CN102325871A - 条件培养基和制备其的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了制备血清减少的脐带组织来源的（UTC）条件培养基的稳定和可扩展的方法。方法包括在减少的血清条件下培养UTC。之后，洗涤UTC并在无血清基础培养基中培养。在大约24个小时后，收集、过滤并使用大约5kDa或类似截留膜浓缩条件培养基。

Description

条件培养基和制备其的方法
与相关申请的交叉引用
此申请引入2004年6月25日提交的美国非临时申请号10/877,012; 2004年6月25日提交的美国非临时申请号10/877,446; 和2007年11月13日提交的美国非临时申请号11/939,360作为参考。这些申请的内容在此处以其整体引入作为参考。
发明领域
本发明涉及条件培养基领域和制备其的方法的领域。具体地，本发明涉及来自产后来源细胞和脐组织来源细胞的血清减少的条件培养基。
发明背景
间充质干细胞（MSC）作为一种治疗形式在多种疾病中的潜在用途已被广泛研究。然而，存在越来越多的证据暗示MSC的有益性能可能通过旁分泌作用施加。发现MSC在其中培养的培养基富含细胞分泌的营养因子和细胞因子。这引发了大量研究，这些研究在心、肺和肾损伤以及许多其他疾病的多种疾病模型中利用由培养的MSC调节的培养基。
发现产后来源细胞（PPDC）和脐带组织来源细胞（UTC），例如MSC，分泌大量营养因子和细胞因子。因此，需要稳定和可扩展的方法来制备PPDC-和UTC-条件培养基。
发明概述
在特定的实施方案中，制备条件培养基的方法包括在培养基中接种UTC；减少培养基的血清含量；将UTC从培养基中转移至无血清基础培养基；在无血清基础培养基中培养UTC；和从无血清基础培养基中分离UTC，留下条件培养基（leaving a conditioned media）。
在某些实施方案中，在无血清基础培养基中培养UTC至多24小时。在其他实施方案中，过滤条件培养基，例如通过使用大约22微米的滤器。在某些实施方案中，浓缩条件培养基，例如使用截留膜；一个实例是大约5 kDa截留膜。
在另一个实施方案中，减少血清含量包括使UTC脱离（wean）培养基。在其他实施方案中，脱离包括以增量（例如约5%至约60%的增量和/或约50%的增量）减少培养基的血清含量。在某些实施方案中，UTC在每个增量中生长约1至3代或在每个增量中生长2代。在其他实施方案中，培养基可为静置培养或微载体珠培养。某些实施方案可包括在标准培养基中初步培养UTC以及在接种前从标准培养基中分离UTC。
在方法的一些实施方案中，通过下述方法制备条件培养基：在培养基中提供UTC；在一个或多个递增步骤中减少培养基的血清含量；当血清含量达到预定水平时将UTC从血清含量减少的培养基转移至无血清基础培养基；在无血清基础培养基中培养UTC不超过24小时；和从无血清基础培养基中分离UTC，留下条件培养基。
在某些实施方案中，转移包括使UTC脱离培养基或将血清减少的培养基替换为无血清基础培养基。可过滤和浓缩条件培养基。
在其他实施方案中，通过下述方法产生条件培养基：在培养基中接种UTC，其中在UTC转移至无血清基础培养基以前将所述培养基的血清含量减少，和其中然后从无血清基础培养基中分离UTC，留下条件培养基。可过滤和浓缩条件培养基。
通过参考以下详述和实施例将理解本发明的其他特征和优势。
附图简述
图1显示了实施例2的结果。
图2显示了实施例3的结果。
详述
在说明性实施方案的以下详细描述中，参考附图，所述附图构成说明书的一部分。这些实施方案被描述地足够详细以使本领域技术人员能够实践本发明，并且应当理解可利用其他实施方案和可进行合理的结构、机械、电子和化学改变而不背离本发明的精神或范围。为避免使本领域技术人员能够实践本文描述的实施方案的不必要的细节，本说明书可能省略了本领域技术人员已知的某些信息。因此以下详述不应被理解为限制性的，说明性实施方案的范围仅由所附权利要求限定。
为更好地阐明本发明，提供以下定义。
干细胞是未分化的细胞，其通过单细胞的自我更新和分化以产生子代细胞（包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和末端分化细胞）的双重能力定义。干细胞的特征也在于其体外分化为来自多胚层（内胚层、中胚层和外胚层）的多种细胞谱系的功能性细胞，以及在移植后产生多胚层组织和在注射至胚泡后基本上参与大部分（如果不是全部）组织的能力。
干细胞根据其发育潜能分为：(1) 全能；(2) 多能（ pluripotent ）；(3) 专能（ multipotent ）；(4) 寡能；和(5) 单能。全能干细胞能够产生所有胚胎和胚胎外细胞类型。多能干细胞能够产生所有胚胎细胞类型。专能干细胞包括能够产生细胞谱系亚群的干细胞，但产生的所有细胞都在特定组织、器官或生理系统中。例如，造血干细胞（HSC）可产生的后代包括HSC（自我更新）、血细胞限制性祖细胞和构成血液正常成分的所有细胞类型和成分（例如血小板）。寡能干细胞可产生比专能干细胞更受限制的细胞谱系亚群。单能干细胞能够产生单个细胞谱系（例如生精干细胞）。
干细胞也可基于得到其的来源分类。成体干细胞通常是在包含多个分化细胞类型的组织中发现的专能未分化细胞。成体干细胞可自我更新。在正常情况下，其也可分化产生其来源组织和可能分化产生其他组织类型的特化的细胞类型。胚胎干细胞是来自胚泡期胚胎内细胞团的多能干细胞。胎儿干细胞是来源于胎儿组织或膜的干细胞。产后干细胞是基本上来源于产后可利用的胚胎外组织，即胎盘和脐带的专能或多能干细胞。已发现这些细胞具有多能干细胞特有的特征，包括快速增殖和分化为多种细胞谱系的潜能。产后干细胞可为血液来源的（例如从脐带血得到的那些）或非血液来源的（例如从脐带和胎盘的非血液组织得到的）。
分化是这样的过程，其中非特化（“未定向”）或较少特化的细胞获得特化细胞例如神经细胞或肌肉细胞的特征。分化的细胞是在细胞谱系中占据更特化（“定向”）位置的细胞。术语定向，当应用于分化过程时，指细胞已在分化途径中行进至一个点，在正常情况下其将继续分化为特定的细胞类型或细胞类型亚群，并不能在正常情况下分化为不同的细胞类型或回复至分化较少的细胞类型。去分化指这样的过程，其中细胞回复至细胞谱系中的较少特化（或定向）的位置。如本文使用的，细胞谱系定义了细胞的遗传性，即其来源于什么细胞和其可产生什么细胞。细胞谱系将细胞置于发育和分化的遗传图表中。
广义上，祖细胞是具有产生比自身更分化的后代的能力但保留补充祖细胞库的能力的细胞。根据该定义，干细胞自身和末端分化细胞的较直接前体也是祖细胞。当提及本发明的细胞时，如下面更详细描述的，可能使用祖细胞的此广义定义。狭义上，经常将祖细胞定义为在分化途径中的中间体的细胞，即其由干细胞产生并且是在成熟细胞类型或细胞类型亚群产生中的中间体。此类型的祖细胞通常不能够自我更新。由此，如果在本文中提到此类型的细胞，其将被称为非更新祖细胞或称为中间祖细胞或前体细胞。
本文中使用的短语分化为中胚层、外胚层或内胚层谱系指细胞已分别定向为特定的中胚层、外胚层或内胚层谱系。分化为中胚层谱系或产生特定中胚层细胞的细胞实例包括但不限于成脂细胞、成软骨细胞、成心细胞、成皮细胞、造血细胞、成血管细胞、成肌细胞、成肾细胞、泌尿生殖器原性细胞、成骨细胞、成心包细胞或基质细胞。分化为外胚层谱系的细胞实例包括但不限于表皮细胞、神经原性细胞和神经胶质原性细胞。分化为内胚层谱系的细胞实例包括但不限于胸膜形成（pleurigenic）细胞、肝原性细胞、产生肠膜（lining）的细胞和产生胰原性和内脏形成细胞的细胞。
更具体地，所述细胞为脐来源细胞或脐带来源细胞（UDC）或脐带组织来源细胞（UTC）。此外，可将细胞描述为干细胞或祖细胞，在广义上使用后一个术语。使用术语来源表示细胞已从其生物学来源获得并在体外培养或另外操纵（例如在生长培养基中培养以扩增群体和/或产生细胞系）。脐干细胞的体外操纵和本发明的脐来源细胞的独特特征在以下详细描述。
使用多个术语描述培养中的细胞。细胞培养通常指从活体中取得细胞并在受控的条件下培养（“培养”或“培养的”）。原代细胞培养是在第一个继代培养前从生物体直接取得的细胞、组织或器官的培养。当细胞在利于细胞生长和/或分裂的条件下被置于生长培养基中得到更大的细胞群体时，细胞在培养物中扩增。当细胞在培养物中扩增时，有时通过细胞数加倍所需要的时间量测量细胞增殖速度。这被称为倍增时间。
细胞系是由原代细胞培养的1次或多次继代培养形成的细胞群。将每轮继代培养称为传代。当细胞被继代培养后，将其称为已传代。有时用已传代的次数提及或表征特定的细胞群或细胞系。例如，可将已传代10次的培养细胞群称为P10培养物。将原代培养物，即从组织分离细胞后的第一代培养物称为P0。在第一次继代培养后将细胞称为第二代培养物（P1或第1代）。在第二次继代培养后，细胞变为第三代培养物（P2或第2代），诸如此类。本领域技术人员将会理解在传代期间可能有多次群体倍增；因此培养物的群体倍增数大于传代次数。在传代之间的时期中细胞的扩增（即群体倍增数）取决于许多因素，所述因素包括但不限于接种密度、基质、培养基、生长条件和传代之间的时间。
条件培养基是这样的培养基，在其中培养过特定细胞或细胞群和然后将特定细胞或细胞群去除。当在培养基中培养细胞时，细胞可分泌可对其他细胞提供营养支持的细胞因子。这些营养因子包括但不限于激素、细胞因子、细胞外基质（ECM）、蛋白质、囊泡、抗体和颗粒。包含细胞因子的培养基是条件培养基。
通常将营养因子定义为促进细胞存活、生长、增殖和/或成熟，或刺激细胞活性提高的物质。
当提及培养的脊椎动物细胞时，术语衰老（又称复制性衰老或细胞衰老）指由有限细胞培养引起的性质；即其没有能力生长超过有限的群体倍增数（有时称为Hayflick 极限）。尽管第一次描述细胞衰老使用成纤维样细胞，大多数可在培养基中成功培养的正常人细胞类型经历细胞衰老。不同细胞类型的体外寿命不同，但最大寿命通常低于100次群体倍增（这是所有培养细胞变得衰老的倍增数，因此使培养物不能分裂）。衰老不依赖于年代时间，而是通过培养物已经历的细胞分裂或群体倍增数测量。因此，通过去除必需生长因子而变得静止的细胞当重新引入生长因子时能够继续生长和分裂，并且之后完成与连续培养的等同细胞相同的倍增数。类似地，当细胞在不同群体倍增数后冷冻于液氮中并且然后解冻和培养时，其经历与保持不冷冻的培养细胞基本上相同的倍增数。衰老细胞不是死或垂死细胞；其实际上耐受程序性细胞死亡（凋亡），并可在其不分裂态维持长达3年。这些细胞非常活跃和具有代谢活性，但它们不分裂。至今未发现衰老细胞的不分裂状态可被任意生物、化学或病毒试剂逆转。
本文中使用的术语生长培养基通常指足够培养细胞的培养基。特别地，一种目前优选的用于培养本发明的细胞的培养基包含Dulbecco修饰必需培养基（DMEM）。特别优选DMEM-低葡萄糖（DMEM-LG）(Invitrogen, Carlsbad, CA)。DMEM-LG优选地补充血清，最优选胎牛血清或人血清。通常加入15% (v/v)胎牛血清（例如确定的胎牛血清，Hyclone, Logan UT）和抗生素/抗真菌素（（优选100单位/毫升青霉素，100微克/毫升链霉素和0.25微克/毫升两性霉素B；Invitrogen, Carlsbad, CA））和0.001% (v/v) 2-巯基乙醇(Sigma, St. Louis MO)。有时使用不同的生长培养基，或提供不同的补充，这些通常在教科书中显示为生长培养基的补充。在某些化学成分确定的培养基中可培养细胞而完全不需要血清。在这种情况下，细胞可能需要某些生长因子，可将这些生长因子加入培养基以支持和维持细胞。目前用于生长加入无血清培养基的优选因子包括一种或多种bFGF、EGF、IGF-I和PDGF。在更优选的实施方案中，对无血清或化学成分确定的培养基加入2、3或所有4种上述因子。在另一个实施方案中，对无血清培养基加入LIF以支持或改善细胞的生长。
也与本发明有关的，本文使用的术语标准生长条件指在37℃，包含5% CO2的标准环境下培养细胞。相对湿度维持在约100%。尽管上述条件可用于培养，应当理解这些条件能够被本领域技术人员改变，技术人员懂得用于培养细胞的本领域可利用的选项。
术语有效量指本文所述的化合物、材料或组合物的浓度或量，所述浓度或量有效实现特定生物学结果。这些结果包括但不限于在外周局部缺血患者中再生、修复或改善骨骼组织，改善血流量和/或刺激和/或支持血管生成。这些有效活性可通过例如对外周局部缺血患者施用本发明的细胞和/或组合物实现。至于对患者体内施用的UTC，有效量的范围可从低至几百或更低至多至几百万或更多。在特定的实施方案中，有效量的范围可从103-1011，更具体地至少约104个细胞。应当理解待施用的细胞数将根据待治疗的疾病详情而变化，所述疾病详情包括但不限于待治疗的尺寸或总体积/表面积，和施用位点与待治疗区域位置的邻近性，以及在医学生物学家熟悉的其他因素。
术语治疗（或处理）（“ treat ， treating or treatment ”）指减弱或改善损伤、病理或病症中的任意成功或成功的指示，包括任意客观或主观参数例如症状的消除、缓解、减少或使患者更能容忍损伤、病理或病症，减慢变性或衰退的速度，使变性的最终阶段令人虚弱的程度降低，改善受试者的身体或精神幸福，或延长存活的时间长短。症状的治疗或改善可基于客观或主观参数；包括身体检查、神经学检查和/或精神病学评估的结果。
术语有效期（或时间）和有效条件指试剂或药物组合物达到其预期结果所必需或优选的一段时间或其他可控制的条件（例如用于体外方法的温度、湿度）。
术语患者或受试者在本文中可互换使用，指使用本文描述的药物或治疗组合物或依照本文描述的方法治疗的动物，优选哺乳动物，和更优选人。
可与术语生物学相容的载体或介质互换使用的术语药学可接受的载体或介质指不仅与治疗上施用的细胞和其他试剂相容而且在合理的医学判断范围内适用于与人类和动物组织接触而没有过多毒性、刺激、变态反应或其他并发症的具有相应的合理效益/风险比的试剂、细胞、化合物、材料、组合物和/或剂型。如本文中更详细描述地，适用于本发明的药学可接受的载体包括液体、半固体（例如凝胶）和固体材料（例如，细胞支架和基质、管片和本领域已知并在本文中更详细描述的其他这样的材料）。这些半固体和固体材料可被设计为在体内抵抗降解（不可生物降解的）或它们可被设计为在体内降解（可生物降解的，可生物溶蚀的）。可生物降解的材料可进一步为可生物再吸收的或可生物吸收的，即其可被溶解和吸收进体液（水溶性植入物是一个实例），或可被降解和最终从体内消除，通过自然途径转化为其他材料或降解和消除。一旦植入体内后生物降解率可根据预期的释放率而改变。基质理想地也可作为临时支架直到被新生成的骨骼肌、周围细胞、血管平滑肌或血管内皮组织替换。因此，在一个实施方案中，基质提供了在患者中与细胞共同使用的其他试剂的持续释放并可提供用于培育组织生长的结构。在其他实施方案中，基质仅提供了用于培育组织的临时支架。基质可为颗粒形式（直径大于10微米的大颗粒或直径小于10微米的微颗粒），或可为结构稳定的三维植入物形式（例如，支架）。植入物可为例如立方体、圆柱体、管、块、膜、片或合适的解剖学形式。
本文中使用了几个有关细胞或组织移植的术语。术语自体转移（“ autologous transfer ”）、自体移植（“ autologous transplantation ”、“ autograft ”）等指这样的移植，其中移植供体也是移植受体。术语同种异体转移、同种异体移植（“ allogeneic transplantation ”、“ allograft ”）等指这样的移植，其中移植供体和移植受体是相同的物种，但移植供体不是受体。这样的细胞移植有时被称为同基因转移，其中供体细胞与受体已经过组织相容性匹配。术语异种转移，异种移植（“ xenogeneic transplantation ”、“ xenograft ”）等指这样的移植，其中移植供体和移植受体是不同的物种。
细胞、细胞群和包括细胞裂解物的制备物等在美国专利公开号20050054098和20050058631中详细描述。
可在体外和体内使用来自培养的UTC的条件培养基。UTC或其它条件培养基的使用可允许在患者中同种异体地使用UTC分泌的有益营养因子而不引入可能引起排斥或其他不良免疫学应答的完整细胞。通过在培养基中培养细胞，然后从培养基中去除细胞制备条件培养基。
从细胞群制备的条件培养基可进一步浓缩使用，例如通过超滤或冻干，或甚至将其干燥，部分纯化，与本领域已知的药学可接受的载体或稀释剂组合，或与其他化合物比如生物制剂，例如药学上有用的蛋白质组合物组合。可在体外或体内使用条件培养基，单独或与例如自体或同基因活细胞组合使用。如果将条件培养基引入体内，可在治疗位点局部或远程引入从而为患者提供需要的细胞生长或营养因子。
根据本发明的实施方案，提供了用于制备血清减少的UTC条件培养基的稳定和可扩展的过程。简单地说，所述方法包括在血清减少的条件下培养UTC。然后洗涤UTC并在无血清基础培养基中培养。大约24小时后，收集、过滤条件培养基并通过使用大约5 kDa或类似分子量的截留膜浓缩。
可根据美国专利公开号20050054098和20050058631中描述的方法分离哺乳动物脐组织来源细胞（UTC）。然后可根据美国专利公开号20050054098和20050058631中描述的方法在静置培养中培养分离的细胞直到条件培养基已制备好时。
可在任意的细胞群体倍增数时制备条件培养基。在另一个实施方案中，在从约20的群体倍增数至约44的群体倍增数时制备条件培养基。在另一个实施方案中，在约30的群体倍增数时制备条件培养基。
通过下述方法制备条件培养基：首先从培养细胞的标准培养基中分离细胞。然后以任意接种密度在静置培养中接种细胞。在一个实施方案中，以每平方厘米约1,000个细胞至每平方厘米约10,000个细胞的密度接种细胞。在另一个实施方案中，以每平方厘米约5,000个细胞的密度接种细胞。
以约5,000个细胞/cm2接种细胞后，通过以增量（increment）减少培养基中的牛血清含量直到仅在基础培养基中培养细胞使细胞从具有约15%牛血清含量的标准培养基中脱离（wean）。可以约5至约60%的增量减少牛血清。在一个实施方案中，以约50%的增量减少牛血清（即培养基中的牛血清为15%、7.5%、3.25%和0%）。允许细胞在每种血清减少的培养基中生长约1至约3代。在一个实施方案中，在每种血清减少的培养基中培养细胞约2代。在加入最后的牛血清减少的培养基之前，以约10,000个细胞/cm2接种细胞。当对细胞加入基础培养基（0%牛血清）时，在培养基中维持细胞不超过24小时。
然后将条件培养基与细胞分离并使用约0.22微米或类似的滤器过滤培养基。滤器可为灭菌的或可为没有灭菌的。然后使用约5K截留滤器或类似的设备浓缩滤过的条件培养基。丢弃滤液但收集保留在滤器上的浓缩的条件培养基。
在另一个实施方案中，根据美国专利公开号20080166328（见实施例）描述的方法在微载体珠培养中培养分离的UTC细胞直到条件培养基已制备好时。
可在任意的细胞群体倍增数时制备条件培养基。在另一个实施方案中，从约20的群体倍增数至约44的群体倍增数时制备条件培养基。在另一个实施方案中，在约30的群体倍增数时制备条件培养基。
细胞接种后，在微载体珠培养中以约10,000个细胞/cm2对细胞加入标准培养基并培养约2天。之后去除标准培养基并替换为基础培养基。可选地，可与静置培养类似地使微载体珠培养物脱离标准培养基。当对细胞加入基础培养基（0%牛血清）时，在培养基中维持细胞不超过24小时。
然后将条件培养基与细胞分离并使用约0.22微米或类似的滤器过滤。滤器可为灭菌的或可为没有灭菌的。然后使用约5K截留滤器或类似的设备浓缩滤过的条件培养基。丢弃滤液但收集保留在滤器上的浓缩的条件培养基。
传统的条件培养基尽管富含来自培养的细胞类型的的蛋白质，但也富含来自培养基中存在的牛血清的蛋白质。通过上述方法制备的条件培养基含有浓缩的人蛋白质。牛蛋白质以标准表征方法例如SDS-PAGE和蛋白质印迹分析检测不到的量存在。在条件培养基中牛蛋白质的检测不到的量是有利的，因为随后减少的牛疾病和病毒的传播风险以及减少的异种免疫应答风险。
如本文描述制备的条件培养基可用于替代传统条件培养基。
以下实施例更详细地描述本发明。这些实施例旨在进一步说明，而不限制本文描述的本发明的方面。
实施例1
从静置培养瓶中培养的细胞产生条件培养基的影响因素
此研究的目的是测定在条件培养基的产生中不同因素的变化（培养基体积、细胞接种密度、培养持续时间、细胞的群体倍增数、细胞的增殖态和血清脱离）是否影响条件培养基中的蛋白质量以及蛋白质表达谱。
作为常规方案，在T-225 cm2培养瓶(Corning Inc, Corning NY)中以10,000个细胞/cm2（除非另外说明）接种至少一种UTC（UTC的分离和表征可见于实施例5-14）至生长培养基（DMEM-低葡萄糖(Gibco, Carlsbad, Ca), 15% (v/v) γ辐射的胎牛血清(Hyclone, Logan, UT), 4 mM Glutamax (Gibco, Carlsbad, Ca), 50 IU/mL青霉素 (Gibco, Carlsbad, Ca)和50 μg/mL链霉素(Gibco, Carlsbad, Ca)）中。48小时后，吸出用过的培养基并洗2次培养瓶，每次使用10mL D-PBS (Gibco, Carlsbad, CA)。每次洗涤时，用血清学移液管冲洗培养瓶2次。然后加入20 mL（除非另外说明）基础培养基(DMEM-低葡萄糖 (Gibco, Carlsbad, Ca)和4 mM Glutamax (Gibco, Carlsbad, Ca))并再培养细胞24小时（除非另外说明）。24小时后，收集条件培养基并用0.22 μm过滤瓶(Corning, Corning NY)过滤，然后在具有5 kDa分子量截留的离心过滤管(Centricon Plus-70, Millipore, Billerica, Ma)中浓缩。样品在这些离心过滤管中于20-25℃以3200 g离心30分钟。通过颠倒离心过滤管收集保留物（于20-25℃以913 g离心5分钟）。然后将得到的浓缩培养基视为终产物。
用于培养基体积的研究，培养细胞48小时后将其切换至3个不同体积的基础培养基（10、25和40 mL）中。用于细胞接种密度的研究，以1,000、5,000和10,000个细胞/cm2 接种细胞48小时后将其切换至基础培养基中。用于培养持续时间的研究，在基础培养基中培养细胞24、48和72小时后收获条件培养基。用于细胞群体倍增数的研究，将细胞培养至不同的群体倍增数然后切换至基础培养基中。在收集培养基时的细胞最终群体倍增数为20、35和44。使用2组细胞以比较细胞增殖态的影响。第一组由下述细胞组成：在切换至基础培养基前以5,000个细胞/cm2 接种的和在标准培养基中培养的增殖细胞。第二组由下述细胞组成：在切换至基础培养基前以10,000个细胞/cm2 接种的和在包含2%血清的培养基中培养的非增殖细胞。血清脱离研究具有2组。第一组由下述细胞组成：以5,000个细胞/cm2 的恒定接种密度（除了在切换至基础培养基前48小时的最后一次传代以10,000个细胞/cm2 的接种密度）从包含15%至7.5%至最终3.25%血清的培养基中脱离2次连续传代的细胞。第二组按照常规方案进行。
蛋白质评估。通过Bradford测定评估每个浓缩培养基样品中的总蛋白质浓度。Quick Start Bradford 1x 染料试剂和Quick Start 牛血清白蛋白标准套装获自Bio-Rad (Hercules, Ca)。用Milli-Q水适当地稀释样品以适合标准曲线的线性范围并一式两份进行。短暂摇动样品和Bradford染料混合物并在黑暗中孵育5分钟，然后在分光光度计(Molecular Devices, SpectraMax 190使用Softmax Pro v4.0软件)上读取595 nm的光密度。基于BSA标准物的OD读数生成的标准曲线将样品的OD读数转化为蛋白质浓度。通过将浓度乘以浓缩步骤后收集的保留物的体积将蛋白质浓度转化为存在的蛋白质总量。
SDS-PAGE。在具有5% (v/v) β-巯基乙醇的Novex® Tris-甘氨酸 SDS样品缓冲液(2X) (Invitrogen, Carlsbad, Ca)中制备5 μg的各个样品。混合后，将样品在95℃加热5分钟并在冰上冷却，然后加入孔中。用于蛋白质的分离，根据制造商的方案使用Novex® Tris-甘氨酸 预制4-20%凝胶和系统(Invitrogen, Carlsbad, Ca)和Novex® Tris-甘氨酸运行缓冲液(Invitrogen, Carlsbad, Ca)。根据制造商的方案使用SIMPLYBLUE安全染色剂染色并使用DRYEASE Mini-凝胶干燥系统(Invitrogen, Carlsbad, Ca)干燥凝胶。
表1-1
Figure 498974DEST_PATH_IMAGE001
。
表1-2
Figure 416114DEST_PATH_IMAGE002
。
在研究的因素中，只有最初的接种密度和培养持续时间影响蛋白质总量，随着增加的细胞密度和培养的持续时间，蛋白质含量增加。蛋白质带型在样品之间非常一致，除了在细胞接种密度研究中的样品中，较低的接种密度导致蛋白质带型的丢失。
实施例2
在血清减少步骤后在条件培养基中的血清蛋白质减少
在条件培养基的生产过程中，在终产物中存在FBS蛋白质是不可避免的。我们的发现显示在终产物中存在大量的FBS。通过产生条件培养基以前的一步血清减少，在终产物中存在的FBS蛋白质的量大幅度减少。
条件培养基的产生。进行了3组研究。在第一组中，将细胞接种于T-225培养瓶并用50mL包含15% FBS的生长培养基培养（feed）。第二组由接种于T-225培养瓶并用50mL包含2% FBS的生长培养基培养的细胞组成。最后一组由没有接种细胞但充满50mL包含15% FBS的生长培养基的T-225培养瓶组成。48小时后，收集各个培养瓶中的培养基并贮存于–80℃。然后用D-PBS（每次10mL）洗涤培养瓶2次，收集每次的洗涤液并贮存于–80℃。然后对每个培养瓶加入20mL基础培养基并遵照实施例1中详细说明的准确方案。
蛋白质分析。对培养基和洗涤液进行蛋白质评估以测定存在的蛋白质的量；方法在实施例1中描述。也进行最终条件培养基的SDS-PAGE以比较组间的蛋白质带型；方法在实施例1中描述。使用蛋白质印迹以比较每组的最终条件培养基产物中存在的牛血清白蛋白（BSA）的量。在含有5% β-巯基乙醇的2x样品缓冲液(Invitrogen, Carlsbad, Ca)中制备样品。混合后，将样品在95℃加热5分钟并在冰上冷却，然后加入孔中。用于蛋白质的分离，使用预制的4-20% NOVEX Mini凝胶和系统(Invitrogen)。在湿转移系统(Bio-Rad, Hercules, CA)中使用含有20%甲醇和0.01% SDS的标准Towbin缓冲液，将凝胶转移至PVDF膜(Invitrogen)。在4℃以100V进行2小时转移。转移后将膜用基于非蛋白质的封闭缓冲液(Pierce, Rockford, IL)封闭并与第一抗体在摇床（rocker）上4℃孵育过夜。使用在新鲜封闭缓冲液中配制的1：1000稀释的小鼠单克隆抗-BSA(Sc-80705, Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA)。然后洗膜3次，每次用PBST(Bio-Rad, Hercules, Ca)洗5分钟，然后与山羊抗小鼠第二抗体(HAF007, RnD Systems, Minneapolis, MN)孵育。然后洗印迹3次，每次在PBST中洗5分钟，然后在化学发光底物(SuperSignal West Dura, Pierce, Rockford, IL)中孵育1分钟，然后用数字成像系统(Bio-Rad, Hercules, CA)检测。
表2-1
Figure 530874DEST_PATH_IMAGE003
又见图1。
我们已显示了在静置培养培养瓶中使用含有15% FBS的培养基在存在或不存在细胞的情况下导致大量蛋白质遗留在洗涤液中。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹确认了这些蛋白质是否是来源于牛的担心，其中在条件培养基中检测到大量的BSA。但是我们发现通过在刚要切换至基础培养基前将生长培养基中的血清量从15%减少至2%，在条件培养基中存在的BSA的量大幅度减少了。由于BSA是量最丰富的血清蛋白质，可以推测其他血清蛋白质也大幅度减少了。
实施例3
使用一步血清减少法从静置培养瓶和旋转培养瓶中制备的条件培养基的比较
从旋转培养瓶中产生条件培养基。以5,000个细胞/cm2 在100mL带有挡板的旋转培养瓶(Corning, Corning, NY)中接种至少一种UTC至Hillex II微载体(12g/L) (Solohill Engineering Inc, MI)上并用生长培养基(DMEM-低葡萄糖(Gibco, Carlsbad, Ca), 15% (v/v) γ辐射的胎牛血清(Hyclone, Logan, UT), 4mM Glutamax (Gibco, Carlsbad, Ca), 50 IU/mL青霉素(Gibco, Carlsbad, Ca)和50 μg/mL链霉素(Gibco, Carlsbad, Ca)培养，使用60rpm的恒定旋转。4天后，通过以1：5的分流比用新鲜微载体和新鲜生长培养基重组含有细胞的微载体将细胞传代至500 mL的旋转培养瓶中。4天后，吸出用过的培养基并用D-PBS洗微载体2次。第一次洗涤液由200 mL PBS组成，伴有短暂摇动。在吸出第一次洗涤液后，第二次洗涤液由500mL PBS组成并在磁力搅拌器上孵育10分钟（以60rpm孵育10分钟）。2次洗涤后，用含有2%FBS的生长培养基培养细胞。24小时后根据上述的精确程序用D-PBS再次洗涤微载体并以0.09 mL/cm2的体积对微载体表面积的比值用基础培养基培养。24小时后，收集条件培养基并用0.22 μm过滤瓶(Corning, Corning NY)过滤，然后用具有5 kDa分子量截留的离心过滤管(Centricon Plus-70, Millipore, Billerica, Ma)浓缩。样品在这些离心过滤管中于20-25℃以3200 g离心30分钟。通过颠倒离心过滤管收集保留物（于20-25℃以913 g离心5分钟）。然后将得到的浓缩培养基视为终产物。
从静置培养瓶中产生条件培养基。以30,000个细胞/cm2 接种一种或多种UTC至T-225 cm2培养瓶中并用生长培养基(DMEM-低葡萄糖(Gibco, Carlsbad, Ca), 2% (v/v) γ辐射的胎牛血清(Hyclone, Logan, UT), 4mM Glutamax (Gibco, Carlsbad, Ca), 50 IU/mL青霉素(Gibco, Carlsbad, Ca)和50 μg/mL链霉素(Gibco, Carlsbad, Ca)培养。48小时后，吸去用过的培养基并每次用10 mL D-PBS (Gibco, Carlsbad, CA)洗培养瓶2次。每次洗涤时，用血清学移液管冲洗培养瓶2次。然后以0.09 mL/cm2的体积对表面积的比值加入基础培养基(DMEM-低葡萄糖 (Gibco, Carlsbad, Ca)和4 mM Glutamax (Gibco, Carlsbad, Ca))并再培养细胞24小时（除非另外说明）。24小时后，收集条件培养基并用0.22 μm过滤瓶(Corning, Corning NY)过滤，然后在具有5 kDa分子量截留的离心过滤管(Centricon Plus-70, Millipore, Billerica, Ma)中浓缩。样品在这些离心过滤管中于20-25℃以3200 g离心30分钟。通过颠倒离心过滤管收集保留物（于20-25℃以913 g离心5分钟）。然后将得到的浓缩培养基视为终产物。
测定最终细胞密度。在已收获条件培养基后，用D-PBS（不含Ca和Mg）(Gibco, Carlsbad, Ca)洗剩余的细胞并用TrypLE Select (Gibco, Carlsbad, Ca)将细胞从培养瓶或微载体上经胰蛋白酶化脱落。然后在完全生长培养基中中和分离的细胞并使用基于流的细胞计数器(GUAVA Technologies)计算数目和活力。细胞混合物的等分试样用染色死细胞的荧光染料稀释20倍，然后注入机器。计算了最终细胞数并用可利用的总培养表面积修正以得到最终细胞密度。在Hillex II微载体的情况下，1.2 g微载体具有约515 cm2的总表面积。
蛋白质分析。对培养基和洗涤液进行蛋白质评估以测定存在的蛋白质的量；方法在实施例1中描述。也进行最终条件培养基的SDS-PAGE以比较组间的蛋白质带型；方法在实施例1中描述。对条件培养基进行如实施例1中描述的BSA的蛋白质印迹。
表3-1
Figure 926083DEST_PATH_IMAGE004
*从70mL条件培养基的浓度（其与静置培养瓶培养中使用的相同量（20mL））得到的值推测的
又见图2。
当在旋转培养瓶中培养时，从条件培养基中回收的蛋白质总量大约是静置培养瓶的4倍，而在静置和旋转培养瓶二者中的总细胞密度几乎差不多。在旋转培养瓶中的条件培养基中存在的BSA与静置培养瓶相比大幅度降低。
实施例4
通过多重ELISA测定条件培养基中存在的目的蛋白质
条件培养基的产生。根据实施例3中描述的方法从静置培养瓶和旋转培养瓶中制备条件培养基。
目的蛋白质的检测。用基础培养基在硅化处理(以减少由吸附引起的蛋白质损失)的微离心管中将样品稀释至100 μg/mL，然后冷冻运输至Pierce Biotechnology, Inc, Woburn, MA以通过SERCHLIGHT多重ELISA测定来测定存在的人和牛目的蛋白质的量，。使用SEARCHLIGHT蛋白质组阵列测量目的蛋白质。蛋白质组阵列是用于每孔2至16种蛋白质的定量测量的多重夹心ELISA。通过将4至16种不同捕获抗体以2x2、3x3或4x4的方式点样至96孔板的每个孔中产生阵列。遵照通常的夹心ELISA程序后，显像整块板以捕获板上每个孔中的每个点产生的化学发光信号。每个点产生的信号量与在原始标准物或样品中的靶蛋白质的量成比例。
表 4-1
Figure 802772DEST_PATH_IMAGE005
ND——未检测出。
据显示通过使用5 kDa截留膜过滤浓缩是一种可行的方法。通过使用ATF过滤系统此方法是可扩展的。条件培养基含量的分析显示大量的人生长因子和细胞因子(BDNF、IL-8、HGF、TIMP-1、TIMP-2、VEGF、FGFb、IL-6和MMP-7)和未检测出量的除了BSA以外的牛蛋白质(IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6和TNF-α)，发现取决于在制备条件培养基以前的最初血清生长培养基，BSA以不同的量存在。
本发明不限于上面描述和例举的实施方案。在所附权利要求书的范围内其能够变化和修改。
实施例5
细胞的分离
脐细胞的分离。脐带从国家疾病研究交流所（National Disease Research Interchange） (NDRI, Philadelphia, PA)获得。在正常分娩后得到组织。在层流净化罩中无菌进行细胞分离方案。为去除血和碎片，在存在100单位/毫升青霉素、100单位/毫升链霉素和25微克/毫升两性霉素B(Invitrogen Carlsbad, CA)的磷酸缓冲盐水（PBS; Invitrogen, Carlsbad, CA）中洗涤脐带。然后在存在50毫升培养基(DMEM-低葡萄糖或DMEM-高葡萄糖; Invitrogen)的150 cm2组织培养板中机械分离组织，直到将组织切成细小的浆状物。将切碎的组织转移至50毫升锥形管中（每管约5克组织）。
然后在DMEM-低葡萄糖培养基或DMEM-高葡萄糖培养基(各个包含100单位/毫升，以100毫克/毫升的链霉素、以0.25微克/毫升的两性霉素B和消化酶)中消化组织。在某些实验中使用胶原酶和分散酶的酶混合物(“C:D”)（胶原酶(Sigma, St Louis, MO)，500单位/毫升；和分散酶(Invitrogen)，50单位/毫升，在DMEM-低葡萄糖培养基中）。在其他实验中使用胶原酶、分散酶和透明质酸酶的混合物(“C:D:H”)（C:D:H=胶原酶，500单位/毫升；分散酶，50单位/毫升；和透明质酸酶(Sigma)，5单位/毫升，在DMEM-低葡萄糖中）。包含组织、培养基和消化酶的锥形管于37℃在定轨振荡器(Environ, Brooklyn, NY)上以225 rpm孵育2小时。
消化后，以150 x g离心组织5分钟，吸去上清。在20毫升生长培养基(DMEM:低葡萄糖(Invitrogen), 15% (v/v)胎牛血清(FBS; 确定的胎牛血清; 货号AND18475; Hyclone, Logan, UT), 0.001% (v/v) 2-巯基乙醇(Sigma), 100单位/毫升的青霉素, 100微克/毫升的链霉素和0.25 微克/毫升的两性霉素B; (均来自Invitrogen, Carlsbad, CA))中重悬沉淀。通过70微米的尼龙BD FALCON细胞过滤器（cell strainer）(BD Biosciences, San Jose, CA)过滤细胞悬浮物。另外使5毫升包含生长培养基的漂洗液通过过滤器。然后使细胞悬浮物通过40-微米尼龙细胞过滤器(BD Biosciences, San Jose, CA)并追加一次另外5毫升生长培养基的漂洗。
在生长培养基（总体积50毫升）中重悬滤液并以150 x g离心5分钟。吸去上清并在50毫升新鲜的生长培养基中重悬细胞。此过程再重复2次。
在最后的离心后吸去上清并在5毫升新鲜的生长培养基中重悬细胞沉淀。使用台盼蓝染色测定活细胞数。然后在标准条件下培养细胞。
以5,000个细胞/cm2在生长培养基中将从脐带组织分离的细胞接种至明胶包被的T-75培养瓶(Corning Inc., Corning, NY)中。2天后，从培养瓶中吸去用过的培养基和未贴壁的细胞。用PBS洗3次贴壁细胞以去除碎片和血液来源的细胞。然后对细胞补充生长培养基并允许生长至汇合至第1代（从第0代起大约10天）。在以后的传代中（从第1代至第2代等），细胞在4-5天中达到亚汇合（75-85%汇合）。在这些以后的传代中，以5,000个细胞/cm2接种细胞。在具有5%二氧化碳的湿润的培养箱中于37℃培养细胞。
使用LIBERASE (2.5毫克/毫升, Blendzyme 3; Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN)和透明质酸酶(5单位/毫升, Sigma)在DEME-低葡萄糖培养基中从组织中分离细胞。组织的消化和细胞的分离如上面用于其他蛋白酶消化的步骤所述，但是使用LIBERASE/透明质酸酶混合物替代C:D或C:D:H酶混合物。使用LIBERASE的组织消化导致从组织中分离容易扩增的细胞群。
比较了使用不同酶组合从脐带中分离细胞的程序。比较的用于消化的酶包括：i) 胶原酶; ii) 分散酶; iii) 透明质酸酶; iv) 胶原酶:分散酶混合物 (C:D); v) 胶原酶:透明质酸酶混合物 (C:H); vi) 分散酶:透明质酸酶混合物 (D:H); 和vii) 胶原酶:分散酶:透明质酸酶混合物 (C:D:H)。观察到使用这些不同的酶消化条件在细胞分离中的差异（表5-1）。
通过不同方法进行了从脐带中分离细胞库的其他尝试。在一个例子中将脐带切片并用生长培养基洗涤以取出血块和凝胶状物质。收集血液、凝胶状物质和生长培养基的混合物并以150 x g离心。重悬沉淀并在生长培养基中接种至明胶包被的培养瓶中。通过这些实验分离到容易扩增的细胞群。
细胞已从NDRI获得的脐带血样品中分离。使用的分离方案是Ho 等人的国际专利申请PCT/US2002/029971中的。将脐带血（NDRI, Philadelphia PA）样品（分别是50毫升和10.5毫升）与裂解缓冲液（过滤除菌的155毫摩尔氯化铵，10毫摩尔碳酸氢钾，0.1毫摩尔EDTA缓冲至pH7.2（所有成分均来自Sigma, St. Louis, MO））混合。以1：20的脐带血与裂解缓冲液的比例裂解细胞。将得到的细胞悬浮物涡旋5秒，然后在环境温度下孵育2分钟。离心裂解物（以200 x g，10分钟）。在包含10%胎牛血清(Hyclone, Logan UT)，4毫摩尔谷氨酰胺(Mediatech Herndon, VA ), 100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素(Gibco, Carlsbad, CA)的完全最低必需培养基(Gibco, Carlsbad CA)中重悬细胞沉淀。离心（以200 x g，10分钟）重悬的细胞，吸去上清并在完全培养基中洗涤细胞沉淀。将细胞直接接种至T75 培养瓶(Corning, NY)、T75层粘连蛋白包被的培养瓶或T175 纤连蛋白包被的培养瓶(二者都来自Becton Dickinson, Bedford, MA)中。
为测定是否可在不同条件下分离细胞群和分离后细胞群是否可在多种条件下立即扩增，在含有或不含0.001%(v/v) 2-巯基乙醇(Sigma, St. Louis, MO)的生长培养基中使用C:D:H酶组合根据上面提供的程序消化细胞。在100单位/毫升的青霉素和100微克/毫升的链霉素的存在下培养所有细胞。在所有检测的条件下在第0代和第1代之间细胞附着和扩增良好（表5-2）。证明在条件5-8和13-16中的细胞可良好增殖至接种后第4代，在这时将它们低温贮藏。
C:D:H组合提供了分离后最好的细胞产量，并且产生的细胞在培养中比其他条件中产生的细胞扩增更多代（表5-1）。单独使用胶原酶或透明质酸酶没有获得可扩增的细胞群。没有尝试测定此结果是否仅限于检测的胶原酶。
表5-1：使用不同酶组合从脐带组织中分离细胞
酶消化 分离的细胞 细胞扩增
胶原酶 X X
分散酶 + (>10 h) +
透明质酸酶 X X
胶原酶:分散酶 ++ (< 3 h) ++
胶原酶:透明质酸酶 ++ (< 3 h) +
分散酶:透明质酸酶 + (>10 h) +
胶原酶:分散酶:透明质酸酶 +++ (< 3 h) +++
注释：+ = 好，++ = 很好，+++ = 极好，X = 未成功。
在检测的酶消化和生长的所有条件下，细胞在第0代和第1代之间附着和扩增良好（表5-2）。在实验条件5-8和13-16中的细胞良好增殖至接种后第4代，在这时将它们低温贮藏。将所有细胞低温贮藏以用于进一步的分析。
表5-2：在不同条件下细胞的分离和培养扩增：
Figure 625234DEST_PATH_IMAGE006
。
有核细胞附着和生长迅速。通过流式细胞仪分析这些细胞并且其与通过酶消化得到的细胞类似。
制备物包含红细胞和血小板。在前3周中有核细胞没有附着和分裂。在接种后3周更换培养基并且未观察到细胞的附着和生长。
使用胶原酶（一种金属蛋白酶）、分散酶（中性蛋白酶）和透明质酸酶（降解透明质酸的粘液溶解酶）的酶组合可有效地从脐组织中分离细胞群。也可使用LIBERASE，其是胶原酶和中性蛋白酶的混合物。也与透明质酸酶一起使用Blendzyme3分离细胞，Blendzyme3是胶原酶（4 Wunsch单位/克）和嗜热菌蛋白酶（1714酪蛋白单位/克）。当在明胶包被的塑料上在生长扩增培养基中培养时，这些细胞可容易地扩增许多代。
也从脐带的残留血而非脐带血中分离了细胞。从组织中洗出的血块中存在细胞，其在使用的条件下附着和生长，这可能是由于在解剖过程中释放的细胞。
参考资料
Ho 等人, WO2003025149 A2, “CELL POPULATIONS WHICH CO-EXPRESS CD49C AND CD90,” NEURONYX, INC. 申请号PCT/US02/29971, 提交于20020920, A2公开于20030327, A3公开于20031218。
实施例6
细胞的生长特征
比较了细胞和其他分离的干细胞群的细胞扩增潜能。细胞扩增至衰老的过程被称为Hayflick极限(Hayflick, “The longevity of cultured human cells,” J. Am. Geriatr. Soc., 1974; 22(1); 1-12, Hayflick, “The strategy of senescence,” Gerontologist, 1974; 14(1); 37-45)。
通过加入20毫升2% (w/v)明胶(B型: 225 Bloom; Sigma, St Louis, MO)至T75培养瓶(Corning Inc., Corning, NY)在室温孵育20分钟包被组织培养用塑料瓶。在去除明胶溶液后，加入10毫升磷酸缓冲液（PBS）(Invitrogen, Carlsbad, CA)然后吸去。
为了比较生长扩增潜能使用以下细胞群：i）间质干细胞(MSC; Cambrex, Walkersville, MD)；ii）脂肪来源细胞（美国专利号6,555,374 B1; 美国专利公开US20040058412）；iii）正常真皮成纤维细胞(cc-2509 货号 9F0844; Cambrex, Walkersville, MD)；和iv）脐来源细胞。最初在生长培养基中以5,000个细胞/cm2将细胞接种至明胶包被的T75培养瓶中。在后来的传代中，如下处理细胞培养物。在胰蛋白酶消化后，在台盼蓝染色后计数活细胞。将细胞悬浮物（50微升）与台盼蓝（50微升，Sigma, St. Louis MO）结合。使用血球计数器估计活细胞数。
计数后，在25毫升新鲜的生长培养基中以5,000个细胞/cm2将细胞接种至明胶包被的T75培养瓶中。在标准环境（5%二氧化碳(v/v)）下于37 ℃培养细胞。每周更换2次生长培养基。当细胞达到约85%汇合时将其传代；重复此过程直到细胞达到衰老。
在每次传代时，用胰蛋白酶消化细胞并计数。计算活细胞产量、群体倍增数[ln (最终细胞数/最初细胞数)/ln2]，倍增时间（培养时间/群体倍增数）。为了测定最佳细胞扩增，通过上一代总产量乘以每代的扩增因子（即扩增因子=最终细胞数/最初细胞数）测定每代的总细胞产量。
也检测了在第10代保存的细胞的扩增潜能。使用不同的条件组。检测了正常真皮成纤维细胞(cc-2509 货号 9F0844; Cambrex, Walkersville, MD)，脐来源细胞和胎盘来源细胞。这些细胞群之前已在第10代时被保存，并在保存前每代以5,000个细胞/cm2培养至第10代。测定了在第10代解冻细胞后细胞密度对细胞群体的影响。在标准条件下解冻细胞，使用台盼蓝染色计数。然后以1,000个细胞/cm2将解冻的细胞接种至生长培养基。在标准环境条件于37 ℃培养细胞。每周更换2次生长培养基。当细胞达到约85%汇合时传代细胞。之后传代细胞直到细胞衰老，即直到它们不能再扩增。在每次传代时，用胰蛋白酶消化细胞并计数。计算活细胞产量、群体倍增数[ln (最终细胞数/最初细胞数)/ln2]和倍增时间（培养时间/群体倍增数）。通过上一代的总产量乘以每代的扩增因子（即扩增因子=最终细胞数/最初细胞数）测定每代的总细胞产量。
在另一个实验中检测了新鲜分离的脐带组织来源细胞培养物在低细胞接种条件下的扩增潜能。如实施例5中所描述的分离脐来源细胞。以1,000个细胞/cm2接种细胞并如上述传代直到细胞衰老。在标准环境条件于37 ℃培养细胞。每周更换2次生长培养基。当细胞达到约85%汇合时传代细胞。在每次传代时，用胰蛋白酶消化细胞并用台盼蓝染色计数。计算了每一代的细胞产量、群体倍增数[ln (最终细胞数/最初细胞数)/ln2]和倍增时间（培养时间/群体倍增数）。通过上一代的总产量乘以每代的扩增因子（即扩增因子=最终细胞数/最初细胞数）测定每代的总细胞产量。在明胶包被的和没有明胶包被的培养瓶中培养细胞。
已证明低O2细胞培养条件可在某些情况下增强细胞扩增(Csete, Marie; Doyle, John; Wold, Barbara J.; McKay, Ron; Studer, Lorenz. Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells. US20040005704)。为了测定改变细胞培养条件是否能增强脐来源细胞的细胞扩增，在低氧条件下培养脐来源细胞培养物。在生长培养基中以5,000个细胞/cm2将细胞接种至明胶包被的培养瓶中。最初在标准环境条件下培养细胞至第5代，这时将其转移至低氧 (5% O2)培养条件。
在其他实验中，在未包被的、胶原包被的、纤连蛋白包被的、层粘连蛋白包被的和基质胶包被的板上扩增细胞。已证明细胞在这些不同基质上扩增良好。
脐来源细胞在60天中扩增了超过40代，产生 > 1E17个细胞的细胞产量。相反，MSC和成纤维细胞分别在< 25天和< 60天后开始衰老。尽管脂肪来源和网膜细胞都扩增了几乎60天，它们分别产生了4.5E12和4.24E13的总细胞产量。因此，当在使用的实验条件下以5,000个细胞/cm2接种时，脐来源细胞比在相同条件下培养的其他细胞类型扩增的好得多（表6-1）。
表6-1：培养至衰老的不同细胞群的生长特征
Figure 705317DEST_PATH_IMAGE007
。
脐来源细胞和成纤维细胞在60天中扩增超过10代，产生> 1E11个细胞的细胞产量（表6-2）。在这些条件下60天后，成纤维细胞开始衰老；而脐来源细胞在80天后开始衰老，完成>50次的群体倍增。
表6-2：使用低密度培养扩增从第10代至衰老的不同细胞群的生长特征
Figure 904217DEST_PATH_IMAGE008
。
细胞在氧气减少的条件下扩增良好，但是在低氧条件下培养似乎对脐带组织来源细胞的细胞扩增没有显著影响。标准环境条件已证明可成功培养足够数量的细胞，对于脐带组织来源细胞的培养不需要低氧培养。
目前培养分离的脐带组织来源细胞的细胞扩增条件（以约5,000 个细胞/cm2的密度，在生长培养基中，在明胶包被的或未包被的培养瓶中，在标准环境氧气下）足够在第11代产生大量细胞。此外，这些数据提示使用低密度培养条件（例如1,000 个细胞/cm2）可容易地扩增细胞。在低氧条件下的脐带组织来源细胞的扩增也利于细胞扩增，尽管当在培养中使用这些条件时还没有观察到细胞扩增潜能的增加的改进。目前，优选在标准环境条件下培养脐带组织来源细胞以产生大量细胞（large pools of cells）。然而当改变培养条件时，同样可改变细胞扩增。此策略可用于增强这些细胞群的增殖和分化能力。
在使用的条件下，当MSC和脂肪来源细胞的扩增潜能受限时，脐带组织来源细胞容易地扩增至大量细胞。
参考
Hayflick, “The longevity of cultured human cells,” J Am Geriatr Soc., 1974; 22; 1-12。
Hayflick, “The strategy of senescence,” Gerontologist, 1974; 14(1); 37-45。
美国专利公开号20040058412。
美国专利公开号20040048372。
美国专利公开号20040005704。
实施例7
在包含D-缬氨酸的培养基中的细胞生长
在细胞疗法中使用的细胞系优选为同种的且不含任意污染的细胞类型。在细胞疗法中使用的人细胞应具有正常数目（46）和正常结构的染色体。为了鉴定脐带组织来源细胞系是同种的且不含非产后组织来源的细胞，分析了细胞样品的核型。
在明胶包被的T75培养瓶(Corning, Corning, NY)中以5,000个细胞/cm2接种脐来源细胞（P5）和成纤维细胞（P9）。24小时后去除培养基并用磷酸缓冲液(PBS) (Gibco, Carlsbad, CA)洗细胞以去除残留的培养基。用修饰的生长培养基（含D-缬氨酸的DMEM（从Gibco特别订货），15% (v/v) 透析的胎牛血清(Hyclone, Logan, UT), 0.001% (v/v) β-巯基乙醇(Sigma), 50单位/毫升的青霉素和50毫克/毫升的链霉素(Gibco)）替换培养基。
与在含有透析的血清的生长培养基中接种的细胞不同，在含有D-缬氨酸的培养基中接种的脐来源细胞和成纤维细胞没有增殖。成纤维细胞在形态学上改变，尺寸增加和形状改变。4周后所有细胞死亡并最终从培养瓶表面脱落。因此，可以推断脐带组织来源细胞需要L-缬氨酸用于细胞生长和维持长期活力。对于脐带组织来源细胞，优选地不从生长培养基中去除L-缬氨酸。
参考
Hongpaisan, “Inhibition of proliferation of contaminating fibroblasts by D-valine in cultures of smooth muscle cells from human myometrium,” Cell Biol Int., 2000; 24; 1-7。
Sordillo 等人, “Culture of bovine mammary epithelial cells in D-valine modified medium: selective removal of contaminating fibroblasts,” Cell Biol Int Rep., 1988; 12; 355-64。
实施例8
细胞的核型分析
在细胞疗法中使用的细胞系优选为同种的且不含任意污染的细胞类型。在细胞疗法中使用的人细胞应具有正常数目（46）和正常结构的染色体。为了鉴定脐带组织来源细胞系是同种的且不含非产后组织来源的细胞，分析了细胞样品的核型。
在生长培养基中培养来自男性新生儿组织的脐带组织来源细胞。选择来自男性新生儿（X，Y）的脐带组织以区分新生儿来源细胞和母体来源细胞（X，X）。在T25培养瓶(Corning, Corning, NY)中在生长培养基中以5,000个细胞/cm2接种细胞并扩增至80%汇合。在含有细胞的T25培养瓶中装满生长培养基至瓶颈。通过快递公司将样品递送至临床细胞遗传学实验室（估计从实验室至实验室的运输时间是1小时）。由New Jersey Medical School, Newark, NJ的人类和分子遗传学中心（Center for Human & Molecular Genetics）进行染色体分析。在最佳观察染色体的中期分析细胞。在计数的位于中期的20个细胞中，分析了5个细胞的正常同种核型数（2）。如果观察到2种核型则将细胞样品表征为同种的。如果观察到超过2种核型则将细胞样品表征为异种的。当鉴定出异种核型数（4）时计数和分析另外的中期细胞。
所有送去进行染色体分析的细胞样品被细胞遗传学实验室工作人员解读为展示正常的外观。在分析的16个细胞系中，3个展示了异种表型（XX和XY），表明存在来源于新生儿和母体来源二者的细胞（表8-1）。每种细胞样品都被表征为同种的（表8-1）。
表8-1. 脐带组织来源细胞的核型结果
Figure 635413DEST_PATH_IMAGE009
注释：N-新生儿侧；V-绒毛区；M-母体侧；C-克隆。
染色体分析鉴定出核型表现正常的脐来源细胞，如临床细胞遗传学实验室解读的。核型分析也鉴定出不含母体细胞的细胞系，因为经测定为同种核型。
实施例9
细胞表面标记的流式细胞术评估
通过流式细胞术表征细胞表面蛋白质或“标记”可用于测定细胞系的特性（identity）。可从多个供体和暴露于不同处理和培养条件下的细胞中测定表达的一致性。通过流式细胞术表征了从脐分离的细胞系，提供了鉴定这些细胞系的谱（profile）。
在血浆处理的T75、T150和T225组织培养瓶(Corning, Corning, NY)中在生长培养基中培养细胞直到汇合。通过与2% (w/v)明胶(Sigma, St. Louis, MO)在室温孵育20分钟用明胶包被培养瓶的生长表面。
在磷酸缓冲液(PBS)(Gibco, Carlsbad, MO)中洗培养瓶中的贴壁细胞并用胰蛋白酶/EDTA(Gibco)使其脱落。收获细胞，离心并在含3% (v/v) FBS的PBS中将细胞重悬至1x107/毫升的细胞浓度。依照制造商的说明书，向100微升细胞悬浮物中加入目的细胞表面标记的抗体（见下文）并将混合物在黑暗中于4℃孵育30分钟。孵育后，用PBS洗细胞并离心以去除未结合的抗体。在500微升PBS中重悬细胞并通过流式细胞术分析。
使用FACScalibur仪器(Becton Dickinson, San Jose, CA)进行流式细胞术分析。
使用了以下细胞表面标记的抗体。
表9-1：在表征UDC的细胞表面标记中使用的抗体。
抗体 制造商 货号
CD10 BD Pharmingen (San Diego, CA) 555375
CD13 BD Pharmingen (San Diego, CA) 555394
CD31 BD Pharmingen (San Diego, CA) 555446
CD34 BD Pharmingen (San Diego, CA) 555821
CD44 BD Pharmingen (San Diego, CA) 555478
CD45RA BD Pharmingen (San Diego, CA) 555489
CD73 BD Pharmingen (San Diego, CA) 550257
CD90 BD Pharmingen (San Diego, CA) 555596
CD117 BD Biosciences (San Jose, CA) 340529
CD141 BD Pharmingen (San Diego, CA) 559781
PDGFr-α BD Pharmingen (San Diego, CA) 556002
HLA-A、B、C BD Pharmingen (San Diego, CA) 555553
HLA-DR、DP、DQ BD Pharmingen (San Diego, CA) 555558
IgG-FITC Sigma (St. Louis, MO) F-6522
IgG- PE Sigma (St. Louis, MO) P-4685
在第8、15和20代分析了脐带细胞。
为了比较供体间的差别，互相比较了来自不同供体的脐带来源细胞。
比较了在明胶包被的培养瓶中培养的脐带来源细胞和在未包被的培养瓶中培养的脐带来源细胞。
比较了用于分离和制备细胞的4种处理。比较了使用1）胶原酶；2）胶原酶/分散酶；3）胶原酶/透明质酸酶；和4）胶原酶/透明质酸酶/分散酶处理的组织来源的细胞。
通过流式细胞术分析的第8、15和20代的脐带来源细胞都表达CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C，通过相对IgG对照的增加的荧光指示。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141、和HLA-DR、DP、DQ是阴性的，通过与IgG对照一致的荧光值指示。
通过流式细胞术分析的从单独的供体分离的脐带来源细胞各个显示了对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C产生的阳性，通过相对IgG对照的增加的荧光值反映。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ产生是阴性的，具有与IgG对照一致的荧光值。
通过流式细胞术分析的在明胶包被的和未包被的培养瓶中扩增的脐带来源细胞对于CD10、CD13、CD44、CD73、CD 90、PDGFr-α和HLA-A、B、C产生都是阳性的，相对IgG对照具有增加的荧光值。这些细胞对于CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ产生是阴性的，具有与IgG对照一致的荧光值。
通过流式细胞术分析脐带来源细胞已建立了这些细胞系的特性。脐带来源细胞为CD10、CD13、CD44、CD73、CD90、PDGFr-α、HLA-A、B、C阳性和CD31、CD34、CD45、CD117、CD141和HLA-DR、DP、DQ阴性。此特性在包括供体、传代、培养容器表面包被、消化酶和胎盘层的变量的变化中是一致的。观察到在个别荧光值直方图曲线平均值和范围中的某些变化，但在所有检测条件下的所有阳性曲线是正常的并表达高于IgG对照的荧光值，因此证明所述细胞包含具有所述标记阳性表达的同种群。
实施例10
通过寡核苷酸阵列分析细胞
使用寡核苷酸阵列比较脐和胎盘来源细胞与成纤维细胞、人间质干细胞和来源于人骨髓的另一种细胞系的基因表达谱。此分析提供了细胞的表征并鉴定了这些细胞的独特分子标记。
组织来源细胞。人脐带和胎盘从国家疾病研究交流所 (NDRI, Philadelphia, PA)获得，来自足月分娩并经患者同意。如实施例5中所描述的获得组织并分离细胞。在明胶包被的组织培养用塑料瓶中在生长培养基中培养细胞。在 37℃和5% CO2下孵育培养物。
成纤维细胞。人真皮成纤维细胞购自Cambrex Incorporated (Walkersville, MD;货号9F0844)和ATCC CRL-1501 (CCD39SK)。在含有10%(v/v)胎牛血清(Hyclone)和青霉素/链霉素 (Invitrogen)的DMEM/F12培养基(Invitrogen, Carlsbad, CA)中培养2种细胞系。在标准组织处理的塑料上培养细胞。
人间质干细胞 (hMSC)。hMSC购自Cambrex Incorporated (Walkersville, MD; 货号2F1655, 2F1656和2F1657)并在MSCGM 培养基(Cambrex)中根据制造商的说明书培养。在37℃和5% CO2下在标准组织培养用塑料上培养细胞。
人髂嵴骨髓细胞 (ICBM) 。人髂嵴骨髓从NDRI经患者同意获得。根据Ho等人 (WO03/025149)所概述的方法处理骨髓。以1份骨髓：20份裂解缓冲液的比例将骨髓和裂解缓冲液（155 mM NH4Cl、10 mM KHCO3和0.1 mM EDTA，pH 7.2）混合。涡旋细胞悬浮物，在环境温度下孵育2分钟，然后以500 x g离心10分钟。去除上清物并在补充10%(v/v)胎牛血清和4 mM谷氨酰胺的最低必需培养基-α(Invitrogen)中重悬细胞沉淀。再次离心细胞并在新鲜培养基中重悬细胞沉淀。使用台盼蓝排斥(Sigma, St. Louis, MO)计数活的单核细胞。在组织培养用塑料瓶中以5 x 104 个细胞/cm2接种单核细胞。在标准环境O2或在5% O2下于37 ℃和5% CO2下孵育细胞。不更换培养基培养细胞5天。培养5天后去除培养基和未贴壁的细胞。贴壁细胞被维持在培养中。
使用细胞刮刀在冷的磷酸缓冲液（PBS）中从培养瓶中去除活跃生长的细胞培养物。以300 x g离心细胞5分钟。去除上清物并在新鲜的PBS中重悬细胞，然后再次离心。去除上清物并立刻冷冻细胞沉淀，贮存于-80℃。提取细胞mRNA并转录为cDNA。然后将cDNA转录为cRNA并标记生物素。将生物素标记的cRNA与 Affymetrix GENECHIP HG-U133A寡核苷酸阵列(Affymetrix, Santa Clara, CA)杂交。根据制造商的说明书进行杂交和数据收集。根据制造商的说明书进行杂交和数据收集。使用“Significance Analysis of Microarrays” (SAM) 版本1.21 计算机软件(Tusher 等人, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 5116-5121)进行数据分析。
在此研究中分析了不同的细胞群。在表10-1中列出了细胞以及传代信息、培养基质（substrate）和培养基。
表10-1. 通过微阵列研究分析的细胞。列出了细胞系的鉴定码以及分析时的传代数、细胞生长基质和生长培养基。
Figure 628777DEST_PATH_IMAGE010
如上所述使用SAM软件通过主成分分析（Principle Component Analysis）评估了数据。分析显示在检测的细胞中以不同的相对量表达的290个基因。此分析提供了细胞群之间的相对比较。
表10-2显示了对于细胞对的比较而计算的欧式距离（Euclidean distance）。欧式距离是基于以在细胞类型中差异表达的290个基因为基础的细胞比较。欧式距离与290个基因表达之间的相似性成反比。
表10-2. 细胞对的欧式距离。
使用在细胞类型之间差异表达的290个基因计算了细胞类型的欧式距离。细胞之间的相似性和欧式距离成反比。
Figure 694691DEST_PATH_IMAGE011
表10-3、10-4和10-5显示了在脐组织来源细胞中增加的（表10-3）、在胎盘来源细胞中增加的（表10-4）和在脐带和胎盘来源细胞中减少的（表10-5）基因表达。
表10-4. 与测定的其他细胞系相比，在脐带来源细胞中表达特异性增加的基因。
Figure 431702DEST_PATH_IMAGE012
表10-3. 与测定的其他细胞系相比，在胎盘来源细胞中表达特异性增加的基因。
Figure 17404DEST_PATH_IMAGE013
表10-5. 与测定的其他细胞系相比，在脐带和胎盘细胞中表达降低的基因。
Figure 447249DEST_PATH_IMAGE014
表10-6、10-7和10-8显示了在人成纤维细胞（表10-6）、ICBM细胞（表10-7）和MSC（表10-8）中增加的基因表达。
表10-6. 与测定的其他细胞系相比在成纤维细胞中表达增加的基因。
在成纤维细胞中增加的基因
双特异性磷酸酶2
KIAA0527蛋白
智人cDNA: FLJ23224 fis，克隆ADSU02206
动力蛋白, 细胞质的, 中间多肽1
锚蛋白3, 郎飞氏结(锚蛋白G)
抑制素, βA (激活素A, 激活素AB α多肽)
核苷酸内焦磷酸酶/磷酸二酯酶 4 (推定的功能)
KIAA1053蛋白
微管相关蛋白1A
锌指蛋白41
HSPC019蛋白
智人cDNA: FLJ23564 fis，克隆LNG10773
智人mRNA；cDNA DKFZp564A072 (来自克隆DKFZp564A072)
LIM蛋白 (类似大鼠蛋白激酶C-结合enigma)
B细胞中κ轻链多肽基因增强子的抑制物, 激酶复合物相关蛋白
假定的蛋白质FLJ22004
人(克隆CTG-A4) mRNA序列
EST，与细胞因子受体样因子2中度类似；细胞因子受体CRL2前体[智人]
转化生长因子，β2
假定的蛋白质MGC29643
由单克隆抗体MRC OX-2鉴定的抗原
表10-7. 与测定的其他细胞系相比在ICBM来源细胞中表达增加的基因。
Figure 777047DEST_PATH_IMAGE016
表10-8. 与测定的其他细胞系相比在MSC细胞中表达增加的基因。
Figure 482835DEST_PATH_IMAGE017
进行本实施例以提供脐带和胎盘来源细胞的分子表征。此分析包括来源于3个不同脐带和3个不同胎盘的细胞。此研究也包括真皮成纤维细胞的2个不同细胞系，间质干细胞的3个不同细胞系和髂嵴骨髓细胞的3个不同细胞系。在包含针对22，000个基因的寡核苷酸探针的GENECHIP寡核苷酸阵列上分析了这些细胞表达的mRNA。
分析显示290个基因的转录物在这5种不同细胞类型中以不同量存在。这些基因包括7个在脐组织来源细胞中特异性增加的基因和10个在胎盘来源细胞中特异性增加的基因。发现54个基因在胎盘和脐带中具有特异性较低的表达水平。
通过PCR确认了选定基因的表达，如在实施例11中所显示。例如，与其他人细胞（例如这里检测的骨髓来源细胞和成纤维细胞）相比，细胞通常（特别是脐来源细胞）具有不同的基因表达谱。
实施例11
细胞标记
使用Affymetrix GENECHIP比较了来源于脐带的细胞和来源于其它来源的细胞的基因表达谱。鉴定了6个“标签”（“signature”）基因：氧化型LDL受体1，白细胞介素-8（IL-8），肾素，网状蛋白，趋化因子受体配体3（CXC配体3）和粒细胞趋化性蛋白2（GCP-2）。这些“标签”基因在脐来源细胞中以相对高的水平表达。
进行在此实施例中描述的程序以验证基因和蛋白质表达的微阵列数据和比较数据，以及建立一系列用于检测脐带组织来源细胞的独特识别标记（identifier）的可信测定。
在明胶包被的T75培养瓶中在生长培养基中培养脐来源细胞（4个分离株）和正常人真皮成纤维细胞（NHDF；新生儿和成人）。在间质干细胞生长培养基Bullet试剂盒（MSCGM; Cambrex, Walkerville, MD）中培养间质干细胞（MSC）。
用于IL-8实验，从液氮中解冻细胞并以5,000个细胞/cm2铺板至明胶包被的培养瓶，在生长培养基中培养48小时，然后在10毫升血清饥饿培养基[DMEM –低葡萄糖 (Gibco, Carlsbad, CA), 青霉素(50 单位/毫升), 链霉素(50微克/毫升)(Gibco)和0.1% (w/v)牛血清白蛋白(BSA; Sigma, St. Louis, MO)]中再培养8小时。然后提取RNA并以150 x g离心上清5分钟以去除细胞碎片。在-80℃冷冻上清直到ELISA分析。
在明胶包被的T75培养瓶中在生长培养基培养脐带来源细胞和来源于人新生儿包皮的人成纤维细胞。在第11代时在液氮中冷冻细胞。解冻细胞并转移至15毫升离心管。在以150 x g离心5分钟后，弃上清。在4毫升培养基中重悬细胞并计数。在含有15毫升生长培养基的75 cm2培养瓶中以375,000个细胞/培养瓶培养细胞24小时。将培养基更换为血清饥饿培养基培养8小时。在孵育结束时收集血清饥饿培养基，以14,000 x g离心5分钟（然后在-20℃贮存）。
为了估计在每个培养瓶中的细胞数，在每个培养瓶中加入2毫升胰蛋白酶/EDTA(Gibco, Carlsbad, CA)。在细胞从培养瓶上脱落后，用8毫升生长培养基中和胰蛋白酶活性。将细胞转移至15毫升离心管并以150 x g离心5分钟。移去上清物并对每个管加入1毫升生长培养基以重悬细胞。用血球计数器测定细胞数。
使用ELISA测定分析细胞分泌至血清饥饿培养基中的IL-8的量(R&D Systems, Minneapolis, MN)。所有测定根据制造商提供的说明书进行。
从汇合的脐带来源细胞和成纤维细胞中提取RNA，或用于IL-8表达，从如上述处理的细胞中提取RNA。根据制造商的说明书（RNeasy Mini Kit; Qiagen, Valencia, CA）用350微升含β-巯基乙醇(Sigma, St. Louis, MO)的RLT缓冲液裂解细胞。根据制造商的说明书（RNeasy Mini Kit; Qiagen, Valencia, CA）提取RNA并进行DNA酶处理（2.7单位/样品）(Sigma St. Louis, MO)。用50微升DEPC处理的水洗脱RNA并贮存于-80℃。也从人脐带中提取RNA。在700微升含β-巯基乙醇的RLT缓冲液中悬浮组织（30毫克）。机械地均质化样品并根据制造商的说明书进行RNA提取。用50微升DEPC处理的水提取RNA并贮存于-80℃。
使用随机六聚体和TaqMan逆转录试剂(Applied Biosystems, Foster City, CA)在25℃ 10分钟，37℃ 60分钟和95℃10分钟下逆转录RNA。样品贮存于-20℃。
使用实时和常规PCR进一步研究了由cDNA微阵列鉴定为在脐带细胞中被独特调控的基因（标签基因——包括氧化型LDL受体、白细胞介素-8、肾素和网状蛋白）。
使用以商品名ASSAYS-ON-DEMAND (Applied Biosystems)基因表达产品出售的基因表达产品在cDNA样品上进行PCR。根据制造商的说明书(Applied Biosystems)，使用具有ABI Prism 7000 SDS软件的7000序列检测系统(Applied Biosystems)将氧化型LDL受体(Hs00234028)、肾素(Hs00166915)、网状蛋白(Hs00382515)、CXC配体3 (Hs00171061)、GCP-2 (Hs00605742)、IL-8 (Hs00174103)和GAPDH与cDNA和TaqMan Universal PCR master mix混合。热循环条件为开始50℃ 2分钟和95℃ 10 分钟, 然后40个循环的95℃15秒和60℃ 1分钟。根据制造商的说明书（来自Applied Biosystems的用于ABI Prism 7700序列检测系统的用户公告#2）分析PCR数据。
使用ABI PRISM 7700 (Perkin Elmer Applied Biosystems, Boston, MA)进行常规PCR以确认来自实时PCR的结果。使用2微升cDNA 溶液(1× Taq聚合酶 (商品名AMPLITAQ GOLD) 通用混合PCR 反应缓冲液(Applied Biosystems)进行PCR并在94℃ 5分钟下进行最初变性。对每个引物组优化了扩增。对IL-8、CXC配体3和网状蛋白（94℃ 15秒, 55℃ 15秒和72℃ 30秒进行30个循环）；对肾素（94℃ 15秒, 53℃ 15秒和72℃ 30秒进行38个循环）；对氧化型LDL受体和GAPDH (94℃ 15秒, 55℃ 15秒和72℃ 30秒进行33个循环)。用于扩增的引物列于表11-1，在最终PCR反应中的引物浓度是1微摩尔，除了对GAPDH是0.5微摩尔以外。GAPDH引物和用于实时PCR的相同，除了没有向最终PCR反应加入制造商的TaqMan探针以外。在2% (w/v)琼脂糖凝胶上分离样品并用溴化乙锭(Sigma, St. Louis, MO)染色。使用固定焦距的POLAROID相机(VWR International, South Plainfield, NJ)在667胶片(Universal Twinpack, VWR International, South Plainfield, NJ)上获取图像。
表11-1：使用的引物。
Figure 818001DEST_PATH_IMAGE018
用冷的4% (w/v)多聚甲醛(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)在室温固定脐带来源细胞10分钟。使用第0代（P0）（分离后直接使用）和第11代（P11）脐带来源细胞（2个脐带来源细胞的分离株）和成纤维细胞（P11）的各一个分离株。使用针对以下表位的抗体进行免疫细胞化学：波形蛋白(1:500, Sigma, St. Louis, MO), 结蛋白(1:150; Sigma - 针对兔产生; 或1:300; Chemicon, Temecula, CA – 针对小鼠产生), α-平滑肌肌动蛋白(SMA; 1:400; Sigma), 细胞角蛋白18 (CK18; 1:400; Sigma), von Willebrand因子(vWF; 1:200; Sigma)和CD34 (人CD34 III类; 1:100; DAKOCytomation, Carpinteria, CA)。此外，在第11代脐带来源细胞上检测了以下标记：抗人GROα - PE (1:100; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), 抗人GCP-2 (1:100; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), 抗人氧化型LDL受体1 (ox-LDL R1; 1:100; Santa Cruz Biotech)和抗人NOGA-A (1:100; Santa Cruz, Biotech)。
用磷酸缓冲液（PBS）洗培养物并将其暴露在含有PBS，4% (v/v)山羊血清(Chemicon, Temecula, CA)和0.3% (v/v) Triton (Triton X-100; Sigma, St. Louis, MO)的蛋白质封闭液中30分钟以接近细胞内抗原。在目的表位位于细胞表面的情况下（CD34, ox-LDL R1），在程序的所有步骤中省去Triton X-100以避免表位丢失。此外，在一抗是针对山羊产生的情况下(GCP-2, ox-LDL R1, NOGO-A)，在整个过程中使用3% (v/v)驴血清替换山羊血清。然后对培养物应用在封闭液中稀释的一抗，在室温进行1小时的时间。去除一抗溶液并用PBS洗培养物，之后应用含有封闭液和山羊抗小鼠IgG-Texas Red (1:250; Molecular Probes, Eugene, OR)和/或山羊抗兔IgG - Alexa 488 (1:250; Molecular Probes)或驴抗山羊IgG – FITC (1:150, Santa Cruz Biotech)的二抗溶液（室温1小时）。然后洗培养物并应用10微摩尔DAPI(Molecular Probes)10分钟以显现细胞核。
在免疫染色后，在Olympus倒置落射荧光显微镜(Olympus, Melville, NY)上使用合适荧光过滤器显现荧光。在所有情况中，以超过对照染色的荧光信号代表阳性染色，在对照染色中除了不使用一抗溶液以外遵照上面概述的全过程（无1°对照）。使用数字彩色摄像机和ImagePro 软件(Media Cybernetics, Carlsbad, CA)获取代表性图像。对三重染色的样品，一次仅使用1个发射过滤器获得每个图像。然后使用Adobe Photoshop软件(Adobe, San Jose, CA)制作分层的拼合照片（montage）。
在磷酸缓冲液（PBS） (Gibco, Carlsbad, CA)中洗培养瓶中的贴壁细胞并用胰蛋白酶/EDTA(Gibco, Carlsbad, CA)使其脱落。收获、离心细胞，然后以1x107/毫升的细胞浓度在3% (v/v) FBS的PBS中重悬。将100微升等分试样转移至锥形管。用Perm/Wash缓冲液(BD Pharmingen, San Diego, CA)透化已对细胞内抗原染色的细胞。按照制造商的说明书向等分试样中加入抗体，在黑暗中于4℃孵育细胞30分钟。孵育后，用PBS洗细胞并离心以去除过量的抗体。在100微升3%FBS中重悬需要二抗的细胞。按照制造商的说明书加入二抗，在黑暗中于4℃孵育细胞30分钟。孵育后，用PBS洗细胞并离心以去除过量的二抗。在0.5毫升PBS中重悬洗过的细胞并通过流式细胞术分析。使用以下抗体：氧化型LDL受体1(sc-5813; Santa Cruz, Biotech), GROa (555042; BD Pharmingen, Bedford, MA), 小鼠IgG1κ (P-4685和M-5284; Sigma)和驴抗山羊IgG (sc-3743; Santa Cruz, Biotech.)。使用FACScalibur (Becton Dickinson San Jose, CA)进行流式细胞术分析。
在来自人脐带来源细胞、成人和新生儿成纤维细胞和间质干细胞（MSC）的cDNA上对选定的“标签”基因进行的实时PCR结果表明与其他细胞相比，在脐来源细胞中网状蛋白和氧化型LDL受体的表达均更高。通过ΔΔCT法分析了从实时PCR得到的数据并表示为对数标度。在细胞和对照之间未发现CXC配体3和GCP-2表达水平的显著差异。通过常规PCR确认了实时PCR的结果。对PCR产物的测序进一步验证了这些观察结果。使用在表11-1中所列的常规PCR CXC配体3引物，在细胞和对照之间未发现CXC配体3表达水平的显著差异。
在生长培养基中培养的和血清饥饿培养基中培养的脐带来源细胞中，脐带细胞中的细胞因子IL-8的表达均提高。使用常规PCR和通过测序PCR产物验证了所有实时PCR数据。
在无血清培养基中培养后，检查了条件培养基中的IL-8的存在。在培养过脐细胞的培养基中检测到最大量的IL-8（表11-2）。在培养过人真皮成纤维细胞的培养基中没有检测到IL-8。
表11-2：通过ELISA测量的IL-8蛋白表达
Figure 858507DEST_PATH_IMAGE019
ND：未检测到。
通过免疫细胞化学分析就分泌蛋白质的产生探测了第0代来源于人脐带的细胞。在分离后立刻（第0代）将细胞用4%多聚甲醛固定并暴露于下述6种蛋白质的抗体：von Willebrand因子，CD34，细胞角蛋白18，结蛋白，α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白。脐带来源细胞对α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白为阳性，直到第11代具有一致的染色模式。
通过免疫细胞化学研究了第11代脐带来源细胞中GROα、GCP-2、氧化型LDL受体1和网状蛋白(NOGO-A)的产生。脐带来源细胞是GCP-2阳性的，但使用此方法没有检测到GROα的产生。此外，细胞是NOGO-A阳性的。
对4种基因：氧化型LDL受体1、肾素、网状蛋白和IL-8已建立了通过微阵列和PCR（实时和常规两种）测量的基因表达水平之间的一致性。这些基因的表达在脐带来源细胞中在mRNA水平上被差异调控，IL-8也在蛋白质水平上被差异调控。没有证实GCP-2和CXC配体3在mRNA水平上的差异表达。尽管此结果不支持最初从微阵列实验中得到的数据，但这可能是由于方法灵敏度的差异。
就α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白的表达探测了第0代来源于人脐带的细胞并且两种蛋白均为阳性。染色模式保持到第11代。
总之，完整的mRNA数据至少部分验证了从微阵列实验得到的数据。
实施例12
细胞表型的免疫组化表征
通过免疫组化分析了在人脐带中发现的细胞的表型。
收获人脐带组织并在4% (w/v)多聚甲醛中于4℃浸没固定过夜。使用针对以下表位的抗体（见表12-1）进行免疫组化：波形蛋白(1:500; Sigma, St. Louis, MO)，结蛋白(1:150, 针对兔产生; Sigma; 或1:300, 针对小鼠产生; Chemicon, Temecula, CA)，α-平滑肌肌动蛋白(SMA; 1:400; Sigma)，细胞角蛋白18 (CK18; 1:400; Sigma), von Willebrand 因子(vWF; 1:200; Sigma)和CD34 (人CD34 III类; 1:100; DAKOCytomation, Carpinteria, CA)。此外，检测了以下标记：抗人GROα-PE (1:100; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), 抗人GCP-2 (1:100; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), 抗人氧化型LDL受体1 (ox-LDL R1; 1:100; Santa Cruz Biotech)和抗人NOGO-A (1:100; Santa Cruz Biotech)。用解剖刀修整固定的标本并在含有乙醇的干冰浴上将其置于OCT包埋化合物(Tissue-Tek OCT; Sakura, Torrance, CA)中。然后使用标准低温恒温箱(Leica Microsystems)将冷冻块切片（10微米厚）并置于载玻片上用于染色。
与以前的研究类似进行免疫组化（例如Messina, 等人 (2003) Exper. Neurol. 184: 816-829）。用磷酸缓冲液（PBS）洗组织切片并将其暴露在含有PBS、4% (v/v)山羊血清(Chemicon, Temecula, CA)和0.3% (v/v) Triton (Triton X-100; Sigma, St. Louis, MO)的蛋白质封闭液中1小时以接近细胞内抗原。在目的表位位于细胞表面的情况下（CD34, ox-LDL R1），在程序的所有步骤中省去triton以避免表位丢失。此外，在一抗是针对山羊产生的情况下(GCP-2、ox-LDL R1、NOGO-A)，在整个过程中使用3% (v/v)驴血清替换山羊血清。然后对切片应用在封闭液中稀释的一抗，在室温进行4小时的时间。去除一抗溶液并用PBS洗培养物，之后应用含有封闭液和山羊抗小鼠IgG-Texas Red (1:250; Molecular Probes, Eugene, OR)和/或山羊抗兔IgG - Alexa 488 (1:250; Molecular Probes)或驴抗山羊IgG – FITC (1:150, Santa Cruz Biotech)的二抗溶液（室温1小时）。洗培养物并应用10微摩尔DAPI(Molecular Probes)10分钟以显现细胞核。
在免疫染色后，在Olympus倒置落射荧光显微镜(Olympus, Melville, NY)上使用合适荧光过滤器显现荧光。以超过对照染色的荧光信号代表阳性染色。使用数字彩色摄像机和ImagePro 软件(Media Cybernetics, Carlsbad, CA)获取代表性图像。对三重染色的样品，一次仅使用1个发射过滤器获得每个图像。然后使用Adobe Photoshop软件(Adobe, San Jose, CA)制作分层的拼合照片。
表12-1：使用的一抗总结。
Figure 937322DEST_PATH_IMAGE020
在脐带中发现的细胞亚群表达波形蛋白、结蛋白、SMA、CK18、vWF和CD34标记（数据未显示）。特别地，vWF和CD34表达局限在脐带中包含的血管中。CD34+细胞在最内层（内腔侧）。发现波形蛋白的表达遍及脐带的基质和血管。SMA局限在动脉和静脉的基质和外壁，但在血管本身中不包含。仅在血管中观察到CK18和结蛋白，结蛋白局限在中层和外层。
在人脐带内的细胞表达波形蛋白、结蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、细胞角蛋白18、von Willebrand因子和CD34。基于体外表征研究显示仅表达波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白，此数据提示目前的脐带来源细胞分离的过程收获了一种细胞亚群或分离的细胞将标记表达改变为表达波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白。
实施例13
营养因子的分泌
测量了来自脐来源细胞的选定的营养因子的分泌。选择具有血管生成活性（即肝细胞生长因子(HGF) (Rosen 等人 (1997) Ciba Found. Symp. 212:215-26)、单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1) (Salcedo 等人 (2000) Blood 96;34-40)、白细胞介素-8 (IL-8) ( Li 等人 (2003) J. Immunol. 170:3369-76)、角质形成细胞生长因子(KGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF) (Hughes 等人 (2004) Ann. Thorac. Surg. 77:812-8)、基质金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)、血管生成素2 (ANG2)、血小板来源生长因子(PDGFbb)、促血小板生成素(TPO)、肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)、基质来源因子1α (SDF-1α))，神经营养/神经保护活性(脑源性神经营养因子(BDNF) (Cheng 等人 (2003) Dev. Biol. 258;319-33)、白细胞介素-6 (IL-6)、粒细胞趋化蛋白-2 (GCP-2)、转化生长因子β2 (TGFβ2))，或趋化因子活性(巨噬细胞炎性蛋白1α (MI第1代α)、巨噬细胞炎性蛋白1β (MI第1代β)、单核细胞化学引诱物-1 (MCP-1)、Rantes (激活后调节、正常T 细胞表达和分泌)、I309、胸腺和激活调节的趋化因子(TARC)、 Eotaxin、巨噬细胞来源的趋化因子(MDC)、IL-8)的因子。
在明胶包被的T75培养瓶中在生长培养基中培养脐带来源细胞和来源于人新生儿包皮的人成纤维细胞。在第11代时低温贮藏细胞并贮存于液氮中。解冻后，向细胞中加入生长培养基，然后转移至15毫升离心管，并以150 x g离心细胞5分钟。在4毫升培养基中重悬细胞沉淀并对细胞计数。在含有15毫升生长培养基的75 cm2培养瓶中以5,000个细胞/cm2接种细胞并培养24小时。将培养基更换为无血清培养基（DMEM-低葡萄糖(Gibco)、0.1% (w/v)牛血清白蛋白(Sigma)、青霉素(50 单位/毫升）和链霉素(50 毫克/毫升，Gibco）)培养8小时。在孵育结束时，通过14,000 x g离心5分钟收集无血清条件培养基，然后在-20℃贮存。
为了估计每个培养瓶中的细胞数，用磷酸缓冲液（PBS）洗细胞并使用2毫升胰蛋白酶/EDTA(Gibco)使细胞脱落。通过加入8毫升生长培养基抑制胰蛋白酶活性。以150 x g离心细胞5分钟。移去上清物并在1毫升生长培养基中重悬细胞。用血球计数器估计细胞数。
在37℃、5% CO2和环境氧气下培养细胞。通过ELISA(R&D Systems, Minneapolis, MN)测定每个细胞样品产生的MCP-1、IL-6、VEGF、SDF-1α、GCP-2 、IL-8和TGF-β2的量。所有测定根据制造商的说明书进行。数值表示为皮克/毫升/百万个细胞(n=2，标准误)。
使用SearchLight蛋白质组阵列(Pierce Biotechnology Inc.)测量了趋化因子(MIP1α、MIP1β、MCP-1、Rantes、I309、TARC、Eotaxin、MDC、IL8)、BDNF和血管生成因子(HGF、KGF、bFGF、VEGF、TIMP1、ANG2、PDGFbb、TPO、HB-EGF)。蛋白质组阵列是用于定量测量每孔2至16种蛋白质的多重夹心ELISA。通过将4至16种不同的捕获抗体以2 x 2, 3 x 3或4 x 4的模式点样至96孔板的每个孔中产生阵列。在夹心ELISA程序进行后，显像整块板以获取在板的每个孔中每个点产生的化学发光信号。在每个点上产生的信号和原始标准品或样品中的靶蛋白量成比例。
脐来源细胞和真皮成纤维细胞分泌MCP-1和IL-6（表13-1）。成纤维细胞分泌SDF-1α和GCP-2。脐来源细胞分泌GCP-2和IL-8。通过ELISA在2种细胞类型中都没检测到TGF-β2。
表13-1. ELISA结果：营养因子的检测
MCP-1 IL-6 VEGF SDF-1α GCP-2 IL-8 TGF-β2
成纤维细胞 17+1 61+3 29+2 19+1 21+1 ND ND
脐(022803) 1150+74 4234+289 ND ND 160+11 2058+145 ND
脐(071003) 2794+84 1356+43 ND ND 2184+98 2369+23 ND
注释：ND：未检测到，=/- 标准误。
SearchLight多重ELISA测定。从细胞中分泌了TIMP1、TPO、KGF、HGF、FGF、HBEGF、BDNF、MIP1β、MCP1、RANTES、I309、TARC、MDC和IL-8（表13-2和13-3）。未检测到Ang2、VEGF或PDGFbb。
表13-2. SearchLight多重ELISA测定结果
TIMP1 ANG2 PDGFbb TPO KGF HGF FGF VEGF HBEGF BDNF
hFB 19306.3 ND ND 230.5 5.0 ND ND 27.9 1.3 ND
U1 57718.4 ND ND 1240.0 5.8 559.3 148.7 ND 9.3 165.7
U3 21850.0 ND ND 1134.5 9.0 195.6 30.8 ND 5.4 388.6
注释：hFB (人成纤维细胞)，U1 (脐来源(022803))，U3 (脐来源(071003))
ND：未检测到。
表13-3. SearchLight多重ELISA测定结果
MIP1a MIP1b MCP1 RANTES I309 TARC Eotaxin MDC IL8
hFB ND ND 39.6 ND ND 0.1 ND ND 204.9
U1 ND 8.0 1694.2 ND 22.4 37.6 ND 18.9 51930.1
U3 ND 5.2 2018.7 41.5 11.6 21.4 ND 4.8 10515.9
注释：hFB (人成纤维细胞)，U1 (脐来源(022803))，U3 (脐来源(071003))
ND：未检测到。
脐来源细胞分泌大量营养因子。这些营养因子中的一些例如HGF、bFGF、MCP-1和IL-8在血管生成中发挥重要作用。其他营养因子例如BDNF和IL-6在神经再生或保护中具有重要作用。
实施例14
体外免疫学
体外评估了脐带细胞系的免疫学特征以预测这些细胞在体内移植后将引发的免疫学应答（如果有的话）。通过流式细胞术测定了脐带细胞系的HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ、CD80、CD86和B7-H2的表达。这些蛋白质由抗原呈递细胞（APC）表达并且是幼稚CD4+ T细胞的直接刺激所必需的(Abbas & Lichtman, Cellular and Molecular Immunology, 第五版(2003) Saunders, Philadelphia, 第171页)。通过流式细胞术也分析了细胞系的HLA-G(Abbas & Lichtman, Cellular and Molecular Immunology, 第五版(2003) Saunders, Philadelphia, 第171页)、CD178 (Coumans等人, (1999) Journal of Immunological Methods 224, 185-196)和PD-L2 (Abbas & Lichtman, Cellular and Molecular Immunology, 第五版(2003) Saunders, Philadelphia, 第171页; Brown等人 (2003) The Journal of Immunology 170, 1257-1266)的表达。由胎盘组织中存在的细胞表达这些蛋白质被认为介导胎盘组织在子宫内的免疫豁免状态。为了预测脐来源细胞系在体内引发免疫应答的程度，在单向混合淋巴细胞反应(MLR)中检测了细胞系。
在用2%明胶(Sigma, St. Louis, MO)包被的T75培养瓶(Corning, Corning, NY)中在生长培养基（DMEM-低葡萄糖(Gibco, Carlsbad, CA)、15% (v/v)胎牛血清(FBS) (Hyclone, Logan, UT)、0.001% (v/v) β-巯基乙醇(Sigma, St. Louis, MO)、50单位/毫升青霉素、50 微克/毫升链霉素(Gibco, Carlsbad, CA)）中培养细胞直到汇合。
在磷酸缓冲液(PBS) (Gibco, Carlsbad, CA)中洗细胞并用胰蛋白酶/EDTA (Gibco, Carlsbad, CA)使其脱落。收获细胞，离心并在3% (v/v) FBS的PBS中以1x107/毫升的细胞浓度重悬细胞。根据制造商的说明书向100微升细胞悬浮物中加入抗体（表14-1）并在黑暗中于4℃孵育30分钟。孵育后，用PBS洗细胞并离心以去除未结合的抗体。在500微升PBS中重悬细胞并使用FACSCalibur仪器(Becton Dickinson, San Jose, CA)通过流式细胞术分析。
表14-1. 抗体。
抗体 制造商 货号
HLA-DRDPDQ BD Pharmingen (San Diego, CA) 555558
CD80 BD Pharmingen (San Diego, CA) 557227
CD86 BD Pharmingen (San Diego, CA) 555665
B7-H2 BD Pharmingen (San Diego, CA) 552502
HLA-G Abcam (Cambridgeshire, UK) ab 7904-100
CD 178 Santa Cruz (San Cruz, CA) sc-19681
PD-L2 BD Pharmingen (San Diego, CA) 557846
小鼠IgG2a Sigma (St. Louis, MO) F-6522
小鼠IgG1κ Sigma (St. Louis, MO) P-4685
将第10代脐带来源细胞的低温保藏小瓶（标记为细胞系A）在干冰上送至CTBR (Senneville, Quebec)以使用CTBR SOP号CAC-031进行混合淋巴细胞反应。从多位男性和女性志愿提供者（收集外周血单核细胞（PBMC）。用丝裂霉素C处理刺激物（供者，donor）同种异体PBMC、自体PBMC和细胞系。向应答者（受者，receiver）PBMC中加入自体和丝裂霉素C处理的刺激物细胞并培养4天。培养后，对每个样品加入[3H]胸苷并培养18小时。收获细胞后，提取放射性标记的DNA，使用闪烁计数器测量[3H]胸苷的加入。
以受者+丝裂霉素C处理的同种异体供者的平均增殖除以受者细胞的基础增殖计算同种异体供者细胞的刺激指数（SIAD）。以受者细胞+丝裂霉素C处理的细胞系的平均增殖除以受者细胞的基础增殖计算脐带来源细胞的刺激指数。
筛选了6位人志愿血液供者以鉴定在混合淋巴反应中与其他5位血液供者展示强烈增殖反应的1位同种异体供者。将此供者选为同种异体阳性对照供者。将其余5位血液供者选为受者。用丝裂霉素C处理同种异体阳性对照供者细胞和脐带来源细胞系并与5位单独的同种异体受者的细胞在混合淋巴反应中培养。一式三份进行反应，使用2块细胞培养板，每块板上3位受者（表14-2）。平均刺激指数范围从6.5（板1）至9（板2）并且同种异体供者阳性对照的范围从42.75（板1）至70（板2）（表14-3）。
表14-2. 混合淋巴细胞反应数据——细胞系A（脐带）
增殖测定的DPM
Figure 497616DEST_PATH_IMAGE021
Figure 269263DEST_PATH_IMAGE023
。
表14-3. 脐带来源细胞和同种异体供者细胞在混合淋巴反应中与5种单独的同种异体受者细胞的平均刺激指数。
受者 脐带
板1 (受者1-4) 42.75 6.5
板2 (受者5) 70 9
通过流式细胞术分析的脐带来源细胞的直方图显示HLA-DR、DP、DQ、CD80、CD86和B7-H2的阴性表达（如与IgG对照一致的荧光值所示），其表明脐带来源细胞系缺乏直接刺激同种异体PBMC（例如CD4+ T细胞）所需的细胞表面分子。
通过流式细胞术分析的脐带来源细胞的直方图显示PD-L2的阳性表达（如相对IgG对照增加的荧光值所示）以及CD178和HLA-G的阴性表达（如与IgG对照一致的荧光值所示）。
在使用脐带来源细胞系进行的混合淋巴细胞反应中，平均刺激指数范围从6.5至9，而同种异体阳性对照的平均刺激指数范围从42.75至70。如流式细胞术所测量的，脐带来源细胞系对刺激性蛋白质HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ、CD80、CD86和B7-H2的表达呈阴性。如流式细胞术所测量的，脐带来源细胞对免疫调节蛋白HLA-G和CD178的表达呈阴性和对PD-L2的表达呈阳性。同种异体供者PBMC含有表达HLA-DP、DR、DQ、CD80、CD86和B7-H2的抗原呈递细胞，因此能够刺激同种异体PBMC（例如幼稚CD4+ T细胞）。脐带来源细胞缺乏直接刺激同种异体PBMC（例如幼稚CD4+ T细胞）所需的抗原呈递细胞表面分子，存在免疫调节蛋白PD-L2，这可能解释了在MLR中与同种异体对照细胞相比，这些细胞展示的低刺激指数。
参考
Bruder 等人 USP 6,355,239 B1 (2002)。
Abbas 等人, Cellular and Molecular Immunology, 5th Ed. (2003) Saunders, Philadelphia, p. 171。
Bouteiller 等人, Placenta, 2003; 24:S10-S15。
Coumans 等人, Journal of Immunological Methods, 1999; 224:185-196。
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序列表
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<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 1
gagaaatcca aagagcaaat gg 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 2
agaatggaaa actggaatag g 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 3
tcttcgatgc ttcggattcc 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 4
gaattctcgg aatctctgtt g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 5
ttacaagcag tgcagaaaac c 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 6
agtaaacatt gaaaccacag cc 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 7
tctgcagctc tgtgtgaagg 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 8
cttcaaaaac ttctccacaa cc 22
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 9
cccacgccac gctctcc 17
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成引物
<400> 10
tcctgtcagt tggtgctcc 19

Claims (40)

1. 一种制备条件培养基的方法，所述方法包括：
在培养基中接种哺乳动物脐带组织来源细胞（UTC）；
减少所述培养基的血清含量；
将所述UTC从所述培养基转移至无血清基础培养基；
在所述无血清基础培养基中培养所述UTC；和
从所述无血清基础培养基中分离所述UTC，留下条件培养基。
2. 权利要求1的方法，其中所述UTC在所述无血清基础培养基中培养至多24小时。
3. 权利要求1的方法，其中过滤所述条件培养基。
4. 权利要求3的方法，其中使用大约22微米的滤器过滤所述条件培养基。
5. 权利要求1的方法，其中浓缩所述条件培养基。
6. 权利要求5的方法，其中使用截留膜浓缩所述条件培养基。
7. 权利要求6的方法，其中所述截留膜是大约5kDa截留膜。
8. 权利要求1的方法，其中所述减少血清含量包括使所述UTC脱离所述培养基。
9. 权利要求8的方法，其中所述脱离包括以增量减少所述培养基中的血清含量。
10. 权利要求9的方法，其中所述血清含量以约5%至约60%的增量减少。
11. 权利要求9的方法，其中所述血清含量以约50%的增量减少。
12. 权利要求9的方法，其中所述UTC在每个增量中生长约1至3代。
13. 权利要求12的方法，其中所述UTC在每个增量中生长约2代。
14. 权利要求1的方法，其中所述培养基是静置培养基。
15. 权利要求1的方法，其中所述培养基是微载体珠培养基。
16. 权利要求1的方法，其进一步包括在标准培养基中初步培养所述UTC并在接种前从所述标准培养基中分离所述UTC。
17. 权利要求1的方法，其中所述UTC是人脐带组织来源细胞。
18. 一种制备条件培养基的方法，所述方法包括：
在培养基中提供分离的哺乳动物脐组织来源细胞（UTC）；
在一个或多个递增步骤中减少所述培养基的血清含量；
当所述血清含量达到预定水平时将所述UTC从血清含量减少的培养基转移至无血清基础培养基；
在所述无血清基础培养基中培养所述UTC不超过24小时；和
从所述无血清基础培养基中分离所述UTC，留下条件培养基。
19. 权利要求18的方法，其中所述转移包括使所述UTC脱离所述培养基。
20. 权利要求18的方法，其中所述转移包括用所述无血清基础培养基替换所述血清减少的培养基。
21. 权利要求18的方法，其还包括过滤所述条件培养基。
22. 权利要求18的方法，其还包括浓缩所述条件培养基。
23. 权利要求18的方法，其中所述UTC是人脐带组织来源细胞。
24. 一种通过在培养基中接种人脐组织来源细胞（UTC）产生的条件培养基，其中在将所述UTC转移至无血清基础培养基之前减少所述培养基的血清含量，和其中然后从所述无血清基础培养基中分离所述UTC，留下条件培养基。
25. 权利要求24的条件培养基，其中所述UTC在所述无血清基础培养基中培养至多24小时。
26. 权利要求24的条件培养基，其中过滤所述条件培养基。
27. 权利要求26的条件培养基，其中使用大约22微米的滤器过滤所述条件培养基。
28. 权利要求24的条件培养基，其中浓缩所述条件培养基。
29. 权利要求28的条件培养基，其中使用截留膜浓缩所述条件培养基。
30. 权利要求29的条件培养基，其中所述截留膜是大约5kDa截留膜。
31. 权利要求24的条件培养基，其中减少血清含量包括使所述UTC脱离所述培养基。
32. 权利要求31的条件培养基，其中所述脱离包括以增量减少所述培养基中的血清含量。
33. 权利要求32的条件培养基，其中所述血清含量以约5%至约60%的增量减少。
34. 权利要求33的条件培养基，其中所述血清含量以约50%的增量减少。
35. 权利要求32的条件培养基，其中所述UTC在每个增量中生长约1至3代。
36. 权利要求35的条件培养基，其中所述UTC在每个增量中生长约2代。
37. 权利要求24的条件培养基，其中所述培养基是静置培养基。
38. 权利要求24的条件培养基，其中所述培养基是微载体珠培养基。
39. 权利要求24的条件培养基，其进一步包括在标准培养基中初步培养所述UTC以及在接种前从所述标准培养基中分离所述UTC。
40. 权利要求24的条件培养基，其中所述UTC是人脐带组织来源细胞。
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