JP5791111B2 - 馴化培地、および馴化培地を作る方法 - Google Patents

Description

開示の内容

〔関連出願への相互参照〕
本出願は、２００４年６月２５日出願の米国仮特許出願第１０／８７７，０１２号、；２００４年６月２５日出願の米国仮特許出願第１０／８７７，４４６号；および２００７年１１月１３日出願の米国非特許出願第１１／９３９，３６０号を参照により組み込む。これらの出願の内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。

〔発明の分野〕
本発明は、馴化培地、およびそれを作る方法の分野に関する。具体的には、本発明は、分娩後由来細胞および臍組織由来細胞からの血清減少馴化培地に関する。

〔発明の背景〕
様々な疾患における療法の形態として、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）使用の可能性が、広く研究されてきた。しかしながら、ＭＳＣの有益な特性がパラクリン効果を通じてもたらされ得ることを示唆する証拠が増えている。ＭＳＣが培養された培地は、細胞が分泌する栄養因子およびサイトカインで強化されていることが分かっている。これにより、心臓、肺および腎臓傷害ならびに多くのほかの傷害の様々な疾患モデルにおいて培養ＭＳＣにより馴化された培地を利用する多くの研究が行われている。

分娩後由来細胞（ＰＰＤＣ）、および臍帯組織由来細胞（ＵＴＣ）は、ＭＳＣのように、かなりの量の栄養因子およびサイトカインを分泌することが分かった。したがって、安定した測定可能なプロセスが、ＰＰＤＣ−およびＵＴＣ−馴化培地の製造に必要である。

〔発明の概要〕
特定の実施形態では、馴化培地を準備する方法は、ＵＴＣを培養培地に播種すること；培養培地の血清含量を減らすこと；培養培地から無血清基本培地にＵＴＣを移すこと；無血清基本培地でＵＴＣを成長させること；および、無血清基本培地からＵＴＣを単離し馴化培地を残すことを含む。

ある実施形態では、ＵＴＣは最大２４時間、無血清基本培地で成長する。他の実施形態では、馴化培地は、約２２μｍ（約２２ミクロン）のフィルターを使用することなどにより、ろ過される。ある実施形態では、馴化培地は、カットオフ膜などで濃縮される。一例は、約８．３×１０^−２１ｇ（約５ｋＤａ）のカットオフ膜である。

他の実施形態では、血清含量を減らすことは、ＵＴＣを培養培地から離すことを含む。他の実施形態では、離すこと（ｗｅａｎｉｎｇ）は、徐々に、例えば、約５％〜約６０％の増分および／または約５０％の増分で、培養培地の血清含量を減らすことを含む。ある実施形態では、ＵＴＣは、各増分で約１〜３継代、または各増分で約２継代成長する。他の実施形態では、培養培地は、静置培養またはマイクロキャリアビーズ培養であってよい。ある実施形態は、標準培養培地でＵＴＣを予備的に培養することと、播種前に標準培養培地からＵＴＣを単離することと、を含んでよい。

方法のいくつかの実施形態では、馴化培地は、培養培地にＵＴＣを提供すること；１つまたは複数の増分段階で培養培地の血清含量を減らすこと；血清含量が所定レベルに達したら、血清含量減少培養培地から無血清基本培地にＵＴＣを移すこと；２４時間以下で、無血清基本培地でＵＴＣを成長させること；および、無血清基本培地からＵＴＣを単離し馴化培地を残すことによって、準備される。

ある実施形態では、移すことは、ＵＴＣを培養培地から離すこと、または血清減少培養培地を無血清基本培地と置き換えることを含む。馴化培地は、ろ過および濃縮され得る。

他の実施形態では、馴化培地が、ＵＴＣを培養培地に播種することにより生成され、培養培地の血清含量は、ＵＴＣを無血清基本培地に移す前に減少し、ＵＴＣはその後、無血清基本培地から単離されて、馴化培地を残す。馴化培地は、ろ過および濃縮され得る。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および実施例を参照することで理解されるであろう。

〔詳細な説明〕
例示的な実施形態に関する、以下の詳細な説明では、その一部を形成する添付図面を参照する。これらの実施形態は、当業者が本発明を実施できるよう十分詳細に説明され、他の実施形態が利用され得ること、ならびに論理的、構造的、機械的、電気的、化学的変更が、本発明の趣旨または範囲を逸脱せずに行われ得ることが、理解される。本明細書に記載する実施形態を当業者が実施するのに必要でない詳細を省くため、説明では、当業者に既知の情報は省略され得る。したがって、以下の詳細な説明は、限定的な意味で理解されるものではなく、例示的な実施形態の範囲は、請求項によってのみ定められる。

本発明をより明確にするため、以下の定義を提供する。

幹細胞は、自己再生前駆体、非再生前駆体、および最終分化細胞を含む子孫細胞を産生するため自己再生および分化する、単一の細胞の能力により定められる未分化細胞である。幹細胞は、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉、外肺葉）から様々な細胞系統の機能細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで分化し、移植後に複数の胚葉の組織を生じさせ、また、胚盤胞への注射後、すべてではなくてもほとんどの組織に、実質的に貢献する能力により、特徴づけられている。

幹細胞は、それらの発生能に従って、（１）全能性；（２）多能性；（３）多分化能性；（４）寡能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）；および（５）単能性と分類される。全能性細胞は、全ての胚細胞および胚体外細胞型を生じることができる。多能性細胞は、全ての胚細胞型を生じさせることができる。多分化能細胞は、細胞系統のサブセットではあるが、全てが特定の組織、臓器、もしくは生理系内にあるものを生じさせることができるものを含む。例えば、造血性幹細胞（ＨＳＣ）が、ＨＳＣ（自己再生性）、血液細胞に制限された寡能性前駆体、ならびに、血液の正常な成分である全ての細胞型および要素（例えば、血小板）を含む子孫を産生することができる。寡能性の細胞は、多分化能幹細胞よりも制限された細胞系統のサブセットを生じさせることができる。単能性の細胞は、単一の細胞系統（例えば、精子形成幹細胞）を生じさせることができる。

幹細胞はまた、幹細胞を入手する供給源に基づいて分類される。成体幹細胞は、概して、複数の分化細胞型を含む組織に見られる、多分化能未分化細胞である成体幹細胞は、それ自体で再生することができる。通常環境下では、起源を発する組織の特殊化された細胞型、および恐らくは他の組織型を生じるように分化することもできる。胚幹細胞は、胚盤胞期胚の内側細胞集団からの多能性細胞である。胎児幹細胞は、胎児組織または膜から生じるものである。分娩後幹細胞は、出生後利用可能な胚外組織、すなわち胎盤および臍帯から実質的に生じる多分化能または多能性細胞である。これらの細胞は、急速な増殖、および多くの細胞系統に分化する可能性を含む、多能性幹細胞に特有の特徴を有することが分かっている。分娩後幹細胞は、血液由来（例えば、臍帯血から得られるもの）、または非血液由来（例えば、臍帯および胎盤の非血液組織から得られるもの）であってよい。

分化は、分化していない（ｕｎｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ）（「コミットしていない（ｕｎｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）」）かまたはあまり分化していない（ｌｅｓｓ ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ）細胞が例えば神経細胞もしくは筋細胞などの、分化した細胞の特徴を取得するプロセスである。分化細胞は、細胞系統内で、より分化した（「コミットした」）位置についたものである。用語「コミットした（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）」は、分化のプロセスに使用される場合、通常環境下で特定の細胞型または細胞型のサブセットに分化し続け、また、通常環境下で、異なる細胞型に分化したり、あまり分化していない細胞型に戻ったりできない時点まで、分化経路を進んできた細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系統内で、あまり分化していない（またはコミットした）位置に戻るプロセスを指す。本明細書で使用される、細胞系統は、細胞の遺伝形質、すなわち、どの細胞から生じたか、また、何の細胞を生じさせることができるのかを定める。細胞系統は、発生および分化の遺伝的スキームの中にその細胞を位置付ける。

広義には、前駆細胞は、それ自身よりも分化した子孫を作る能力を有するが、前駆体の集まり（ｐｏｏｌ）を補充する能力を有する、細胞である。その定義により、幹細胞自体は、最終分化細胞に対してより直接的な前駆体であるので、これも前駆細胞である。本発明の細胞について言及する場合、以下でさらに詳細に説明するように、前駆細胞の、この広義の定義を使用することができる。狭義では、前駆細胞は、分化経路における中間体である細胞としばしば定義される。すなわち、前駆細胞は、幹細胞から生じており、成熟細胞型または細胞型のサブセットの産生における中間体である。この型の前駆細胞は、概して、自己再生することができない。したがって、この型の細胞に本明細書中で言及する際、「非自己再生前駆細胞」または「中間前駆細胞」もしくは「中間前駆体細胞」と呼ぶ。

本明細書で使用される、「中胚葉、外胚葉または内胚葉系統へ分化する」という語句は、それぞれ、特異的中胚葉、外胚葉または内胚葉系統へコミットされる細胞をさす。中胚葉系統に分化するか、または特異的中胚葉細胞を生じさせる細胞の例は、脂肪生成、軟骨生成、心原性、皮膚原性、造血性、血管形成（ｈｅｍａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）、筋原性、腎性、尿生殖器原性（ｕｒｏｇｅｎｉｔｏｇｅｎｉｃ）、骨原性、周心原性（ｐｅｒｉｃａｒｄｉｏｇｅｎｉｃ）、または間質性の細胞を含むがこれらに限定されない。外胚葉系統に分化する細胞の例は、上皮細胞、神経原性細胞、および神経膠原性（ｎｅｕｒｏｇｌｉａｇｅｎｉｃ）細胞を含むがこれらに限定されない。内胚葉系統に分化する細胞の例は、胸膜原性（ｐｌｅｕｒｉｇｅｎｉｃ）細胞、肝性細胞、腸の裏打ちを生じさせる細胞、ならびに膵原性（ｐａｎｃｒｅｏｇｅｎｉｃ）および内蔵原性（ｓｐｌａｎｃｈｏｇｅｎｉｃ）細胞を生じさせる細胞を含むがこれらに限定されない。

細胞は、さらに具体的には、臍由来細胞もしくは臍帯由来細胞（ＵＤＣ）、または臍帯組織由来細胞（ＵＴＣ）である。さらに細胞は、幹細胞または前駆細胞として説明されてよく、前駆細胞は、広い意味で使用される。用語「由来（ｄｅｒｉｖｅｄ）」は、細胞が、それらの生物学的供給源から得られ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成長または別様に操作されていることを示すのに使用される（例えば、成長培地で培養され、集団を増殖させ、かつ／または細胞株を産生する）。本発明の臍幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ操作、および臍由来細胞の独自の特徴は、以下で詳細に説明する。

培養中の細胞を説明するため、さまざまな用語が使用される。「細胞培養」は、概して、生物から採取され制御条件下で成長した（「培養中」または「培養された」）細胞を指す。「初代細胞培養」は、生物から直接採取された細胞、組織または臓器を、最初の二次培養前に培養することである。細胞は、細胞増殖および／または分裂を促進する条件下で成長培地に入れられると、培養中に「増殖（ｅｘｐａｎｄｅｄ）」し、結果として、大きな細胞集団をもたらす。細胞が培養中に増殖すると、細胞増殖速度は、時には、細胞が２倍の数になるのに必要な時間の長さで測定される。これを、「倍加時間」という。

細胞株は、初代細胞培養の１回または複数回の二次培養により形成された細胞集団である。二次培養の各ラウンドは、継代と呼ばれる。細胞が二次培養されると、それらは、継代されてきたと言われる。特定の細胞集団、または細胞株は、時には、継代されてきた回数で呼ばれるか、またはそれによって特徴付けられる。例えば、１０回継代されてきた培養細胞集団は、Ｐ１０培養物と呼ばれ得る。初代培養物、すなわち、組織から細胞を単離した後の最初の培養物は、Ｐ０と呼ばれる。最初の二次培養の後、細胞は、２度目の培養物（Ｐ１または１代継代）と説明される。２度目の二次培養後、細胞は、第３培養物（Ｐ２または２代継代）になる、等である。継代期間中に多くの集団倍加があり得、そのため、培養物の集団倍加数は、継代数より大きいことが、当業者には理解されるであろう。継代相互間の時間中の細胞増殖（すなわち、集団倍加数）は、播種密度、基質、培地、成長条件、および継代相互間の時間を含むがこれらに限定されない多くの要因に依存している。

馴化培地は、特定の細胞または細胞集団が培養され、その後取り除かれる培地である。細胞が培地で培養されると、細胞因子を分泌することができ、この細胞因子は、他の細胞に栄養に関する支援を与えることができる。そのような栄養因子は、ホルモン、サイトカイン、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、タンパク質、小胞、抗体、および顆粒を含むがこれらに限定されない。細胞因子を含む培地は、馴化培地である。

概して、栄養因子は、細胞の生存、成長、増殖および／または成熟化を促進するか、または細胞の活性増大を刺激する、物質として定義される。

培養された脊髄動物細胞に言及する場合、用語「老化」（「複製老化」もしくは「細胞老化」とも）は、有限細胞培養物に起因し得る特性、すなわち、有限数の集団倍加を超えて成長できないことを指す（ヘイフリックの限界と呼ばれることもある）。細胞老化は、最初は線維芽細胞様細胞を用いて説明されたが、培養中にうまく成長できる最も正常なヒト細胞型は、細胞老化を受ける。異なる細胞型のｉｎ ｖｉｔｒｏ寿命はさまざまであるが、最長寿命は、典型的には１００集団倍加より少ない（１００は、培養中の全細胞が老化することにより、培養物を分割できなくなる倍加数である）。老化は経時的時間に依存しないが、むしろ、培養物が受ける、細胞分裂、すなわち集団倍加により測定される。よって、必須成長因子を除去することで静止状態になった細胞は、その成長因子が再び導入されると、成長および分裂を再開でき、その後、継続して成長した同等の細胞と同じ数の倍加を行う。同様に、細胞が、さまざまな数の集団倍加後に液体窒素で凍結され、その後解凍および培養されると、培養中に凍結されなかった細胞と実質的に同じ数の倍加を受ける。老化細胞は、死んだもしくは死にかけの細胞ではなく、それらは、プログラムされた細胞死（アポトーシス）に対し実際に耐性があり、３年もの間、非分裂状態に保たれている。これらの細胞は、非常によく生きており、代謝的に活性であるが、分裂はしない。老化細胞の非分裂状態は、あらゆる生物学的、化学的、ウイルス性薬物によって可逆性であることは分かっていない。

本明細書で使用される用語「成長培地」は、概して、細胞を培養するのに十分な培地を指す。具体的には、本発明の細胞を培養する１つの現在好適な培地は、ダルベッコ変法基本培地（ＤＭＥＭ）を含む。特に好ましいのは、ＤＭＥＭ−低グルコース（ＤＭＥＭ−ＬＧ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）である。ＤＭＥＭ−ＬＧは、好ましくは、血清を補充され、最も好ましくは、ウシ血清またはヒト血清を補充される。典型的には、１５％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（例えば、規定のウシ胎仔血清、Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ ＵＴ）が、抗生物質／抗真菌薬（（好ましくは１００単位／ｍＬのペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍＬアンホテリシンＢ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ならびに０．００１％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ Ｍｏ）と共に加えられる。場合によっては、異なる成長培地を使用するか、または異なる補充物が提供され、これらは通常、成長培地への補充物として本文中で示される。化学的に定義されたある培地では、細胞は、血清が全く存在しない状態で成長することができる。そのような場合、細胞は、ある成長因子を必要としてよく、この成長因子は、培地に加えられて、細胞を支持および維持することができる。無血清培地での成長のため加えられるべき現在好ましい因子は、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、およびＰＤＧＦのうち１つまたは複数を含む。さらに好適な実施形態では、これらの因子のうち２つ、３つ、または４つ全てが無血清培地または化学的に定義された培地に加えられる。他の実施形態では、ＬＩＦを無血清培地に加えて、細胞の成長を支持または改善する。

また本発明に関して、本明細書で使用される用語「標準成長条件」は、５％ＣＯ_２を含む標準大気中、３７℃で細胞を培養することを指す。相対湿度は約１００％に保たれる。前述した条件は、培養に有用であるが、そのような条件は、細胞を培養するために当技術分野で利用可能なオプションを認識するであろう当業者によって変えられ得ることが理解される。

用語「有効量」は、特定の生物学的結果を達成するのに有効な、本明細書に記載する化合物、材料、または組成物の濃度または量を指す。そのような結果は、骨格組織の再生、修復、もしくは改善、血流の改善、ならびに／または末梢性虚血患者における血管新生の刺激および／もしくは支援を含むがこれらに限定されない。このような有効な活性は、例えば、本発明の細胞および／または組成物を末梢性虚血患者に投与することによって達成できる。患者にｉｎ ｖｉｖｏで投与される際のＵＴＣに関して、有効量は、わずか数百以下から数百万以上の範囲であってよい。特定の実施形態では、有効量は、約１０^３〜約１０^１１個の細胞、さらに具体的には、少なくとも約１０^４個の細胞の範囲でよい。投与されるべき細胞数は、医薬生物学者によく知られている要因の中でも、治療される大きさまたは総体積／表面積、および治療される領域の場所に対する投与部位の近さを含むがこれらに限定されない、治療されるべき障害の詳細によって異なることが認識されるであろう。

用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、症状の寛解、緩解、減弱、または傷害、病態もしくは状態が患者にとってより耐えられるものとなること、変性もしくは減退の速度が遅くなること、変性の最終地点があまり衰弱させるものでなくなる（ｌｅｓｓ ｄｅｂｉｌｉｔａｔｉｎｇ）こと、被験者の身体的もしくは精神的幸福の改善、または生存長さが長くなること、などの客観的または主体的なパラメータを含む、傷害、病態または状態の希薄化または回復の成功または成功の兆しを指す。症状の治療または回復は、身体検査、神経学的検査および／または精神医学的検査の結果を含む、客観的または主観的なパラメータに基づいていてよい。

用語「有効期間（または時間）」および「有効条件」は、概して、意図する結果を達成するために、薬剤または医薬組成物に必要であるかまたは好ましい、時間、または他の制御可能な条件（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法の温度、湿度）を指す。

用語「患者」または「被験者」は、本明細書では交換可能に使用され、これらは、医薬または治療組成物で、または本明細書に記載する方法に従って、治療される、動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトを指す。

用語「医薬的に許容可能な担体または培地」は、用語「生物学的に適合性の担体または担体」と交換して使用されてよく、概して、治療的に投与されるべき細胞および他の薬剤と適合性があるだけでなく、正しい医学的判断の範囲内にあり、妥当なリスク／ベネフィット比に比例した過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の合併症なしで、ヒトおよび動物の組織と接触して使用されるのに適している、試薬、細胞、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。本明細書でさらに詳細に説明するように、本発明で使用するのに適した、医薬的に許容可能な担体は、液体、半固体（例えばゲル）、および固体材料（例えば、細胞足場およびマトリックス、チューブ、シート、ならびに、当技術分野で既知であり、本明細書でさらに詳細に説明される、他のそのような材料）を含む。これらの半固体および固体材料は、体内での分解に抵抗するよう設計されてよく（非生分解性）、またはそれらは、体内で分解するように設計されてもよい（生分解性、生体侵食性）。生分解性材料は、さらに、生体再吸収性（ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ）または生体吸収性（ｂｉｏａｂｓｏｒｂａｂｌｅ）であってよい。すなわち、生分解性材料は、体液中に溶解および吸収されてよく（水溶性インプラントが１例である）、または他の材料への変換、もしくは天然経路を通じた崩壊および排除によって、分解され、最終的には体から排除される。生分解速度は、いったん体内に植え込まれたら、所望の放出速度に応じて変えられてよい。マトリックスはまた、新たに成長した骨格筋、周皮細胞、血管平滑筋、または血管内皮組織で置き換えられるまで、一時的な足場として作用することが望ましい。したがって、一実施形態では、マトリックスは、細胞と関連して使用される他の薬剤の徐放を提供し、患者の体内の組織成長を促す構造体を提供することができる。他の実施形態では、マトリックスは単に、発達している組織の一時的な足場を提供するだけである。マトリックスは、粒子形態（直径が１０μｍ（１０ミクロン）超のマクロ粒子、または直径が１０μｍ（１０ミクロン）未満の微小粒子）であってよく、あるいは、構造的に安定した３次元インプラント（例えば足場）の形態であってもよい。インプラントは、例えば、立方体、円筒、チューブ、ブロック、フィルム、シート、もしくは適切な解剖学的形態であってよい。

細胞または組織の移植に関して、本明細書でいくつかの用語が使用される。用語「自家移転」、「自家移植」、「自家移植片（ａｕｔｏｇｒａｆｔ）」などは、移植ドナーが移植レシピエントでもある移植を指す。用語「同種移転」、「同種移植」、「同種移植片」などは、移植ドナーが移植レシピエントと同じ種であるが、そのレシピエントではない移植をさす。ドナーの細胞がレシピエントと組織適合的に一致している細胞移転は、時には、「同系移転」と呼ばれる。用語「異種移転」、「異種移植」、「異種移植片」などは、移植ドナーが移植レシピエントとは異なる種である移植を指す。

細胞、細胞溶解液を含む細胞集団および製剤などが、米国特許出願公開第２００５００５４０９８号および２００５００５８６３１号に詳細に記載される。

培養ＵＴＣからの馴化培地をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで培養することができる。ＵＴＣまたは他の馴化培地の使用により、拒絶反応もしくは他の逆免疫反応の誘因となりうる無処理細胞を導入することなしに、ＵＴＣによって分泌された有利な栄養因子を同種異系的に患者で使用することができる。培養培地中で細胞を培養し、その後、培地から細胞を取り除くことによって、馴化培地を準備する。

細胞集団から準備された馴化培地は、そのまま使用されるか、例えば限外ろ過もしくは凍結乾燥によってさらに濃縮されるか、あるいは、乾燥して、部分的に精製して、当技術分野において既知の医薬的に許容可能な担体もしくは希釈剤と組み合わせるか、または、例えば医薬的に有用なタンパク質組成物といった生物製剤のような他の化合物と組み合わせることができる。馴化培地は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、単独で、または、例えば自家もしくは同系の生細胞と共に、使用されることができる。馴化培地は、ｉｎ ｖｉｖｏで導入される場合、治療部位で局所的に導入してもよいし、あるいは、例えば、患者に必要とされる細胞成長因子または栄養因子を提供するために、遠隔的に導入してもよい。

本発明の実施形態によれば、安定で測定可能なプロセスが、血清減少ＵＴＣ−馴化培地を製造するために提供される。端的には、方法は、血清減少条件下でのＵＴＣの培養を含む。その後、ＵＴＣは洗浄され、無血清基本培地で成長する。約２４時間後、馴化培地は、収集され、ろ過され、約８．３×１０^−２１ｇ（約５ｋＤａ）または同様の分子量の膜の使用によって濃縮される。

哺乳動物の臍組織由来細胞（ＵＴＣ）は、米国特許出願公開第２００５００５４０９８号および２００５００５８６３１号に記載の方法に従うことで、単離され得る。単離細胞は次に、馴化培地を準備する時間まで、米国特許出願公開第２００５００５４０９８号および２００５００５８６３１号に記載の方法に従うことにより、静置培養で成長することができる。

馴化培地は、細胞の任意の集団倍加により準備され得る。別の実施形態では、馴化培地は、約２０〜約４４の集団倍加から準備される。さらに他の実施形態では、馴化培地は、約３０集団倍加から準備される。

馴化培地は、まず、細胞が成長した標準培養培地から細胞を単離することにより準備される。細胞は次に、任意の播種密度で静置培養に播種される。一実施形態では、細胞は、約１，０００個の細胞／ｃｍ^２〜約１０，０００個細胞／ｃｍ^２の密度で播種される。さらに他の実施形態では、細胞は、約５，０００個の細胞／ｃｍ^２の密度で播種された。

約５，０００個の細胞／ｃｍ^２での細胞播種後、細胞は、細胞が基本培地でのみ成長するまで徐々に培地のウシ血清含量を減らすことにより、約１５％のウシ血清含量を有する標準培養培地から離される。ウシ血清は、約５〜約６０％の増分で減少されてよい。一実施形態では、ウシ血清は、約５０％（すなわち培地において１５％、７．５％、３．２５％、および０％のウシ血清）の増分で減少される。細胞は、約１〜約３継代にわたり各血清減少培地で成長することができる。一実施形態では、細胞は、約２継代にわたり、各血清減少培地で成長する。最終的なウシ血清減少培地を加える前に、細胞は、約１０，０００個の細胞／ｃｍ^２で、播種される。基本培地（０％ウシ血清）が細胞に加えられると、細胞は、２４時間以下にわたり、培地に維持される。

馴化培地は、次に細胞から単離され、約０．２２μｍ（約０．２２ミクロン）または同様のフィルターを用いてろ過される。フィルターは滅菌されてもされなくてもよい。ろ過された馴化培地は、次に、約５Ｋのカットオフフィルターまたは類似装置を用いて濃縮される。ろ液は廃棄され、フィルター上に保持された、濃縮馴化培地は収集される。

別の実施形態では、単離されたＵＴＣ細胞は、馴化培地を準備する時点まで、米国特許出願公開第２００８０１６６３２８号（実施例を参照）に記載のような方法に従って、マイクロキャリアビーズ培養で成長する。

馴化培地は、細胞の任意の集団倍加で準備され得る。別の実施形態では、馴化培地は、約２０〜約４４集団倍加から準備される。さらに他の実施形態では、馴化培地は、約３０集団倍加で準備される。

マイクロキャリアビーズ培養における約１０，０００個の細胞／ｃｍ^２での細胞播種後、標準培養培地が細胞に加えられ、約２日間培養される。その後、標準培養培地が除去され、基本培地と取り替えられる。あるいは、マイクロキャリアビーズ培養は、静置培養と東陽に、標準培養培地から離されてよい。基本培地（０％ウシ血清）が細胞に加えられると、細胞は培地で２４時間以下、保たれる。

馴化培地は次に細胞から単離され、約０．２２μｍ（約０．２２ミクロン）または同様のフィルターを用いてろ過される。フィルターは滅菌されてもされなくてもよい。ろ過された馴化培地は次に、約５Ｋのカットオフフィルターまたは類似装置を用いて濃縮される。ろ液は廃棄され、フィルター上に保持された、濃縮馴化培地は収集される。

従来の馴化培地は、培養された細胞型からのタンパク質に富んでいるが、培地に存在するウシ血清からのタンパク質にも富んでいる。前記の方法により準備された馴化培地は、ヒトタンパク質に凝縮されている。ウシタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析など、標準的な特徴付け方法の検出を下回る量で、存在する。馴化培地中のウシタンパク質の、検出を下回る量は、その後のウシ疾患およびウイルスの感染のリスクの減少、ならびに異物免疫反応（ｘｅｎｏｉｍｍｕｎｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）のリスクの減少のため、有利である。

本明細書に記載のとおり準備された馴化培地は、従来の馴化培地の代わりに有用である。

以下の実施例は、本発明を、より詳細に説明する。これらの実施例は、本明細書で説明した発明の態様をさらに例示することを意図しており、限定することを意図するものではない。

実施例１
静置フラスコで培養された細胞からの馴化培地の生成に影響する因子
この研究の目的は、馴化培地の生成における異なる因子（培地容量、細胞播種密度、培養期間、細胞の集団倍加、細胞の増殖状態および血清離脱）の変化が、馴化培地におけるタンパク質の量、ならびにタンパク質発現プロファイルに影響するかどうかを判断することであった。

一般的なプロトコルとして、少なくとも１つのＵＴＣ（ＵＴＣの単離および特徴付けは実施例５〜１４で見ることができる）が、１０，０００個の細胞／ｃｍ^２（特に指定のない限り）で、Ｔ−２２５ｃｍ^２フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ，Ｃｏｒｎｉｎｇ ＮＹ）上で、成長培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａ）、１５％（ｖ／ｖ）ガンマ線照射されたウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、４ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）、５０ＩＵ／ｍＬペニシリン（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）および５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）中で、播種された。４８時間後、使用済み培地が吸引され、フラスコは、毎回１ＯｍＬのＤ−ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で２回洗浄された。各洗浄の間、フラスコは、血清用ピペットで２回流された。２０ｍＬ（特に指定のない限り）の基本培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）および４ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ））が次に加えられ、細胞が、さらに２４時間（特に指定のない限り）培養された。２４時間後、馴化培地が収集され、０．２２μｍフィルターフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ ＮＹ）でろ過され、その後、遠心分離フィルターチューブ（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ−７０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａ）内で、８．３×１０^−２１ｇ（５ｋＤａ）の分子量カットオフで、濃縮された。サンプルは、２０〜２５℃で、これらの遠心分離フィルターチューブ内で、３２００ｇで３０分間、回された。残余分は、９１３ｇで５分間、２０〜２５℃で、フィルターチューブの反転遠心分離により収集された。結果として得られた濃縮培地は、その後、最終産物とみなされた。

培地容量研究では、細胞は、３つの異なる容量の基本培地（１０、２５および４０ｍＬ）に切り替えられる前に、４８時間成長した。細胞播種密度研究では、細胞は、基本培地に切り替える前に４８時間、１，０００、５，０００、および１０，０００個の細胞／ｃｍ^２で播種された。培養持続時間の研究では、細胞は、馴化培地を回収する前に２４、４８および７２時間、基本培地で培養された。細胞の集団倍加研究では、細胞は、基本培地に切り替える前に異なる集団倍加まで成長した。培地収集時における最終的な細胞集団倍加は、２０、３５および４４であった。２つの群を使用して細胞の増殖状態の影響を比較した。第１群は、５，０００個の細胞／ｃｍ^２で播種され、基本培地に切り替える前に標準成長培地で成長した増殖細胞からのみなった。第２群は、１０，０００個の細胞／ｃｍ^２で播種され、基本培地に切り替える前に２％血清含有培地で成長した、非増殖細胞からのみなった。血清離脱研究は、２群を有した。第１群は、基本培地に切り替える４８時間前に５，０００個の細胞／ｃｍ^２の一定播種密度で（ただし、最後の継代は１０，０００個の細胞／ｃｍ^２で播種された）１５％から７．５％へ、そして最終的には３．２５％の血清を含有する培地で、２連続継代にわたり離脱された細胞のみからなった。第２群は、一般的なプロトコルに従った。

タンパク質評価。各濃縮培地サンプルの総タンパク質濃度が、Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ａｓｓａｙにより評価された。Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｉｘ Ｄｙｅ Ｒｅａｇｅｎｔ、およびＱｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ｓｔａｎｄａｒｄ ＳｅｔがＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａ）から入手された。サンプルは、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で適切に希釈され、標準曲線の線形範囲内に収められ、２回（ｉｎ ｄｕｐｌｉｃａｔｅｓ）実行された。サンプルとＢｒａｄｆｏｒｄ染料との混合物は、端的には、分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ １９０、Ｓｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ ｖ４．０ソフトウェア付き）上で５９５ｎｍの光学密度（ＯＤ）で読み取る前に５分間暗所で、撹拌され、インキュベートされた。サンプルのＯＤ読み取りは、ＢＳＡ標準のＯＤ読み取りから生成された標準曲線に基づいて、タンパク質濃度に変換された。タンパク質濃度は、その濃度を、濃度工程の後で収集された残余分の容量に掛け合わせることにより示された、存在するタンパク質の総量に変換された。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。５μｇの各サンプルが、５％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノールを含むＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ ＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（２Ｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）において準備された。混合後、サンプルは、９５℃で５分間加熱され、ウェルに加える前に氷上冷却された。タンパク質分離について、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ プレキャスト４〜２０％ゲルおよびシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）が、製造業者のプロトコルに従って、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）と共に使用された。ゲルは、製造業者のプロトコルに従って、ＳＩＭＰＬＹＢＬＵＥ Ｓａｆｅ染料で染色され、ＤＲＹＥＡＳＥ Ｍｉｎｉ−Ｇｅｌ Ｄｒｙｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）を使用して乾燥された。

研究した因子の中で、初期細胞播種密度および培養持続時間のみが、総タンパク質含量に影響し、細胞密度および培養持続時間の増加と共にタンパク質含量が増えた。タンパク質バンド形成パターンは、低播種密度がタンパク質バンド形成パターンの損失を生じた細胞播種密度研究のサンプルを除いて、サンプル間で非常に一致していた。

実施例２
血清減少工程後の馴化培地における血清減少タンパク質
馴化培地の産生中、最終産物にＦＢＳタンパク質が存在するのは避けられない。われわれの発見では、かなりの量のＦＢＳタンパク質が最終産物に存在することが示されている。最終産物中に存在するＦＢＳタンパク質の量は、馴化培地の生成前に１段階の血清減少を通じて、実質的に減少する。

馴化培地の生成。３研究群があった。第１群では、細胞は、Ｔ−２２５フラスコ上に播種され、５ＯｍＬの１５％ＦＢＳ含有成長培地を与えられた。第２群は、Ｔ−２２５フラスコ上に播種され、５ＯｍＬの２％ＦＢＳ含有培地を与えられた細胞からなった。最終群は、細胞が播種されていないが、５ＯｍＬの１５％ＦＢＳ含有成長培地で満たされたＴ−２２５フラスコからなった。４８時間後、各フラスコからの培地が収集され、−８０℃で保管された。フラスコはその後、２回、Ｄ−ＰＢＳ（各回１ＯｍＬ）で洗浄され、各洗浄物（ｗａｓｈ）は、収集され、−８０℃で保管された。２ＯｍＬの基本培地が次に各フラスコに加えられ、実施例１に詳述する正確なプロトコルに従った。

タンパク質分析。タンパク質評価が、培地および洗浄物について実行され、存在するタンパク質の量を判断した。方法は実施例１に記載される。最終馴化培地のＳＤＳ−ＰＡＧＥも実行され、群間のタンパク質バンド形成パターンを比較した。方法は実施例１に記載される。ウエスタンブロットを使用して、各郡の最終馴化培地産物に存在するウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の量を比較した。サンプルは、５％のβ−メルカプトエタノールを含む２ｘサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）において準備された。混合後、サンプルは、９５℃で５分間加熱され、ウェルに入れる前に氷上冷却された。タンパク質分離について、プレキャストされた４〜２０％のＮＯＶＥＸ Ｍｉｎｉゲルおよびシステムを使用した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。ゲルは、２０％メタノールおよび０．０１％のＳＤＳと共に標準Ｔｏｗｂｉｎ’ｓ Ｂｕｆｆｅｒを用いて、湿気移転システム（ｗｅｔ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｙｓｔｅｍ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）において、ＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に移された。移転は、１００Ｖで２時間にわたり４℃で行われた。移転後、膜は、非タンパク質系遮断緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で遮断され、ロッカー上で一晩４℃で、一次抗体と共にインキュベートされた。マウスモノクローナル抗−ＢＳＡ（Ｓｃ−８０７０５、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）が、新鮮遮断緩衝液において作られた１：１０００の希釈で使用された。膜は、その後、３回、各回５分間、ＰＢＳＴ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａ）により洗浄され、ヤギ抗マウス二次抗体（ＨＡＦ００７，ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）でインキュベートされた。ブロットは、次に、３回、各回５分間、ＰＢＳＴで洗浄され、化学発光基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ，Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で１分間インキュベートされ、次に、デジタル画像化システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で検出された。

図１も参照のこと。

細胞が存在するかまたは存在しない状態で、静置培養フラスコにおいて１５％ＦＢＳ含有培地を使用することにより、洗浄物にかなりの量のタンパク質が残ったことを示した。これらのタンパク質がウシ由来であるかどうかという問題は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより確認され、それにより、かなりの量のＢＳＡが馴化培地で検出された。しかしながら、成長培地における血清の量を、基本培地に切り替える直前に１５％から２％へ減少させることによって、馴化培地に存在するＢＳＡの量が実質的に減少したことが分かった。ＢＳＡは最も最も血清が豊富なタンパク質であり、他の血清タンパク質も実質的に減少したと推測することができる。

実施例３
１段階血清減少方法で静置フラスコおよび攪拌フラスコから作られた馴化培地の比較
攪拌フラスコからの馴化培地の生成。少なくとも１つのＵＴＣが、１００ｍＬの調節攪拌フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中、Ｈｉｌｌｅｘ ＩＩ マイクロキャリア（１２ｇ／Ｌ）（Ｓｏｌｏｈｉｌｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｃ，ＭＩ）上に５，０００個の細胞／ｃｍ^２で播種され、成長培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）、１５％（ｖ／ｖ）のガンマ線照射されたウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、４ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）、５０ＩＵ／ｍＬペニシリン（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）および５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）を、６０ｒｐｍの一定回転で、与えられた。４日後、細胞は、細胞を含有するマイクロキャリアを、新鮮成長培地と共に１：５の分割比で新鮮なマイクロキャリアにより再構築することにより、５００ｍＬ攪拌フラスコ内へ継代された。４日後、使用済み培地が吸引され、マイクロキャリアは、Ｄ−ＰＢＳで２回洗浄された。第１洗浄は、短い攪拌を伴って２００ｍＬのＰＢＳからなった。第１洗浄の吸引後、第２洗浄は、５００ｍＬのＰＢＳ、および磁気攪拌機で１０分間６０ｒｐｍでの１０分インキュベーションからなった。２回の洗浄後、細胞は、２％ＦＢＳ含有成長培地を与えられた。２４時間後、マイクロキャリアは、前記の正確な手順に従って、Ｄ−ＰＢＳで再び洗浄され、０．０９ｍＬ／ｃｍ^２の、マイクロキャリア表面積に対する容量の割合で、基本培地を与えられた。２４時間後、馴化培地が収集され、０．２２μｍフィルターフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ ＮＹ）でろ過され、その後、遠心分離フィルターチューブ（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ−７０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａ）内で、８．３×１０^−２１ｇ（５ｋＤａ）の分子量カットオフで濃縮された。サンプルは、これらの遠心分離フィルターチューブ内で３２００ｇで３０分間、２０〜２５℃で回転された。残余分は、９１３ｇで５分間、２０〜２５℃で、フィルターチューブの反転遠心分離によって収集された。結果として得られた濃縮培地はその後、最終産物とみなされた。

静置フラスコからの馴化培地の生成。１つまたは複数のＵＴＣが、Ｔ−２２５ｃｍ^２上に３０，０００個の細胞／ｃｍ^２で播種され、成長培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）、２％（ｖ／ｖ）のガンマ線照射されたウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、４ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）、５０ＩＵ／ｍＬペニシリン（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）および５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）を与えられた。４８時間後、使用済み培地が吸引され、フラスコは、２回、各回１０ｍＬのＤ−ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で、洗浄された。各洗浄中、フラスコは、血清用ピペットで２回流された。基本培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）および４ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ））が、次に、０．０９ｍＬ／ｃｍ^２の、表面積に対する容量の割合で加えられ、細胞が、さらに２４時間（特に指定のない限り）培養された。２４時間後、馴化培地が収集され、０．２２μｍフィルターフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ ＮＹ）でろ過され、その後、遠心分離フィルターチューブ（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ−７０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａ）内で、８．３×１０^−２１ｇ（５ｋＤａ）の分子量カットオフで濃縮された。サンプルは、これらの遠心分離フィルターチューブ内で、３２００ｇで３０分間、２０〜２５℃で回転された。残余分は、９１３ｇで５分間、２０〜２５℃での、フィルターチューブの反転遠心分離により収集された。結果として得られた濃縮培地はその後、最終産物とみなされた。

最終細胞密度の決定。馴化培地が回収された後、残りの細胞は、Ｄ−ＰＢＳ（ＣａおよびＭｇなし）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）で洗浄され、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）を用いて、トリプシン処理されてフラスコまたはマイクロキャリアから出される。分離した細胞は次に、完全成長培地で中和され、流動ベース細胞カウンター（ＧＵＡＶＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、数および生存率をカウントされた。細胞混合物のアリコートが、死細胞を染色する蛍光染料で２Ｏｘ希釈され、その後、機械の中に入れられた。最終細胞数が、計算され、最終細胞密度を得るのに利用可能な総培養表面積に対して補正された。Ｈｉｌｌｅｘ ＩＩマイクロキャリアの場合、１．２ｇのマイクロキャリアは、約５１５ｃｍ^２の総表面積を有する。

タンパク質分析。タンパク質評価が培地および洗浄物について実行され、存在するタンパク質の量を判断した。方法は実施例１に記載される。最終馴化培地のＳＤＳ−ＰＡＧＥも実行され、群間のタンパク質バンド形成パターンを比較した。方法は実施例１に記載される。実施例１に記載したようにＢＳＡのウエスタンブロットが馴化培地に対して行われた。

＊ ７０ｍＬの馴化培地濃度から得た値から、静置フラスコ培養で使用される同じ量（２０ｍＬ）に対して外挿。
図２も参照のこと。

攪拌フラスコで培養されると、馴化培地で回収されるタンパク質の総量は、静置フラスコの場合の約４倍であり、最終細胞密度は、静置および攪拌フラスコの双方でほぼ匹敵していた。攪拌フラスコの馴化培地中のＢＳＡの存在は、静置フラスコと比べると、実質的に低かった。

実施例４
多重ＥＬＩＳＡによる、馴化培地に存在する目的のタンパク質の判断
馴化培地の生成。馴化培地が、実施例３に記載の方法に従って、静置フラスコおよび攪拌フラスコから作られた。

目的のタンパク質の検出。サンプルは、シリコン処理したマイクロ遠心分離チューブ中、基本培地で１００μｇ／ｍＬに希釈され、付着によるタンパク質損失を低減し、ＳＥＲＣＨＬＩＧＨＴ多重ＥＬＩＳＡアッセイにより、存在する目的のヒトおよびウシタンパク質の量を判断するためにＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡへ凍結輸送された。目的のタンパク質は、ＳＥＡＲＣＨＬＩＧＨＴ Ｐｒｏｔｅｏｍ Ａｒｒａｙｓを用いて測定した。プロテオームアレイは、ウェル当たり２〜１６個のタンパク質を定量測定するための多重サンドイッチＥＬＩＳＡである。アレイは、２ｘ２、３ｘ３または４ｘ４パターンの４〜１６個の異なる捕捉抗体を９６−ウェルプレートの各ウェルにスポッティングすることにより生成される。典型的なサンドイッチＥＬＩＳＡ処理の後、プレート全体が画像化され、プレートの各ウェル内部で各スポットにおいて生成された化学発光信号をとらえる。各スポットで生成された信号の量は、元の標準またはサンプルにおける標的タンパク質の量に比例する。

ＮＤ−検出不能

８．３×１０^−２１ｇ（５ｋＤａ）のカットオフ膜によるろ過での濃縮が、実行可能な方法であることが分かった。このプロセスは、ＡＴＦろ過システムの使用により測定可能である。馴化培地含量の分析は、かなりの量のヒト成長因子およびサイトカイン（ＢＤＮＦ、ＩＬ−８、ＨＧＦ、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＶＥＧＦ、ＦＧＦｂ、ＩＬ−６およびＭＭＰ−７）、ならびに検出不能な量のウシタンパク質（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６およびＴＮＦ−α）を明らかにしたが、馴化培地を作る前の初期血清成長条件に応じてさまざまな量で存在することが分かったＢＳＡは除く。

本発明は、前記で説明し例示した実施形態に限定されるものではない。本発明は、請求項の範囲内でバリエーションおよび改変が可能である。

実施例５
細胞の単離
臍細胞単離。臍帯をＮａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）から入手した。組織は、正常な配達に従って入手された。細胞単離プロトコルが、層流フードで無菌で行われた。血液および残骸を除去するため、臍帯は、１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の存在下で、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で洗浄された。組織は次に、組織が細かな柔らかい塊（ｆｉｎｅ ｐｕｌｐ）に刻まれるまで、５０ｍＬの培地（ＤＭＥＭ−低グルコースまたはＤＭＥＭ−高グルコース；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で、１５０ｃｍ^２組織培養プレート中で機械的に分離された。切り刻まれた組織は、５０ｍＬの円錐チューブ（チューブ当たり約５ｇの組織）に移された。

組織が、次に、ＤＭＥＭ−低グルコース培地もしくはＤＭＥＭ−高グルコース培地のいずれかで消化された。培地はそれぞれ、１００単位／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢおよび消化酵素を含有した。いくつかの実験では、コラゲナーゼおよびディスパーゼの酵素混合物が使用された（「Ｃ：Ｄ」）（コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、５００単位／ｍＬ；およびディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０単位／ｍＬ、ＤＭＥＭ−低グルコース培地中）。他の実験では、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼの混合物（「Ｃ：Ｄ：Ｈ」）が使用された（Ｃ：Ｄ：Ｈ＝コラゲナーゼ、５００単位／ｍＬ；ディスパーゼ、５０単位／ｍＬ；およびヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）、５単位／ｍＬ、ＤＭＥＭ−低グルコース中）。組織、培地および消化酵素を含む円錐チューブは、オービタルシェーカー（Ｅｎｖｉｒｏｎ，Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，Ｎ．Ｙ．）中、３７℃で、２２５ｒｐｍで２時間インキュベートされた。

消化後、組織を、１５０ｘｇで５分間遠心分離し、上澄みを吸引した。ペレットは、２０ｍＬの成長培地（ＤＭＥＭ：低グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；規定のウシ胎仔血清；ロット＃ＡＮＤ１８４７５；Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ；（それぞれＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡより））中で再懸濁された。細胞懸濁液は、７０μｍ（７０ミクロン）のナイロンＢＤ ＦＡＬＣＯＮ細胞ストレーナー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を通してろ過された。成長培地を含む、５ｍＬの追加のリンス剤を、ストレーナーに通した。細胞懸濁液を次に、４０μｍナイロン細胞ストレーナー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に通し、追加の５ｍＬの成長培地のリンス剤がその後に入れられる（ｃｈａｓｅｄ）。

ろ液は、成長培地（総容量５０ｍＬ）に再懸濁され、１５０ｘｇで５分間遠心分離される。上澄みを吸引し、細胞を、５０ｍＬの新鮮な成長培地に再懸濁した。このプロセスを、さらに２回繰り返した。

最終的な遠心分離の後、上澄みを吸引し、細胞ペレットを、５ｍＬの新鮮な成長培地に再懸濁した。トリパンブルー染色を用いて、生存細胞数を判断した。細胞を、標準条件下で培養した。

臍帯組織から単離された細胞が、成長培地中、ゼラチンコートＴ−７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）上に、５，０００個の細胞／ｃｍ^２で播種された。２日後、使用済み培地、および未付着細胞を、フラスコから吸引した。付着細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、残骸および血液由来細胞を除去した。次に、細胞は、成長培地を補充され、コンフルエンスまで成長した（０代継代から１代継代まで約１０日間）。次の継代では（１から２代継代まで、など）、細胞は、４〜５日でサブコンフルエンス（７５〜８５％コンフルエンス）に達した。続いて起こるこれらの継代では、細胞を、５，０００細胞／ｃｍ^２で播種した。細胞は、加湿インキュベーター中、５％の二酸化炭素、３７℃で成長した。

細胞が、ＬＩＢＥＲＡＳＥ（２．５ｍｇ／ｍＬ、Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ３；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）およびヒアルロニダーゼ（５単位／ｍＬ Ｓｉｇｍａ）により、ＤＭＥＭ−低グルコース培地中で組織から単離された。組織の消化、および細胞の単離は、他のプロテアーゼ消化について前述したとおりであるが、ＬＩＢＥＲＡＳＥ／ヒアルロニダーゼ混合物を、Ｃ：ＤもしくはＣ：Ｄ：Ｈ酵素混合物の代わりに使用した。ＬＩＢＥＲＡＳＥによる組織消化は、容易に増殖した組織からの細胞集団の単離を結果としてもたらした。

異なる酵素の組み合わせを用いて、臍帯から細胞を単離する処置を比較した。消化について比較された酵素は以下を含んだ：ｉ）コラゲナーゼ；ｉｉ）ディスパーゼ；ｉｉｉ）ヒアルロニダーゼ；ｉｖ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ混合物（Ｃ：Ｄ）；ｖ）コラゲナーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｈ）；ｖｉ）ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｄ：Ｈ）；およびｖｉｉ）コラゲナーゼ：ディスパーゼ：ヒアルロニダーゼ混合物（Ｃ：Ｄ：Ｈ）。これらの異なる酵素消化条件を使用した細胞単離の差異を観察した（表５−１）。

異なるアプローチによって臍帯から細胞の集まりを単離する、他の試みを行った。ある場合には、臍帯をスライスし、成長培地で洗浄して、血餅およびゼラチン質の材料を取り除いた。血液、ゼラチン質の材料、および成長培地の混合物を収集し、１５０ｘｇで遠心分離した。ペレットを再懸濁し、成長培地において、ゼラチンコートフラスコ上に播種した。これらの実験から、容易に増殖した細胞集団を単離した。

細胞はまた、ＮＤＲＩより手に入れた臍帯血サンプルからも単離された。使用した単離プロトコルは、Ｈｏ ｅｔ ａｌ．による国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０２９９７１のものである。臍帯血のサンプル（それぞれ５０ｍＬおよび１０．５ｍＬ）（ＮＤＲＩ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ＰＡ）が、溶解緩衝液（ろ過滅菌された（ｆｉｌｔｅｒ−ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ）１５５ミリモルの塩化アンモニウム、１０ミリモルの炭酸水素カリウム、０．１ミリモルのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２に緩衝化（全成分はＳｉｇｍａ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯより））と混合された。細胞は、臍帯血と溶解緩衝液が１：２０の割合で溶解された。結果として得られた細胞懸濁液を５秒間ボルテックスし、周囲温度で２分間インキュベートした。可溶化液を遠心分離した（２００ｘｇで１０分間）。細胞ペレットが、１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ ＵＴ）、４ミリモルのグルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）、１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含有するＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）で、再懸濁された。再懸濁した細胞を遠心分離し（２００ｘｇで１０分間）、上澄みを吸引し、細胞ペレットを完全培地中で洗浄した。細胞が、Ｔ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、Ｔ７５ラミニンコートフラスコ、またはＴ１７５フィブロネクチンコートフラスコ（２つともＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）のいずれかの中に直接播種された。

細胞集団が異なる条件下で単離し、単離直後にさまざまな条件下で増殖できるかどうかを判断するため、細胞が、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むかまたは含まない成長培地で、Ｃ：Ｄ：Ｈの酵素組み合わせを用いて、前記の手順に従って消化された。１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンの存在下で全ての細胞が成長した。全試験条件下で、細胞は、０代継代と１代継代との間で、十分に付着し増殖した（表５−２）。５〜８および１３〜１６の条件での細胞は、播種後、細胞が低温保存される４回目の継代までは十分増殖したことが示された。

Ｃ：Ｄ：Ｈの組み合わせは、単離後、最もよい細胞の収量を提供し、他の条件よりも多くの世代にわたって培養中に増殖した細胞を生成した（表５−１）。増殖可能な細胞集団は、コラゲナーゼまたはヒアルロニダーゼ単独では、得られなかった。この結果が試験したコラゲナーゼに特異的なものであるかどうかを判断する試みは行っていない。

略語：＋＝良い、＋＋＝非常に良い、＋＋＋＝きわめて良い、Ｘ＝成功せず

細胞は、酵素消化および成長について試験した全条件下において、０代継代と１代継代との間で十分付着および増殖した（表５−２）。実験条件５〜８および１３〜１６の細胞は、低温保存される４回目の継代までは、播種後十分に増殖した。全ての細胞をさらなる分析のため、低温保存した。

有核細胞が、急速に付着および成長した。これらの細胞は、フローサイトメトリーにより分析され、酵素消化により得られた細胞と同様であった。

製剤は、赤血球および血小板を含有した。最初の３週間は、有核細胞は付着および分裂しなかった。培地は、播種後３週間で変えられ、付着および成長した細胞は観察されなかった。

細胞集団は、酵素の組み合わせ、すなわちコラゲナーゼ（メタロプロテアーゼ）、ディスパーゼ（中性プロテアーゼ）およびヒアルロニダーゼ（ヒアルロン酸を分解する粘液溶解酵素）を用いて、効果的に臍組織から単離できた。コラゲナーゼと中性プロテアーゼとのブレンドであるＬＩＢＥＲＡＳＥも使用することができる。コラゲナーゼ（４Ｗｕｎｓｃｈ単位／ｇ）およびサーモリシン（１７１４カゼイン単位／ｇ）である、Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ ３もヒアルロニダーゼと共に使用されて、細胞を単離することができた。これらの細胞は、成長増殖培地においてゼラチンコートプラスチック上で培養されると、多くの継代にわたり容易に増殖した。

細胞は、臍帯中の残りの血液からも単離されたが、臍帯血からは単離されなかった。使用した条件下で付着および成長した、組織から洗浄された血餅中の細胞の存在は、切開プロセス中に放出されている細胞によるものであろう。

参考文献
Ｈｏ ｅｔ ａｌ，ＷＯ２００３０２５１４９ Ａ２，”ＣＥＬＬ ＰＯＰＵＬＡＴＩＯＮＳ ＷＨＩＣＨ ＣＯ−ＥＸＰＲＥＳＳ ＣＤ４９Ｃ ＡＮＤ ＣＤ９０” ＮＥＵＲＯＮＹＸ，ＩＮＣ． 出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／２９９７１、出願日２００２０９２０，Ａ２ 公開日２００３０３２７，Ａ３ 公開日２００３１２１８．

実施例６
細胞の成長特性
細胞の細胞増殖能力が、他の単離幹細胞集団に対して比較された。老化までの細胞増殖プロセスは、ヘイフリックの限界と呼ばれる（Ｈａｙｆｌｉｃｋ，”Ｔｈｅ ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ，” Ｊ． Ａｍ． Ｇｅｒｉａｔｒ． Ｓｏｃ、１９７４；２２（１）；１−１２、Ｈａｙｆｌｉｃｋ、”Ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ，” Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｉｓｔ、１９７４；１４（１）；３７−４５）。

組織培養プラスチックフラスコは、室温で、２０分間、２０ｍＬの２％（ｗ／ｖ）ゼラチン（タイプＢ：２２５ Ｂｌｏｏｍ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）をＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に加えることによってコートされた。ゼラチン溶液の除去後、１０ｍＬリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が加えられ、その後吸引された。

成長増殖能力比較のため、以下の細胞集団を利用した；ｉ）間葉系幹細胞（ＭＳＣ； Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）；ｉｉ）脂肪由来細胞（米国特許第６，５５５，３７４ Ｂ１；米国特許出願公開第ＵＳ２００４００５８４１２）；ｉｉｉ）正常な皮膚線維芽細胞（ｃｃ−２５０９ ロット＃ ９Ｆ０８４４；Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）；およびｉｖ）臍由来細胞。細胞は、最初に５，０００細胞／ｃｍ^２で、ゼラチンコートＴ７５フラスコに成長培地において播種された。その後の継代では、細胞培養を以下のとおり処理した。トリプシン処理後、トリパンブルー染色の後で生存細胞をカウントした。細胞懸濁液（５０μＬ）を、トリパンブルー（５０μＬ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ Ｍｏ）と混ぜ合わせた。生存細胞数は、血球計数器を用いて見積もった。

カウント後、細胞が、２５ｍＬの新鮮成長培地中、ゼラチンコートしたＴ−７５フラスコ上に５，０００個の細胞／ｃｍ^２で播種された。細胞は、３７℃で、標準大気（５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素）中で成長した。成長培地は、１週間に２回変えた。細胞が約８５％のコンフルエンスに達すると、細胞を継代した；このプロセスは、細胞が老化に達するまで繰り返された。

各継代で、細胞をトリプシン処理してカウントした。生存細胞収量、集団倍加［ｌｎ（最終の細胞／最初の細胞）／ｌｎ２］、および倍加時間（培養中の時間／集団倍加）を計算した。最適な細胞増殖を決定する目的で、継代当たりの総細胞収量が、各継代の増殖因子に、前の継代の総収量を掛け合わせることにより、決定された（すなわち、増殖因子＝最終の細胞／最初の細胞）。

１０代継代で保存された（ｂａｎｋｅｄ）の細胞の増殖能力も試験した。異なる１組の条件を使用した。正常な皮膚線維芽細胞（ｃｃ−２５０９ ロット＃ ９Ｆ０８４４；Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、臍由来細胞、および胎盤由来細胞が試験された。これらの細胞集団は、その前に１０代継代で保存されており、各継代５，０００個の細胞／ｃｍ^２で、その時点まで培養されていた。１０代継代での細胞解凍後の細胞集団に対する細胞密度の影響を決定した。細胞は、標準条件下で解凍され、トリパンブルー染色を用いてカウントされた。解凍された細胞は、その後、成長培地中、１，０００個の細胞／ｃｍ^２で播種された。細胞は、３７℃で、通常の大気条件下で成長した。成長培地は１週間に２回変えられた。細胞は、約８５％コンフルエンスに達すると、継代された。細胞は、その後、老化まで、すなわち、それ以上増殖できなくなるまで、継代された。細胞は、各継代で、トリプシン処理されカウントされた。細胞収量、集団倍加（ｌｎ（最終的な細胞／最初の細胞／ｌｎ２）および倍加時間（培養中の時間）／集団倍加）を計算した。継代当たりの総細胞収量は、各継代の増殖因子に、その前の継代の総収量を掛け合わせることにより決定された（すなわち、増殖因子＝最終的な細胞／最初の細胞）。

低細胞播種条件下での、新たに単離された臍帯組織由来細胞培養物の増殖能力を、別の実験で試験した。臍由来細胞は、実施例５に記載のとおり、単離された。細胞は、１，０００個の細胞／ｃｍ^２で播種され、老化まで前記のように継代された。細胞は、３７℃で、通常の大気条件下で成長した。成長培地は、１週間に２回変えられた。細胞は、約８５％コンフルエンスに達すると、継代された。各継代で、細胞をトリプシン処理して、トリパンブルー染色によりカウントした。細胞収量、集団倍加（ｌｎ（最終の細胞／最初の細胞）ｌｎ２）および倍加時間（培養中の時間／集団倍加）が、各継代について計算された。継代当たりの総細胞収量が、各継代の増殖因子に、前の継代の総収量を掛け合わせることにより、決定された（すなわち、増殖因子＝最終的な細胞／最初の細胞）。細胞は、ゼラチンコートフラスコ、および非ゼラチンコートフラスコで成長した。

低Ｏ_２細胞培養条件が、ある場合には、細胞増殖を改善することが証明されている（Ｃｓｅｔｅ、Ｍａｒｉｅ；Ｄｏｙｌｅ，Ｊｏｈｎ；Ｗｏｌｄ，Ｂａｒｂａｒａ Ｊ．；ＭｃＫａｙ，Ｒｏｎ；Ｓｔｕｄｅｒ，Ｌｏｒｅｎｚ． Ｌｏｗ ｏｘｙｇｅｎ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｏｆ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ． ＵＳ２００４０００５７０４）。臍由来細胞の細胞増殖が細胞培養条件を変えることで改善できるかどうかを判断するため、臍由来細胞の培養物が、低酸素条件で成長させられた。細胞を、成長培地中、ゼラチンコートフラスコ上で、５，０００細胞／ｃｍ^２で播種した。細胞は、最初は、５代継代にわたり標準的な大気条件下で培養され、５代継代の時点で、低酸素（５％ Ｏ_２）培養条件に移された。

他の実験では、細胞は、コート無しプレート、コラーゲンコートプレート、フィブロネクチンコートプレート、ラミニンコートプレート、およびマトリゲルコートプレート上で増殖された。培養物は、これらの異なるマトリックス上で十分増殖することが示された。

臍由来細胞は、４０継代超にわたり増殖し、６０日で＞１Ｅ１７個の細胞の細胞収量を生成した。それとは対照的に、ＭＳＣおよび線維芽細胞は、＜２５日後、および＜６０日後にそれぞれ老化した。脂肪由来細胞および網細胞は双方、ほぼ６０日にわたり増殖したが、これらは、４．５Ｅ１２および４．２４Ｅ１３の総細胞収量をそれぞれ生成した。したがって、使用した実験条件下で、５，０００個細胞／ｃｍ^２で播種されると、臍由来細胞は、同じ条件下で成長した他の細胞型よりも、はるかによく増殖した（表６−１）。

臍由来細胞および線維芽細胞は、１０継代超にわたり増殖し、６０日で＞１Ｅ１１個の細胞の細胞収量を生成した（表６−２）。これらの条件下で６０日後、線維芽細胞は老化したが、臍由来細胞は、８０日後に老化し、＞５０集団倍加を完了した。

細胞は低酸素条件下で十分に増殖するが、低酸素条件下での培養は、臍帯組織由来細胞の細胞増殖に対してはあまり効果がないようである。標準的大気条件は、十分な数の細胞を成長させるのにうまくいくことが既に証明されており、低酸素培養は、臍帯組織由来細胞の成長には必要でない。

標準的な大気中酸素の下、約５，０００個の細胞／ｃｍ^２密度で、成長培地中で、ゼラチンコートされるかまたはコートされないフラスコ上で、単離された臍帯組織由来細胞を成長させる現在の細胞増殖条件は、多数の細胞を１１代継代で生成するのに十分である。さらに、データは、細胞が低密度培養条件（例えば、１，０００個の細胞／ｃｍ^２）で容易に増殖し得ることを示唆している。低酸素条件における臍帯組織由来細胞増殖も、細胞増殖を促進するが、細胞増殖能力の漸進的改善は、これらの成長条件を使用した場合に、観察されていない。現在、標準的な大気条件下で臍帯組織由来細胞を培養することが、細胞の大きな集まりを生成するのに好ましい。しかしながら、培養条件を変えた場合、細胞増殖は同様に変えられることができる。このストラテジーを用いて、これらの細胞集団の増殖および分化能力を高めることができる。

利用した条件下で、ＭＳＣおよび脂肪由来細胞の増殖能力は限られているが、臍帯組織由来細胞は、容易に多くの数まで増殖した。

参考文献
Ｈａｙｆｌｉｃｋ，”Ｔｈｅ ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ，” Ｊ Ａｍ Ｇｅｒｉａｔｒ Ｓｏｃ．，１９７４；２２；１−１２．
Ｈａｙｆｌｉｃｋ，“Ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ，” Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｉｓｔ，１９７４；１４（１）；３７−４５．
米国特許出願公開第２００４００５８４１２号
米国特許出願公開第２００４００４８３７２号
米国特許出願公開第２００４０００５７０４号。

実施例７
Ｄ‐バリン含有培地での細胞成長
細胞療法に使用される細胞株は、好ましくは、同種であり、いかなる汚染細胞型も含まない。細胞療法に使用されるヒト細胞は、正常な構造を有する、正常な数（４６個）の染色体を有していなければならない。同種であり、分娩後組織由来でない細胞を含まない、臍帯組織由来細胞株を識別するため、細胞サンプルの核型を分析した。

臍由来細胞（Ｐ５）および線維芽細胞（Ｐ９）を、５，０００個細胞／ｃｍ^２で、ゼラチンコートＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）において播種した。２４時間後、培地を取り除き、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で洗浄して、残りの培地を取り除いた。培地は、修飾成長培地（Ｄ−バリンを含むＤＭＥＭ（特注品 Ｇｉｂｃｏ）、１５％（ｖ／ｖ）透析ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、０．００１％（ｖ／ｖ）βメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、５０単位／ｍＬのペニシリン、および５０ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ））と取り替えられた。

Ｄ−バリン含有培地に播種された臍由来細胞および線維芽細胞は、透析血清を含有する成長培地に播種された細胞と異なり、増殖しなかった。線維芽細胞は形態学的に変化し、サイズが大きくなり、形状が変わった。細胞は全て死滅し、最終的には、４週間後にフラスコ表面から離れた。したがって、臍帯組織由来細胞は、細胞成長のため、および長期間の生存を維持するために、Ｌ−バリンを必要とすると結論付けることができる。Ｌ−バリンは、好ましくは、臍帯組織由来細胞については成長培地から取り除かれない。

参考文献
Ｈｏｎｇｐａｉｓａｎ，”Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｙ Ｄ−ｖａｌｉｎｅ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｍｙｏｍｅｔｒｉｕｍ，” Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔ．，２０００；２４；１−７
Ｓｏｒｄｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，”Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｍａｍｍａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｄ−ｖａｌｉｎｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｅｄｉｕｍ：ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，” Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔ Ｒｅｐ．，１９８８；１２；３５５−６４。

実施例８
細胞の核型分析
細胞療法に使用される細胞株は、好ましくは、同種であり、いかなる汚染細胞型も含まない。細胞療法に使用されるヒト細胞は、正常な構造を有する、正常な数（４６個）の染色体を有していなければならない。同種であり、分娩後組織由来でない細胞を含まない、臍帯組織由来細胞株を識別するため、細胞サンプルの核型を分析した。

オスの新生仔（ｍａｌｅ ｎｅｏｎａｔｅ）の組織からの臍帯組織由来細胞を成長培地で培養した。オスの新生仔からの臍帯組織（Ｘ、Ｙ）は、新生児由来細胞と母系由来細胞（Ｘ、Ｘ）との間で識別を行うように選択された。細胞は、１平方センチ当たり５，０００個の細胞で、Ｔ２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中、成長培地において播種され、８０％コンフルエンスまで増殖された。細胞を含有するＴ２５フラスコは、ネック部分まで成長培地を入れられた。サンプルは、臨床組織遺伝学研究所までクーリエにより送達された（研究所間の輸送時間は１時間と予測される）。染色体分析は、ニュージャージー州ニューアークのＮｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳｃｈｏｏｌにあるＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓにより行われた。細胞は、染色体が最もよく見える分裂中期の間に分析された。カウントされた分裂中期の２０個の細胞のうち、５個が、正常な同種核型数（２）について分析された。細胞サンプルは、２つの核型が観察された場合に同種であると特徴付けられた。細胞サンプルは、３つ以上の核型が観察された場合に異種であると特徴付けられた。異種性の核型数（４）が識別されると、追加の分裂中期細胞をカウントし、分析した。

染色体分析に送られた全細胞サンプルは、細胞遺伝学研究室のスタッフによって、正常外見を呈していると解釈された。分析された１６の細胞株のうち３つが、異種性の表現型（ＸＸおよびＸＹ）を表し、これは、新生児由来および母系由来の双方に由来する細胞が存在することを示している（表８−１）。細胞サンプルはそれぞれ、同種であると特徴付けられた（表８−１）。

略語：Ｎ−新生児側；Ｖ−絨毛領域；Ｍ−母系側；Ｃ−クローン

染色体分析は、臨床細胞遺伝学研究室により解釈されると、核型が正常である臍由来細胞を識別した。核型分析はまた、同種核型により判断される、母系性細胞を含まない細胞株も識別した。

実施例９
細胞表面マーカーのフローサイトメトリー評価
フローサイトメトリーによる細胞表面タンパク質または「マーカー」の特徴づけを用いて、細胞株の同一性を判断することができる。発現の一貫性は、複数のドナーから、また異なる処理および培養条件にさらされた細胞において、判断され得る。臍から単離された細胞株は、フローサイトメトリーにより特徴付けられ、これらの細胞株の同定のプロファイルを与えた。

細胞は、プラズマ処理されたＴ７５、Ｔ１５０、およびＴ２２５組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中、成長培地で、コンフルエントまで培養された。フラスコの成長表面は、２％（ｗ／ｖ）ゼラチン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を２０分間室温でインキュベートすることにより、ゼラチンによりコートされた。

フラスコ中の付着細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）；（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＭＯ）で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）で分離した。細胞を回収し、遠心分離し、ＰＢＳ中の３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳで、１ｘ１Ｏ^７／ｍＬの細胞濃度で再懸濁した。製造業者の仕様書に従って、目的の細胞表面マーカーに対する抗体（以下参照）が、１００μＬの細胞懸濁液に加えられ、混合物が、３０分間４℃で暗所においてインキュベートされた。インキュベーション後、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、遠心分離して、非結合抗体を除去した。細胞を、５００μＬのＰＢＳ中に再懸濁して、フローサイトメトリーにより分析した。

フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｕｒ器具（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて行った。

細胞表面マーカーに対する以下の抗体を使用した。

臍帯細胞は、８代継代、１５代継代、および２０代継代で分析された。

ドナー間の差異を比較するため、異なるドナー由来の臍帯由来細胞を互いに比較した。

ゼラチンコートフラスコで培養された臍帯由来細胞が、非コートフラスコで培養された臍帯由来細胞と比較された。

細胞の単離および準備に使用される４つの処理を比較した。１）コラゲナーゼ；２）コラゲナーゼ／ディスパーゼ；３）コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ；および４）コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ／ディスパーゼでの処理による、組織由来の細胞を比較した。

フローサイトメトリーで分析した、８代継代、１５代継代、および２０代継代における臍帯由来細胞は全て、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−αおよびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃを発現し、これは、ＩｇＧ対照に対する蛍光の増大で示される。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに対して陰性であり、これは、ＩｇＧ対照と一致する蛍光値により示される。

フローサイトメトリーにより分析された別個のドナーから単離された臍帯由来細胞はそれぞれ、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの産生に対して陽性を示し、これは、ＩｇＧ対照に対する蛍光値の増大に反映される。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの産生に対して陰性であり、蛍光値はＩｇＧ対照と一致した。

フローサイトメトリーにより分析された、ゼラチンコートフラスコおよび非コートフラスコで増殖した臍帯由来細胞は全て、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの産生に対して陽性であり、ＩｇＧ対照に対する蛍光値は増大した。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの産生に対しては陰性であり、蛍光値は、ＩｇＧ対照と一致していた。

フローサイトメトリーによる臍帯由来細胞分析は、これらの細胞株の同一性を証明した。これらの臍帯由来細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＰＤＧＦｒ−α、およびＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃに対して陽性であり、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに対して陰性である。この同一性は、ドナー、継代、培養容器表面コーティング、消化酵素および胎盤巣を含む変数の変動間で一致していた。個々の蛍光値のヒストグラム曲線平均および範囲におけるいくらかの変動が観察されたが、試験した全条件下での全ての正の曲線（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｕｒｖｅｓ）は、正常であり、ＩｇＧ対照より大きな蛍光値を発現したため、細胞は、マーカーの陽性発現を有する同種集団を含むことが、確認される。

実施例１０
オリゴヌクレオチドアレイによる細胞の分析
オリゴヌクレオチドアレイを使用して、臍由来細胞および胎盤由来細胞の遺伝子発現プロファイルを、線維芽細胞、ヒト間葉系幹細胞、およびヒト骨髄由来の別の細胞株と比較した。この分析により、細胞の特徴付けがもたらされ、これらの細胞に対する独自の分子マーカーが識別された。

組織由来細胞。ヒト臍帯および胎盤が、患者の同意を得て、正常満期分娩から、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）によって入手された。組織を受け取り、実施例５に記載するように細胞を単離した。細胞は、成長培地において、ゼラチンコート組織培養プラスチックフラスコ上で培養された。培養物は、３７℃、５％のＣＯ_２でインキュベートされた。

線維芽細胞。ヒトの皮膚の線維芽細胞を、Ｃａｍｂｒｅｘ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ；ロット番号９Ｆ０８４４）およびＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５０１（ＣＣＤ３９ＳＫ）から購入した。いずれの株も、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で培養した。細胞は、標準の組織処理プラスチック上で成長した。

ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）。ｈＭＳＣｓを、Ｃａｍｂｒｅｘ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ；ロット番号２Ｆ１６５５，２Ｆ１６５６および２Ｆ１６５７）から購入し、製造業者の仕様書に従って、ＭＳＣＧＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）で培養した。細胞は、標準の組織培養プラスチック上で３７℃、５％ＣＯ_２で成長した。

ヒト腸骨稜骨髄細胞（ＩＣＢＭ）。ヒト腸骨稜骨髄は、患者の同意を得てＮＤＲＩから受け取った。骨髄を、Ｈｏ， ｅｔ ａｌにより概説された方法に従って処理した（ＷＯ０３／０２５１４９）。骨髄は、溶解緩衝液（１５５ｍＭのＮＨ_４Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ_３、および０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）と、１部の骨髄：２０部の溶解緩衝液の割合で混合された。細胞懸濁液は、ボルテックスされ、周囲温度で２分間インキュベートされ、５００ｘｇで１０分間遠心分離された。上澄みを廃棄し、細胞ペレットを、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清および４ｍＭのグルタミンを補充された、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ−α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で再懸濁した。細胞をもう一度遠心分離し、細胞ペレットを、新鮮培地で再懸濁した。生存単核細胞が、トリパンブルー排除（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いてカウントされた。単核細胞は、組織培養プラスチックフラスコ中、５ｘ１０^４個の細胞／ｃｍ^２で播種された。細胞は、３７℃、５％ＣＯ_２で、標準の周囲Ｏ_２もしくは５％Ｏ_２で、インキュベートされた。細胞は、培地を変えずに５日間培養された。培地および非付着細胞を、培養から５日後に除去した。付着細胞は、培養物中に維持された。

細胞の、活発に成長する培養物は、冷たいリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、細胞スクレーパーによりフラスコから除去された。細胞を、３００ｘｇで５分間遠心分離した。上澄みを除去し、細胞を新鮮なＰＢＳ中に再懸濁し、再び遠心分離した。上澄みを除去し、細胞ペレットをすぐに冷凍し、−８０℃で保管した。細胞ｍＲＮＡが抽出され、ｃＤＮＡに転写された。ｃＤＮＡは次に、ｃＲＮＡに転写され、ビオチン標識された。ビオチン標識ｃＲＮＡは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰ ＨＧ−Ｕ１３３Ａ オリゴヌクレオチドアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）によりハイブリダイズされた。ハイブリダイゼーションおよびデータ収集を、製造業者の仕様書に従って行った。ハイブリダイゼーションおよびデータ収集を、製造業者の仕様書に従って行った。データ分析が、「Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」（ＳＡＭ）バージョン１．２１コンピューターソフトウェア（Ｔｕｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：５１１６−５１２１）を用いて行われた。

異なる細胞集団を、この研究では分析した。継代情報、培養基質、および培養培地と共に細胞を表１０−１に挙げる。

データは、前記のようにＳＡＭソフトウェアで、主要成分分析によって評価された。分析により、試験した細胞において異なる相対量で発現した２９０個の遺伝子が明らかになった。この分析により、集団間の相対比較がもたらされた。

表１０−２は、細胞対の比較のために計算されたユークリッド距離を示す。ユークリッド距離は、細胞型間で差次的に発現した２９０個の遺伝子に基づいた細胞の比較に基づいていた。ユークリッド距離は、２９０個の遺伝子の発現間の類似性に反比例している。

表１０−３、１０−４、および１０−５は、臍組織由来細胞で増加した遺伝子の発現（表１０−３）、胎盤由来細胞で増加した遺伝子の発現（表１０−４）、ならびに臍帯および胎盤由来細胞で減少した遺伝子の発現（表１０−５）を示す。

表１０−６、１０−７、および１０−８は、ヒト線維芽細胞（表１０−６）、ＩＣＢＭ細胞（表１０−７）、およびＭＳＣ（表１０−８）で増加した遺伝子の発現を示す。

本実施例は、臍帯および胎盤由来の細胞の分子の特徴づけをもたらすために実行された。この分析は、３つの異なる臍帯および３つの異なる胎盤由来の細胞を含んだ。研究はまた、２つの異なる皮膚線維芽細胞株、３つの間葉系幹細胞株、および３つの腸骨稜骨髄細胞株も含んだ。これらの細胞により発現されたｍＲＮＡは、オリゴヌクレオチドプローブを含むＧＥＮＥＣＨＩＰオリゴヌクレオチドアレイにおいて、２２，０００個の遺伝子について分析された。

分析により、２９０個の遺伝子の転写物が、これらの５つの異なる細胞型に、異なる量で存在することが明らかになった。これらの遺伝子は、臍組織由来細胞で特に増加した７個の遺伝子、および胎盤由来細胞で特に増加した１０個の遺伝子を含む。５４個の遺伝子が、胎盤および臍帯において特に低い発現レベルを有することが分かった。

選択された遺伝子の発現は、実施例１１に示すようにＰＣＲで確認された。一般的には、細胞、詳細には臍由来細胞は、例えば、ここで試験した骨髄由来細胞および線維芽細胞などの、他のヒト細胞と比較すると、別個の遺伝子発現プロファイルを有する。

実施例１１
細胞マーカー
臍帯由来の細胞の遺伝子発現プロファイルが、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰを用いて、他の供給源由来の細胞のものと比較された。６つの「シグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）」遺伝子が識別された、すなわち、酸化ＬＤＬレセプター１（oxidized LDL receptor 1）、インターロイキン−８（interleukin-8）（ＩＬ−８）、レニン（renin）、レティキュロン（reticulon）、ケモカインレセプターリガンド３（chemokine receptor ligand 3）（ＣＸＣリガンド３（CXC ligand 3））、および顆粒球走化性タンパク質２（granulocyte chemotactic protein 2）（ＧＣＰ−２）である。これらの「シグネチャー」遺伝子は、臍由来細胞において比較的高いレベルで発現した。

この実施例で説明される手順は、マイクロアレイデータを確認し、遺伝子およびタンパク質の発現についてデータを比較するため、ならびに、臍帯組織由来細胞について独自の識別子を検出する一連の確実なアッセイを確立するために、実行された。

臍由来細胞（４つの分離物（ｉｓｏｌａｔｅｓ））、および正常なヒトの皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ；新生児および成体）を、ゼラチンコートＴ７５フラスコで、成長培地において成長させた。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が、間葉系幹細胞成長培地Ｂｕｌｌｅｔキット（ＭＳＣＧＭ；Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で成長した。

ＩＬ−８実験について、細胞が、液体窒素から解凍され、ゼラチンコートフラスコに、５，０００個の細胞／ｃｍ^２で蒔かれ、成長培地で４８時間成長し、１０ｍＬの血清飢餓培地［ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ）、ペニシリン（５０単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）（Ｇｉｂｃｏ）、および０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ； Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）］で８時間さらに成長した。ＲＮＡを次に抽出し、上澄みを、１５０ｘｇで５分間、遠心分離して、細胞の残骸を除去した。上澄みを、ＥＬＩＳＡ分析まで−８０℃で凍らせた。

臍帯、ならびに、ヒト新生児包皮由来のヒト線維芽細胞を、ゼラチンコートＴ７５フラスコにおいて、成長培地で培養した。細胞は、液体窒素中で、１１代継代において凍らせた。細胞を解凍し、１５ｍＬ遠心分離チューブに移した。１５０ｘｇで５分間の遠心分離の後、上澄みを捨てた。細胞を、４ｍＬの培養培地中に再懸濁し、カウントした。細胞は、１５ｍＬの成長培地を含む７５ｃｍ^２フラスコにおいて、３７５，０００個の細胞／フラスコで２４時間、成長した。培地は、８時間かけて血清飢餓培地に変えた。血清飢餓培地は、インキュベーションの最後に収集され、１４，０００ｘｇで５分間遠心分離された（そして−２０℃で保管された）。

各フラスコ内の細胞数を見積もるため、２ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を各フラスコに加えた。細胞がフラスコから離れた後、トリプシン活性が、８ｍＬの成長培地で中和された。細胞を、１５ｍＬ遠心分離チューブに移し、１５０ｘｇで５分間、遠心分離した。上澄みを除去し、１ｍＬの成長培地を各チューブに加えて、細胞を再懸濁させた。細胞の数は、血球計数器により判断された。

細胞が血清飢餓培地中に分泌したＩＬ−８の量は、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を使用して分析された。全てのアッセイは、製造業者が提供する説明書に従って行われた。

ＲＮＡを、コンフルエントの臍帯由来細胞および線維芽細胞から、またはＩＬ−８発現のため、前記のとおり処理された細胞から、抽出した。細胞は、製造業者の説明書（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に従って、βメルカプトエタノールを含有する、３５０μＬの緩衝液ＲＬＴ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で溶解した。ＲＮＡは、製造業者の説明書（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に従って抽出され、デオキシリボヌクレアーゼ処置にかけられた（２．７単位／サンプル）（Ｓｉｇｍａ Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。ＲＮＡは、５０μＬのＤＥＰＣ処理水により溶出し、−８０℃で保管された。ＲＮＡはまた、ヒト臍帯からも抽出された。組織（３０ｍｇ）は、βメルカプトエタノールを含有する７００μＬの緩衝液ＲＬＴ中に懸濁された。製造業者の仕様書に従って、サンプルを機械的に均質化し、ＲＮＡ抽出を進めた。ＲＮＡは、５０μＬのＤＥＰＣ処理水で抽出され、−８０℃で保管された。

ＲＮＡは、ＴａｑＭａｎ逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）と共にランダムヘキサマーを使用して、２５℃で１０分間、３７℃で６０分間、９５℃で１０分間、逆転写された。サンプルを−２０℃で保管した。

ＣＤＮＡマイクロアレイによって、臍帯細胞で特異的に調節されたとして識別された遺伝子（シグネチャー遺伝子‐酸化ＬＤＬレセプター、インターロイキン−８、レニン、およびレティキュロンを含む）は、リアルタイムＰＣＲおよび従来のＰＣＲを使用して、さらに調べられた。

ＰＣＲは、商品名Ａｓｓａｙｓ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）遺伝子発現産物として販売される遺伝子発現産物を用いて、ｃＤＮＡサンプルに対して行われた。酸化ＬＤＬレセプター（Ｈｓ００２３４０２８）；レニン（ＨｓＯＯ１６６９１５）；レティキュロン（Ｈｓ００３８２５１５）；ＣＸＣリガンド３（Ｈｓ００１７１０６１）；ＧＣＰ−２（Ｈｓ００６０５７４２）；ＩＬ−８（Ｈｓ００１７４１０３）；およびＧＡＰＤＨが、７０００配列検出システムをＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７０００ ＳＤＳソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に使用して、製造業者の説明書（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、ｃＤＮＡおよびＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲマスターミックスと混合された。熱サイクル条件は、最初は、５０℃で２分間、および９５℃で１０分間で、その後、９５℃で１５秒間、および６０℃で１分間の４０サイクルが続いた。ＰＣＲデータは、製造業者の仕様書（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システムについてＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＵｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃２）に従って分析された。

従来のＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲからの結果を確認するため、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて行われた。ＰＣＲは、２μＬのｃＤＮＡ溶液（１ｘＴａｑポリメラーゼ（商品名：ＡＭＰＬＩＴＡＱ ＧＯＬＤ）ユニバーサルミックスＰＣＲ反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および初期変性を使用して、９４℃で５分間行われた。増幅が、各プライマーセットについて最適化された。ＩＬ−８、ＣＸＣリガンド３、およびレティキュロン（９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、および７２℃で３０秒を３０サイクル）；レニン（９４℃で１５秒間、５３℃で１５秒間、および７２℃で３０秒間を３８サイクル）；酸化ＬＤＬレセプターおよびＧＡＰＤＨ（９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、および７２℃で３０秒間を３３サイクル）。増幅に使用したプライマーを表１１−１に挙げる。最終ＰＣＲ反応におけるプライマー濃度は１マイクロモルであったが、これは、０．５マイクロモルであったＧＡＰＤＨを除く。ＧＡＰＤＨプライマーは、製造業者のＴａｑＭａｎプローブが最終ＰＣＲ反応に加えられなかったことを除けば、リアルタイムＰＣＲと同じであった。サンプルは、２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で分離され、臭化エチジウム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で染色された。画像が、単焦点ＰＯＬＡＲＯＩＤカメラ（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，Ｎ．Ｊ．）を使用して、６６７フィルム（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｔｗｉｎｐａｃｋ， ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，Ｎ．Ｊ．）に取り込まれた。

臍帯由来細胞が、４％（ｗ／ｖ）の冷パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で１０分間、室温にて固定された。０代継代（ＰＯ）（単離直後）および１１代継代（Ｐ１１）における臍帯由来細胞のそれぞれ１つの単離物（臍帯由来細胞の２つの単離物）、ならびに線維芽細胞（Ｐ１１）の単離物を使用した。免疫細胞化学は、以下のエピトープに対する抗体を用いて行った。エピトープは、ビメンチン（１：５００，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、デスミン（１：１５０；Ｓｉｇｍａ−ウサギに対して産生；または１：３００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ−マウスに対して産生）、α平滑筋アクチン（ＳＭＡ；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ；１：２００；Ｓｉｇｍａ）、およびＣＤ３４（ヒトＣＤ３４クラスＩＩＩ；１：１００；ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）である。さらに、以下のマーカーを、１１代継代臍帯由来細胞に対して試験した：抗−ヒトＧＲＯα−ＰＥ（１：１００；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、抗−ヒトＧＣＰ−２（１：１００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、抗−ヒト酸化ＬＤＬレセプター１（ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１；１：１００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、および抗−ヒトＮＯＧＡ−Ａ（１：１００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ）。

培養物を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、および０．３％（ｖ／ｖ）トリトン（トリトンＸ−１００；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むタンパク質遮断溶液に３０分間さらして、細胞内抗原にアクセスした。目的のエピトープが細胞表面（ＣＤ３４， ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１）に位置する場合、トリトンＸ−１００は、エピトープ損失を防ぐために手順の全工程で省略した。さらに、一次抗体がヤギ（ＧＣＰ−２，ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１，ＮＯＧＯ−Ａ）に対して産生される場合、３％（ｖ／ｖ）のロバ血清をプロセス全体にわたって、ヤギ血清の代わりに使用した。遮断溶液中で希釈された一次抗体を次に、１時間にわたり室温で培養物に加えた。一次抗体溶液を除去し、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）および／またはヤギ抗−ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ ４８８（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）またはロバ抗−ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共に遮断溶液（ｂｌｏｃｋ）を含む二次抗体溶液（室温で１時間）を加える前に、培養物をＰＢＳで洗浄した。培養物は次に洗浄され、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を１０分間適用して、細胞核を可視化する。

免疫染色後、Ｏｌｙｍｐｕｓ倒立落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）上で適切な蛍光フィルターを用いて、蛍光を可視化した。すべての場合において、陽性染色は、一次抗体溶液を適用したことを除いて前記に概説した手順全体に従った場合、対照染色を超えて蛍光信号を表した（１°対照なし）。代表的な画像が、デジタルカラービデオカメラ、およびＩｍａｇｅＰｒｏ ソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて取り込まれた。三重染色（ｔｒｉｐｌｅ−ｓｔａｉｎｅｄ）サンプルでは、各画像は、１回にただ１つの放出フィルターを使用して撮られた。層をなすモンタージュが次に、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて準備された。

フラスコ中の付着細胞が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で洗浄され、トリプシン／ＥＤＴＡ （Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により分離された。細胞を回収し、遠心分離し、１ｘ１０^７／ｍＬの細胞濃度で、ＰＢＳ中３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳで再懸濁させた。１００μＬのアリコートを円錐チューブへ送った。細胞内抗原について染色された細胞は、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で透過処理された。製造業者の仕様書のとおり、抗体を、アリコートに加え、細胞を、暗所で３０分間、４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離して、余分な抗体を除去した。二次抗体を必要とする細胞を、１００μＬの３％ＦＢＳで再懸濁した。二次抗体を、製造業者の仕様書に従って加え、細胞を、暗所で３０分間、４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離して、余分な二次抗体を除去した。洗浄した細胞を、０．５ｍＬのＰＢＳで再懸濁し、フローサイトメトリーにより分析した。以下の抗体を使用した：酸化ＬＤＬレセプター１（ｓｃ−５８１３；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＧＲＯａ（５５５０４２；ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）、マウスＩｇＧ１κ、（Ｐ−４６８５およびＭ−５２８４；Ｓｉｇｍａ）、およびロバ抗ヤギＩｇＧ（ｓｃ−３７４３；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．）。フローサイトメトリー分析が、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって行われた。

ヒト臍帯由来の細胞、成体および新生児線維芽細胞、ならびに間葉系幹細胞（ＭＳＣ）からのｃＤＮＡに対して行われた、選択された「シグネチャー」遺伝子に関するリアルタイムＰＣＲの結果は、レティキュロンおよび酸化ＬＤＬレセプター双方の発現が、臍由来細胞の方が、その他の細胞に比べて高かったことを示している。リアルタイムＰＣＲから得られたデータは、ΔΔＣＴ方法によって分析され、対数尺度で表示された。細胞と対照との間では、ＣＸＣリガンド３およびＧＣＰ−２の発現レベルに有意な差は見られなかった。リアルタイムＰＣＲの結果が、従来のＰＣＲにより確認された。ＰＣＲ産物の配列決定が、これらの観察をさらに確認した。表１１‐１に挙げた従来のＰＣＲ ＣＸＣリガンド３プライマーを使用して、細胞と対照との間で、ＣＸＣリガンド３の発現レベルに有意差は見られなかった。

臍帯細胞におけるサイトカイン、ＩＬ−８の発現は、成長培地で培養した臍帯由来細胞、および血清が欠乏した臍帯由来細胞の双方で、上昇した。リアルタイムＰＣＲデータ全てが、従来のＰＣＲで、またＰＣＲ産物を配列決定することによって、有効であった。

無血清培地で成長した後、馴化培地が、ＩＬ−８の存在について調べられた。最も多い量のＩＬ−８が、臍細胞が成長した培地で検出された（表１１−２）。ヒトの皮膚線維芽細胞が成長した培地では、ＩＬ−８が検出されなかった。

ＮＤ：不検出

０代継代でのヒト臍帯由来の細胞が、免疫細胞化学的分析によって、選択されたタンパク質の産生について調べられた。単離（０代継代）直後、細胞は、４％パラホルムアルデヒドで固定され、６個のタンパク質の抗体に曝露された。そのタンパク質は、フォン・ヴィルブランド因子、ＣＤ３４、サイトケラチン１８、デスミン、α−平滑筋アクチン、およびビメンチンである。臍帯由来細胞は、α−平滑筋アクチンおよびビメンチンに対して陽性であり、染色パターンは、１１代継代にわたり一貫していた。

１１代継代での臍帯由来細胞におけるＧＲＯα、ＧＣＰ−２、酸化ＬＤＬレセプター１およびレティキュロン（ＮＯＧＯ−Ａ）の産生を、免疫細胞化学により調べた。臍帯由来細胞は、ＧＣＰ−２陽性であったが、ＧＲＯαの産生は、この方法では検出されなかった。さらに、細胞は、ＮＯＧＯ−Ａ陽性であった。

マイクロアレイおよびＰＣＲ（リアルタイムおよび従来のもの）により測定された遺伝子発現レベル間の一致が、４つの遺伝子：酸化ＬＤＬレセプター１、レニン、レティキュロン、およびＩＬ−８について証明された。これらの遺伝子の発現は、臍帯由来細胞において、ｍＲＮＡレベルで差次的に調節され、ＩＬ−８も、タンパク質レベルで差次的に調節された。ＧＣＰ−２およびＣＸＣリガンド３の差次的発現は、ｍＲＮＡレベルでは確認されなかった。この結果は、マイクロアレイ実験からもともと入手されたデータを支持するものではないが、これは、方法の感受性における違いによるものであろう。

０代継代でのヒト臍帯由来の細胞が、α−平滑筋アクチンおよびビメンチンの発現について調べられ、この双方について陽性であった。染色パターンは、１１代継代にわたり保存された。

結論として、完全なｍＲＮＡデータは、マイクロアレイ実験から入手したデータを、少なくとも部分的に検証した。

実施例１２
細胞表現型の免疫組織化学的特徴付け
ヒト臍帯内で発見された細胞の表現型を、免疫組織化学的検査により分析した。

ヒト臍帯組織を回収し、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで一晩、４℃で浸漬固定した。免疫組織化学的検査が、以下のエピトープに対する抗体を用いて行われた（表１２−１を参照）。エピトープは、ビメンチン（１：５００；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、デスミン（１：１５０，ウサギに対して産生；Ｓｉｇｍａ；または１：３００，マウスに対して産生；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、α平滑筋アクチン（ＳＭＡ；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、サイトケラチン１８（ＣＫ１８；１：４００；Ｓｉｇｍａ）、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ；１：２００；Ｓｉｇｍａ）、およびＣＤ３４（ヒトＣＤ３４クラスＩＩＩ；１：１００；ＤＡＫＯＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）である。さらに以下のマーカーを試験した。そのマーカーは、抗−ヒトＧＲＯα−ＰＥ（１：１００；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、抗−ヒトＧＣＰ−２（１：１００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、抗−ヒト酸化ＬＤＬレセプター１（ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１；１：１００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、および抗ヒトＮＯＧＯ−Ａ（１：１００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）である。固定された検体は、メスで刈り込まれ、エタノールを含むドライアイス浴上で、ＯＣＴ包埋化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ ＯＣＴ；Ｓａｋｕｒａ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）の中に置かれた。凍結ブロックは、標準のクリオスタット（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて切開され（１０μｍ（１０ミクロン）厚さ）、染色のため、スライドガラスに載せられた。

免疫組織化学的検査が、先の研究と同様に行われた（例えば、Ｍｅｓｓｉｎａ、ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｅｘｐｅｒ． Ｎｅｕｒｏｌ． １８４：８１６−８２９）。組織切片を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ、４％（ｖ／ｖ）ヤギ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、および０．３％（ｖ／ｖ）トリトン（トリトンＸ−１００；Ｓｉｇｍａ）を含むタンパク質遮断溶液に１時間さらして、細胞内抗原にアクセスした。目的のエピトープが細胞表面（ＣＤ３４，ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１）上にある場合、トリトンは、エピトープ損失を防ぐために、手順の全工程で省略された。さらに、一次抗体がヤギ（ＧＣＰ−２，ｏｘ−ＬＤＬ Ｒ１，ＮＯＧＯ−Ａ）に対して産生される場合、３％（ｖ／ｖ）ロバ血清が、手順全体にわたってヤギ血清の代わりに使用された。遮断溶液で希釈された一次抗体は、次に、切片に４時間、室温で適用された。一次抗体溶液を除去し、培養物は、ヤギ抗−マウスＩｇＧ−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）および／またはヤギ抗−ウサギ ＩｇＧ−Ａｌｅｘａ ４８８（１：２５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）またはロバ抗−ヤギＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：１５０；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共に、遮断溶液を含有する二次抗体溶液を適用する（室温で１時間）前に、ＰＢＳで洗浄された。培養物を洗浄し、１０マイクロモルのＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を１０分間適用し、細胞核を可視化した。

免疫染色後、Ｏｌｙｍｐｕｓ倒立落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）上で適切な蛍光フィルターを用いて蛍光を可視化した。ポジティブ染色は、対照染色を上回って、蛍光信号により表された。代表的な画像が、デジタルカラービデオカメラ、およびＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて取り込まれた。三重染色（ｔｒｉｐｌｅ−ｓｔａｉｎｅｄ）サンプルでは、各画像は、１回にただ１つの放出フィルターを使用して撮られた。層をなすモンタージュが次に、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて準備された。

ビメンチン、デスミン、ＳＭＡ、ＣＫ１８、ｖＷＦおよびＣＤ３４マーカーが、臍帯内で発見された細胞の部分集団で発現した（データは不図示）。具体的には、ｖＷＦおよびＣＤ３４の発現は、臍帯に含まれる血管に制限された。ＣＤ３４＋細胞は、最も内側の層（管腔側）にあった。ビメンチン発現は、臍帯のマトリックスおよび血管全体で見られた。ＳＭＡは、動脈および静脈のマトリックスおよび外壁に限定されたが、血管自体には含まれなかった。ＣＫ１８およびデスミンは、血管内部のみで観察され、デスミンは、中間および外側の層に限定された。

ビメンチン、デスミン、α−平滑筋アクチン、サイトケラチン１８、フォン・ヴィルブランド因子、およびＣＤ３４は、ヒト臍帯内部の細胞で発現した。ビメンチンおよびα−平滑筋アクチンのみが発現したことを示す、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの特徴付けの研究に基づいて、データは、臍帯由来細胞単離の現行のプロセスにより細胞の部分集団が回収されること、または単離細胞が、マーカーの発現を変えて、ビメンチンおよびα−平滑筋アクチンを発現することを示唆している。

実施例１３
栄養因子の分泌
臍由来細胞からの、選択された栄養因子の分泌を測定した。血管新生活性を有する因子が選択された（すなわち肝細胞成長因子（ＨＧＦ）（Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ． Ｓｙｍｐ．２１２：２１５−２６）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−Ｉ）（Ｓａｌｃｅｄｏ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｂｌｏｏｄ ９６；３４−４０）、インターロイキン−８（ＩＬ−９）（Ｌｉ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７０：３３６９−７６）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００４） Ａｎｎ． Ｔｈｏｒａｃ． Ｓｕｒｇ．７７：８１２−８）、組織マトリックスメタロプロテイナーゼ抑制物質１（ＴＩＭＰ１）、アンジオポエチン２（ＡＮＧ２）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦｂｂ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヘパリン結合上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、間質由来因子１α（ＳＤＦ−１α））、神経栄養／神経保護活性（脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．２５８；３１９−３３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球走化性タンパク質−２（ＧＣＰ−２）、形質転換成長因子β２（ＴＧＦβ２））、またはケモカイン活性（マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ１α）、マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ１β）、単球走化性因子−１（ＭＣＰ−１）、Ｒａｎｔｅｓ（活性時に調節、発現および分泌された正常なＴ細胞）、Ｉ３０９、胸腺および活性調節ケモカイン（ＴＡＲＣ）、エオタキシン、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、ＩＬ−８）。

臍帯由来の細胞、ならびにヒト新生児の皮膚由来のヒト線維芽細胞が、成長培地中で、ゼラチンコートＴ７５フラスコにおいて培養された。細胞は、１１代継代で冷凍保存され、液体窒素中に保存された。解凍後、成長培地が細胞に加えられ、その後、１５ｍＬ遠心分離チューブに移され、細胞の遠心分離を１５０ｘｇで５分間行った。細胞ペレットが、４ｍＬの成長培地で再懸濁され、細胞をカウントした。細胞を、５，０００個の細胞／ｃｍ^２で、１５ｍＬの成長培地をそれぞれ含むＴ７５フラスコに播種し、２４時間培養した。培地を、無血清培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン（５０単位／ｍＬ）およびストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ，Ｇｉｂｃｏ））に８時間かけて変えた。無血清馴化培地が、１４，０００ｘｇで５分間の遠心分離によるインキュベーションの終わりに収集され、‐２０℃で保管された。

各フラスコ内の細胞数を見積もるため、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて分離した。８ｍＬの成長培地を加えることにより、トリプシン活性が抑制された。細胞を１５０ｘｇで５分間、遠心分離した。上澄みを除去し、細胞を、１ｍＬ成長培地で再懸濁した。細胞数は、血球計数器を用いて見積られた。

細胞は、５％二酸化炭素および大気中酸素中で、３７℃で成長した。各細胞サンプルにより産生されたＭＣＰ−１、ＩＬ−６、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１α、ＧＣＰ−２、ＩＬ−８、およびＴＧＦ−β２の量は、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によって判断された。すべてのアッセイは、製造業者の説明書に従って行われた。示された値は、１００万個の細胞当たりのピコグラム／ｍＬ（ｎ＝２，ｓｅｍ）であった。

ケモカイン（ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＭＣＰ−１、Ｒａｎｔｅｓ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、エオタキシン、ＭＤＣ、ＩＬ８）、ＢＤＮＦ、および血管新生因子（ＨＧＦ、ＫＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＩＭＰ１、ＡＮＧ２、ＤＧＦｂｂ、ＴＰＯ、ＨＢ−ＥＧＦが、Ｓｅａｒｃｈｌｉｇｈｔプロテオームアレイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）を用いて測定された。プロテオームアレイは、１つのウェル当たり２〜１６個のタンパク質の定量的測定をするための、多重サンドイッチＥＬＩＳＡである。アレイは、２ｘ２、３ｘ３、または４ｘ４パターンの、４〜１６個の異なる捕捉抗体を、９６ウェルプレートの各ウェルにスポッティングすることにより産生される。サンドイッチＥＬＩＳＡ手順の後、プレート全体が画像化され、プレートの各ウェル内部の各スポットで生成された化学発光信号を捕捉する。各スポットで生成された信号は、元の標準またはサンプルにおける標的タンパク質の量に比例する。

ＭＣＰ−１およびＩＬ−６が、臍由来細胞および皮膚線維芽細胞から分泌された（表１３−１）。ＳＤＦ−１αおよびＧＣＰ−２が線維芽細胞により分泌された。ＧＣＰ−２およびＩＬ−８は、臍由来細胞により分泌された。ＴＧＦ−β２は、ＥＬＩＳＡによってはいずれの細胞型からも検出されなかった。

略語：ＮＤ：不検出せず、＝／−ｓｅｍ

ＳｅａｒｃｈＬｉｇｈｔ多重ＥＬＩＳＡアッセイ。ＴＩＭＰ１、ＴＰＯ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＨＢＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＭＩＰ１β、ＭＣＰ１、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、およびＩＬ−８が細胞から分泌された（表１３−２および１３−３）。Ａｎｇ２、ＶＥＧＦ、またはＰＤＧＦｂｂは検出されなかった。

略語：ｈＦＢ（ヒト線維芽細胞）、Ｕ１（臍由来（０２２８０３））、Ｕ３（臍由来（０７１００３））
ＮＤ：不検出

略語：ｈＦＢ（ヒト線維芽細胞）、Ｕ１（臍由来（０２２８０３））、Ｕ３（臍由来（０７１００３））
ＮＤ：不検出

臍由来細胞は、いくつかの栄養因子を分泌した。これらの栄養因子の一部、例えばＨＧＦ、ｂＦＧＦ、ＭＣＰ−１およびＩＬ−８、は血管新生において重要な役割を果たす。他の栄養因子、例えば、ＢＤＮＦおよびＩＬ−６は、神経再生または保護に重要な役割を有する。

実施例１４
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ免疫学
免疫学的反応を予測しようとして、臍帯細胞株が、それらの免疫学的特徴についてｉｎ ｖｉｔｒｏで評価され、もしあれば、これらの細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ移植の際に引き出すであろう。臍帯細胞株は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２の発現についてフローサイトメトリーによりアッセイされた。これらのタンパク質は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）により発現され、未処理ＣＤ４^＋Ｔ細胞の直接刺激のために必要である（Ａｂｂａｓ ＆ Ｌｉｃｈｔｍａｎ， ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ， ５ｔｈ Ｅｄ．（２００３） Ｓａｕｎｄｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ｐ．１７１）。細胞株はまた、ＨＬＡ−Ｇ（Ａｂｂａｓ ＆ Ｌｉｃｈｔｍａｎ， ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，５ｔｈ Ｅｄ． （２００３） Ｓａｕｎｄｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ｐ．１７１）；ＣＤ１７８（Ｃｏｕｍａｎｓ ｅｔ．ａｌ、（１９９９） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２４、１８５−１９６）；およびＰＤ−Ｌ２（Ａｂｂａｓ ＆ Ｌｉｃｈｔｍａｎ，ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，５ｔｈ Ｅｄ． （２００３） Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐ．１７１；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ． ａｌ． （２００３） Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７０，１２５７−１２６６）の発現について、フローサイトメトリーによって分析された。胎盤組織にある細胞によるこれらのタンパク質の発現は、子宮内での胎盤組織の免疫特権状態を媒介すると考えられる。どの程度まで臍由来細胞株がｉｎ ｖｉｖｏで免疫反応を引き出すかを予測するため、細胞株は、一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で試験された。

細胞は、２％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でコートされたＴ７５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中で、コンフルエントになるまで、成長培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）；（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、０．００１％（ｖ／ｖ）βメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、５０単位／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））で培養された。

細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で分離した。細胞を回収し、遠心分離し、ＰＢＳ中の３％（ｖ／ｖ）ＦＢＳで、１ｘ１Ｏ^７／ｍＬの細胞濃度で再懸濁した。抗体（表１４−１）が、製造業者の仕様書のとおりに、１００μＬの細胞懸濁液に加えられ、暗所で３０分間、４℃でインキュベートされた。インキュベーション後、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、遠心分離して、非結合抗体を除去した。細胞は、５００μＬのＰＢＳ中で再懸濁され、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ器具（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いてフローサイトメトリーによって分析された。

細胞株「Ａ」と標識された、１０代継代の臍帯由来細胞の冷凍保存バイアルが、ドライアイス上で、ＣＴＢＲ（Ｓｅｎｎｅｖｉｌｌｅ，Ｑｕｅｂｅｃ）に送られて、ＣＴＢＲ ＳＯＰ ｎｏ．ＣＡＣ−０３１を用いて混合リンパ球反応を行った。末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）が、複数の男性及び女性のボランティアドナーから収集された。刺激剤（ドナー）同種ＰＢＭＣ、自家ＰＢＭＣ、および細胞株が、マイトマイシンＣで処理された。自家およびマイトマイシンＣで処理した刺激細胞が、反応者（レシピエント）ＰＢＭＣに加えられ、４日間培養された。インキュベーション後、［^３Ｈ］チミジンが各サンプルに加えられ、１８時間培養された。細胞の回収後、放射標識ＤＮＡが抽出され、［^３Ｈ］チミジンの取り込みが、シンチレーションカウンターを用いて測定された。

同種ドナー（ＳＩＡＤ）の刺激指数が、レシーバー＋マイトマイシンＣ処理同種ドナーをレシーバーのベースライン増殖で割ったものの平均増殖として、計算された。臍帯由来細胞の刺激指数が、レシーバーのベースライン増殖で割った、レシーバー＋マイトマイシンＣ処理細胞株の平均増殖として計算された。

６個のヒトボランティア血液ドナーがスクリーニングされて、残りの５つの血液ドナーとの混合リンパ球反応で強い増殖反応を示すであろう単一の同種ドナーを識別した。このドナーは、同種陽性対照ドナーとして選択された。残りの５つの血液ドナーは、レシピエントとして選択された。同種陽性対照ドナーおよび臍帯由来細胞株は、マイトマイシンＣ処理され、５個の個々の同種レシーバーとの混合リンパ球反応において培養された。反応は、プレート当たり３つのレシーバーで２つの細胞培養プレートを用いて３回行われた（表１４−２）。平均刺激指数は、６．５（プレート１）〜９（プレート２）の範囲であり、同種ドナー陽性対照は、４２．７５（プレート１）〜７０（プレート２）の範囲であった（表１４−３）。

フローサイトメトリーにより分析された臍帯由来細胞のヒストグラムは、ＩｇＧ対照と一致した蛍光値により示されるように、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２の陰性発現を示し、このことは、臍帯由来細胞株には、同種ＰＢＭＣを直接刺激するのに必要な細胞表面分子がないこと（例えば、ＣＤ４^＋Ｔ細胞）を示している。

フローサイトメトリーにより分析された臍帯由来細胞のヒストグラムは、ＩｇＧ対照に対する蛍光値の増大に示されるように、ＰＤ−Ｌ２の陽性発現を示し、また、ＩｇＧ対照と一致した蛍光値により示されるように、ＣＤ１７８およびＨＬＡ−Ｇの陰性発現を示した。

臍帯由来細胞株で実施された混合リンパ球反応では、平均刺激指数は、６．５〜９の範囲であり、同種陽性対照では、４２．７５〜７０の範囲であった。臍帯由来細胞株は、フローサイトメトリーにより測定された場合に、刺激タンパク質ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２の発現について陰性であった。臍帯由来細胞株はまた、フローサイトメトリーにより測定された場合に、免疫調節タンパク質ＨＬＡ−ＧおよびＣＤ１７８の発現には陰性で、ＰＤ−Ｌ２の発現には陽性であった。同種ドナーＰＢＭＣは、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＲ、ＤＱ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＢ７−Ｈ２を発現する抗原提示細胞を含み、それにより、同種ＰＢＭＣの刺激を可能にする（例えば未処理のＣＤ４^＋Ｔ細胞）。同種のＰＢＭＣ（例えば未処理のＣＤ４^＋Ｔ細胞）の直接刺激に必要な臍帯由来細胞上の抗原提示細胞表面分子がないこと、ならびに免疫調節タンパク質ＰＤ−Ｌ２の存在は、同種対照と比較した場合に、ＭＬＲ中でこれらの細胞により示される低い刺激指数の説明となる。

参考文献
Ｂｒｕｄｅｒ ｅｔ ａｌ． ＵＳＰ６，３５５，２３９ Ｂ１（２００２）
Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 、５ｔｈ Ｅｄ． （２００３） Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ｐ． １７１．
Ｂｏｕｔｅｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｃｅｎｔａ，２００３；２４：Ｓ１０−Ｓ１５．
Ｃｏｕｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ 、１９９９；２２４：１８５−１９６．
Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 、２００３；１７０：１２５７−１２６６．

〔実施の態様〕
（１） 馴化培地を準備する方法において、
哺乳動物の臍帯組織由来細胞（ＵＴＣ）を培養培地に播種することと、
前記培養培地の血清含量を減らすことと、
前記培養培地から無血清基本培地に前記ＵＴＣを移すことと、
前記無血清基本培地で前記ＵＴＣを成長させることと、
前記無血清基本培地から前記ＵＴＣを単離し馴化培地を残すことと、
を含む、方法。
（２） 実施態様１に記載の方法において、
前記ＵＴＣは最大２４時間、前記無血清基本培地で成長する、方法。
（３） 実施態様１に記載の方法において、
前記馴化培地は、ろ過される、方法。
（４） 実施態様３に記載の方法において、
前記馴化培地は、約２２μｍ（約２２ミクロン）のフィルターを用いてろ過される、方法。
（５） 実施態様１に記載の方法において、
前記馴化培地は、濃縮される、方法。

（６） 実施態様５に記載の方法において、
前記馴化培地は、カットオフ膜で濃縮される、方法。
（７） 実施態様６に記載の方法において、
前記カットオフ膜は、約８．３×１０^−２１ｇ（約５ｋＤａ）のカットオフ膜である、方法。
（８） 実施態様１に記載の方法において、
前記血清含量を減らすことは、前記ＵＴＣを前記培養培地から離すことを含む、方法。
（９） 実施態様８に記載の方法において、
前記離すことは、前記培養培地の血清含量を徐々に（in increments）減らすことを含む、方法。
（１０） 実施態様９に記載の方法において、
前記血清含量は、約５％〜約６０％の増分で（in increments of）減らされる、方法。

（１１） 実施態様９に記載の方法において、
前記血清含量は、約５０％の増分で減らされる、方法。
（１２） 実施態様９に記載の方法において、
前記ＵＴＣは、約１〜３継代にわたり各増分で成長する、方法。
（１３） 実施態様１２に記載の方法において、
前記ＵＴＣは、約２継代にわたり各増分で成長する、方法。
（１４） 実施態様１に記載の方法において、
前記培養培地は、静置培養である、方法。
（１５） 実施態様１に記載の方法において、
前記培養培地は、マイクロキャリアビーズ培養である、方法。

（１６） 実施態様１に記載の方法において、
標準培養培地で前記ＵＴＣを予備的に培養することと、
播種前に前記標準培養培地から前記ＵＴＣを単離することと、
をさらに含む、方法。
（１７） 実施態様１に記載の方法において、
前記ＵＴＣは、ヒト臍帯組織由来細胞である、方法。
（１８） 馴化培地を準備する方法において、
単離された哺乳動物の臍組織由来細胞（ＵＴＣ）を培養培地に提供することと、
１つまたは複数の増分段階で、前記培養培地の血清含量を減らすことと、
前記血清含量が所定レベルに達したら、血清含量減少培地から無血清基本培地に前記ＵＴＣを移すことと、
２４時間以下で前記無血清基本培地において前記ＵＴＣを成長させることと、
前記無血清基本培地から前記ＵＴＣを単離し馴化培地を残すことと、
を含む、方法。
（１９） 実施態様１８に記載の方法において、
前記移すことは、前記ＵＴＣを前記培養培地から離すことを含む、方法。
（２０） 実施態様１８に記載の方法において、
前記移すことは、前記血清減少培養培地を前記無血清基本培地と置き換えることを含む、方法。

（２１） 実施態様１８に記載の方法において、
前記馴化培地をろ過すること、
をさらに含む、方法。
（２２） 実施態様１８に記載の方法において、
前記馴化培地を濃縮すること、
をさらに含む、方法。
（２３） 実施態様１８に記載の方法において、
前記ＵＴＣは、ヒト臍帯組織由来細胞である、方法。
（２４） ヒト臍組織由来細胞（ＵＴＣ）を培養培地に播種することで生成される馴化培地において、
前記培養培地の血清含量は、前記ＵＴＣを無血清基本培地に移す前に減少し、
前記ＵＴＣはその後、前記無血清基本培地から単離されて、馴化培地を残す、馴化培地。
（２５） 実施態様２４に記載の馴化培地において、
前記ＵＴＣは、最大２４時間、前記無血清基本培地で成長する、馴化培地。

（２６） 実施態様２４に記載の馴化培地において、
前記馴化培地は、ろ過される、馴化培地。
（２７） 実施態様２６に記載の馴化培地において、
前記馴化培地は、約２２μｍ（約２２ミクロン）のフィルターを用いてろ過される、馴化培地。
（２８） 実施態様２４に記載の馴化培地において、
前記馴化培地は、濃縮される、馴化培地。
（２９） 実施態様２８に記載の馴化培地において、
前記馴化培地は、カットオフ膜で濃縮される、馴化培地。
（３０） 実施態様２９に記載の馴化培地において、
前記カットオフ膜は、約８．３×１０^−２１ｇ（約５ｋＤａ）のカットオフ膜である、馴化培地。

（３１） 実施態様２４に記載の馴化培地において、
前記血清含量を減らすことは、前記ＵＴＣを前記培養培地から離すことを含む、馴化培地。
（３２） 実施態様３１に記載の馴化培地において、
前記離すことは、徐々に前記培養培地の血清含量を減らすことを含む、馴化培地。
（３３） 実施態様３２に記載の馴化培地において、
前記血清含量は、約５％〜約６０％の増分で減らされる、馴化培地。
（３４） 実施態様３３に記載の馴化培地において、
前記血清含量は、約５０％の増分で減らされる、馴化培地。
（３５） 実施態様３２に記載の馴化培地において、
前記ＵＴＣは、約１〜３継代にわたり各増分で成長する、馴化培地。

（３６） 実施態様３５に記載の馴化培地において、
前記ＵＴＣは、約２継代にわたり各増分で成長する、馴化培地。
（３７） 実施態様２４に記載の馴化培地において、
前記培養培地は、静置培養である、馴化培地。
（３８） 実施態様２４に記載の馴化培地において、
前記培養培地は、マイクロキャリアビーズ培養である、馴化培地。
（３９） 実施態様２４に記載の馴化培地において、
標準培養培地で前記ＵＴＣを予備的に培養することと、
播種前に前記標準培養培地から前記ＵＴＣを単離することと、
をさらに含む、馴化培地。
（４０） 実施態様２４に記載の馴化培地において、
前記ＵＴＣは、ヒト臍帯組織由来細胞である、馴化培地。

実施例２の結果を示す。 実施例３の結果を示す。

Claims (38)

1. 馴化培地を準備する方法において、
   哺乳動物の臍帯組織由来細胞（ＵＴＣ）を培養培地に、１以上の増分ステップで播種することと、
   前記培養培地の血清含量を減らすことと、
   前記培養培地から無血清基本培地に前記ＵＴＣを移すことと、
   前記無血清基本培地で前記ＵＴＣを、２４時間以内で成長させることと、
   前記無血清基本培地から前記ＵＴＣを単離し馴化培地を残すことと、
   を含み、
   その結果、前記単離された馴化培地中の前記培養培地に由来する血清タンパク質は、標準的な特徴付け方法の検出限界を下回る量で存在するようになる、
   方法。
2. 請求項１に記載の方法において、
   前記馴化培地は、ろ過される、方法。
3. 請求項２に記載の方法において、
   前記馴化培地は、２２μｍ（２２ミクロン）のフィルターを用いてろ過される、方法。
4. 請求項１に記載の方法において、
   前記馴化培地は、濃縮される、方法。
5. 請求項４に記載の方法において、
   前記馴化培地は、カットオフ膜で濃縮される、方法。
6. 請求項５に記載の方法において、
   前記カットオフ膜は、８．３×１０^−２１ｇ（５ｋＤａ）のカットオフ膜である、方法。
7. 請求項１に記載の方法において、
   前記血清含量を減らすことは、前記ＵＴＣを段階的に適応させることを含む、方法。
8. 請求項１に記載の方法において、
   前記血清含量は、増分のそれぞれのステップで、５％〜６０％の増分で減らされる、方法。
9. 請求項１に記載の方法において、
   前記血清含量は、増分のそれぞれのステップで、５０％の増分で減らされる、方法。
10. 請求項１に記載の方法において、
    前記ＵＴＣは、増分の結果減少した血清含量を持つそれぞれの培地中、１〜３継代にわたり成長する、方法。
11. 請求項１０に記載の方法において、
    前記ＵＴＣは、増分の結果減少した血清含量を持つそれぞれの培地中、２継代にわたり成長する、方法。
12. 請求項１に記載の方法において、
    前記培養培地は、静置培養である、方法。
13. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法において、
    前記培養培地は、マイクロキャリアビーズ培養である、方法。
14. 請求項１に記載の方法において、
    標準培養培地で前記ＵＴＣを予備的に培養することと、
    播種前に前記標準培養培地から前記ＵＴＣを単離することと、
    をさらに含む、方法。
15. 請求項１に記載の方法において、
    前記ＵＴＣは、ヒト臍帯組織由来細胞である、方法。
16. 馴化培地を準備する方法において、
    単離された哺乳動物の臍組織由来細胞（ＵＴＣ）を培養培地に提供することと、
    １つまたは複数の増分段階で、前記培養培地の血清含量を減らすことと、
    前記血清含量が所定レベルに達したら、血清含量減少培地から無血清基本培地に前記ＵＴＣを移すことと、
    ２４時間以下で前記無血清基本培地において前記ＵＴＣを成長させることと、
    前記無血清基本培地から前記ＵＴＣを単離し馴化培地を残すことと、
    を含み、
    その結果、前記単離された馴化培地中の前記培養培地に由来する血清タンパク質は、標準的な特徴付け方法の検出限界を下回る量で存在するようになる、
    方法。
17. 請求項１６に記載の方法において、
    前記移すことは、前記ＵＴＣを段階的に適応させることを含む、方法。
18. 請求項１６に記載の方法において、
    前記移すことは、前記血清減少培養培地を前記無血清基本培地と置き換えることを含む、方法。
19. 請求項１６に記載の方法において、
    前記馴化培地をろ過すること、
    をさらに含む、方法。
20. 請求項１６に記載の方法において、
    前記馴化培地を濃縮すること、
    をさらに含む、方法。
21. 請求項１６に記載の方法において、
    前記ＵＴＣは、ヒト臍帯組織由来細胞である、方法。
22. ヒト臍組織由来細胞（ＵＴＣ）を培養培地に播種することで生成される馴化培地において、
    前記培養培地の血清含量は、前記ＵＴＣを無血清基本培地に移す前に、１以上の増分ステップで減少し、
    前記ＵＴＣはその後、前記無血清基本培地から単離されて、馴化培地を残し、
    その結果、前記単離された馴化培地中の前記培養培地に由来する血清タンパク質は、標準的な特徴付け方法の検出限界を下回る量で存在する、
    馴化培地。
23. 請求項２２に記載の馴化培地において、
    前記ＵＴＣは、最大２４時間、前記無血清基本培地で成長する、馴化培地。
24. 請求項２２に記載の馴化培地において、
    前記馴化培地は、ろ過される、馴化培地。
25. 請求項２４に記載の馴化培地において、
    前記馴化培地は、２２μｍ（２２ミクロン）のフィルターを用いてろ過される、馴化培地。
26. 請求項２２に記載の馴化培地において、
    前記馴化培地は、濃縮される、馴化培地。
27. 請求項２６に記載の馴化培地において、
    前記馴化培地は、カットオフ膜で濃縮される、馴化培地。
28. 請求項２７に記載の馴化培地において、
    前記カットオフ膜は、８．３×１０^−２１ｇ（５ｋＤａ）のカットオフ膜である、馴化培地。
29. 請求項２２に記載の馴化培地において、
    前記血清含量を減らすことは、前記ＵＴＣを段階的に適応させることを含む、馴化培地。
30. 請求項２２に記載の馴化培地において、
    前記血清含量は、増分のそれぞれのステップで、５％〜６０％の増分で減らされる、馴化培地。
31. 請求項３０に記載の馴化培地において、
    前記血清含量は、増分のそれぞれのステップで、５０％の増分で減らされる、馴化培地。
32. 請求項２２に記載の馴化培地において、
    前記ＵＴＣは、増分の結果減少した血清含量を持つそれぞれの培地中、１〜３継代にわたり成長する、馴化培地。
33. 請求項３２に記載の馴化培地において、
    前記ＵＴＣは、増分の結果減少した血清含量を持つそれぞれの培地中、２継代にわたり各増分で成長する、馴化培地。
34. 請求項２２に記載の馴化培地において、
    前記培養培地は、静置培養である、馴化培地。
35. 請求項２２〜３３のいずれか１項に記載の馴化培地において、
    前記培養培地は、マイクロキャリアビーズ培養である、馴化培地。
36. 請求項２２に記載の馴化培地において、
    標準培養培地で前記ＵＴＣを予備的に培養することと、
    播種前に前記標準培養培地から前記ＵＴＣを単離することと、
    をさらに含む、馴化培地。
37. 請求項２２に記載の馴化培地において、
    前記ＵＴＣは、ヒト臍帯組織由来細胞である、馴化培地。
38. 請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の方法において、
    前記培養培地はマイクロキャリアビーズ培養である、方法。

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