CN109006803A

CN109006803A - 一种人脐带间充质干细胞运输液

Info

Publication number: CN109006803A
Application number: CN201810982975.7A
Authority: CN
Inventors: 卢珊珊; 郑桂纯
Original assignee: Qinghai Colorful Flower Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Saiyi Cell Technology Research Institute Co., Ltd
Priority date: 2018-08-27
Filing date: 2018-08-27
Publication date: 2018-12-18
Anticipated expiration: 2038-08-27
Also published as: CN109006803B

Abstract

本发明涉及一种人脐带间充质干细胞运输液。本发明在现有技术基础上添加5μM太子参环肽B可以有效克服现有技术运输液悬浮72h后细胞活率降低较为明显的不足，本发明运输液配方为：按质量百分比计由30％的0.2％海藻糖溶液(海藻糖的PBS溶液)、25％的红细胞储存液、5％的0.2％肝素钙溶液(肝素钙的PBS溶液)和40％的人血白蛋白注射液常温混合均匀组成，并含有5μM太子参环肽B。该运输液不仅可以提高人脐带间充质干细胞运输72h时的活率，且不影响其多向分化能力。

Description

一种人脐带间充质干细胞运输液

技术领域

本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种人脐带间充质干细胞运输液。

背景技术

干细胞是一类具有自我更新和多向分化能力的细胞。正是因为它的再生潜力和可塑性使得它广泛应用于再生医学和干细胞研究中。干细胞为目前缺乏有效治疗方法的许多疾病带来希望，包括脑卒中、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病和帕金森病。

间充质干细胞是从成年和胎儿组织分离的多能基质细胞，被定义为黏附的成纤维细胞样细胞。间充质干细胞具有内在的归巢能力，可以迁移到损伤组织，积极参与组织修复。间充质干细胞虽然具有多能性，但自我更新能力逐渐降低导致细胞分裂停滞，在体外表现出有限的使用寿命，限制了它在治疗上的应用。与成年组织相比，围产期组织来源间充质干细胞具有较低的突变风险，并且表现出优异的细胞活性，包括更大的分化、归巢和植入效力，以及较低的免疫原性。不同来源的间充质干细胞具有相似甚至相同的表型，但由于其独特的遗传特征、迁移能力、分离方法，不同围产期组织来源间充质干细胞具有不同的治疗效果。

目前常用的细胞运输方式有两种，一种是非培养状态低温液氮运输，另一种是培养状态下装满培养基运输。两种方法都有一定的弊端。其中利用液氮运输可以在特定的液氮容器内存放大量的细胞后进行运输，但是存在一定的安全隐患，且造价高，冻存液成分不明确，一般含有不同比例的血清，会对后续实验造成一定的影响，同时冻存过的细胞活性会下降。而对贴壁细胞进行运输，单次运输细胞数量较低，细胞培养基耗费过多，且液体含量较高时不能采用空运模式，同时如果密封不严或者在运输过程中存在一系列碰撞则容易致使培养基外漏，细胞无培养基会出现死亡。

中国专利CN108432742A公开了一种间充质干细胞常温运输液，该申请克服了传统间充质干细胞运输的弊端，实现了常温、大量运输，避免了传统运输方式中培养基、液氮的大量浪费，有效降低成本；且该申请运输液的成分简单、配制方便、无污染，对间充质干细胞具有优异的生物学特性保存效果。但是，3种细胞(人羊水、脐带、胎盘来源间充质干细胞)在细胞运输液中常温放置72h后的活细胞数量均出现显著降低，不适合于长途运输。

发明内容

本发明是对现有技术的改进，旨在提供一种适合长途运输的人脐带间充质干细胞运输液。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

一种干细胞常温运输液，按质量百分比计由30％的0.2％海藻糖溶液、25％的红细胞储存液、5％的0.2％肝素钙溶液和40％的人血白蛋白注射液常温混合均匀组成，还含有太子参环肽B。

优选地，0.2％海藻糖溶液由海藻糖和PBS缓冲液配制而成，0.2％为质量体积百分含量。

优选地，0.2％肝素钙溶液由肝素钙和PBS缓冲液配制而成，0.2％为质量体积百分含量。

优选地，太子参环肽B浓度为5μM。

上述干细胞常温运输液在人脐带间充质干细胞运输中的应用。

本发明在现有技术基础上添加5μM太子参环肽B可以有效克服现有技术运输液悬浮72h后细胞活率降低较为明显的不足，本发明运输液配方为：按质量百分比计由30％的0.2％海藻糖溶液(海藻糖的PBS溶液)、25％的红细胞储存液、5％的0.2％肝素钙溶液(肝素钙的PBS溶液)和40％的人血白蛋白注射液常温混合均匀组成，并含有5μM太子参环肽B。该运输液不仅可以提高人脐带间充质干细胞运输72h时的活率，且不影响其多向分化能力。

具体实施方式

一、实验材料

选择健康产妇的新鲜脐带，签署知情同意书，同意用于科研实验。

人脐带间充质干细胞培养基购自赛业公司；胎牛血清购自美国Thermo公司；DMEM培养基购自美国Gibco公司；红细胞储存液购自北京索莱宝科技有限公司；人血白蛋白注射液购自上海莱士血液制品股份有限公司；干细胞成骨分化培养基购自PromoCell公司；神经分化培养基：在含2％B27的DMEM/F12培养基加入20μg/L的表皮生长因子和20μg/L的碱性成纤维生长因子配制而成。

二、实验方法

1、人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)的分离培养

将脐带剪开，用PBS清洗数次后，取出华通胶，剪碎，用含有0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化至液体浑浊，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，用200目筛网过滤，1800r/min离心10min，弃去上层液体，留下底层细胞，加入人脐带间充质干细胞培养基吹匀，然后接种在明胶包被的培养皿，置于37℃、体积分数为5％CO₂培养箱培养。细胞长至90％左右时消化计数，按1:2传代。

2、实验分组及细胞悬浮液的制备

取第4代细胞，用PBS清洗3次，加入胰蛋白酶消化细胞；待细胞变圆脱落，加入无血清DMEM培养基吹散，1200rpm下离心5min；将上层液体倒掉，加入PBS重悬之后1000rpm离心3min；弃上层液体加入PBS重悬继续1000rpm下离心3min；弃去上层液体后分别按照如下分组加入对应的常温运输液吹打均匀，细胞浓度为1×10⁶个细胞/mL。

现有技术组：常温运输液为中国专利CN108432742A说明书实施例3配方，即按原料质量百分比计由30％的0.2％海藻糖溶液(海藻糖的PBS溶液)、25％的红细胞储存液、5％的0.2％肝素钙(肝素钙的PBS溶液)和40％的人血白蛋白注射液常温混合均匀组成；

实验1组：在对照组运输液基础上添加5μM太子参环肽B。

实验2组：在对照组运输液基础上添加5μM太子参环肽D。

72h将细胞液吹打均匀后取300μL记录活细胞数。

3、运输液悬浮72h前后成骨分化能力的测定

取实验1组在运输液中悬浮0、72h的hUCMSCs，以5×10⁴/mL的密度接种于24孔板，24h待其铺满孔底后，更换为成骨分化培养基诱导培养9d(每3d更换一次培养基)后收集细胞，RT-PCR检测ALP mRNA的相对表达水平。

采用TRIZOL一步法提取总RNA。取总RNA 3μg，采用RevertAid TM逆转录试剂盒完成逆转录。反应总体积为50μL，其中10×Taqbuffer 5.0μL，MgCl₂(25mmol/L)5.0μL，dNTPMix(10mmol/L)2μL，ALP及β-actin上、下游引物(10μmol/L)各1μL，cDNA 5μL，Taq酶(5U/μL)0.5μL，补足双蒸水至50μL。反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性40s，55℃退火60s，72℃延伸60s，72℃终末延伸10min，共30循环。

ALP上游引物5’-CCAACTCTTTTGTGCCAGAGA-3’

ALP下游引物5’-GGCTACATTGGTGTTGAGCTTTT-3’

β-actin上游引物5’-CATGGGTCAGAAGGATTCCT-3’

β-actin下游引物5’-TGATCTGGGTCATCTTCTCG-3’

电泳后，用凝胶成像系统进行扫描拍照，分析目的条带的灰度值，按ALP灰度值/β-actin灰度值的比值计算ALP mRNA的相对表达水平。

4、运输液悬浮72h前后成神经分化能力的测定

取实验1组在运输液中悬浮0、72h的hUCMSCs，以5×10⁴/mL的密度接种于24孔板，24h待其铺满孔底后，更换为神经分化培养基诱导培养9d(每3d更换一次培养基)后收集细胞，RT-PCR检测神经细胞标记蛋白巢蛋白mRNA的相对表达水平。

采用TRIZOL一步法提取总RNA。取总RNA 3μg，采用RevertAid TM逆转录试剂盒完成逆转录。反应总体积为50μL，其中10×Taqbuffer 5.0μL，MgCl₂(25mmol/L)5.0μL，dNTPMix(10mmol/L)2μL，巢蛋白及β-actin上、下游引物(10μmol/L)各1μL，cDNA 5μL，Taq酶(5U/μL)0.5μL，补足双蒸水至50μL。反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性40s，55℃退火60s，72℃延伸60s，72℃终末延伸10min，共30循环。

巢蛋白上游引物5’-CTCCAAGAATGGAGGCTGTAGGAA-3’

巢蛋白下游引物5’-CCTATGAGATGGAGCAGGCAAGA-3’

β-actin上游引物5’-CATGGGTCAGAAGGATTCCT-3’

β-actin下游引物5’-TGATCTGGGTCATCTTCTCG-3’

电泳后，用凝胶成像系统进行扫描拍照，分析目的条带的灰度值，按巢蛋白灰度值/β-actin灰度值的比值计算巢蛋白mRNA的相对表达水平。

5、统计学分析

采用SPSS19.0软件进行分析，两独立样本比较采用独立样本t检验，不同组间比较采用单因素方差分析，计量资料用均值±标准差表示，P<0.05为差异有显著性意义。

三、实验结果

1、运输液悬浮对细胞存活能力的影响

结果如表1所示。只有实验1组运输液悬浮72h后，活细胞数量与悬浮前无显著性差异，这说明本发明添加太子参环肽B的运输液对hUCMSCs活率影响最小。

表1运输液悬浮前后各组活细胞数

	悬浮0h	悬浮72h
			现有技术组	3×10⁵个细胞	2.35×10⁵个细胞
实验1组	3×10⁵个细胞	2.91×10⁵个细胞
			实验2组	3×10⁵个细胞	2.39×10⁵个细胞

2、运输液悬浮72h对hUCMSCs成骨分化能力的影响

结果如表2所示。实验1组运输液悬浮72h对hUCMSCs成骨分化能力无明显影响。

表2ALP mRNA相对表达水平测定结果

	0h	72h
			运输液悬浮	6.17±0.11	6.25±0.10

碱性磷酸酶(ALP)为早期成骨标志，主要分布于细胞膜，促进细胞钙化，ALP的定量检测可以反映成骨细胞的分化水平，其活性越高，说明前成骨细胞向成熟的成骨细胞分化的越明显。ALP活性的高表达是成骨细胞分化成熟的早期标志，ALP活性增强时，骨形成增强，并促进骨基质矿化形成，故ALP的活性是反映成骨细胞分化程度和功能状态的良好指标。

3、运输液悬浮72h对hUCMSCs神经分化能力的影响

结果如表3所示。实验1组运输液悬浮72h对hUCMSCs神经分化能力无明显影响。

表3巢蛋白mRNA相对表达水平测定结果

	0h	72h
			运输液悬浮	10.02±0.08	10.17±0.08

巢蛋白(Nestin)是神经干细胞的特征性标志蛋白，其表达水平是反映神经细胞分化程度和功能状态的良好指标。

综上可见，本发明在现有技术基础上添加5μM太子参环肽B可以有效克服现有技术运输液悬浮72h后细胞活率降低较为明显的不足，本发明运输液配方为：按质量百分比计由30％的0.2％海藻糖溶液(海藻糖的PBS溶液)、25％的红细胞储存液、5％的0.2％肝素钙(肝素钙的PBS溶液)和40％的人血白蛋白注射液常温混合均匀组成，并含有5μM太子参环肽B。该运输液不仅可提高人脐带间充质干细胞运输72h时活率，还不影响其分化能力。

Claims

1.一种干细胞常温运输液，按质量百分比计由30％的0.2％海藻糖溶液、25％的红细胞储存液、5％的0.2％肝素钙溶液和40％的人血白蛋白注射液常温混合均匀组成，其特征在于：还含有太子参环肽B。

2.根据权利要求1所述的干细胞常温运输液，其特征在于：所述0.2％海藻糖溶液由海藻糖和PBS缓冲液配制而成，0.2％为质量体积百分含量。

3.根据权利要求1所述的干细胞常温运输液，其特征在于：所述0.2％肝素钙溶液由肝素钙和PBS缓冲液配制而成，0.2％为质量体积百分含量。

4.根据权利要求1所述的干细胞常温运输液，其特征在于：太子参环肽B浓度为5μM。

5.权利要求1～4任一所述干细胞常温运输液在人脐带间充质干细胞运输中的应用。