其制备方法与应用 |
CN105028389A (zh) * | 2015-07-08 | 2015-11-11 | 苏州苏大赛尔免疫生物技术有限公司 | 一种红细胞保存液 |
CN105284787A (zh) * | 2015-10-23 | 2016-02-03 | 深圳爱生再生医学科技有限公司 | 骨髓间充质干细胞的保存试剂及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
"4℃条件下保存不同时间点小鼠骨髓间充质干细胞的细胞活性和生物学特性研究";时炳正 等;《口腔医学研究》;20130328;第29卷(第3期);第205-209页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN106614524A (zh) | 2017-05-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103070161B (zh) | 一种脂肪间充质干细胞冻存液及冻存方法 | |
CN106465710B (zh) | 脂肪组织冻存液及脂肪组织冻存方法 | |
JP5341059B2 (ja) | 幹細胞懸濁液 | |
Tsagias et al. | Isolation of mesenchymal stem cells using the total length of umbilical cord for transplantation purposes | |
CN102807966B (zh) | 胎盘全细胞冻存、复苏以及分离和扩增干细胞的方法 | |
CN102660502B (zh) | 冻存和复苏脐带全细胞并分离和扩增干细胞的方法 | |
CN106614524B (zh) | 一种间充质干细胞的保存液以及保存方法 | |
CN106982821A (zh) | 脐带间充质干细胞临床冻存保护液组合物及其用途 | |
CN104711221B (zh) | 从成人外周血中自动化分离免疫细胞并提取prp的方法 | |
CN103074298B (zh) | 一种人脂肪间充质干细胞库及其构建方法 | |
Rasmussen et al. | Effect, feasibility, and clinical relevance of cell enrichment in large volume fat grafting: a systematic review | |
US10329533B2 (en) | Regenerative cell and adipose-derived stem cell processing system and method | |
IL192311A (en) | Cells are essential from frozen umbilical cord tissue and methods for obtaining them | |
KR101321144B1 (ko) | 줄기세포 초자화 동결보존액 및 이를 이용하는 줄기세포 초자화 동결보존방법 | |
JP2019131573A (ja) | 臍帯組織の凍結保存方法 | |
CN108685948B (zh) | 一种医用细胞修复剂的制备方法 | |
CN108056095A (zh) | 一种脂肪间充质干细胞运输保护液及其应用 | |
CN105420191A (zh) | 一种富含造血干细胞的临床用脐血单核细胞的制备方法 | |
KR20100084620A (ko) | 조직 재생을 위한 세포 조성물 | |
CN105238749A (zh) | 一种复苏骨髓间充质干细胞的方法 | |
CN106924285A (zh) | 一种胎盘间充质干细胞注射液及其制备方法和应用 | |
CN110317781B (zh) | 间充质干细胞冻存和复苏的方法 | |
CN110317782B (zh) | 提高间充质干细胞复苏后存活的方法和所用的冻存液 | |
CN108728408A (zh) | 犬胎膜间充质干细胞及制备方法和使用的培养基 | |
JP5753874B2 (ja) | 細胞生存率低下抑制剤 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |