CN105028389A - 一种红细胞保存液 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种红细胞保存液，所述红细胞保存液的组成和含量如下：腺嘌呤0.3～0.5g/L，葡萄糖25～35g/L，柠檬酸钠6～10g/L，肌苷0.2～0.4g/L，氯霉素0.2～0.3g/L，硫酸新霉素0.08～0.12g/L，氯化钠2.5～3.5g/L，磷酸二氢钠0.04～0.06g/L。本发明能够使红细胞的保存期限达到十四周，在保存期内，本发明保存的红细胞悬液有较高的抗原效价。

Description

一种红细胞保存液

技术领域

本发明涉及生物技术材料，具体涉及一种红细胞保存液。

背景技术

红细胞膜表面有很多种抗原，如ABH抗原、Rh抗原等。这些抗原能够特异性地与抗体结合，所以红细胞被广泛地应用于血型血清学试验。目前，红细胞都是从人血细胞中获得，无法用其他来源的物质代替，这使得红细胞的获得和保存受到极大的限制。若是将新鲜的红细胞放入生理盐水中，1～2天便会发生溶血，无法使用。因而红细胞的保存方法一直是相关研究者关注的问题。尤其是一些稀有血型，由于来源稀少、保存时间不长，极大的阻碍了血型血清学试验的顺利进行。

最常见的红细胞保存方法是将红细胞悬浮于红细胞保存液中，4。℃冷藏，这样保存的优点在于可以减缓红细胞的代谢速度，保护红细胞在体外保存时结构和功能的完整性，从而延长其保存时间，减少红细胞的浪费，如将红细胞保存于GMA红细胞保存液中。但GMA红细胞保存液的保存期仅为42天，其保存的红细胞在第4周左右就会发生长菌，保存效果受到很大的影响。

中国专利CN02148958.0公开了一种红细胞保存液，可以较长时间地保存和稳定红细胞，其保存期限为2个月。

为了满足更长的保存时间要求，需要提出新的红细胞保存方法和保存液。

发明内容

本发明的目的是提供一种红细胞保存液，能够更长时间更好效果地保存红细胞。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是，一种红细胞保存液，所述红细胞保存液的组成和含量如下：

优选的，所述红细胞保存液的组成和含量如下：

优选的，所述红细胞保存液还含有SOD40000U/L。

所述红细胞保存液能够使所保存的洗涤红细胞在14周内的储存末期溶血率小于红细胞总量的0.8％。

本发明还提供一种试剂红细胞，所述试剂红细胞是将洗涤红细胞保存于上述红细胞保存液中，保存期限不少于14周。

所述洗涤红细胞是指将保存期内的全血、悬浮红细胞用大量等渗溶液洗涤，去除80％以上的白细胞和99％以上的血浆成分和部分非红细胞成分的红细胞成分血。

本发明以葡萄糖、腺嘌呤、肌苷等构成红细胞的营养体系，红细胞的长期保存需要不断地为新陈代谢提供能量，而红细胞中没有细胞核、线粒体等细胞器，因此这种能量主要来自于糖酵解。红细胞通过糖酵解获得生长所需能量，糖酵解产生的ATP是细胞生命活动所需能量的直接来源，可增强细胞代谢活性，而糖酵解以葡萄糖为底物。腺嘌呤是三磷酸腺苷来源，可以提高ATP的活性水平。肌苷是腺嘌呤的前体，能直接透过细胞膜进入红细胞，参与能量代谢。

氧化钠注射液是细胞的等渗溶液，因此添加氧化钠后，不仅可以维持红细胞的渗透压，保护细胞膜结构的完整性，还可以保持红细胞内外的离子平衡。

本发明添加硫酸新霉素和氧霉素，有效地防止了微生物的侵袭，保护了红细胞的正常代谢。

相较于现有技术，本发明的有益效果在于：

1、保存时间长。在第十四周时，本发明保存的红细胞悬液的游离血红蛋白浓度仍符合国家标准(洗涤红细胞在储存末期溶血率小于红细胞总量的0.8％)。

2、在保存期内，本发明保存的红细胞悬液保持了较高的抗原效价。

附图说明

图1是游离血红蛋白浓度测定结果对比。其中，1是实施例1的测定结果，2是实施例2的测定结果，3是实施例3的测定结果。

图2是红细胞悬液的抗原效价测定结果对比。其中，其中，1是实施例1的测定结果，2是实施例2的测定结果，3是实施例3的测定结果，4是市售红细胞悬液的测定结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。

洗涤红细胞的制备：

将5份新鲜的A型健康人的红细胞吸出血清后混合，加入2～3倍体积的氧化钠注射液，吹打混匀，置于离心机中3000rpm离心5min，将离心好的A型红细胞试管取出，吸去上清液及附着在红细胞表层的白细胞、血小板等成分，再加入2～3倍体积的氧化钠注射液，混匀后在离心机中3000rpm离心5min，并重复两遍。在第4次离心后，吸出绝大多数上清液，留下压积红细胞备用。将洗好的红细胞吸出100μl到已加入9.9mL红细胞保存液的滴管瓶中，配制出10mL1％的不同保存液保存的红细胞悬液各2瓶，其中一瓶用于检测，另一瓶静置观察，均放于4℃冰箱冷藏保存。

对于B型健康人红细胞也进行上述过程制得洗涤红细胞悬液。

1)实施例1

按以下成分和含量配制红细胞保存液：

将实施例1的红细胞保存液与洗涤红细胞一同配制为1％红细胞悬液。

2)实施例2

按以下成分和含量配制红细胞保存液：

将实施例2的红细胞保存液与洗涤红细胞一同配制为1％红细胞悬液。

3)实施例3

GMA红细胞保存液：

将实施例3的GMA红细胞保存液与洗涤红细胞一同配制为1％红细胞悬液。

将实施例1～3的红细胞悬液，检测红细胞悬液中的游离血红蛋白浓度。将实施例1～3的红细胞悬液和市售红细胞悬液一起，检测红细胞悬液的抗原效价。

1、游离血红蛋白浓度测定

红细胞主要由红细胞膜和大量的血红蛋白组成，当红细胞膜破裂时，膜表面抗原被破坏，血红蛋白逸出，发生溶血现象。所以游离血红蛋白浓度可以作为红细胞体外保存效果的质量指标之一。

血红蛋白具有过氧化酶作用，可以使过氧化氢分解产生新生态氧，新生态氧氧化联苯胺为蓝色或绿色的衍生物，在酸性条件下颜色变为黄绿色，吸收峰在435nm处。根据吸光度与已知浓度的血红蛋白的吸光度进行比较，可求得其浓度。

用30mL冰乙酸溶解邻甲联苯胺0.1g，加蒸馏水至50mL，配制为0.2％的邻甲联苯胺溶液，4℃保存；吸取3.67mL30％的过氧化氢，加蒸馏水至100mL，配制为1％的过氧化氢溶液，每次实验都新鲜配制；吸取冰乙酸溶液50mL，加蒸馏水至500mL，配制为10％的冰乙酸溶液；称取0.02g牛血红蛋白溶于1mL生理盐水中，配制为20mg/mL的血红蛋白储备液，用时稀释为200mg/L的血红蛋白标准液。

向测定管内加入待测上清液20μl，空白管加入双蒸水20μl，标准管加入200mg/L的血红蛋白标准液20μl。再向上述各管中加入0.2％邻甲联苯胺溶液1mL，然后加入1％过氧化氢溶液1mL，混匀放置10min后，各管加入10％冰乙酸溶液10mL，于紫外可见分光光度计，波长为435nm，空白管标零测定吸光度。

游离血红蛋白浓度(mg/L)＝测定管吸光度/标准管吸光度×200(mg/L)

测定结果见表1。

表1各红细胞悬液在保存期内的游离血红蛋白浓度

注：“^＊”表示几乎看不见红细胞时的游离血红蛋白浓度。

如图1所示，随着保存时间的延长，各红细胞悬液的游离血红蛋白浓度都逐渐上升。从第6周开始，实施例3红细胞悬液的游离Hb浓度开始急剧上升，但到实验后期时，由于细菌对血红蛋白的分解，游离血红蛋白含量反而下降。

按照国家标准GB18469-2012《全血及成分血质量要求》，洗涤红细胞储存末期溶血率应小于红细胞总量的0.8％，即游离血红蛋白浓度小于880mg/L。那么，实施例3GMA红细胞悬液的保存期为6周，实施例1红细胞悬液的保存期为14周，而实施例2保存的红细胞的保存期可以达到16周。

2、红细胞悬液的抗原效价检测

测定各保存液保存的A/B型红细胞的抗原效价，并与市售人ABO血型反定型用红细胞试剂盒中的A/B型红细胞作对比。

准备好试管，并作好标记，从冰箱中拿出A型1％GMA红细胞悬液，吸出500μl到试管中备用。取出3张ABO.RhD血型定型卡作好标记，并将它们的后3孔依次标记为：1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512。再取出9支试管，依次标记为：1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512，向每管加入氧化钠注射液600μl，然后在第一支试管中加入抗A血型定型试剂600μl，再依次倍比稀释，将稀释好的抗A血清加入到对应的血型卡孔中，每孔50μl，将A型1％GMA红细胞悬液加入到这9个血型卡孔中，每孔50μl。最后将这3张血型卡放入TXK4型血型血清学多用离心机中，离心5min(900rpm2min，2000rpm3min)，记录每孔的凝集强度，并用Warsh方法积分，每孔分数相加为此次抗原效价总分。

表2凝集强度判读标准

凝集强度	判读标准
		4+	约95％的红细胞复合物位于凝胶表面，侧面观察为一条直线。
3+	约90％的红细胞复合物位于凝胶中上部，微柱凝胶管尖底部有少量细胞。
		2+	约50％的红细胞复合物位于凝胶中上部，50％位于凝胶中下部。
1+	约90％的红细胞复合物位于凝胶中下部，剩下位于凝胶中上部。
		±	约90％的红细胞复合物位于凝胶底部，剩下的位于胶表面或胶中。
-	全部的红细胞复合物位于凝胶底部。

表3Warsh方法积分

凝集强度	4+	3+	2+	1+	±	-
							分数	8	6	4	2	1	0

按上述步骤，对剩余的其他红细胞悬液与市售红细胞悬液检测抗原效价。测定结果见表4。

表4各红细胞悬液在保存期内的红细胞抗原效价积分

注：实施例3的空白栏是由于红细胞数量太少，检测时无法判定。

如图2所示，各红细胞悬液的红细胞抗原效价都随时间的延长而逐渐下降，但是实施例1～3红细胞悬液的抗原效价在同一检测时间内差别并不明显，相反，市售红细胞的抗原效价明显下降。实施例3红细胞悬液中的红细胞在第14周时已太过稀少，无法判定其抗原效价。

市售红细胞的已知抗原效价积分为66分，保存期为2个月，那么实施例3GMA液保存的红细胞的保存期为12周，实施例1和2保存的红细胞的保存期为14周。尽管在前8周，GMA红细胞悬液的抗原效价都略高于实施例1的红细胞悬液，但实施例1和2的红细胞悬液却能将这一效价稳定维持到14周，因此，实施例1和2的红细胞保存液的长期保存效果比GMA红细胞保存液好。

本发明的有益效果在于：

1、保存时间长。在第十四周时，本发明保存的红细胞悬液的游离血红蛋白浓度仍符合国家标准(洗涤红细胞在储存末期溶血率小于红细胞总量的0.8％)

2、在保存期内，本发明保存的红细胞悬液保持了较好的抗原效价。

以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (5)

1.一种红细胞保存液，其特征在于，所述红细胞保存液的组成和含量如下：

2.如权利要求1所述的红细胞保存液，其特征在于，所述红细胞保存液的组成和含量如下：

3.如权利要求1或2所述的红细胞保存液，其特征在于，所述红细胞保存液还含有SOD40000U/L。

4.如权利要求1～3任一所述的红细胞保存液，其特征在于，所述红细胞保存液能够使所保存的洗涤红细胞在14周内的储存末期溶血率小于红细胞总量的0.8％。

5.一种试剂红细胞，其特征在于，所述试剂红细胞是将洗涤红细胞保存于权利要求1～4所述的红细胞保存液中，保存期限不少于14周。