CN108432742A - 一种间充质干细胞常温运输液 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种间充质干细胞常温运输液，其按原料质量百分比计由25～40％的海藻糖溶液、20～40％的红细胞储存液、1～10％的肝素钙和20～45％的人血白蛋白注射液组成。本发明克服了传统间充质干细胞运输的种种弊端，其实现了常温、大量运输，避免了传统运输方式中培养基、液氮的大量浪费，有效降低成本。同时本发明的常温运输液成分简单、配制方便、无污染，且对间充质干细胞具有优异的生物学特性保存效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种细胞运输液。
背景技术
细胞治疗、再生医学和干细胞研究中的最新进展已经显著增加了对各种类型的容易获得的细胞悬浮液的需求，特别是对间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的需要。间充质干细胞是从成年和胎儿组织分离的多能基质细胞，被定义为粘附的成纤维细胞样细胞，MSCs来源于发育早期中胚层，具有高度的自我更新能力和多向分化潜能，经体外诱导可分化成为多种类型的细胞，如成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、脂肪细胞和心源性细胞。
间充质干细胞具有免疫抑制和免疫调节功能是广泛接受的事实。由于其调节免疫反应的能力，MSCs是一种潜力治疗各种免疫介导疾病的候选人，因此实验中对间充质干细胞的利用量越来越高。目前常用的细胞运输方式有两种，一种是非培养状态低温液氮运输，另一种是培养状态下装满培养基运输。两种方法都有一定的弊端。其中利用液氮运输可以在特定的液氮容器内存放大量的细胞后进行运输，但是存在一定的安全隐患，且造价高，冻存液成分不明确，一般含有不同比例的血清，会对后续实验造成一定的影响，同时冻存过的细胞活性会下降。而对贴壁细胞进行运输，单次运输细胞数量较低，细胞培养基耗费过多，且液体含量较高时不能采用空运模式，同时如果密封不严或者在运输过程中存在一系列碰撞则容易致使培养基外漏，细胞无培养基会出现死亡。
因此，探究出一种简便的能一次大量运输细胞的且能保证细胞活性的细胞运输液就显得特别重要。
发明内容
本发明的目的在于针对上述技术的不足，提供一种间充质干细胞常温运输液。
本发明所采取的技术方案是：一种间充质干细胞常温运输液，其按原料质量百分比计由25～40％的海藻糖溶液、20～40％的红细胞储存液、1～10％的肝素钙和20～45％的人血白蛋白注射液组成。
作为上述方案的进一步改进，该常温运输液按原料质量百分比计由30％的海藻糖溶液、25％的红细胞储存液、5％的肝素钙和40％的人血白蛋白注射液组成。
作为上述方案的进一步改进，所述海藻糖溶液是质量浓度为0.2％的海藻糖溶液。
作为上述方案的进一步改进，所述质量浓度为0.2％的海藻糖溶液由海藻糖颗粒与生理盐水混合制成。
作为上述方案的进一步改进，所述肝素钙是质量浓度为0.2％的肝素钙。
本发明的有益效果是：本发明克服了传统间充质干细胞运输的种种弊端，其实现了常温、大量运输，避免了传统运输方式中培养基、液氮的大量浪费，有效降低成本。同时本发明的常温运输液成分简单、配制方便、无污染，且对间充质干细胞具有优异的生物学特性保存效果。
附图说明
图1是本发明实施例4中三种不同来源间充质干细胞的免疫荧光鉴定图；
图2是本发明实施例4中三种不同来源间充质干细胞的成骨分化图；
图3是本发明实施例4中三种不同来源间充质干细胞的成脂分化图；
图4是本发明实施例4中三种不同来源间充质干细胞分别在实施例3所得常温运输液内悬浮时的培养的细胞形态；
图5是本发明实施例4中三种不同来源间充质干细胞分别在实施例3所得常温运输液内分别储存24h、48h、72h的细胞数量；
图6是本发明实施例4中三种不同来源间充质干细胞分别在实施例3所得常温运输液内储存72h后贴壁培养的细胞图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。同时下述所提及的原料未详细说明的，均为市售产品；未详细提及的工艺步骤或制备方法为均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或制备方法。
实施例1
一种间充质干细胞常温运输液，其按原料质量百分比计由25％的0.2％海藻糖溶液、40％的红细胞储存液、1％的0.2％肝素钙和34％的人血白蛋白注射液常温混合均匀组成。
实施例2
一种间充质干细胞常温运输液，其按原料质量百分比计由40％的0.2％海藻糖溶液、20％的红细胞储存液、10％的0.2％肝素钙和30％的人血白蛋白注射液常温混合均匀组成。
实施例3
一种间充质干细胞常温运输液，其按原料质量百分比计由30％的0.2％海藻糖溶液、25％的红细胞储存液、5％的0.2％肝素钙和40％的人血白蛋白注射液常温混合均匀组成。
实施例4
一、三种间充质干细胞的分离培养
本发明选择三种不同的间充质干细胞，分别为人羊水干细胞、人脐带来源间充质干细胞和人胎盘来源间充质干细胞。
(1)人羊水干细胞(human amniotic fluid stem cells，hAFSCs)
羊水样品与加有EDTA的PBS 1:1稀释；1200r/min离心5min；弃上清，加入羊水专用培养基反复吹打混匀；接种在明胶包被的培养皿；以37℃，5％CO2的环境条件培养4～5天即可观察到羊水干细胞生长。
(2)人脐带来源间充质干细胞(human Unbilical Cord Mesenchymal StemCells，hUC-MSCs)
将脐带剪开，用PBS清洗数次后，取出华通胶，剪碎，用含有0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化至液体浑浊，含有10％胎牛血清的完全培养基终止消化，用200目筛网过滤，离心(1800r/10min)，将上层液体弃去，留下底层细胞，加培养基后吹匀，接种然后接种在明胶包被的培养皿，以37℃、5％CO2的环境条件培养2～4天。
(3)人胎盘来源间充质干细胞(human Placenta Mesenchymal Stem Cells，hP-MSCs)
剥开羊膜，剪下组织块，剪碎组织，用PBS清洗数次直至液体颜色变浅，用胶原酶II在37℃下消化30min，用200目筛网过滤，离心(1800r/10min)，吸取25ml到装有15ml的淋巴细胞分离液，离心800r/20min(加速度：1，减速度：0)，移取中间白膜层细胞于离心管中离心(1800r，10min，加速度：9，减速度：9).移弃上清，收集细胞沉淀，用组织保护液重悬，混匀，接种于明胶包被过的细胞板。
上述三种间充质干细胞的免疫荧光鉴定图如图1所示。
二、三种间充质干细胞的鉴定
分别使用成骨诱导分化液、成脂诱导分化液对分离培养后的三种干细胞进行成骨成脂诱导，在第21天利用茜素红、油红O分别对成骨诱导组、和成脂诱导组染色；
利用免疫荧光检测三种干细胞CD44、CD90的表达。加入3.7％多聚甲醛溶液固定羊水干细胞30min，并用含有5％FBS的PBS洗涤；加入透化剂室温孵育15min后弃去，用PBS洗涤；加入封闭液37℃封闭1h后弃去，PBS洗三遍，每次5min；
在4℃下与针对CD44和CD90的一抗孵育过夜，除去一抗后，用含有5％FBS的PBS洗涤细胞三次；室温下在黑暗中，加入用FITC标记的二抗标记1小时，用PBS洗三遍，每次5min；最后将样品在避光条件下用DAPI孵育5分钟，用PBS洗三遍，每次5min；加入抗荧光淬灭剂后在荧光显微镜下拍照，其成骨分化图和成脂分化图如图2和图3所示。
三、细胞悬液的制作
将上述经鉴定后的三种不同来源的间充质干细胞用PBS清洗3次，加入胰蛋白酶取代物消化细胞；待细胞变圆脱落，加入无血清培养基吹散，1200rpm下离心5min；将上层液体倒掉，加入PBS重悬之后离心1000rpm下离心3min；弃上层液体加入PBS重悬继续1000rpm下离心3min；弃去上层液体后分别加入实施例3常温运输液吹打均匀。1ml实施例3常温运输液大致容纳1×106个细胞，得带hAFSCs常温运输液样品、带hUC-MSCs常温运输液样品和带hP-MSCs常温运输液样品，其三种不同来源的间充质干细胞在实施例3常温运输液内悬浮时的细胞形态如图4所示。
四、细胞活性检测
分别上述所得带hAFSCs常温运输液样品、带hUC-MSCs常温运输液样品和带hP-MSCs常温运输液样品常温放置24h、48h、72h后，取300μl细胞液吹散均匀并对活细胞进行计数，其三个样品分别储存24h、48h和72h后的细胞数量如图5所示，且储存72h后贴壁培养的细胞图如图6所示。
上述实施例为本发明的优选实施例，凡与本发明类似的工艺及所作的等效变化，均应属于本发明的保护范畴。
Claims (5)
1.一种间充质干细胞常温运输液，其特征在于：按原料质量百分比计由25～40％的海藻糖溶液、20～40％的红细胞储存液、1～10％的肝素钙和20～45％的人血白蛋白注射液组成。
2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞常温运输液，其特征在于：按原料质量百分比计由30％的海藻糖溶液、25％的红细胞储存液、5％的肝素钙和40％的人血白蛋白注射液组成。
3.根据权利要求1或2所述的一种间充质干细胞常温运输液，其特征在于：所述海藻糖溶液是质量浓度为0.2％的海藻糖溶液。
4.根据权利要求3所述的一种间充质干细胞常温运输液，其特征在于：所述质量浓度为0.2％的海藻糖溶液由海藻糖颗粒与生理盐水混合制成。
5.根据权利要求1或2所述的一种间充质干细胞常温运输液，其特征在于：所述肝素钙是质量浓度为0.2％的肝素钙。
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