JP2005514926A - 新規ほ乳類多分化能幹細胞および組成物、その調製方法および投与方法 - Google Patents

新規ほ乳類多分化能幹細胞および組成物、その調製方法および投与方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、新規ほ乳類多分化能幹細胞（ＭＳＣ）、その組成物を調製する方法、およびその細胞を調製し投与する方法に関する。特に、本発明は、新規ほ乳類多分化能幹細胞、その医薬組成物、およびその細胞を調製し投与する方法を有利に提供する。本発明は、ＡＰＰおよびｒｅｅｌｉｎレベルの変化により多分化能幹相棒の移動および／または分化を変更する方法も有利に提供する。さらに、本発明は、本発明の方法および細胞を用いて生化学製品を製造する方法も有利に提供する。

Description

この出願は、それぞれ出典明示して本明細書の一部とみなされる以下の米国仮特許出願：２００２年１月１４日付け出願の第６０／３４８,４７３号、２００２年２月１９日付け出願の第６０／３５７,７８３号、２００２年４月２９日付け出願の第６０／３７６,２５７号、２００２年５月８日付け出願の第６０／３８１,１３８号、２００２年８月１９日付け出願の第６０／４０４,３６１号、２００２年１２月２日付け出願の第６０／４３０,３８１号に関連する。
本発明は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)を通じて、認証番号Ｒ０３−ＡＧ１９８７４号として米国政府の援助を受けてなされた。本発明において政府は特定の権利を有する。
１．発明の分野
本発明は、新規ほ乳類多分化能幹細胞（ＭＳＣ）、その組成物およびそれらの組成物を調製する方法および投与する方法に関する。一つの局面において、本発明は、低発生能細胞から高発生能細胞を作製する方法に関する。もう一つの局面において、本発明は、本発明により調製した細胞に関する。もう一つの局面において、本発明は、本発明の高発生能細胞を含む医薬組成物に関する。もう一つの局面において、本発明は、本発明の高発生能細胞を含む細胞または組織再生用の細胞製剤に関する。もう一つの局面において、本発明は、本発明の高発生能細胞をその必要性がある動物の組織に投与するステップを含む細胞または組織を再生する方法に関する。もう一つの局面において、本発明は、本発明の高発生能細胞または本発明により作製された最終分化細胞をその必要のあるヒトを含む動物に投与するステップを含む神経学的または身体的な欠損のあるヒトまたは動物を治療する方法に関する。もう一つの局面において、本発明は、本発明の高発生能細胞を利用する最終分化細胞の作製方法および使用方法に関する。もう一つの局面において、本発明は、細胞の表現型を変化させる方法に関する。
２．関連技術の背景
幹細胞は、しばしば、自己再生的(self-renewing)で多分化能であると定義され、様々な型の分化細胞を発生させる能力を有する。したがって、それらは神経学的および身体的な欠損や、加齢、疾患、外傷その他の要因による組織機能のいかなる喪失または減少の治療においても有望である。しかしながら、そのような治療は依然として実質的に克服すべき重大な障害に直面している。
ＮＳＣおよび神経学的欠損
幹細胞置換療法の一つの重要な主眼は神経学的障害にあり、神経幹細胞、特に、胎児神経幹細胞が主要な調査対象である。中枢神経系（ＣＮＳ）の分化中、神経幹細胞（ＮＳＣ）としても知られている多分化能神経幹細胞（ＭＮＳＣ）は増殖し、最終的にニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトを含む成体脳を構成する細胞型に分化する過渡的に分裂する始原細胞を生じる。ＮＳＣは、マウス、ラット、ブタおよびヒトを含むいくつかのほ乳類種から単離されている。例えば、国際出願公開番号ＷＯ９３／０１２７５、ＷＯ９４／０９１１９、ＷＯ９４／１６７１８、および［Cattaneo et al., 1996, Mol. Brain Res. 42: 161-66］を参照せよ。胚性および成体齧歯類中枢神経系（ＣＮＳ）由来のＮＳＣが単離されていて、さらに様々な培養系でイン・ビトロ繁殖されている。例えば、［Frolichsthal-Shoeller et al., 1999, NeuroReport 10: 345-351］；［Doetsch et al., 1999, Cell 97: 703-716］を参照せよ。ヒト胎児脳由来のＮＳＣは上皮増殖因子（ＥＧＦ）および／または塩基性線維芽増殖因子（ｂＦＧＦ）が補充された無血清培地を用いて培養されている。例えば、［Svendsen et al., 1998, J. Neuroscience Methods 85:141-152； Carpenter et al., 1999, Experimental Neurology 158: 265-278］を参照せよ。これらの無血清、分裂促進因子補充法を利用して培養されたＮＳＣは、通常、実質的に未分化クラスター凝集体を形成する。分裂促進因子の除去および基質の供給により、幹細胞はニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトに分化する。
神経回路に関与するシナプス結合は個体の生涯を通して変化し続けるが、シナプス可塑性および細胞死のため、神経組織発生、すなわち、新たなニューロンの発生は出生後早期に完成すると考えられた。成体脳におけるＭＮＳＣの発見（例えば、［Alvarez-Buylla et al, 1997, J. Neurobiology 33: 585-601； Gould et al., 1999, Science 286: 548-552］を参照せよ。）は神経組織発生に関する理論に著しい変化をもたらした。それは、成体脳におけるＭＮＳＣの存在が生涯を通してニューロンの発生が起こり得ることを示唆するからである。それにもかかわらず、加齢、肉体的および生物学的外傷または神経変性症関連脳機能喪失（ここでは、「神経学的欠損」という）は内在性神経組織発生によるいかなる潜在的回復効果よりも遙かに勝る。その結果、加齢、肉体的および生物学的外傷または神経変性症（すなわち、神経学的欠損）による脳機能の喪失または適当な脳機能の喪失を被る患者にとって、ＮＳＣの移植は潜在的に価値ある治療である。
人々の平均年齢が上昇し、年齢上昇に付随して同時に上昇する神経学的欠損の発生のため、神経変性症の治療が主たる懸念となっている。アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病およびパーキンソン病を含むそのような疾患は脳の特定部位のニューロン変性に関連付けられ、ニューロナル・シグナリングに重要な神経伝達物質を合成および放出する脳領域の不能を引き起こす。
神経変性は、年齢に関連するまたは関連しない多くの病気および疾患を含み、ニューロン喪失をもたらす。これらの病気は、脳卒中およびてんかんのごときＣＮＳ外傷ならびに筋萎縮性側索硬化症および脳性麻痺を含むニューロン喪失をもたらす疾患を含む。
基底神経節として知られている脳領域における変性は、病変の正確な部位に応じて様々な異なる認識および運動症状の疾患を引き起こし得る。基底神経節は、（尾状核および被殻からなる）線状体、淡蒼球、黒質、無名質、腹側淡蒼球、マイネルト基底核、腹側被蓋野および視床下核を含む多くの別個の領域からなる。
基底神経節における変性は運動欠損ももたらし得る。例えば、ハンチントン舞踏病は線状体のニューロン変性に関連して、不随意反射動作をもたらす。視床下核と呼ばれる小領域の変性は、バリスムと呼ばれる病気における四肢の激しい振り動かし動作に関連し、一方、被殻および淡蒼球における変性は、ゆっくりとした悶え動作の病気、すなわちアテトーシスに関連する。パーキンソン病において、変性は基底神経節の別の領域、黒質緻密部に見られる。通常、ドパミン作動性連結がこの領域から背側線状体まで走り、それは運動を調節するのに重要である。パーキンソン病の治療はこの回路に対するドパミン活性を回復させることを中心とする。
アルツハイマー病患者は、前脳および大脳皮質の深部細胞変性を発症する。さらに、基底神経節の局在領域であるマイネルト基底核が選択的に変性されるようである。通常、コリン作動性神経投射がこの核から記憶を含む認識機能に関与すると考えられている大脳皮質まで走る。
ほとんどのＣＮＳ療法の目的は、細胞変性による特定の化学機能または酵素活性の喪失を回復させることにある。医薬組成物の投与がＣＮＳ不全の主たる治療であった。残念ながら、このタイプの治療は、血液脳関門を横切って薬物を輸送する能力の限界、これらの薬物を長期間投与する患者に獲得された薬物耐性を含む多くの難問を抱える。
多分化能幹細胞の移植は、定量薬物投与対してのみならず、血液脳関門によって余儀なくされる複雑なドラッグデリバリーシステムに対しても、その必要を回避する。しかしながら、実際には、この技術にも重要な限界が見つかった。まず、供給者からの分化細胞の細胞表面分子を保持する移植用細胞が受給者中で免疫反応を誘導し得、脳の変調をきたした領域に直接細胞を注入することによって引き起こされた物理的損傷によって悪化されるという問題である。さらに、神経幹細胞は、それらが隣接細胞と正常な神経連結を形成できる発達段階になければならない。これらの理由により、神経移植は胎児細胞の使用を中心とする。
ほ乳類の胎児脳組織が直接移植に対して適度の生存特性を有することが証明されている。胎児ニューロンの増大した生存可能性は、成体ニューロンと比較して胎児ニューロンは無酸素症に対する罹病性が低いことによると考えられている。胎児細胞の生存率に有利に働くさらなる要因は、胎児細胞上の細胞表面マーカーの欠如であり、その存在は成体からの移植組織の拒絶をもたらす。しかしながら、脳が免疫学上特権的な部位であると考えられているにもかかわらず、胎児組織でさえもある程度の拒絶が発生する。それゆえ、異種胎児組織を使用する能力は、組織拒絶および免疫抑制剤の必要性によって制限される。
大量の未発育胎児組織の使用には別の困難性も存在する。胎児ＣＮＳ組織は１を超える細胞型からなり、かくして十分に特徴付けられた細胞源ではない、さらに、移植のために胎児組織を十分かつ一定量供給することができるかについて疑わしい。例えば、ＭＰＴＰ誘発パーキンソン症候群の治療において、一人の患者の脳にうまく移植するには、６ないし８個体程度の胎児からの組織が必要となる。胎児組織の調製中の汚染の可能性というさらなる問題もある。これらの組織は既に細菌やウイルスに感染しているかもしれないので、用いる胎児の各々について高価な診断試験が要求される。総合的な診断試験でさえも全ての感染組織をカバーできない。例えば、試料がＨＩＶフリーである保証はない。なぜならば、通常そのウイルスは、感染後数週間は存在しないからである。
胎児組織に加えて、神経移植のための別の可能性ある起源があり、細胞系譜および遺伝子組み換え細胞型を含むが、どちらの起源にも問題がある。細胞系譜は、とりわけ、正常細胞を腫瘍遺伝子で形質転換することによって、または変化した成長特性でもって細胞をイン・ビトロ培養することによって誘導される不死化細胞である。そのうえ、不利な免疫反応可能性、細胞を不死化するためのレトロウイルスの使用、これらの細胞が無糸分裂状態に戻る可能性、および正常成長阻害信号に対するこれらの細胞の反応の欠如がこのような細胞系譜を広範囲にわたる使用にとってほぼ望ましいものとする。同様に、生体異物の移植はあまり成功していない。
神経移植の別のアプローチは、遺伝子組み換え細胞型の使用、すなわち遺伝子療法を伴う。しかしながら、これらの細胞との免疫反応を導入してしまう危険性が依然として存在する。さらに、レトロウイルス介在導入は他の細胞異常を生じるかもしれない。また、レトロウイルス介在遺伝子導入により作製された細胞系譜は、移植後それらの導入された遺伝子を徐々に不活性化することが示されており、さらに宿主組織と正常なニューロン結合を達成しないかもしれない。
現在利用可能な移植法は、神経学的生涯の他の利用可能な治療よりも向上しているが、顕著な欠点がある。従来技術の移植において宿主細胞に完全に組み込むことができないこと、および移植用の信頼ある起源から無制限で適当な細胞を入手することができないことが神経移植の重大な制限である。分裂し部分的に分化したＮＳＣの組織内注入を利用した研究は、あまり期待がもてないことが示された（例えば、［Benninger et al., 2000, Brain Pathol. 10: 330-341; Blakemore et al., 2000, Cell Transplant 9: 289-294; Rosser et al., 2000, Eur. J. Neurosci. 12: 2405-2413; Rubio et al., 2000, Mol. Cell Neurosci. 16: 1-13.］を参照せよ）。全般的に、結果はあまりたいしたものではなかった。なぜならば、多くの検討のなかで、ＮＳＣクラスターの解離はＮＳＣの早期老化を引き起こし、培養中でＮＳＣの易損性を増大させることが知られているからである。例えば、［Svendsen et al., 1998, J. Neurosci. Methods 85: 141-152.］を参照せよ。さらに、外来性組織が脳に導入されたための不利な免疫反応にもかかわらず、損傷領域への直接的な細胞の物理的導入によって引き起こされた外傷は移植細胞を除外し得る宿主による免疫細胞の動員を誘発しかねない。かくして神経学的欠損を改善するためのＮＳＣの使用による重大な問題が残っている。
ここに記載されるように、神経学的欠損は、例えば、眼や脊髄のごとき非脳組織も含む。さらに、身体的欠損は多分化能幹細胞を利用する改善の標的である。「身体的欠損」は広く様々な疾患および傷害により引き起こされた疾患であり、外傷、不全、例えば、心筋梗塞による心筋のごとき筋肉不全または喪失を生じる。他の例は不全、例えば、内臓のごとき、上記の神経学的欠損で議論したものから離れた他の細胞および組織の変性または喪失を含む。例えば、肝機能は、とりわけ、疾患（例えば、肝硬変または肝炎）、外傷または年齢によって悪影響を受ける。脳の神経学的欠損を治療するためのＮＳＣの使用における上記の問題は、眼や脊髄のごとき他の組織における神経学的欠損にも当てはまる。
疾患、加齢または損傷を受けたほ乳類脳に多分化能幹細胞を導入する改善された方法が、当該技術分野で必要とされる。さらに、変調をきたした、損傷した、または変性した組織に、本発明の多分化能幹細胞またはその医薬製剤を使用するかまたは投与する方法が必要とされ、ここで、幹細胞は宿主組織に適した様式で分化し、損傷細胞の置換損傷した組織の修復および、所望により、機能喪失の改善を可能とする。移植用の細胞、特に、ほ乳類脳またはその他の組織に導入したとき、それらにおける増殖、移動および分化に特異的に適合しおよび可能とする細胞の制限のない信頼ある起源が当該技術分野で必要である。さらに、できるだけ非侵襲性の様式で、特に、例えば、脳内のニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトに、または、例えば、眼組織内の桿体または錐体光受容細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、神経節細胞、ブルーフ膜、脈絡膜および網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に、イン・ビボで増殖し分化する多分化能幹細胞を導入することによって、損傷した神経その他の組織を修復する方法が当該分野で必要とされる。
発明の概要
本発明は、多分化能幹細胞を作製する方法および、その方法によって作製された細胞を提供する。特に、本発明は、神経学的または身体的な障害を軽減するために、その必要がある動物に再導入できる幹細胞を十分に作製するための試薬および方法を提供する。
第１の局面において、本発明は、低発生能細胞から高発生能細胞を作製する方法を提供する。一つの具体例において、この方法は低発生能細胞を有効量の置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドの化合物に有効時間接触させるステップを含み、ここに、置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドの化合物に接触させた低発生能細胞がその起源の系譜または異なる系譜の低発生能細胞を分化させることが可能な高発生能細胞になる。特定の具体例において、本発明の方法は、さらに、置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドの化合物に接触させた低発生能細胞を神経系細胞または神経系細胞で調整した培地と一緒に共培養するステップを含み、ここに、置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドの化合物に接触させた低発生能細胞がその起源の系譜または異なる系譜の低発生能細胞を分化させることが可能な高発生能細胞になる。さらなる具体例において、この方法は、非被覆フラスコまたは細胞を退ける処理がされたフラスコ中で、低発生能細胞を置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドの化合物に接触させるステップを含む。なおさらなる具体例において、線維芽成長因子、表皮成長因子またはそれらの組合せのごとき成長因子に低発生能細胞を接触させる。あるいは、低発生能細胞をさらにヘパリンに接触させる。
本発明によって提供されるように、代表的な置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドの化合物は、限定されないが、例えば、ブロモデオキシウリジン、ヨードデオキシグアノシン、ヨードデオキシシトシンのごときハロゲン置換（ハロ置換）デオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシド化合物ならびに、例えば、メチルデオキシチミジンのごときアルキル置換種を含む。最も好ましい種はブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）である。特定の具体例において、低発生能細胞を有効量の置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドの化合物に有効時間接触させる。いくつかの具体例において、低発生能細胞は、造血幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、表皮幹細胞、網膜幹細胞、脂肪幹細胞および間葉幹細胞のごとき組織（または組織特異的）幹細胞である。特定の具体例において、低発生能細胞は、限定されないが、天然に産出したか組み替えたかにかかわらず、接合体、胞胚、胚、胎仔、小幼仔または成体、および、所望により、前記具体例のいずれかのヒト種を含む。ここで言うように、本発明の方法は、単体で存在するかまたは２以上の細胞のクラスターを形成する１または複数の高発生能細胞を提供する。
本発明のこの局面の実施において、高発生能細胞になるときに低発生能細胞の表現型が変化する。かくして、本発明は第１の表現型の低発生能細胞を第２の表現型の高発生能細胞に変化させる方法を提供し、ここに、第２の表現型は置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドに接触させた細胞を取り巻く環境によって決定される。好ましい具体例において、低発生能細胞は幹細胞、より好ましくは造血幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、表皮幹細胞、網膜幹細胞、脂肪幹細胞および間葉幹細胞である。
第２の局面において、本発明は、本発明の方法を用いて１または複数の高発生能細胞を提供する。特定の具体例において、この細胞は２以上の細胞のクラスターを形成する。ここで言うように、この高発生能細胞は、好ましくは約５０パーセント未満、より好ましくは約２５パーセント未満、より一層好ましくは約１０パーセント未満、より一層好ましくは約５パーセント未満、より一層好ましくは約１パーセント未満の再分化細胞を含む。ここで用いる「再分化細胞」とは、本明細書の方法の実行の間、細胞の移動、分化、および宿主組織への取り込みの前に最終分化した細胞をいう。
本発明のなおさらなる局面において、本発明の方法により調製された高発生能細胞を含む医薬組成物および医薬症許容される担体または補形剤が提供される。本発明は、細胞もしくは組織再生に用いるためか、またはその必要のある動物の組織における疾患もしくは障害を直すための組織幹細胞である高発生能細胞を含む当該医薬組成物を提供する。
かくして、本発明は、ここに提供される医薬組成物を用い、高発生能細胞を投与することによってその必要のある動物を治療する方法も提供する。ある好ましい具体例において、高発生能細胞は２以上の高発生能細胞のクラスターを含む。好ましくは、動物は、神経変性症、外傷性傷害、神経毒傷害、虚血、発育障害、視覚に影響する障害、脊髄の傷害もしくは疾患、脱髄症、自己免疫症、感染、炎症性疾患、または身体的な疾患、障害、傷害、外傷、不全、変性もしくは喪失によって生じた欠損のごとき、高発生能細胞の投与によって治療または軽減し得る身体的または神経学的欠損を有する。好ましい具体例において、１または複数の高発生能細胞は組織損傷の領域に移動し、組織特異的様式で分化し、神経学的または身体的な欠損を減じるように機能することが可能である。本発明の方法によって提供されるように、シリンジで１または複数の高発生能細胞を注入するか、カテーテルで高発生能細胞を挿入するか、または高発生能細胞を外科移植によって、細胞を投与する。特定の具体例において、高発生能細胞を神経学的または身体的な欠損領域と流体連結している体腔にシリンジで注入する。ある好ましい具体例において、体腔は脳室である。他の具体例において、高発生能細胞を神経学的または身体的な欠損領域と流体連結している体腔にカテーテルで挿入する。ある好ましい具体例において、体腔は脳室である。なおさらに付随的な具体例において、高発生能細胞を神経学的または身体的な欠損領域と流体連結している体腔に外科移植する。ある好ましい具体例において、体腔は脳室である。あるいは、高発生能細胞をシリンジもしくはカテーテルもしくは外科移植によって神経学的または身体的な欠損部位に直接挿入するか、または全身的（例えば、静脈内）挿入する。
１または複数の高発生能細胞の動物への投与は、最終分化細胞に分化する細胞を生じる。かくして、本発明は最終分化細胞を作製する方法を提供し、それは、本発明の高発生能細胞をその必要のある動物に投与するステップを含む。本発明の方法によって提供されるように、高発生能細胞をシリンジで注入することによってか、高発生能細胞をカテーテルで挿入するか、または高発生能細胞を外科移植によって細胞を投与する。特定の具体例において、高発生能細胞を神経学的または身体的な欠損領域と流体連結している体腔にシリンジで注入する。特定の好ましい具体例において、体腔は脳室である。他の具体例において、高発生能細胞を神経学的または身体的な欠損領域と流体連結している体腔にカテーテルで挿入する。特定の好ましい具体例において、体腔は脳室である。なおさらに付随的な具体例において、高発生能細胞を神経学的または身体的な欠損領域と流体連結している体腔に外科移植する。特定の好ましい具体例において、体腔は脳室である。あるいは、高発生能細胞をシリンジもしくはカテーテルもしくは外科移植によって神経学的または身体的な欠損部位に直接挿入するか、または全身的（例えば、静脈内）挿入する。
本発明のこの局面の実施において、最終分化細胞になるときに高発生能細胞の表現型が変化する。かくして、本発明は第１の表現型の高発生能細胞を第２の表現型の低発生能細胞、より好ましくは最終分化細胞に変化させる方法を提供する。この方法は、発生可能性のある表現型の細胞を変化させる方法を提供し、それは第１の発生可能性のある表現型の細胞を有効量の置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドに有効時間接触させるステップを含み、それは、第１の発生可能性のある表現型とは異なる第２の発生可能性のある表現型に細胞を変化させ、ここに、第２の発生可能性のある表現型は置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドに接触させた細胞を取り巻く環境によって決定される。特定の具体例において、第１の発生可能性のある表現型の細胞は幹細胞であり得る。他の具体例において、第１の発生可能性のある表現型の細胞は上皮幹細胞、表皮幹細胞、網膜幹細胞、脂肪幹細胞および間葉幹細胞であり得、特に好ましい具体例において、間葉幹細胞である。
あるいは、本発明は、最終分化細胞、すなわち、投与前に最終分化した細胞で神経学的または身体的な欠損を有する患者を治療する方法を提供する。そのような最終分化細胞は神経学的または身体的な欠損部位に投与するか、または全身的に、例えば、静脈内投与する。
なおもう一つの具体例において、本発明は、ニューロン起源のものを除き、幹細胞を治療して、それを高発生能細胞に転換させることに関し、本発明は、眼組織に見られる様々な細胞型、なかでも、脈絡膜、ブルーフ膜および網膜色素上皮細胞、桿体系および錐体系視神経細胞、水平細胞、双極ニューロン、アマクリン、神経節および視神経細胞にそれが分化できるようにする。眼組織に見られる非制限的代表例の細胞型を集合的に網膜細胞という。これらの方法は、本発明の高発生能細胞を、ＴＧＦ−ｂ３、ＩＧＦ−１およびＣＮＴＦよりなる群から選択される成長因子の１またはそれらの組合せの有効量に有効時間接触させるステップを含み、成長因子に接触した細胞が網膜細胞に分化できるようにする。
もう一つの局面において、本発明は、ほ乳類における内在性または外来性の多分化能幹細胞の移動および／または分化をそのほ乳類におけるＡＰＰおよび／またはｒｅｅｌｉｎのレベルを調節することによって変更する方法を提供する。特定の具体例において、外来性多分化能幹細胞は本発明の方法により作製された高発生能細胞であり得る。特定の他の具体例において、高発生能細胞を本発明の医薬組成物または細胞製剤の部分として投与する。他の具体例において、ほ乳類におけるｒｅｅｌｉｎの量をｒｅｅｌｉｎタンパク質、ｒｅｅｌｉｎレベルを変更する薬物またはｒｅｅｌｉｎを発現するベクターをほ乳類に投与することによって変更する。なお他の具体例において、ほ乳類におけるＡＰＰの量を抗ＡＰＰ抗体、ＡＰＰレベルを変更する薬物、ＡＰＰを発現するベクター、またはＡＰＰタンパク質をほ乳類に投与することによって変更する。なお他の具体例において、ｒｅｅｌｉｎは本発明の高発生能細胞の前、後または同時に投与し得る。同様に、他の具体例において、抗ｓＡＰＰ抗体、またはｓ−ＡＰＰ（分泌ＡＰＰ）は、本発明の高発生能細胞の前、後または同時に投与し得る。関連する具体例において、本発明は、ほ乳類における内在性または外来性多分化能幹細胞の移動をそのほ乳類におけるＡＰＰまたはｒｅｅｌｉｎ受容体の量または結合アフィニティーを変更することによって変更する方法を提供する。同様に、本発明は、ほ乳類における内在性または外来性の多分化能幹細胞の分化をそのほ乳類におけるＡＰＰ受容体の量または結合アフィニティーを変更することによって変更する方法を提供する。
もう一つの具体例において、分化細胞特異的産物を作製する方法を提供し、それは、所望の細胞型の分化を誘発することが知られている因子の有効量の存在下、本発明の高発生能細胞を分化させ、次いで、所望の分化細胞特異的産物を単離するステップを含む。もう一つの具体例において、本発明は、未分化細胞特異的産物を作製する方法を提供し、それは、本発明の方法により本発明の高発生能細胞を繁殖させ、次いで、所望の未分化細胞特異的産物を単離するステップを含む。
かくして、本発明は、新規ほ乳類多分化能幹細胞、その医薬組成物、およびその細胞を調製し投与する方法を有利に提供する。本発明は、ＡＰＰおよびｒｅｅｌｉｎレベルの変化により多分化能幹相棒の移動および／または分化を変更する方法も有利に提供する。さらに、本発明は、本発明の方法および細胞を用いて生化学製品を製造する方法も有利に提供する。
本発明の特定の具体例は、以下の特定の好ましい具体例のより詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
本特許または本出願は少なくとも１つのカラー図面を含む。カラー図面と共に公開された本特許または本出願は３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８４の規定により、所定の手数料納付の支払いを条件に請求により庁から提供される。
好ましい具体例の詳細な説明
本発明は、組織特異的な様式で分化することが可能な高発生能細胞、特に、その必要のあるほ乳類に投与し得る高発生能細胞を提供する。
ここに、より詳細に開示するように、本発明の方法は、とりわけ、染色体組織源から得られた低発生能細胞を培養し、次いで、それから高発生能細胞を作製することを含む。一つの局面において、この効果は置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドの化合物の存在下で低発生能細胞を培養することによって達成される。本発明によって提供される代表的な置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドの化合物は、限定されないが、例えば、ブロモデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、ブロモデオキシグアノシン、ヨードデオキシシトシンのごときハロゲン置換（ハロ置換）デオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシド化合物ならびに、例えば、メチルデオキシチミジンのごときアルキル置換化合物を含む。最も好ましい化合物はブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）である。ＢｒｄＵは元来化学療法用に製造されたチミジンアナログである。それが遺伝子発現やいくつかの細胞型の細胞分化を調節することが知られている。ＢｒｄＵおよび他の置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドの化合物は増殖細胞の核に取り込まれ、免疫染色によって検出することが容易であるので、幹細胞のごとき増殖細胞の検出に用いられてきた。しかしながら、幹細胞に対するその生物学的影響は、当該分野において、認識も理解も開示もされていない。
成体幹細胞はある程度の多分化能を保持し続けるが、成体幹細胞はその組織特異的性質によって制限される。一例として、ヒトＮＳＣは基礎培地条件下で自発的に脳細胞に分化するが、ＭｅＳＣは特定の因子の添加なくして、基本的に神経細胞へ自発分化できない；本発明の状況において、そのような細胞は２以上の異なる系譜の細胞に分化し得る細胞に比べて、低発生能である。これらの結果は、各種の組織特異的幹細胞は、自体が特別の型の細胞になるようにする特異的情報を含む、すなわち、それらは組織特異的な様式で特定の型の細胞になるように部分的に約束されている（すなわち、低発生能）。幹細胞のこの障害を克服し、高発生能細胞を作製するため、それらの細胞および環境を変えることが必要である。本発明は、低発生能細胞から高発生能細胞を作製する方法ならびに、高発生能細胞の処理および使用、および高発生能細胞自体に関する。一例として、本発明は、間葉幹細胞（すなわち、低発生能細胞）のような容易に単離され豊富にある幹細胞が、とりわけ、骨細胞や軟骨細胞のごとき間葉系譜細胞にのみ分化するようにもはや強要されないようにする処理に関する。本発明によって処理すれば、低発生能間葉幹細胞は、例えば、ニューロン系譜細胞に分化することが可能な高発生能細胞になる。本発明は、自家移植の使用も可能とし、それは本発明の高発生能細胞の移植に対する免疫反応の可能性を除去する。例えば、本発明の方法により患者の間葉幹細胞を単離し、処理し得、移植部位によらず組織特異的な様式で脳、眼、筋肉等に分化するように同一患者に移植し直す。かくして、本発明は、成体または胎児源からの異種移植に関連する問題がなく、神経学的および身体的な欠損を治療する方法を提供する。
ここで用いるとき、「多分化神経幹細胞（ＭＮＳＣ）」、「神経幹細胞（ＮＳＣ）」および「神経始原細胞（ＮＰＣ）」なる用語は、ＣＮＳの未分化の多分化能細胞をいう。そのような用語は科学論文に一般的に用いられている。ＭＮＳＣは組織特異的細胞型、例えば、脳に移植したとき、アステロサイト、オリゴデンドロサイトおよびニューロンに分化し得る。本発明のＭＮＳＣは、ほ乳類宿主組織において、そこに導入したとき、増殖、移動および分化に対する適応によって天然ＭＮＳＣから区別される。
ここで用いるとき、「低発生能細胞」は、多重系譜分化が制限されている、すなわち単一系譜の組織特異的分化が可能な細胞であり、例えば、未処理間葉幹細胞は、とりわけ、骨細胞および軟骨細胞、すなわち、間葉系譜の細胞に分化し得るが、他の系譜（例えば、神経系譜）の細胞に分化する能力のみ制限されている。
ここで用いるとき、「高発生能細胞」は、その対応する低発生能細胞よりもより幅広い種類の細胞型に容易に分化することが可能な細胞である。例えば、間葉幹細胞は容易に骨細胞や軟骨細胞に分化し得るが、神経または網膜系譜細胞に分化する能力のみ制限されている（この意味で、低発生能細胞である）。本発明により処理された間葉幹細胞は、例えば、間葉系譜および神経系譜細胞型に容易に分化し得るので、高発生能細胞になる；本発明の方法によって処理すると、細胞の可塑性が増大する。
本発明による１以上の高発生能細胞は別個の細胞として繁殖し、２以上の細胞のクラスターも形成する。クラスターは単一の高発生能細胞の子孫または初代細胞のクラスターを含み得る。
ここで用いるとき、「有効量」および「治療上有効量」なる用語は、それぞれ、所望の活性を支持するのに用いられる試薬の量をいう。本発明によって調製され作製される高発生能細胞の場合、有効量は、ここに記載されるＭＳＣの１以上の生物学的活性の観察可能なレベルを支持するのに必要な量である。置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドの化合物に関して、有効量は約１０ナノモーラーと１００マイクロモーラーとの間または、より好ましくは約２と５００マイクロモーラーとの間または、より一層好ましくは約１０マイクロモーラーである。本発明の細胞から網膜細胞を作製する方法に関して、ＴＧＦ−ｂ３、ＣＮＴＦおよびＩＧＦの有効量は、約１ｎｇ／ｍｌないし１μｇ／ｍｌの間または、より好ましくは約５ｎｇ／ｍｌないし５００ｎｇ／ｍｌの間または、より一層好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌないし１００ｎｇ／ｍｌの間または、より一層好ましくは約５０ｎｇ／ｍｌである。
ここで用いるとき、「有効期間」は本発明の試薬および細胞がそれらの特定の活性を達成するのに必要な時間をいう。例えば、低発生能細胞は、有効期間に、置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドの化合物と接触してそれらを高発生能にし得る。ここでいうとき、置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドの化合物に接触する有効期間は、１ないし１０日間または、より好ましくは約１ないし５日間または、より一層好ましくは約２ないし３日間である。さらに、本発明の細胞は、分化の前または間にＴＧＦ−ｂ３、ＣＮＴＦ、ＩＧＦまたはそれらの組合せと有効期間接触して、自体を網膜細胞に分化可能にし得る。ここでいうとき、ＴＧＦ−ｂ３、ＣＮＴＦおよびＩＧＦ接触の有効期間は１ないし１０日間または、より好ましくは約１ないし７日間または、より一層好ましくは約２ないし５日間である。
ここで用いるとき、「医薬上許容される担体」または「生理学上許容される担体」なる用語は、本発明によって調製または作製された高発生能細胞の医薬組成物の上手な送達を達成するか促進させるのに適した１以上の調剤物質をいう。
ここで用いるとき、「加齢、肉体的および生物学的外傷または神経変性症によって引き起こされる影響を改善する」等は、本発明の高発生能細胞またはその医薬製剤の有効量の使用すなわちその変調をきたした、損傷したまたは変性した組織への投与による損傷または変性組織の有害な影響を低減することをいい、ここに、幹細胞は宿主細胞に適した様式で分化し得、損傷した細胞の置換、損傷した組織の修復および構造的または機能的喪失の低減を可能とする。例えば、脳機能ないしは適正な脳機能のある程度の喪失をもたらすイベント、疾患または過程の神経学的影響が挙げられる。そのような改善は、本発明の高発生能細胞またはその医薬組成物の有効量を動物に投与することによって行われる。
本発明は、本発明の高発生能細胞の医薬組成物および脳その他の組織へ送達する方法も提供する。本発明は、加齢、肉体的または生物学的外傷または神経変性症による脳その他の組織の喪失ないしは適当な脳その他の組織の喪失により生じた脳その他の組織の疾患または不全を軽減し、除去する方法も提供する。
多くの組織から、例えば、組織の連結細胞外基質由来または市販のＮＳＣ（例えば、BioWhittaker, Walkersville, MD, CC-2599）由来の個々の細胞の分離によるドナー組織から、多くの方法で細胞を得られる。本発明の高発生能細胞のある神経幹細胞具体例について、滅菌手順を用いて脳由来組織を取り出し、トリプシン、コラゲナーゼ等のごとき酵素での処理を含むいずれかの公知方法を用いて、または細分化または切除器具での処理のごとき物理的分離方法を用いて、細胞を分離する。神経細胞および他の多分化能幹細胞の分離は、組織培養培地中で実行し得；好ましい具体例において、若年および成体細胞の分離用の培地は、ＭｇＣｌ２が３．２ｍＭの濃度にて、ＣａＣｌ２が０．１ｍＭの濃度にて存在する以外は、脳髄液（ＣＳＦ）と同じ組成（１２４ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．３ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３および１０ｍＭ Ｄ−グルコース）を有する低カルシウム人工脳髄液である。分離された細胞は、２００と２０００ｒｐｍとの間、通常４００と８００との間の低速にて遠心し、懸濁培地を吸引し、次いで、細胞を培養培地に再懸濁させる。多数の未分化幹細胞子孫を所望するならば、懸濁培地が好ましい。細胞を維持することが可能ないずれかの容器、好ましくは非被服フラスコまたは細胞を退ける処理がされたフラスコ、接触依存性幹細胞分化を阻害する培養プレートまたはローラーボトルに、細胞懸濁物を播種する。
脳組織からの単離は実現可能であるが、骨由来の間葉幹細胞が、本発明に使用する高発生能細胞を作製するための特に良好な細胞源である。なぜならば、当該分野で単離技術が確立されているからであり（免疫疾患骨髄移植において何十年もの間用いられている。）、そのような技術は自原的に実行し得る。患者自らの間葉幹細胞を単離し、本発明により処理し、必要があれば、再投与し得る。対照的に、神経細胞源を用いる自家移植は格別実現可能であるわけではない。
上記の培養条件下での高発生能細胞の成長は、これらの細胞が２以上の細胞の未分化クラスターを形成することを誘発するか、または許容する（図１に示す）。これらのクラスターは２０ｍＬの成長培地中Ｔ７５フラスコあたり約５０の密度で最適に成長する。この成長培地は、例えば、抗生物質−抗真菌剤混合物（１：１００、ペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ； Gibco）、Ｂ２７（１：５０、GIBCO）、ヒト組換えＦＧＦ−２およびＥＧＦ（各２０ｎｇ／ｍｌ、R&D Systems, Minneapolis, MN）ならびにヘパリン（５μｇ／ｍｌ、Sigma, St. Louis, MO）が補充されたＤＭＥＭ／ＨＡＭＳ Ｆ１２（約３：１にて； Gibco BRL, Burlington, ON）から構成される。これらのクラスターは３７℃にてＣＯ２インキュベータ（約５％ＣＯ２）中で保たれる。最適成長条件を可能にするため、２以上の細胞のいかなるクラスターも約１４日毎に４分の１に分割し、約４〜５日毎に５０％の培地を入れ替えて栄養補給する。これらの条件は、ＮＳＣならびに、本発明の高および低発生能細胞の急速連続的成長を許容し、それらは、それらの多分化能特性を保持しつつ無限に増殖され得る。ほとんどの真核細胞を用いるとき、培養条件は可能なかぎり生理学的条件に近くあるべきである。培養培地のｐＨは生理学的ｐＨに近くあるべきで、好ましくはｐＨ６〜８、より好ましくは約ｐＨ７ないし７．８であり、ｐＨ７．４が最も好ましい。生理学的温度は約３０℃ないし４０℃の範囲である。好ましくは、細胞を約３２℃ないし約３８℃の間の温度にて培養する。ここに開示したように調製および維持された神経幹細胞（ＮＳＣ）は、無血清繁殖後３年以上たっても多分化能特性を発揮し続ける。イン・ビトロ分化を所望するならば、例えば、アール塩(Earle's salt)およびＬ−グルタミンを含有する無血清基礎培地イーグル（BME）の培養皿に細胞を再接種し得る。細胞は、ＦＧＦ−２、ＲＧＦその他の外来性分化因子の不存在下で約５日間培養し得る。このようにして分化を誘発する場合、これらの培養ＮＳＣはｂ−ＩＩＩチューブリン（神経細胞マーカー）またはグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、アストロサイトマーカー）で免疫組織化学的染色したときニューロンまたはアストロサイトの特徴的モルホロジーを示す。
上で開示したように、好ましくは、本発明に用いる幹細胞培地は少なくとも１の増殖誘発成長因子で補充される。ここに定義する成長因子は、タンパク質、ペプチドまたは、本発明のより高発生能細胞および／またはより高発生能細胞子孫に対して成長、増殖または栄養効果を有するその他の分子をいう。増殖を誘発するのに用いる成長因子はより高発生能細胞が増殖することを許容するいずれの栄養性因子をも含み、細胞の表面上の受容体に結合してその細胞に栄養性または成長誘発効果を発揮するいずれの分子をも含む。代表的な増殖誘発成長因子は、表皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、アンフィレグリン、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦまたはＦＧＦ−１）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２）およびそれらの組合せを含む。好ましい増殖誘発成長因子はＥＧＦおよびＦＧＦまたはそれらの組合せを含む。成長因子は、通常約１ｆｇ／ｍｌないし１ｍｇ／ｍｌの濃度にて培養培地に添加される。通常、約１ないし１００ｎｇ／ｍｌの間の濃度が十分である。当該分野の単純滴定実験ルーチンを用いて、特定の細胞培養に対する特定の成長因子の最適濃度を決定する。
無血清培地で増殖する本発明の細胞は、宿主への移植に先立ち、例えば、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）やヨードデオキシグアノシン（ＩｒｄＧ）のようなハロゲン化デオキシヌクレオシド、メチルデオキシグアノシンのようなアルキル置換実例のごとき置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドの化合物の存在下で成長させるべきである。移植前成長培地は長期繁殖培地の成分を含むが、有効期間使用するための有効量の置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドも含有する。宿主細胞に移植したときに脳内で適正に増殖し、移動し分化するように、本発明の方法により調製した高発生能細胞を調整するか適合させる。
本発明の高発生能細胞の細胞製剤および医薬組成物もここに提供される。医薬組成物は、投与の態様に適するように選択された医薬上または生理学上許容される配合剤と混合して、治療上有効量の高発生能細胞を最適に含む。好ましくは、許容される調剤物質は、用いる用量および濃度にて高発生能細胞および受容者に対して非毒である。
本発明の細胞製剤および医薬組成物は、本発明の高発生能細胞の、例えば、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、臭い、滅菌性、安定性、溶解もしくは放出速度、吸着性、または組成物の浸透度、ならびに増殖、移動および分化能を修正し、維持し、または保護するための調剤物質を含有することができる。適当な調剤物質は、限定されないが、（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンのごとき）アミノ酸、抗菌化合物、（アスコルビン酸、硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウムのごとき）抗酸化剤、（ホウ酸塩、炭酸水素酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸のごとき）バッファー、（マンニトールまたはグリシンのごとき）容積補填剤、（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のごとき）キレート剤、（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンのごとき）錯化剤、フィラー、単糖類、二糖類、および（グルコース、マンノース、またはデキストリンのごとき）他の炭化水素、（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのごとき）タンパク質、着色剤、香味剤および希釈剤、乳化剤、（ポリビニルピロリドンのごとき）親水性ポリマー、低分子量ポリペプチド、（ナトリウムのごとき）塩形成対イオン、（塩化ベンゾアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素のごとき）保存剤、（グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールのごとき）溶媒、（マンニトールまたはソルビトールのごとき）糖アルコール、懸濁化剤、（プルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート２０またはポリソルベート８０のごときポリソルベート；Ｔｒｉｔｏｎ；トリメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロオキサパールのごとき）表面活性剤または湿潤剤、（スクロースまたはソルビトールのごとき）安定性向上剤、（ハロゲン化アルキル金属―好ましくは、塩化ナトリウムまたはカリウム―またはマンニトールソルビトールのごとき）張度向上剤、デリバリービヒクル、希釈剤、補形剤および／または医薬補助剤を含む。REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (18th, Ed., A.R. Gennaro, ed, Mack Publishing Company 1990)を参照せよ。
医薬組成物中の一次賦形剤または担体は本質的に水性または非水性のいずれであってもよい。例えば、注入に適した賦形剤または担体は水、生理食塩水または人工脳髄液であろう。最適な医薬組成物は、例えば、意図する投与経路、デリバリー形態、所望の用量および受容組織に依存して当業者が決定する。例えば、上掲のREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCESを参照せよ。そのような組成物はＭＮＳＣ組成物の物理的状態、安定性および抗力に影響であろう。
本発明は、本発明の高発生能細胞を運搬または移植して動物の脳または中枢神経系や、例えば、網膜組織のごとき他の組織への加齢、身体的および生物学的外傷および変性症の影響を改善する方法を提供する。ＣＮＳへの組織移植が神経変性症および傷害によるＣＮＳ損傷の治療の可能性を与えることは、当該分野においてよく認識されている。新たな細胞を損傷したＣＮＳに移植することは損傷した神経回路を修復し、神経伝達物質を供給し、それによって神経学的機能を回復させる可能性を有する。眼組織のごとき他の組織への移植が神経変性症および傷害によるＣＮＳ損傷の治療の可能性を与えることも、当該分野において認識されている。ここに開示したように、本発明は、ほ乳類組織において、そこに導入したときに、増殖、移動および分化に適合した高発生能細胞を作製する方法を提供する。神経学的障害およびＣＮＳ損傷の治療における高発生能細胞の使用ならびに他の組織の損傷または変性の治療における高発生能細胞の使用は、当業者に知られている確立された動物モデルの使用によって立証し得る。
本発明の高発生能細胞は、加齢、身体的もしくは生物学的外傷または神経変性症などの結果得られたものを含むいずれかの様式で得られた異常または変性症状を持つ動物または、トランスジェニックおよび「遺伝子ノックアウト」動物のごとき人が組換え遺伝子技術を用いて作製した動物モデルに投与することができる。
本発明の高発生能細胞の受容者は、シクロスポリンのごとき免疫抑制剤の使用か、局所付与免疫抑制剤を採用する局所免疫抑制方針かのいずれかによって免疫抑制し得るが、そのような免疫抑制剤は、例えば、脳および眼組織のごとき特定の免疫特権組織において必ずしも予め必要のあるものではない。ある具体例において、本発明の送達方法は、現行の送達方法よりも、細胞の損傷または不全の部位に局在化する組織損傷を少なくし得る。
本発明の高発生能細胞は、受容者自身の組織から調製し得る。そのような場合、高発生能細胞の子孫を分離または単離された組織から作製し、ここに記載する方法を用いてイン・ビトロで増殖させ得る。間葉幹細胞（ＭｅＳＣ）の場合、例えば骨髄から単離したＭｅＳＣから子孫を作製し得る。細胞数の適当な増加によって、本発明の幹細胞を収穫し、受容者の変調をきたした組織に投与すべく準備し得る。
先行技術と比較して、高発生能細胞の脳への送達方法には顕著な差異がある。ひとつの代表的な差異は以下である：本発明の高発生能細胞を心室内移植する。さらに、１以上の別個の高発生能細胞が有効であるが、本発明の高発生能細胞を、好ましくは２以上の細胞のクラスターの形態で、外科手順または、クラスターを実質的に無傷にしておくのに十分な大きさのシリンジを用いる注入によって移植する。以下の実施例に開示する結果は、２以上の細胞のクラスターの形態での本発明の高発生能細胞の心室送達は脳における損傷領域への移動および適正なニューロン分化をもたらすことを示している。心室内注入のもう一つの利益は、組織破壊が少なく、宿主による免疫細胞の局在化動員を少なくなくする。このことは、いかなる免疫抑制もなく、心室歪み、腫瘍形成および増大した宿主アストロサイト染色の欠如によって証拠付けられる。
本発明の高発生能細胞の脳への送達方法は、例えば、眼のごとき他の免疫特権組織と基本的に重複する。１以上の別個のまたは存在する２以上の細胞のいかなるクラスターをも実質的に無傷にしておくのに十分な大きさのシリンジを用いる注入によってクラスターの形態で２以上の高発生能細胞の送達は眼における損傷領域への移動および適正な組織特異的分化をもたらし得る。
分離および部分的分化したＮＳＣの組織内注入（脳）の技術の例がある（例えば、Benninger et al., 2000, Brain Pathol. 10:330-341; Blakemore et al., 2000, Cell Transplant. 9:289-294; Rosser et al., 2000, Eur. J. Neurosci. 12:2405-2413; Rubio et al., 2000, Mol. Cell. Neurosice. 16:1-13を参照せよ）。さらに、ＮＳＣの使用ニューロスフェアの分離が、培養中でＮＳＣの早期老化を引き起こし、ＮＳＣの易損性を増大させることが知られている。例えば、Svendsen et al., 1998, J. Neurosci. Methods 85:141-152を参照せよ。本発明のいくつかの局面は２以上の細胞のクラスターの注入を優先的に採用するが、本発明の高発生能細胞は、非クラスター形態で移植したときにも適当に移動し分化するようである。本発明によって提供されるように、心室内移植は先行技術に開示される部位特異的注入の代わりとなる代替経路を提供する。心室内移植を用いて、移植細胞はＣＳＦの流れによって様々な構造体へのアクセスが可能となり、クラスター形態での本発明の高発生能細胞の移植は脳および中枢神経系の不適当な解剖学的部位での早熟分化を防止するように作用し得る。眼に関して、例えば、硝子体液への２以上の細胞の眼内投与は本発明の高発生能細胞が変性または傷害の領域に移動し、適当に分化することを許容する。
特に、高発生能細胞が受容者にとって自原的である場合に、他の免疫非特権組織への本発明の高発生能細胞の輸送も実行し得る。
宿主の神経組織への移植の機能的統合は様々な機能の回復に対する移植の有効性を調査することによってアッセイし、限定されないが、内分泌、運動、認識および感覚機能のテストを含む。有用な運動テストは、脳の変性側から離れた回転運動を定量化するテスト、動きの緩慢性、バランス、協同、無動症すなわち動きの欠如、剛直性および振せんを定量化するテストを含む。認識テストは日常の仕事を実行する能力のテストならびに、モリス水迷路特性のごとき迷路特性を含む様々な記憶テストを含む。例えば、本発明の細胞および方法を用いて、イン・ビトロ繁殖後、２４月齢ラットの心室に注入された高発生能細胞は、移植４週間後のモリス水迷路によって評価すると、認識スコアが向上した老齢宿主脳への広範囲にわたる位置的取込みを示した（図２）。ここに開示した実験の結果は、高発生能細胞がそれらの多分化能状態を保持するのに必要な環境を老齢脳が提供可能であることを示し、加齢関連神経変性症における神経置換療法の可能性を立証する。
宿主の他の組織への移植の機能的統合は傷ついたまたは変性した組織に特異的な様々な機能の回復に対する移植の有効性、例えば、眼への本発明の幹細胞の移植に対する視力の改善を調査することによってアッセイし得る。眼に関して、本発明の細胞および方法を用いて、イン・ビトロ繁殖後、ラット眼の硝子体腔に注入された本発明の高発生能細胞は、移植４週間後宿主眼組織への広範囲にわたる位置的取込みを示した（図３）。ここに開示した実験の結果は、脳と同様に、本発明の高発生能細胞が組織特異的様式で分化するのに必要な環境を眼が提供可能であることを示し、かくして、傷害または変性に関連する組織損傷における置換療法の可能性を立証する。
本発明の細胞および方法の作用のメカニズムに対していかなる特定の理論にも限定されることなく、宿主脳への認識機能に対する高発生能細胞移植の有益な効果ならびに他の組織における高発生能細胞の有益な効果について少なくとも２つの説明ができる。一つは、置換または増強である。ニューロン回路は高発生能細胞誘導ニューロンによって置換または増強され得る。他の組織において、細胞および細胞構造もその組織に適した高発生能細胞誘導細胞によって置換または増強され得る。別の説明は、移植された高発生能細胞から放出された因子の栄養性作用である。ここに開示したように高発生能細胞を移植したラット脳のモルホロジー解析は、高発生能細胞の広範囲にわたる取込みおよび空間記憶タスクに関連する脳領域におけるニューロン細線維の大量成長を示した（図４および５）。しかしながら、高発生能細胞は依然として損傷ニューロンに向かって移動し、神経栄養因子の産生によってそれらを救助する。これらの２つの説明の間の協同も存在するであろう。
モリス水迷路テストで評価すると、高発生能細胞を移植した動物の空間記憶の向上は、空間記憶に関連することが知られている脳の領域への高発生能細胞の取込みによって達成された。ラット脳組織の移植後モルホロジーは、宿主脳への移植細胞の機能的会合が起きたことを示す。免疫組織化学解析は、大脳皮質に見られるｂＩＩＩ−チューブリン陽性ドナー誘導細胞が大脳皮質辺縁に向く樹状突起を有することで特徴付けられ、海馬においては、ドナー誘導ニューロンが複数のプロセスおよび枝を持つモルホロジーを示すことを明らかにした。異なる脳領域における移植された高発生能細胞のこれらの異なるモルホロジーは、脳の各領域に存在する様々な因子によって高発生能細胞の部位特異的分化が起こることを示す。
移植されたラット脳における前頭皮質層３および海馬のＣＡ２野に強アストロサイト染色も見られ、これらの領域には、アストロサイトは通常この動物において存在しない。高発生能細胞のＣＡ２への移動は特に興味深いものである。なぜならば、ＣＡ２錐体ニューロンは高度にｂＦＧＦを発現し、ｂＦＧＦの発現は嗅内皮質損傷によってアップレギュレートされるからである（例えば、Eckenstein et al., 1994, Biochem, Pharmacol. 47: 103-110; Gonzalez et al., 1995, Brain Res. 701: 201-226; Williams et al., 1996, J. Comp. Neurol. 370: 147-158を参照せよ）。宿主脳におけるＣＡ２錐体ニューロンは、加齢に伴って発生し得るイベントであるシナプス伝達の減少に応答してｂＦＧＦを発現する。その結果、この発現ｂＦＧＦは移植された高発生能細胞の信号として機能し得、移植後宿主脳に生成されたｂＦＧＦの影響の下、反応し、移動し、または増殖する。
移植されたラット脳においてアストロサイト染色が豊富な領域は広範囲にわたって染色されたニューロン細線維が同定された領域と同一である（図４ａ、４ｄおよび４ｅ）。発育中、グリア細胞は、ニューロンおよび軸索誘導および栄養因子の産生のごとき多くの複雑な機能を有する（例えば、Pundt et al., 1995, Brain Res. 695:25-36を参照せよ）。グリアおよびニューロン細線維のこの重なりは、この相互作用が移植された高発生能細胞の生存、移動および分化において、きわめて重要な役割を演じることを強く示唆する。
移植されたラット脳の免疫組織化学は、宿主脳の両側にニューロンとアストロサイトが対称的に分布することを明らかにし、これらの高発生能細胞の子孫が移動し得ることを示す。移植後、アストロサイトは長距離移動することが示されているが（例えば、Blakemore et al., 1991, Trends Neurosci. 14:323-327; Hatton et al., 1992, Glia 5: 251-258; Lundberg et al., 1996, Exp. Neurol. 139:39-53を参照せよ。）、ニューロンはグリア細胞ほど広範囲に移動しないことを示す実験証拠がある（例えば、Fricker et al., 1999, J. Neurosci. 1999: 5990-6005を参照せよ）。ここに開示したように、本発明の高発生能細胞から誘導されたニューロン前駆体はアストロサイト前駆体と同様の移動能力を有する。
バイオリアクター
有用な製品を製造するための生体触媒の使用は数千年の人類の歴史の一部である。今世紀まで、生体触媒からの有用な製品の製造はバッチ型反応器（発酵槽）で行われていた。バイオリアクターを用いる数多くのより新しくより効率的な方法を用いて、例えば、ｐＨ、酸素、滅菌性、栄養素のごとき重要な成長パラメータを調節する。生物学的製造の基礎的経済性は２倍である：原料から誘導され、原料よりも価値のある製品の製造、および他のいずれの方法でも経済的に作製できない製品の製造、どちらの場合も市場の要求を満たすことを目的とする。
ビールのごとき大量生化学的製造について、投資に対して納得のいく返還を得るためには数百万ガロンのビールを製造しなければならないので、本質的なコストは初期原料および製造施設の初期資本コストにある。これらの製品の収量はいかなる生物学的に誘導された生成物よりもいくらか高いものであることも特記する。
対極は、モノクローナル抗体のごとき高価値の生化学製品であり、その最大の必要経費は製品のダウンストリーム・プロセッシングにある。特定の生体出発物質を得ることが困難であることやイン・ビボで使用するならば最終製品の純度を取り決める連邦規則のごとき他の理由でこのようになる。しかしながら、この状況において、極少量の製品製造やその製造を実行する困難性は、同一の基本量につき、バルクの生化学品よりも何桁も高い規模で最終製品を販売することを要求する。ある状況において、生化学品製造に重要な原料を得るコストはその製造が経済的に割に合わないほど高いものである。さらに、ある原料はいかなるコストでも単純に入手可能ではなく、より簡単に得られた（またはとにかく得ることができる）原料を重要原料に転換することを可能にする方法に非常に価値がある。
本発明の方法は、より簡単に入手可能な低発生能細胞、例えば、ＭｅＳＣを高発生能細胞、分化細胞に特異的なタンパク質すなわち製品の製造用のバイオリアクターとして用いるためのおそらく入手が困難な所望の細胞型に引き続きイン・ビトロで分化し得る細胞に転換することを可能にする。分化は本発明の細胞を成長因子および所望の細胞型に分化させるのに重要であると当該分野で知られている成長因子および補充剤に暴露することにより誘発し得る。別に記載したように、ＴＧＦ−３ｂ、ＣＮＴＦまたはＩＧＦ−１への暴露によりＭｅＳＣ起源の本発明の高発生能細胞を誘発して網膜起源の細胞にイン・ビトロ分化させた。さらに、ここに記載する成長条件を用いて、高および低発生能細胞自体を長期間繁殖させ、それらの細胞に特異的なタンパク質すなわち製品の製造用のバイオリアクターとして用いた。所望の細胞型に最終分化する素質を有する高発生能細胞の潜在的に無制限集団を容易に単離し繁殖させる能力は今まで入手不可能または法外に高価な細胞製品の生化学的製造を可能にする。
本発明の方法は、技術的にも金銭的にもより一層実現可能な個人向け薬物スクリーニングも作製する。ＭｅＳＣのごとき容易に入手された低発生能細胞を本発明の方法により処理し、特定の薬物の試験に適した細胞型に誘導し得る。例えば、神経分化した細胞が脳に作用する薬物の実験系として用いられてきた。ＮＳＣは商業的に入手可能であるが、それらはいかなる特定の個人にも特異的ではなく、かくして、個人向け薬物効力試験には無益である。本発明の方法を用いれば、当該分野で十分に確立された最小侵襲性方法を用いて単離された個人の低発生能細胞、例えばＭｅＳＣを、例えば神経起源の細胞に分化させ、試験に用いることができる高発生能細胞に転換し得る。そのような方法を用いて、例えば、特定の患者につき特定の薬物によって誘発された特定の遺伝子の発現レベルへの薬物の効果を決定し得る。そのような情報は、生化学レベルにて、薬物に対して適当または不適当な反応であるかを決定するのに重要であり、それは所望しない、しばしば危険または致死的効果の可能性を持ついかなる薬物に対しても重要な情報である。
本発明の高発生能細胞は多くの観点から神経幹細胞を模倣し得るので、神経幹細胞に不随する関連情報、それに引き続いて間葉幹細胞および網膜幹細胞に不随する情報が提示される。当業者は、これらの３タイプの幹細胞に本発明の方法が限定されず、未だ最終分化していていない全ての細胞型に拡張されることを容易に理解するであろう。
神経に関して
ほ乳類ＮＳＣの増殖率は一般的に低いので、特異的神経変性症または肉体的または生物学的脳外傷がなくても、加齢と障害のある脳機能との間には相関がある。本発明は、ほ乳類の脳において、そこに導入したとき、増殖、移動および分化が可能な高発生能細胞の添加によって、加齢による障害のある脳機能を無効にする方法を提供する。
肉体的外傷および生物学的外傷は障害のあるまたは不適切な脳機能のさらなる原因である。「肉体的外傷」なる用語は、鈍器による頭部外傷、重篤な脳しんとう等のごとき外因による脳細胞損傷をいう。そのような肉体的外傷は、その外傷の原因および重篤性に応じて局部にとどまるかまたは全身化する。「生物学的外傷」なる用語は、例えば、発作、動脈瘤、てんかん、脳腫瘍、低酸素症等の生物学的プロセスにその端を発するいかなる急性脳傷害をもいう。
障害のあるまたは不適当な脳機能のもう一つの原因は神経変性症である。近年、神経変性症は、これらの障害に最も大きな危険性のある高齢者人口が増えつつあることから、重要な懸念事項となっている。神経変性症は、限定されないが、アルツマー病、筋萎縮性側索硬化（ＡＬＳ）、パーキンソン病、ピック病、ハンチントン病、進行性核上性麻痺、皮質基底変性、パーキンソン−ＡＬＳ−痴呆複合症、ゲルツマン−シュトラウサー−シャインカー症候群、ハラーボールデン−シュパッツ病、クフ病、ウィルソン病、多発性硬化症（ＭＳ）、後期発症異染ロイコジストロフィーおよびアデノロイコジストロフィーを含む。これらの疾患の影響は、本発明の高発生能細胞の投与によって無効にし得る。
運動または認識機能を損じる様々な脳器質疾患がある。基底神経節における変性は、変性の正確な位置に応じて認識および運動症候群を持つ疾患をもたらし得る。運動欠損は基底神経節の変性の普通の結果である。ハンチントン舞踏病は線条体におけるニューロンの変性に関連し、それは宿主の付随意反射運動をもたらす。視床下核と呼ばれる小領域における変性はバリスムと呼ばれる状態である四肢の激しい振り動かし動作に関連し、被殻および淡蒼球における変性はゆっくりとした悶え動作の状態すなわちアテトーシスに関連する。パーキンソン病において、変性は基底神経節の別の領域である黒質緻密部で見られる。通常、この領域から背側線条体にドパミン性連結が走り、それは動きを調節するのに重要である。パーキンソン病の治療はこの回路に対するドパミン活性を回復させることに集中し、それは本発明により脳のこの領域に高発生能細胞を移植することによって達成される。
もう一つの神経変性症であるアルツハイマー病において、前頭および大脳皮質に実質的な細胞変性がある。さらに、基底神経節の局在領域であるマイネルト基底核が選択的に変性するようである。通常、この核から大脳皮質までコリン作動性神経系投射が走り、それは記憶を含む認識機能に関与すると考えられる。
間葉に関して
生体幹細胞はある程度の多分化能を保持し続けるが、生体幹細胞から作製された細胞型はそれらの組織特異的特性によって制限される。例えば、ヒトＮＳＣは基礎培地条件下で自発的に脳細胞に分化するが、ＭｅＳＣは特定の因子の添加なくして、基本的に神経細胞へ容易に自発分化できない；本発明の状況において、そのような細胞は２以上の異なる系譜の細胞に分化し得る細胞に比べて、低発生能である。これらの結果は各種の組織特異的幹細胞は、自体が特別の型の細胞になるようにする特異的情報を含む、すなわち、それらは組織特異的な様式で特定の型の細胞になるように部分的に約束されている（すなわち低発生能）。幹細胞のこの障害を克服し、高発生能細胞を作製するため、それらの細胞および環境を変えることが必要である。しかしながら、組織特異的幹細胞の運命を決定する正確な調節メカニズムはまだ分からない。この知識ベースでのギャップは重要な問題を引き起こす。なぜならば、ＭｅＳＣは骨髄から単離し、培養中で増殖させることはかなり容易であるが、それらは基本的にＮＳＣその他の非間葉系譜細胞には容易に分化しないからである。中枢神経におけるＭｅＳＣの使用の可能性が議論されているが、ＭｅＳＣにおいて神経系譜を誘発する技術は本発明前には十分に確立されていなかった。
本発明のＭｅＳＣは、本発明の方法を利用する潜在的な治療的使用に対するＮＳＣの使用の代替物として機能し得、それは、ＢｒｄＵのごとき置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシド種の素質を利用してＭｅＳＣを準備する、すなわち、制限された間葉分化パスから神経幹細胞様（すなわち他の系譜）分化パスにそれらを移動させる。ＭｅＳＣは、本発明の置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシド前処理を用いて、イン・ビトロおよびイン・ビボでうまくニューロンおよびグリアに分化した。かくして、本発明のＭｅＳＣは本発明の方法を利用する神経置換における潜在的な治療的使用に対するＮＳＣの使用の代替物として機能し得る。
これらの細胞は神経置換治療分野において重要である。なぜならば、それらの製造は自家移植を許容するからである。幹細胞を患者から単離し、イン・ビトロで繁殖させ、所望であるか必要であれば遺伝子的に修飾し、次いで、同一の患者に移植し直し得る。神経幹細胞はほとんどの周辺組織細胞に分化させ得るので、本発明は神経置換のみならず、他種の組織の再生や置換にも有用である。さらに、細胞は患者を起源とするので、取り組むべき倫理的な障害や免疫拒絶の問題がない。
網膜に関して
黄斑変性を含む網膜変性症は、失明の主たる原因である。遺伝子療法、成長／生存因子注入およびビタミン治療の調査にもかかわらず、有効な視力回復治療は現在のところない。成人するとニューロンは再生しないという長い間抱き続けられてきた「常識」のため、光受容体または神経細胞の変性により生じた視覚障害は治療不可能と考えられてきた。しかしながら、この考えの正当性が疑われ、実際には、これらの細胞は成熟後も復活する可能性を有するという新たな証拠があり、かくして、幹細胞移植を用いた網膜再生による視覚障害を治療する新規治療の開発への扉が開かれた。
冷血脊椎動物における網膜再生の能力は昔から認識されていた。魚類および両生類は、網膜の辺縁、いわゆる「毛様体縁帯」に存在する網膜幹細胞の集団により新たな網膜細胞を産生し続ける。最近の研究により、鳥類および成体ほ乳類も冷血脊椎動物の毛様体縁帯の網膜縁類似体に細胞帯域を有するという証拠を得た。これらの網膜幹細胞は、イン・ビトロで光受容細胞その他の網膜細胞を発生させるだけではなく、網膜野に移植後網膜細胞に分化すると報告されている。これらの結果は、網膜再生療法の可能性を示すが、臨床アプリケーションのために幹細胞の代替源が求められる。なぜならば、網膜幹細胞の数には限界があるからである。
神経幹細胞は胚性および成体ほ乳類脳から単離され、様々な培養系にてイン・ビトロで繁殖されている。無血清非補充培地条件下、ＮＳＣは、それぞれ、ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトのマーカーであるｂＩＩＩ−チューブリン−、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）−およびＯ４−免疫陽性細胞に自発分化する。以下の実施例に記載するように、本発明の方法により処理したＮＳＣは２４月齢マウスの脳に移植後ニューロンおよびグリアに移動し、分化し、これらの動物の認識機能を著しく向上させた。この結果は本発明により作製した高発生能細胞が網膜幹細胞代替物を作製するための移植可能物を提供し得ることを示唆した。
網膜細胞の増殖および分化を調節する網膜組織の発達に関与する様々な因子がある。成長因子ベータ−３（ＴＧＦ−ｂ３）の形質転換は発達中細胞増殖を調節し、網膜運命に対する神経始原細胞の決定または分化またはそれらの双方にも影響すると考えられている。胚性１８日齢ラット網膜培養のＴＧＦベータ様タンパク質、アクチビンＡでの処理は、これらの培養の始原細胞の細胞周期からの退出を生じ、桿体光受容体に分化し、ＴＧＦ家系が発達中の網膜における光受容体分化の重要なレギュレータであることを示す。本発明による調製された高発生能細胞をＴＧＦ−ｂ３、ＩＧＦ−１およびＣＮＴＦよりなる群から選択される有効量の選択因子で有効期間処理することは、網膜分化経路の採択を誘発する。すなわち、本発明の高発生能細胞は、その起源にかかわらず、網膜分化経路を採択させられる。本発明の方法により処理されていない細胞は、これらの成長因子に単純に暴露しただけではそのようには分化しない。本発明の方法を用いて、低発生能細胞を高発生能細胞に形質転換し、引き続き、網膜幹細胞の代替物として用いて、眼球組織損傷を修復するかまたは組織再生を促進させ得る。
上記したように、ここで用いるとき、「網膜分化」とは、眼組織に見られる様々な細胞型、とりわけ、脈絡膜、ブルーフ膜および色素上皮細胞、桿体または錐体光受容細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン、神経節および視神経細胞をいう。眼組織に見られるこれらの非制限的な代表的細胞型を集約的に網膜細胞という。
本発明の方法は、置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドの化合物を用いて、細胞運命決定を低発生能細胞から高発生能細胞に変更する。網膜移植の場合、これらの高発生能細胞をＴＧＦ−ｂ３、ＵＧＦ−１およびＣＮＴＦよりなる群から選択される有効量の成長因子で有効期間処理して、網膜細胞系譜へのそれらの決定変更を促進する。
本発明の高発生能細胞を用いて取り組める様々な神経学的および身体的な欠損がある。
治療に向いた「神経学的欠損」
本発明は、ある程度、多分化能前駆体細胞を刺激して分割し、脳内を移動させ得るという発見に関連するので、ＭＳＣを用いて、広範囲にわたる疾患、障害および傷害によって引き起こされた神経学的欠損を治療し得る。これらの傷害は限定されないが以下のもので
ある。
変性症
本発明の方法により治療し得る変性症は、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、ピック病、進行性上核麻痺（ＰＳＰ）、線条体黒質変性症、大脳皮質基底核変性症、小児期崩壊性障害、オリーブ橋小脳萎縮症（ＯＰＣＡ；遺伝性形態を含む。）、リー脳症、乳児期壊死性脳脊髄症、ハンター病、ムコ多糖症、（種々のロイコジストロフィー（クラッベ病、ペリツェウス・メルツバッハ病など）、黒内障性（家族性）白痴、クフ病、スピルマイヤー・フォークト病、タイ・ザックス病、バッテン病、ジャンスキー・ビールショフスキー病、レイ病、脳性運動失調症、慢性アルコール中毒、脚気、ハレルフォルデン・スパッツ症候群および小脳変性症を含む。
中枢神経に対する外傷性および神経毒性傷害
本発明の方法により治療し得る外傷性および神経毒性傷害は、銃創、鈍器損傷、貫通性傷害による傷害（例えば、刺創）、（例えば、ＣＮＳ外傷から腫瘍もしくは膿瘍を摘出するため、またはてんかん治療のための）外科手順の間に生じた傷害、（例えば、ＭＰＴＰまたは一酸化炭素による）中毒、揺さぶられっ子症候群、医薬に対する副作用（特異的反応を含む。）、（例えば、アンフェタミン類からの）薬物過剰用量および外傷後脳障害を含む。
虚血
中枢神経系への血流または酸素送達のいかなる崩壊も、その中でニューロンおよびグリア細胞を含む細胞を傷つけるかまたは殺してしまう。これらの傷害は本発明の方法より治療し得、（（心停止、不整脈、または心筋梗塞に起因するような）全般発作または（血栓、塞栓その他の動脈閉塞に起因するような）焦点発作を含む）発作、無酸素症、低酸素症、部分的溺水、ミオクローヌス、重度煙吸入、ジストニー（遺伝性ジストニーを含む。）、および後天的水頭症による生じた傷害を含む。
本発明の方法により治療し得る発育障害は、統合失調症、特定形態の重度精神遅滞、脳性麻痺（感染、無酸素症、早産、血液型不適合などによるかどうか；盲、聾、遅滞、運動能力欠損などとして発症するかどうか）、先天性水頭症、ＣＮＳに影響する代謝障害、重度自閉症、ダウン症、ＬＨＲＨ／視床下部障害および二分脊椎症を含む。
視覚に影響する障害
視覚に影響する障害、特に、網膜細胞の喪失または機能停止により生じた障害は、本発明の方法および本発明の細胞を用いて治療し得る。これらの障害は、例えば、糖尿病性網膜症、緑内障に関連する網膜損傷、網膜への外傷性傷害、網膜血管閉塞症、（滲出型または萎縮型）黄斑変性症、手術後治癒、腫瘍、遺伝性網膜ジストロフィー、視神経萎縮症、およびその他の網膜変性症を含む。本発明の細胞および方法を用いて修復する標的となる細胞は、例えば、脈絡膜、ブルーフ膜、網膜組織上皮細胞（ＲＰＥ）、桿体、錐体、水平細胞、双極ニューロン、アマクリン細胞、神経節細胞および視神経を含む。
脊髄の傷害および疾患
脊髄への傷害またはそれに影響する疾患も本発明の方法により治療し得る。そのような傷害または疾患は、ポリオ後症候群、筋萎縮性側索硬化症、非特異的脊髄変性症、破砕し、部分的に分断し、完全に分断するか、さもなければ脊髄内の細胞機能に悪影響を与える（自動車またはスポーツ事故により引き起こされたもののごとき）外傷性傷害、（例えば、腫瘍摘出のための）脊髄への外科手術によって生じた傷害、前角細胞疾患、および麻痺性疾患を含む。
脱髄性または自己免疫性疾患
脱髄または自己免疫反応によって生じた神経学的欠損は、本発明の方法によって治療し得る。そのような欠損は多発性硬化症または狼瘡によって生じる。
感染症または炎症
感染症または炎症によって生じた神経学的欠損は本発明の方法によって治療し得る。治療可能な欠損を生じ得る感染症または炎症は、クロイツフェルト・ヤコブ病その他のスローウイルス感染症、ＡＩＤＳ脳症、脳炎後パーキンソン症候群、ウイルス性脳炎、細菌性髄膜炎およびその他の生物により引き起こされる髄膜炎、頭蓋内静脈洞の静脈炎および血栓静脈炎、梅毒性パーキンソン症候群、およびＣＮＳの結核を含む。
上に明記した欠損、疾患および障害に加えて、当業者は、その起源にかかわらず、神経学的欠損を十分に理解し、そのような欠損を有する患者を治療するために本発明の方法を適用することができる。ここに記載する方法での治療に向いている列記した病気に加えて、神経学的欠損は、レッシュ・ナイハン症候群、重症筋無力症、様々な痴呆、多数の麻痺性疾患およびてんかんによって生じ得る。さらに、加齢性記憶喪失の軽減が本発明の目的である。本発明の方法はこれらのおよびその他の疾患、障害または傷害によって生じた神経学的欠損を軽減するために容易に適用し得る。
治療に向いた「身体的欠損」
本発明は、分割し、損傷した組織に移動し、組織特異的な様式で分化することを刺激する多分化能前駆対細胞を用いた身体的欠損の改善にも関する。本発明による細胞を用いて、その結果が外傷、不全、例えば、心筋梗塞による心筋のごとき筋肉の変性または喪失である広範囲にわたる疾患、障害および傷害によって生じた身体的欠損を治療し得る。その他の例は、上記の神経学的欠損のセクションで議論されたものとは違う、例えば、内臓のごとき他の細胞および組織の不全、変性または喪失を含む。例えば、肝機能は、とりわけ、疾患（例えば、肝硬変または肝炎）、外傷または加齢によって悪影響を及ぼされる。本発明の具体例を用いる治療に向いている他の代表的な内臓は、心臓、膵臓、腎臓、胃および肺を含む。身体的欠損は例えば椎骨のごとき骨格アセット(skeletal assets)の不全、変性または喪失を含む。
Ｒｅｅｌｉｎおよびアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）
Ｒｅｅｌｉｎ
本発明の高発生能細胞を欠如する動物における神経発生は内在性ＮＳＣに依存する。ＮＳＣの島は胚性および成体ほ乳類脳で検出されており、それらの多分化能の可能性のため、それらはアストロサイト、ニューロンまたはオリゴデンドロサイトに分化し得る。最近の研究は、脳室下領域（ＳＶＺ）中のＮＳＣおよび成体脳の歯状回を観察し、神経発生は生きている間中発生するであろうことを示した。内在性成体ＮＳＣの多能性は領域的にも時間的にも制限されているにもかかわらず、これらの細胞は環境契機に反応して移動し分化する能力を維持する。以下の実施例１に記載するように、２４月齢ラットの側脳室に注入したヒトＮＳＣは、宿主脳への対称的な移動、およびその後のニューロンおよびグリア細胞への分化を示した。この結果は、老齢脳がＮＳＣおよび本発明の外来性高発生能細胞の移動をガイドする調節機構を維持していることを示し、それは適正な成体脳の神経可塑性に不可欠なものであろう。
最近の研究［Corbin et al., 2001, Nat Neurosci 4 Supp. 1:1177-827; Marin et al., 2001, Nat Rev Neurosci 2: 780-901］は、放射方向および接線方向の２つの異なるニューロン移動パターンを明らかにした。各パターンは皮質形成に関与する２つの異なるニューロン集団からなる。一方のニューロン集団は胚性ＳＶＺから増殖し、放射状グリアに沿って移動して皮質下板まで到達し、放射状グリアの足場から離れ、次いで、ガンマアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）作動性カハール・レチウス細胞によって分泌されるｒｅｅｌｉｎ勾配にガイドされる皮質下板に侵入する［D'Arcangelo et al., 1995, Nature 374:719-23］。他方のニューロン集団は神経節終脳隆起の外套にあるＳＶＺにおいて増殖し、ＧＡＢＡ産生介在ニューロンを生じる接線方向に移動する神経芽細胞からなる［Anderson et al., 2001, Development 128:353-63］。成体脳において、宿主グリア細胞は、過渡的放射状グリア型細胞になることによってＮＳＣの移植［Leavitt et al., 1999, Exp. Neurol 157:43-57］および損傷［Yang et al., 1997, Exp. Neurol 146:199-205］に反応し、それは成体神経発生における移動をガイドするように機能するのであろう。対照的に、腹側梨状皮質および嗅球で発現した細胞のサブセットは放射状グリア連結なしに長距離移動し［Durbec et al., 2001, Mol Cell Neurosci 17:561-76］、特異的調節メカニズムが成体脳においてＮＳＣの使用をガイドし、これらのメカニズムのうちのいくつかは発生中に有効なものに類似しているようである。
Ｒｅｅｌｉｎは約４００ｋＤａの大きな細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質であり、それは神経細胞表面上に発現されるインテグリン受容体、超低密度リポタンパク質受容体（ＶＬＤＬＲ）およびアポリポプロテインＥ受容体２（ＡｐｏＥＲ２）のａ３サブユニットに結合し、ｄｉｓａｂｌｅｄ−１（Ｄａｂ−１）細胞質ゾルタンパク質のアダプター機能をトリガーする。インテグリン受容体サブユニットのクラスター化に引き続くｒｅｅｌｉｎ結合はチロシンキナーゼ（接着斑キナーゼ）を活性化して、Ｄａｂ−１をリン酸化する。このリン酸化Ｄａｂ−１は結合し、可溶性チロシンキナーゼおよび機能的細胞コンパートメントに対する転写因子を輸送する。無ｒｅｅｌｅｒマウスにおいて、移動ニューロンは、おそらくｒｅｅｌｉｎに関連するセリンプロテアーゼ活性の欠乏のため皮質下板に侵入できない。皮質形成の間に移動するニューロンの役割に多くの関心が寄せられてきたが、今や、我々は成体脳中のいくつかのニューロン群においてｒｅｅｌｉｎが発現することを知っている［Pesold et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3221-6; Pesold et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3217-22］。このタンパク質は他の重要な機能において有効であり、例えば、ｒｅｅｌｉｎ半数体不完全ヘテロ接合体ｒｅｅｌｅｒマウスは、大脳皮質および海馬の錐体ニューロンにおける樹状突起棘発現密度の低下を示し、アルファ−３−インテグリン（ａ３−インテグリン）受容体サブユニット免疫反応性は樹状突起棘シナプス後肥厚に共局在化し、それは、タンパク質合成を必要とする成体脳神経可塑性（棘形成およびシナプス形成）におけるｒｅｅｌｉｎのための役割を支持する。そのような研究は、統合失調症および自閉症の犠牲者において低下したｒｅｅｌｉｎレベルが見られたという観察との納得のいく関連を引き出した。神経可塑性および幹細胞移動における欠損は内在性幹細胞群または本発明の外来性高発生細胞が脳において必要な領域に移動するのを抑制するか妨げる。
本発明者らの研究は、ｒｅｅｌｉｎがＮＳＣ生物学の調節に重要な役割を演じることを示した。培養中の組換えｒｅｅｌｉｎのＮＳＣの使用への添加は、それらの成長を象徴する細胞クラスター中の細胞の運動性を増大させる。ｒｅｅｌｉｎを発現しないマウスであるｒｅｅｌｅｒホモ接合体マウスの脳にＮＳＣを移植すると、移動はほぼ停止し；ＮＳＣは、移植後野生型マウス脳において、移動しみごとに対称的分布を提示する。本発明者らは、ｒｅｅｌｉｎを発現する細胞のみがｒｅｅｌｅｒホモ接合体マウスの大脳皮質に移動することを見いだした。これらの結果は、ｒｅｅｌｉｎが、ＮＳＣまたは本発明の高発生能細胞の移動の必須な因子であり、統合失調症または自閉症の患者における後成的にダウンレギュレーションされた発現は、潜在的にそれらの発現型に関連する移動および神経可塑性における欠損を生じる。Ｒｅｅｌｉｎは成体大脳皮質中のＧＡＢＡ作動性ニューロンにおいて優先的に発現し、それで、統合失調症の新皮質におけるある程度のＧＡＢＡ作動性インターニューロンの喪失がこのメカニズムによって説明される
Ｒｅｅｌｉｎ発現が抑制されたほ乳類は、脳内で内在性または外来性の多分化能細胞の適正な移動を経験しないであろう。かくして、遺伝子組換え手法、すなわち、ｒｅｅｌｉｎを発現する細胞または内在性細胞トランスフェクションに適当なベクターの導入により、ｒｅｅｌｉｎレベルをあげて、いくつかのさらなるグリア分化を犠牲にしても移動を促進する。Ｒｅｅｌｉｎタンパク質を必要のある動物に投与し得る。例えば、ｒｅｅｌｉｎを発作部位に導入し、損傷領域への多分化能細胞の移動を促進して修復を開始する。適正な移動を可能にするのに十分なｒｅｅｌｉｎレベルに上昇させるのに十分な量にて、Ｒｅｅｌｉｎ発現または全体的なｒｅｅｌｉｎレベルを増加させる薬物を投与することもできる。同様に、動物に存在するｒｅｅｌｉｎの生物学的活性もｒｅｅｌｉｎ受容体に依存する。Ｒｅｅｌｉｎ受容体豊富性またはｒｅｅｌｉｎアフィニティーを変更すれば、動物に存在するいかなるｒｅｅｌｉｎの活性をも促進するか、または抑制し得る。本発明は、細胞移動に影響を与えるとして当該分野でよく知られている遺伝子技術によりｒｅｅｌｉｎ受容体の自然供給を補充するかまたは変更する遺伝子技術の使用を包含する。同様に、本発明は、ほ乳類におけるＡＰＰ受容体の量または結合アフィニティーを変更することによって、ほ乳類において内在性または外来性の多分化能幹細胞の分化を変更する方法を提供する。そのような方法は統合失調症および自閉症にさいなまれる人々を救うであろう。
かくして、ｒｅｅｌｉｎレベルの変化を用いて、内在性ＮＳＣならびに本発明の高発生能細胞のごとき外来性多分化能細胞の移動に影響を及ぼすことができる。
ＡＰＰ
多くの因子がアポトーシス細胞死の後に放出されるが、いくつかの研究は、アポトーシスとアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）との間の重大な相関を指摘する。損傷したニューロンおよびアポトーシスが決定付けられているニューロンはＡＰＰに対して強い免疫陽性信号を発する。さらに、ＡＰＰから産生されるアミロイド遺伝子断片は貧血清条件下、神経細胞から細胞外空間に放出される。ＡＰＰの発現はレチノイン酸誘発性ニューロン分化の間に増大するとも報告されている。ベータ−アミロイド（ｂ−アミロイド）前駆体様タンパク質（ＡＰＬＰ−１およびＡＰＬＰ−２）のｍＲＮＡ発現もヒトＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞のレチノイン酸誘発性分化の間にアップレギュレートする。様々な細胞培養系におけるニューロン分化の間のＡＰＰ発現レベルの増大は、分化プロセス中のＡＰＰに対する重大な細胞機能を示唆する。これらの観察から、無血清条件下、アポトーシス細胞から放出されるＡＰＰ断片は隣接する幹細胞に対して調節および分化因子として機能するようである。
ＡＰＰは発育中および脳損傷後にアップレギュレートされることが知られており、それらの双方ともＮＳＣの移動および分化を必要とするイベントである。分泌ＡＰＰ（ｓＡＰＰ）は、神経幹細胞の増殖および成長を著しく促進することに加えて、タンパク質キナーゼＣおよび培養されたニューロンにおいてシナプス形成を生じる。さらに、ｓＡＰＰはＲａｓ経路によりＰＣ１２細胞におけるＭＡＰＫ（ＥＲＫ）を活性化できることが示されている。ＭＡＰＫ活性化は増殖または分化を誘発し得るので、ｓＡＰＰは基部幹細胞のこの経路を活性化し、細胞分化を誘発する。これらの事実は以下のいくつかの実施例とともに、ＡＰＰの生理学的機能の一つが、適正な構造およびニューロン回路の上手な形成および置換を可能にする脳内の幹細胞生物学の調節であることを示唆する。損傷したまたは死んだ細胞から放出されたｓＡＰＰは優先的にＮＳＣの集団のグリア分化を誘発し、これはＮＳＣの損傷領域へのガイダンスによってニューロン回路を再構築する作用をすることができる。次いで、幹細胞誘導グリア細胞は周囲の損傷細胞を支持し、この領域の他のＮＳＣのニューロン移動および分化を促進し得る。初期アポトーシス細胞死誘発グリア分化後にニューロン分化が起こるという本発明者等のイン・ビトロ観察［Brannnen et al., 2000, Neuroreport 11:123-8］がこの考えを支持する。かくして、通常の生理学的条件下、ＡＰＰは脳損傷から回復するために必要である。家族性ＡＤの場合、これらの患者の脳において産生された増加したレベルのＡＰＰ断片は、ＮＳＣの早熟分化の方向への病因シフトが発生し、それによって、ＮＳＣ集団を減少させるかまたは消耗するように、ＮＳＣの生理学的平衡を修正する。加齢または疾患プロセスの間に成体脳における変性しつつあるニューロンの有効な自然置換が正常脳機能を維持するのに重要であるので、ＮＳＣ集団消耗はそのような置換を妨げる。
予備的な研究において、本発明者らはＡＰＰ断片がアポトーシスＨＮＳＣから分泌され、イン・ビトロでの他のＮＳＣの分化を誘発するという証拠を見つけた。本発明者らは、外から添加した分泌型ＡＰＰ（ｓＡＰＰ）がＮＳＣの分化を誘発する一方、ＡＰＰのＮ末端を認識する抗体はＮＳＣの分化を妨害することも観察した。これらの発見は、ＡＰＰシグナリングがＮＳＣの分化に関与する調節系の一つであることを示唆する。本発明者らは、ＡＰＰノックアウトマウス脳に移植されたＮＳＣは適正に移動せず、脳損傷を修復できないが、野生型マウスへのＮＳＣ移植が適正な位置の上手に移動し、組織に適した様式で分化した。この結果は、ＡＰＰノックアウトマウスにおける表現型変化の最初の発見であるばかりではなく、成体脳細胞の再生におけるＡＰＰの生理学的役割も示唆する。さらに本発明者らは、ＮＳＣ培養へのより高濃度のｓＡＰＰの添加またはトランスジーンによるＡＰＰの過剰発現がこれらの細胞のニューロン分化よりもグリア分化を生じることを見いだした。これらの発見は、ＡＤにおけるＡＰＰ代謝の病因変化が神経幹細胞のグリア分化を誘発し、幹細胞集団の消耗に導くことを示唆し、それは成体脳における神経発生を進めるのに重要であろう。
脳内の内在性幹細胞集団のいかなる消耗をも防止するか、修復するために、本発明の高発生能細胞を本発明方法によりＡＰＰ産生が増大したほ乳類に投与し得る。そのような作用は過剰ＡＰＰを壊滅させるように作用し、それでも多分化能細胞の増大したグリア分化は変性しつつあるニューロンを置換するのに顕著に適正な移動および分化を伴うようにする。あるいは、抗ＡＰＰ抗体を用いて、過剰ＡＰＰレベルを下げる。抗ＡＰＰ抗体をＡＰＰが過剰なほ乳類に投与し、内在性または外来性の多分化能幹細胞集団のグリア分化を防止するのに十分な量にＡＰＰレベルを低下させるようにし得る。遺伝子組換え法を用いて、抗ＡＰＰ抗体を発現するベクターをＡＰＰレベルが上昇したほ乳類に導入し得る。そのような方法は、抗体タンパク質自体の反復投与の必要を防ぐ。さらに、ＡＰＰ発現または全体的なＡＰＰレベルを下げる薬物を投与し得る。
ＡＰＰ発現が抑制されたほ乳類は、脳内において内在性または外来性多分化能細胞の適正な移動を経験しない。かくして、遺伝子組換え技術、いくつかの場合、かなり低レベルで発現する、ＡＰＰを発現する細胞もしくは内在性細胞トランスフェクションに適したベクターの導入によってＡＰＰレベルを上昇させて、いくつかのさらなるグリア分化を犠牲にして、移動を刺激し得る。ＡＰＰタンパク質を必要のあるほ乳類に投与し得る。例えば、ＡＰＰを発作の部位に導入し、損傷領域への多分化能細胞の移動を促進して修復を開始する。グリア分化は脳内の治癒プロセスのなかで重要な部分である。適正な移動を可能にするのに十分なＡＰＰレベルに上昇させるのに十分な量にて、ＡＰＰ発現または全体的なＡＰＰレベルを増大させる薬物を投与することもできる。
Ｒｅｅｌｉｎでのように、動物中に存在するＡＰＰの生物学的活性もＡＰＰ受容体に依存する。ＡＰＰ受容体豊富性またはＡＰＰアフィニティーを変更すれば、動物に存在するいかなるＡＰＰの活性をも促進するか、または抑制し得る。本発明は、細胞移動および／または増殖に影響を与えるとして当該分野でよく知られている遺伝子技術によりＡＰＰ受容体の自然供給を補充するかまたは変更する遺伝子技術の使用を包含する。
かくして、ＡＰＰレベルの変化を用いて、内在性ＮＳＣならびに本発明の高発生能細胞のごとき外来性多分化能細胞の移動および分化に影響を与えることができる。
本発明の細胞の利点は、当該分野で知られている規定手順（例えば、SAMBROOK, ET. AL., MOLECULAR CLONING: A LABORATOY MANUAL. 3RD EDITION, COLD SPRING HABOUR LABORATORY, 2001を参照せよ。）で遺伝子組換えし得ることである。上記したように、好ましい具体例において、（リボチーム、アンチセンス分子その他のＡＰＰ発現を阻害する手段のごとき）ＡＰＰの発現を阻害する構築物が提供され得る。さらなる具体例において、薬物抵抗性遺伝子およびマーカー、またはＧＦＰのごとき検出可能なマーカーが提供され得る。好ましくは、マーカーおよび他の遺伝子は有効であって、本発明のＭＳＣから誘導された最終分化細胞または本発明の未分化ＭＳＣまたは双方において有効な（限定されないが、プロモーターおよびエンハンサーを含む）遺伝子発現調節領域に遺伝子学的に連結している。
以下の実施例は本発明の好ましい具体例をより完全に例示するために提示されたものである。しかしながら、それらが本発明の範囲を限定し、不随する特許請求の範囲によって規定されるものとは決して理解してはならない。
実施例
実施例１
本発明のＮＳＣの移植による老齢ラットの認識機能の向上
ヒトＮＳＣは分化にいかなる外来性因子をも要求せず、それらの生存を支持するためにいかなる因子の添加もなく、基礎培地中で３週間以上生存した［Qu et al., 2001, Neuroreport 12:1127-32］。かくして、ヒトＮＳＣは自体を分化させ支持する因子を産生するようであり、本発明による治療後に老齢動物にこれらの細胞を移植し得ることを示唆する。
補充無血清培地中分裂促進物質の影響下での分化せずに繁殖され、核ＤＮＡへのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取込みによって前処理されたヒトＮＳＣを成熟（６月齢）および老齢（２４月齢）のマウスの側脳室に注入した。本発明の方法により調製したヒトＮＳＣは、老齢ラット脳に異種移植３０日後も多分化能および移動性の両方を維持しつつ生存し、２４月齢ラットの認識機能も向上させた。動物の認識機能は本発明のヒトＮＳＣの移植前および移植４週間後の両方にてモリス水迷路によって評価した。ヒトＮＳＣ移植前、何匹かの老齢動物（非加齢性記憶障害動物）は成熟動物の範囲内で認識機能し、その他（加齢性記憶障害動物）は成熟動物の全く範囲外で機能した。ＢｒｄＵ処理ヒトＮＳＣの移植後、ほとんどの老齢動物は成熟動物の範囲内で認識機能した。印象的なことに、加齢性記憶障害動物の一匹がその行動に劇的な向上を見せ、成熟動物よりもさらに良好に機能した（図２ａ）。統計解析は、ＢｒｄＵ処理ヒトＮＳＣ移植後の認識機能が、成熟および加齢性記憶障害動物の双方にて著しく向上するが、非加齢性記憶障害動物では向上しないことを示し（図２ｂ）、それは老齢動物の肉体的限界であろう。処理ヒトＮＳＣの移植後、水迷路における３匹の老齢動物の能力が低下した。これらの動物の体力が実験期間中に低下した可能性がある。
これらの行動結果は、宿主脳へのＢｒｄＵ処理ヒトＮＳＣ移植の有益な効果を示した。２番目の水迷路タスク後、それぞれニューロンおよびアストロサイトのマーカーであるヒトｂＩＩＩ−チューブリンおよびヒトＧＦＡＰについての免疫組織化学によって死後脳をさらに分析した。脳室歪みの徴候はなく、腫瘍形成の証拠もなく、弱い宿主のアストロサイト染色によって明らかにされたように強い宿主抗移植免疫反応も観察されなかった。強烈にかつ広範囲にｂＩＩＩ−チューブリンで染色すると、ＢｒｄＵ陽性核を有するニューロンが、両側の単一および頭頂皮質（図４ａ〜ｃ）および海馬（図４ｄ、ｅ）に見られた。大脳皮質に見られたｂＩＩＩ−チューブリン陽性ニューロンは大脳皮質の縁に向く樹状突起により特徴付けられる。海馬において、ドナー誘導ニューロンは、細胞サイズや形状、および１以上の突起および分枝において異なる多重モルホロジーを示す。
一般的に、ＧＦＡＰ陽性アストロサイトは神経細胞が見られた領域近辺に局在した。さらなる解析（それらの分布の重ね合わせ像）により、ドナー誘導アストロサイトが大脳皮質のニューロン細線維と共局在化していることが分かった（図４ｆ）。これらのアストロサイトは宿主グリアよりも大きく、直径で８〜１０ミクロンの細胞体と太い突起を持つ。これらのアストロサイトのいくつかは、片側モルホロジー（非対称）を有し、免疫染色は周りに太い環を形成し、大部分の突起は反対側に形成された。ほとんどの細胞は対称的であり、両側から突起が形成された。処理ヒトＮＳＣの移植なしでは通常動物においてこの型の細胞が存在しないことがラットアストロサイトについての免疫組織化学を用いて確認された。宿主アストロサイトは複数の繊細な突起を有する小細胞体を有し、脳全体に、主に白質および脳の縁周辺に分布していた。これらの結果は、本発明の移植細胞がラット脳を移動し、適当な細胞型に分化したことを立証した。認識機能における同時向上は、移植した本発明の高発生能細胞が受給者脳に機能的統合したことを示した。
この実施例および以下のいくつかの実施例には、次の方法を用いた：
モリス水迷路： モリス水迷路は大容量円形タンク（直径１８３ｃｍ；壁高５８ｃｍ）からなり、水（２７℃）で満たされ、粉ミルク（０．９ｋｇ）を添加して白濁させている。迷路の４つの四分割部分のうちの１以上の中央付近の水面下（１ｃｍ）に、透明な避難プラットホーム（高さ３４．５ｃｍ）を配置する。ラットは、連続して７日間、１日につき３回の訓練試行を受け試行間に、６０秒間のインターバルを設けた。訓練試行は、動物を水に９０秒間または遊泳ラットが無事にプラットホームにたどり着くまで入れるおくことからなる。ラットが９０秒間以内にプラットホームを見つけることができなければ、動物を優しくプラットホームに導く。空間学習評価について、プラットホームの位置は迷路の１の四分割部分に固定しておくが、各試行の出発点は変える。毎回６回目の試行がプローブ試行であり、その間、プラットホームを３０秒間プールの底に引き込み、次いで上昇させて避難可能にする。訓練試行は空間タスクの獲得および一時記憶を評価し、プローブ試験を用いてサーチストラテジーを評価する。空間学習評価の完了にて、６回の試行のキュー訓練で１セッションを行い、水面より２ｃｍ上昇した目視可能な黒色プラットホームに避難する訓練をラットに行う。このプラットホームの位置を試行と試行との間で変えて、空間学習能力とは独立した感覚運動機能および動機付け機能を評価する。各ラットに、プラットホームに到達するまで３０秒間を与え、３０秒間の試行間インターバルの直前までそこにいさせる。特性の正確さをプローブ試行から計算した学習インデックススコアを用いて評価する。学習インデックスは、第２、第３および第４の中間プローブ試行に対する平均近似値(proximity)（プローブ試行の長さで除した累積調査誤差(cumulative search error)）から誘導された評価基準である。これらの試行からのスコアを重み付けし、合計して空間学習能力の総合評価基準とする。インデックス上低いスコアは、ターゲット位置付近のより正確な調査を示し；高いスコアはより無作為の調査および低い学習を示す。
細胞の移動および分化： 脳内での本発明の細胞の分化および／または移動を調査するため、高発生能細胞を齧歯類脳に移植した。動物を５０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールで麻酔し（ｉ．ｐ．）、定位固定装置に載せた（David Korp）。５μｌリン酸バッファー化食塩水中約１×１０４ないし１０５個の細胞を低位固定装置に結合したマイクロシリンジを用いて脳室に注入した。電気カミソリを用いて外科部位から毛を除去した後、ヨード液をその領域に塗り、頭蓋表面の皮膚に下方から上方まで０．５ｃｍの外科切開を行った。以下の代表的な配置を用いて、脳室を定位的に位置付けた：（マウスに対して）ＡＰ＝ブレグマから−０．５８ｍｍ、ＭＬ＝硬膜下＋１ｍｍおよび２．４ｍｍ：（ラットに対して）ＡＰ＝ブレグマから−１．４ｍｍ、ＭＬ＝硬膜下＋３．３ｍｍおよび４．５ｍｍ。慎重な穿孔により０．４ｍｍの孔を頭蓋に開けた。マイクロシリンジを用いて、本発明の細胞を脳室に注入した。注入は、５分間かけて行い、針は注入後さらに２分間そこに残した。注入後、外科的に切開した皮膚をマイケル縫合クリップで閉じた（２．５×１．７５ｍｍ）。手術１０日間後、切開部位の適正な治癒が観察され、マイケル縫合を取り外した。
細胞の移動および分化： 脳内での本発明の細胞の分化および／または移動を調査するため、高発生能細胞を齧歯類脳に移植した。動物を５０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールで麻酔し（ｉ．ｐ．）、定位固定装置に載せた（David Korp）。５μｌリン酸バッファー化食塩水中約１×１０４ないし１０５個の細胞を低位固定装置に結合したマイクロシリンジを用いて脳室に注入した。電気カミソリを用いて外科部位から毛を除去した後、ヨード液をその領域に塗り、頭蓋表面の皮膚に下方から上方まで０．５ｃｍの外科切開を行った。以下の代表的な配置を用いて、脳室を定位的に位置付けた：（マウスに対して）ＡＰ＝ブレグマから−０．５８ｍｍ、ＭＬ＝硬膜下＋１ｍｍおよび２．４ｍｍ：（ラットに対して）ＡＰ＝ブレグマから−１．４ｍｍ、ＭＬ＝硬膜下＋３．３ｍｍおよび４．５ｍｍ。慎重な穿孔により０．４ｍｍの孔を頭蓋に開けた。マイクロシリンジを用いて、本発明の細胞を脳室に注入した。注入は、５分間かけて行い、針は注入後さらに２分間そこに残した。注入後、外科的に切開した皮膚をマイケル縫合クリップで閉じた（２．５×１．７５ｍｍ）。手術１０日間後、切開部位の適正な治癒が観察され、マイケル縫合を取り外した。
ラット脳への投与後の本発明の細胞の存在および位置を以下のようにして分析した。移植３０日間後、過剰用量のペントバルビタールナトリウム（７０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）でラットを犠牲にし、リン酸バッファー化食塩水（ＰＢＳ）に続けて４％パラホルムアルデヒドで潅流した。脳を摘出し、２０％スクロースを含有する４％パラホルムアルデヒド固定液中で一晩インキュベートした。クライオミクロトームを用いて、脳を２０ミクロンの前頭断切片にスライスした。切片をＰＢＳで簡単に洗浄し、室温にて３０分間、１Ｍ ＨＣｌで前処理し、次いで、細胞核に取り込まれたＢｒｄＵへの抗ＢｒｄＵ抗体のアクセシビリティーを増大させるために、ホウ酸ナトリウム（０．１Ｍ、ｐＨ８．０）で３０分間中和した。ＰＢＳですすいだ後、断片をＰＢＳ中０．２５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する溶液（ＰＢＳＴ）に３０分間移した。次いで、断片を３％ロバ正常血清を含有するＰＢＳＴ中で１時間インキュベートし、その後、ＰＢＳＴ中で希釈したヒツジ抗ＢｒｄＵ（１：１０００； Jackson IR Laboratories, Inc. West Grove, PA）またはマウス抗ＢｒｄＵ（１：２００； DSHB, Iowa City, IA）で４８℃にて一晩インキュベートすることによってブロックした。ＰＢＳ中で断片をすすいだ後、ローダミンＩｇＧにコンジュゲートしたロバ抗マウスまたはロバ抗ヒツジ（Jackson IR Laboratories Inc.）ＰＢＳＴ中１：２００希釈にて添加し、断片を室温にて暗闇でさらに２時間インキュベートした。
ＢｒｄＵ免疫陽性核を持つ本発明の移植細胞はヒトｂＩＩＩ−チューブリンおよびヒトグリア線維タンパク質（ＧＦＡＰ）につき染色した。次いで、断片をＰＢＳで洗浄し、それぞれ、マウスＩｇＧ２ｂモノクローナル抗ヒトｂＩＩＩ−チューブリン、クローンＳＤＬ３Ｄ１０（１：５００、Sigma）、ヤギ抗ヒトＧＦＡＰ、Ｎ末端ヒトアフィニティー精製（１：２００、Research Diagnostics Inc., Flander, NJ）またはマウスＩｇＧ１モノクローナル抗ＧＦＡＰ、クローンＧ−Ａ−５（１：５００、Sigma）と共に４８℃にて暗闇で一晩インキュベートした。ＰＢＳで簡単に洗浄して過剰な一次抗体を除去した後、一次抗体結合の位置を次いでＦＩＴＣコンジュゲート化（Jackson IR Laboratories Inc.）二次抗体（それぞれ、ロバ抗マウス（１：２００）またはロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ；１：２００））を用いて、断片を室温にて暗闇で２時間インキュベートすることによって決定した。
次いで、断片をＰＢＳで完全に洗浄してから、スライドガラスに搭載した。蛍光顕微鏡観察のために、搭載した断片を４’,６−ジアミジン−２−フェニルインドール・２ＨＣｌ（ＤＡＰＩ、Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA）を用いるベクタシールド(Vectashield)で覆った。Axioscope 2上に搭載したAxiocamカメラを用いて、Axiovision ソフトウェア（Zeiss）で顕微鏡像を撮った。
ＢｒｄＵ免疫陽性核を有する移植ＭＮＳＣをヒトｂＩＩＩ−チューブリンおよびヒトＧＦＡＰについて染色した。同一の顕微鏡視野からの３つの異なる面におけるヒトｂＩＩＩ−チューブリンおよびヒトＧＦＡＰでの二重免疫標識は、これら２つの信号が同一細胞内に共局在化していることを明らかに示す（図５）。製造者の説明によれば、抗ｂＩＩＩ−チューブリン抗体は宿主（ラット）のｂＩＩＩ−チューブリンも認識する。それにもかかわらず、異なる面でのｂＩＩＩ−チューブリンおよびＢｒｄＵの特異的共局在化は、大部分のｂＩＩＩ−チューブリン免疫陽性細胞が実際に移植した本発明の細胞であることを示している。これは、ｂＩＩＩ−チューブリンが主に未成熟ニューロンで発現し、その大部分がここに開示する移植細胞であるからであろう。これらの細胞特異的抗原の存在は、移植した本発明の細胞がそれぞれ上手にニューロンおよびアストロサイトに分化したことを示す。
ＮＳＣ培養：ＮＳＣは購入し（BioWhittaker, Walkesville, MD）、あるいは、ヒト組織から単離し、ＨＡＭＳ−Ｆ１２（Gibco BRL, Burlington, ON）；抗生物質−抗真菌剤混合物（１：１００、Gibco）；Ｂ２７（１：５０、GIBCO）；ヒト組換えＦＧＦ−２およびＥＧＦ（各２０ｎｇ／ｍｌ、R&D Systems, Minneapolis, MN）；ならびにヘパリン（５μｇ／ｍｌ、Sigma, St. Louis, MO）を含む非補充無血清基礎培地で培養した。細胞を５％ＣＯ２加湿インキュベーションチャンバー（Fisher, Pittsburgh, PA）内で約３７℃にてインキュベートした。最適成長条件を容易にするため、１以上のＮＳＣのクラスターを２週間毎に４つに切断し、４〜５日毎に５０％の培地を入れ替えることによって栄養補給した。分化を阻害するために、細胞は非被覆フラスコまたは細胞を退ける処理がされているフラスコ上で繁殖させ得る。分化を誘発するために、これらの細胞をアール塩およびＬ−グルタミンを含む無血清基礎培地イーグルBME）中の培養皿（１皿あたり約１×１０５個）に再接種し得、ＦＧＦ−２およびＥＧＦの不存在下および他の外部からの分化因子の添加もせずに約５日間培養した。この無血清培地で培養したＮＳＣは自発的にニューロン細胞型に分化し得る。
実施例２
イン・ビトロでのＭｅＳＣの神経分化
神経幹細胞は、胚性および成体のほ乳類およびヒト［Doetsh et al., 1999, Cell 97: 703-16; Johansson et al., 1999, Cell 96: 25-34］の中枢神経（ＣＮＳ）から単離され、様々な培養系でイン・ビトロ繁殖されている［Svendsen et al., 1999, Brain Pathol. 9:499-513］。複雑なはっきりとしない体液（例えば、血清）の不存在下、培養中で神経祖先を成長させることの能力がないことが、これらの細胞の生理学を理解する上で長い間障害となっていた。ＭｅＳＣおよびＮＳＣを増殖させる長期培養系が確立された［Brannon et al., 2000, Neuroreport 11:1123-8］。多分化能ヒトＮＳＣがイン・ビトロで繁殖する能力が生物学的調査用のよく特徴付けられた物質を生成する。長期培養で成長するとき、ＮＳＣはｂＩＩＩ−チューブリン−およびグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）−免疫陽性細胞に分化する［Brannon et al., 2000, Neuroreport 11:1123-8］。３年間のイン・ビトロ繁殖後、そのようなヒトＮＳＣは、無血清基礎培地条件下、分化してニューロンおよびグリアを産生する可能性を維持して、これらの細胞の多分化能を示し、かくして、この培養系がＮＳＣを維持し、それらの生物学を調査するのに最適であることを立証する。ＮＳＣは酸素損傷ヒト神経細胞系統（Ｓｙ５）との共培養においても分化した。Ｓｙ５細胞の一晩培養を別記の培地で成長させ、ＮＳＣ培地中０．０、０．０１、０．０３または０．１μＭ Ｈ２Ｏ２で１５分間処理し、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地で完全に洗浄し、次いで、ＮＳＣと共培養した。結果（図６（ＩＩ））は、それがイン・ビトロ繁殖の非常に長期間後でも損傷した神経細胞に反応することによってニューロンおよびアストロサイトに分化し得ることを示す。
幹細胞の運命は前後関係の契機に大きく影響される。幹細胞はそれらが暴露されている環境的契機によって反応し、特定の細胞型に分化し得る。さらに、（神経環境契機に反応しないＭｅＳＣのごとき）環境的契機に反応して分化し得ない細胞を本発明の方法により置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドで処理したとき、それらがそのように分化できるようになる。それらは特性上高発生能になる。ここに、神経組織がＢｒｄＵで前処理されたＭｅＳＣにおいて神経系譜を開始し得る環境因子を産生することを立証する。ＭｅＳＣをＭｅＳＣのＢｒｄＵ（共培養前に５日間１０μＭ ＢｒｄＵ）処理後、分化したＮＳＣと共培養した。ＭｅＳＣは血清または基礎分化条件の使用後ニューロンにもグリアにも分化しなかった（ｂＩＩＩ−チューブリンおよびＧＦＡＰ陰性）（データ示さず。）。ＮＳＣは基礎培地条件；すなわち、共培養前５日間、アール塩およびＬ−グルタミンを含有する無血清基礎培地（Invitrogen）において、１２ウェル組織培養プレートで分化させた。ＮＳＣは自発的に混合細胞集団に分化し、中央に２以上の細胞のクラスターを形成した神経前駆体および冠状に移動する未成熟および／または成熟ニューロンおよびアストロサイトを含む（図７）。次いで、ＢｒｄＵで処理したＭｅＳＣを組織培養０．４μｍ膜インサート（Falcon）に移し、基礎培地条件で分化したＮＳＣの上部に置いた。
共培養７日後の免疫細胞化学は、ＢｒｄＵ処理ＭｅＳＣが、ｂＩＩＩ免疫陽性小双極および非極細胞に（全細胞の約４０％）およびＧＦＡＰ免疫陽性大平坦多極細胞（全細胞の約６０％）に分化することを明らかにした（図８）。ＭｅＳＣから誘導されたｂＩＩＩ−チューブリン免疫陽性細胞は分化ＮＳＣに見られるものよりも短かったが、ＮＳＣおよびＭｅＳＣ分化培養に双方における細胞の全体モルホロジーが同様である（図８）。この結果は、ＢｒｄＵ前処理ＭｅＳＣは、分化ＮＳＣと共培養したとき、ニューロンおよびグリアになれることを示す。一方、ＢｒｄＵ非処理ＭｅＳＣはｂＩＩＩ−チューブリンまたはＧＦＡＰ免疫反応性のいずれも発現せず、共培養後も繊維芽様モルホロジー状態を維持し、置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシド処理がＭｅＳＣにおいて神経系譜変化を開始するのに必要であるとの明確な証拠を立証した。
例えば、レチノイン酸やＢＤＮＦ（脳誘導神経栄養因子）のごとき外来性分化因子を培養に添加せず、また、この共培養系中では細胞−細胞接触が存在しないので、膜透過性外来性因子が分化しつつあるＮＳＣから放出され、非処理ＭｅＳＣでは不可能な様式でＢｒｄＵ処理ＭｅＳＣの細胞運命決定を変更した。すなわち、この場合、神経環境契機に反応できるＮＳＣのように、ＢｒｄＵ処理ＭｅＳＣは高発生能細胞として働いた。
ＭｅＳＣ培養： それらは当業者によく知られた数々の方法で単離し得るが、本実施例に関しては、ヒトＭｅＳＣは購入し（BioWhittaker, Walkersvill, MD）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３３４およびＣＤ１３３抗原についてのネガティブセレクションによって選択した。ＭｅＳＣは、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Gibco, BRL, Burlington, ON）；抗生物質−抗真菌剤混合物（Gibco）；およびＦＢＳ ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ培地（Stem Cell Technologies, Vancouver, BC）で培養した。５％ＣＯ２加湿インキュベーションチャンバー（Fisher, Pittsburgh, PA）内で３７℃にて、細胞をインキュベートした。１週間に２回培養培地の半分を入れ替えることによって細胞に栄養補給した。６０回後、細胞は依然として上記の抗原について陰性であった。イン・ビトロおよびイン・ビボ分化の前、様々な持続時間（２４〜２４０時間）、異なる用量（１０ｎＭ〜１００μＭ）の５−ブロモ−２−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ、Sigma）でヒトＭｅＳＣを処理した。ＤＮＡメチル化がＢｒｄＵ効果に関与しているかどうか調べるために、５−アザチジンの存在下（０．３〜１ｍＭ）、ＢｒｄＵで処理した。前記の成長条件は、例えば、ＮＳＣその他の幹細胞のごときＭｅＳＣ以外の細胞型に適用可能である。
ヒトＭｅＳＣおよびＮＳＣの共培養： ヒトＮＳＣ（約１×１０４ないし１×１０５）は、共培養前に、アール塩およびＬ−グルタミンを含有する無血清基礎培地イーグル（BME, Gibco）において、ＦＧＦ−２およびＥＧＦの不存在下、他の外来性分化因子の添加なしで、５日間１２ウェル培養プレートで分化させた。これらの条件下、ＮＳＣは自発的にニューロンおよびグリアに分化した。共培養実験について、ＢｒｄＵ処理ヒトＭｅＳＣ（約１×１０４ないし１×１０５）を、孔径が０．４μｍの細胞培養インサート（Falcon, Franklin Lakes, NJ）に移し、これらの分化しつつあるＮＳＣ上の基礎培地に懸濁させた。ＮＳＣに対するＭｅＳＣの比率は、約１：１であった。ＭｅＳＣの免疫細胞化学分析について、培養インサートは７日間の共培養のかなり後で除去し、ＭｅＳＣをメタノールで３０分間−２０℃にて固定した。
免疫細胞化学： 固定化後、ＭｅＳＣをＰＢＳで３回簡単に洗浄し、次いで、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中３％ロバ正常血清で１時間ブロックし、マウスＩｇＧ２ｂモノクローナル抗ヒトｂＩＩＩ−チューブリン、クローンＳＤＬ３Ｄ１０（１：５００、Sigma）およびヤギ抗ヒトグリア線維タンパク質（ＧＦＡＰ）Ｎ末端ヒトアフィニティー精製（１：２００、Research Diagnostics, Inc., Flader, NJ）で一晩４℃にてインキュベートした。対応する二次抗体は、それぞれ、ローダミンにコンジュゲートしたロバ抗マウスおよびＦＩＴＣ（Jackson IR Laboratories, Inc.）にコンジュゲートした抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）であった。簡単なＰＢＳ洗浄後、二次抗体を１：２００希釈にてＰＢＳに添加し、暗闇で室温にて２時間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡観察のためにＤＡＰＩ入りのベクタシールド（Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA）で覆った。
画像およびデータ解析： 培養細胞の蛍光顕微鏡観察からのデジタル取込み画像は、セル・スコアリング、パーティクル・アナリシスおよびセル・アナリシスマクロを用いたＮＩＨ画像ソフト（NHI）によって解析し得る。対象領域にある特定の抗体マーカーを示す細胞の個数を計数し得る。さらに、全細胞数は、ＤＡＰＩ核対比染色によって計数し得、各細胞数は全細胞数の割合で表現する。各処理条件からの結果はＡＮＯＶＡおよびその後のポストホック（Fisher's Protected LCD）解析によって解析し得る。
実施例３
マウス脳内での本発明のＭｅＳＣの神経分化
ＢｒｄＵ処理高発生能ＭｅＳＣのイン・ビボでの移動および分化パターンを試験するために、上記のように分化せず繁殖し、核ＤＮＡへのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取込によって標識されたそのようなＭｅＳＣを成体マウスの側脳室に注入した（Ｃ５７／ｂｌａｃｋ）
移植から４ないし６週間後、それぞれニューロンおよびアストロサイトのマーカーであるヒト特異的ｂＩＩＩ−チューブリンおよびＧＦＡＰについての免疫組織化学によってマウス脳を分析した。移植ＭｅＳＣの移動および分化パターンはラットに移植されたＮＳＣでの本発明者等の以前の結果と全く同様であった。ＢｒｄＵ免疫陽性核を有する移植ＭｅＳＣは宿主脳内でニューロンおよびアストロサイトに分化し、それはｂＩＩＩ−チューブリンおよびＧＦＡＰについての二重染色後の蛍光顕微鏡によって証拠付けられた。ＭｅＳＣ誘導細胞は、注入部位からそれらの位置的な終点までの長距離を移動した。ｂＩＩＩ−チューブリンおよびＧＦＡＰについての二重免疫染色でのさらなる解析は、ＭｅＳＣ誘導ニューロンおよびアストロサイトは、それぞれ、大脳皮質のＶ層およびＩＩＩ層に局在することを明らかにした（図９ａ、ｂ）。これらのニューロンは大脳皮質の縁を向く樹状突起によって特徴付けられ、これらのニューロン樹状突起は大脳皮質のＩＩＩ層にあるアストロサイトと関連するようである。海馬の錐体細胞層の周囲では（図９ｃ〜ｈ）、ニューロンはｂＩＩＩ−チューブリンに対して免疫陽性であり、複数の突起と分枝のあるモルホロジーを示した。ＧＦＡＰに対する強アストロサイト染色が海馬のＣＡ２小領域で観察された。ＢｒｄＵ標識核を有するＭｅＳＣ誘導細胞は、腹側前頭にあるカレヤーハ島および嗅球の上衣下を含む活動的な出生後神経形成が行われている領域に局在した。
ＢｒｄＵ処理がなければ、動物の脳に移植されたＭｅＳＣはヒトｂＩＩＩ−チューブリンおよびヒト神経細繊維に対して免疫反応性を示し、環境的契機もＭｅＳＣのニューロン分化に寄与するにもかかわらず、ＢｒｄＵ処理がＭｅＳＣの分化に必要であることを示す。
イン・ビトロおよびイン・ビボ試験からのこれらの結果は、ＭｅＳＣが、置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドの処理によって、間葉限定を克服し、その胚起源とは表現型としては無関係の神経系譜細胞に分解することを示す。
実施例４
ラット硝子体腔への移植後の本発明のＭｅＳＣの移動および分化
ラットの硝子体腔へのＭｅＳＣの移植について、注入前分化のない６ウェル組織培養において、ＴＧＦ−ｂ３（１ｎｇ／ｍｌないし１０ミクロングラム／ｍｌ；ここでは１００ｎｇ／ｍｌ）および約２μＭの５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を含有する上記の長期維持培地で３日間細胞を培養した。
針で意図的に傷をつけ、これらの細胞を注入してＭｅＳＣの移動を容易にした。傷つけた後、約１．５×１０５ないし２×１０５個の細胞を含有する２０μｌの細胞懸濁液を右目の硝子体内空間にゆっくりと注入した。左目は、注入せずに対照として無傷のままにした。移植３０日後、そのラットを犠牲にし、眼球を全部摘出した。次いで、これらの眼球をパラフィン包埋し、５μｍの断片にスライスした。断片をラット抗ＢｒｄＵ（１：６００、Accurate Chemical & Scientific Corp.）およびマウスロドプシン（１：２００、Chemicon）を用いて二重免疫蛍光細胞化学を用いて染色し、スライドに載せ、次いで、ＤＡＰＩ入りのＶＥＣＴＡＳＩＥＬＤマウンティング培地を用いてカバースリップした。
図１０は、ＢｒｄＵおよびＴＧＦ−ｂ３で前処理したＭｅＳＣの移植４週間後の網膜断片の免疫細胞化学およびイン・シチュハイブリダイゼーション組織化学（ＩＳＨＨ）を示す。網膜の損傷領域へのこれらの細胞の広範囲の移動が見られ（図１０ａ）、眼内注入後の網膜への神経幹細胞の移動および取込みを発見した他の研究者［Nishida et al., 2000, Invest Ophthalomol Vis Sci 41:4268-7f4; Kurimoto et al., 2001, Neurosci Lett. 306:57-60; Warfvinge et al., 2001, Exp. Neurol. 169:1-12］と同様であった。しかしながら、光受容体層に取り込まれたＭｅＳＣが実際にオプシン免疫反応を示すことが可能であることはここで初めて立証され（図１０ｂ）、対照的に、以前の研究（同上）はそのような発見は報告していない。ヒトおよびラットの双方のオプシンを認識する抗オプシン抗体を用いたので、ドナー（ヒト幹細胞）によって、または宿主（ラット細胞）によってどちらのオプシンが発現されたのかは決定できなかった。この技術的問題を解消するために、ＩＳＨＨをヒトロドプシン遺伝子エンコーディング領域に対して下記のように行った。クローン化ヒトロドプシン配列はＧｅｎｂａｎｋに列記される他のいずれの種のオプシン遺伝子をも認識せず：特に、この配列はラット遺伝子に見られるいずれのＤＮＡ配列に対しても顕著な類似性を示さなかった（データ示さず）。ＤＩＧ標識ＲＮＡプローブとしてヒトオプシン遺伝子配列を用いて、ヒト幹細胞移植後の網膜にヒトオプシン発現を検出した（図１０ｃ）。これらの結果は、ＢｒｄＵおよびＴＧＦ−ｂ３で前処理したＭｅＳＣがラット網膜に取り込まれるだけでなく、光受容体細胞に分化することも示した。本発明の方法によりＢｒｄＵで前処理していないＭｅＳＣは組織に適した様式で移動も分化もしなかった。
代表的ヒト特異的オプシンリボプローブの構築： ヒト特異的ロドプシン遺伝子配列の３６０ｂｐフラグメント（Ｕ４９７４２の６２４１ｂｐから６６０１ｂｐまで）を選択した。選択されたヒト特異的ロドプシン遺伝子配列は多の種からの他のロドプシン遺伝子との顕著なレベルの同一性は示さない。特に、この配列はラットゲノムに見られるいずれのＤＮＡ配列との顕著な類似性を示さない（データ示さず）。順方向プライマー（５’−ＴＴＣＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＴＧＡＧＡＴＴ−３’；配列番号：１）および逆方向プライマー（５’−ＧＧＡＡＴＴＴＣＣＣＡＣＴＣＴＴＴＧＴＴ−３’；配列番号：２）を用いるＰＣＲによって、ヒトゲノムＤＮＡから選択されたヒト特異的ロドプシン遺伝子配列を増幅した。ＰＣＲ増幅は、対照ヒトゲノムＤＮＡ（１００ｎｇ、Invitrogen）、１×増幅バッファー（Invitrogen）、４０ｎＭの各プライマーｄＮＴＰ混合物（２５０μＭ、Invitorgen）およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ、Invitrogen）を含有する５０μｌ体積中、９５℃（３０秒間）、５２℃（３０秒間）および７２℃（６０秒間）の３０サイクルで行った。ＰＣＲ増幅フラグメントは、２％寒天ゲル上でのゲル精製後、ＴＯＰＯＴＡクローニングイン・ビトロ転写ベクター（Invitrogen）にライゲートした。プラスミドをイー・コリコンピテント細胞（Strategene）に形質転換し、インサートを配列決定することによって、クローンを確認した。
パラフィン包埋断片中のヒトオプシンｍＲＮＡのイン・シチュハイブリダイゼーション組織化学： ジゴキシゲニン標識ヒトオプシン特異的リボプローブをイン・ビトロ転写によって作製した。反応（２０μｌ）を４μｌの５×転写バッファー（USB Corporation）、２μｌの１０×ジゴキシゲニンＲＮＡ標識混合物（０．２μｇ／ｍｌ、Roche）、１μｌのテンプレートＤＮＡ（上記のＰＣＲ反応物、１００ｎｇ／ｌ）、２μｌのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ、USB）、および１１μｌの分子生物学グレード水を含有する反応混合物中で行った。ピペットを用いて混合した後、反応混合物を室温にて２時間インキュベートした。プローブをエタノール沈降法で精製し、１００μｌ分子生物学グレード水に溶解した。１０μｌのこのプローブ溶液を用いて、ハイブリダイゼーション混合物を作製した。ラット眼断片を室温中５分間キシレン（Fisher）で脱パラフィンし、室温にて連続濃度のエタノール（Fisher）および蒸留水を用いて含水させた。次いで、断片を０．１Ｍリン酸バッファー化食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４で１５分間室温にて洗浄し、その後、１０ｎｇ／ｍｌのプロテインキナーゼＫ（Sigma）と共に３７℃にて３０分間インキュベートした。断片をグリシン溶液（０．７５ｇグリシン／１０ｍｌの０．１Ｍ ＰＢ、ｐＨ７．４）中５分間室温にて洗浄し、２．５％無水酢酸を含有する１３％トリエタノールアミン溶液（ｐＨ８．０）で１０分間室温にて処理した。次いで、断片を室温（ＲＴ）にて１５分間づつ２×ＳＳＣ（食塩水−クエン酸ナトリウムバッファー、Sigma、ｐＨ７．０）で２回洗浄した後ハイブリダイゼーションバッファーで予備ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションバッファーは、５０％ホルムアミド、１×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン（Invitorgen）、４×ＳＳＣ、０．２５ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡおよび０．３ｍｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡからなる。１０μｌの上記のジゴキシゲニンリボプローブを含有するハイブリダイゼーションバッファー中で６０℃にて１８時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、断片を４×ＳＳＣバッファーで２回洗浄し、５０％ホルムアミドおよび２×ＳＳＣで６０℃にて３０分間厳密に洗浄した。断片をＲＮＡアーゼバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍ ＥＤＴＡ）で室温にて１０分間洗浄し、次いで、ＲＮＡアーゼ溶液（ＲＮＡアーゼバッファー中５０μｇ／ｍｌのＲＮＡアーゼ（Promega））とともに室温にて３０分間インキュベートした。断片を連続濃度のＳＳＣバッファー（２×、０．５×、０．１×）で２回６０℃にて２０分間洗浄し、最後の洗浄だけは室温にて行った。ＰＢＳですすいだ後、一次抗体が結合したジゴキシゲニン、ヒツジ抗ジゴキシゲニン（１：５００、Roche）、およびフルオレセイン（ＦＩＴＣ）−コンジュゲーティド・アフィニティー精製ロバ抗ヒツジＩｇＧ（１：２００、Jackson Laboratories）が結合した二次抗体の免疫検出によって可視化した。
画像およびデータ解析： 培養細胞の蛍光顕微鏡観察からのデジタル取込み画像は、上記のセル・スコアリング、パーティクル・アナリシスおよびセル・アナリシスマクロを用いたＮＩＨ画像ソフト（NHI）によって解析し得る。
実施例５
ＤＮＡメチル化およびＢｒｄＵ
いくつかのＤＮＡ制限消化酵素はシトシンメチル化に感受性であり、それらは切断部位がメチル化シトシンを含むとＤＮＡを切断することができない。そのような酵素の一つ（ＨｐａＩＩ）を用いて、ＤＮＡメチル化の修飾によって、ＢｒｄＵ処理が酵素切断パターンを変更するかどうかを調査した。０μＭ、１μＭおよび１０μＭのＢｒｄＵで７２時間処理したヒトＭｅＳＣからのゲノムＤＮＡを消化し、０．６％のポリアクリルアミド上のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。用量依存的に、消化により生じたＤＮＡフラグメントのサイズが増大し、ＢｒｄＵが酵素消化を妨害したことを示した（図１１）。この結果は、ＢｒｄＵ処理によるＤＮＡメチル化状態の変更によって説明できるであろう。他の置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドの化合物はＢｒｄＵの適当な代替物である。
実施例６
基底核大細胞（ＮＢＭ）損傷ラットモデルへの本発明の高発生能細胞の移植
幹細胞移植ストラテジーはアルツハイマー病（ＡＤ）神経形成療法において支持される。基底コリン作動性ニューロンは、ＡＤにおいて選択的に変性され、長い投射が大脳皮質および海馬まで伸長する。ＡＤに対する神経置換治療についての未解決の問題は、これらの変性しつつあるコリン作動性細胞を幹細胞の移植によって置換し得るかどうかである。この問題に答えるために、本発明の高発生能細胞を基底核大細胞（ＮＢＭ）損傷モデルラットに移植した。損傷はイボテン酸の注入によるか、またはサポニンにコンジュゲートした抗ＮＧＦ受容体抗体（Advanced Targeting System, San Diego CA）によって誘発した。本発明により調製した細胞をＮＢＭ損傷ラットの反対側の側脳室（Qu, 2001）に同時に注入した。手術４週間後、脳を免疫組織化学で調べた。多くのＧＦＡＰ陽性細胞が損傷領域で検出されが、ＢｒｄＵ陽性ではなく、この領域でのアストロサイト活性化を示した。ＣｈＡＴまたはｂＩＩＩ−チューブリン免疫活性を有するＢｒｄＵ陽性細胞が損傷部位に見られ、本発明の高発生能細胞が反対側の脳室から損傷部位に移動し、コリン作動性その他の神経細胞に分化したことを示す。これらのニューロンへ分化する細胞は、どちらかといえばモルホロジー的に未成熟に見えるニューロンである。本発明者等の結果は、ＡＤにおけるコリン作動性ニューロンの神経置換治療が肯定的な研究であることを示した。
本発明の細胞の移植： オスＳＤラットをペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で深く麻酔した。ブレグマを基準点として用いて、約１×１０５個の本発明の細胞を収集し、固定装置（Devid Kopff）を用いてラット脳の右脳室に注入した（ＡＰ１．４；ＭＬ３．３；およびＤＶ４．５ｍｍ）。
１９２−ＩｇＧ−サポニンコンジュゲートで誘導したコリン損傷： オスのスプラーグ・ドーリーラット４月齢を５０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールで麻酔し、固定装置（David Kopf）に載せた。マイクロシリンジを用いて、（滅菌濾過２００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）のビヒクル中）１μｇ／２μｌの１９２−ＩｇＧ−サポニンコンジュゲートトキシンの片側ＮＢＭ注入を行った。以下の配置を用いて、ＮＢＭを定位的に位置付けた：ＡＰ＝ブレグマから−２．３ｍｍ、ＭＬ＝硬膜下±３．７、７．５ｍｍ。トキシンを５分間かけて送達し、針は注入後さらに５分間そこに残した。
免疫組織化学： ラットを過剰用量の麻酔薬（ペントバルバタール、７０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）によって犠牲にし、リン酸バッファー化食塩水（ＰＢＳ）に続けて４％パラホルムアルデヒドで潅流した。脳を摘出し、２０％スクロースを含有する４％パラホルムアミド固定液中に一晩入れた。クライオミクロトームを用いて、脳を２０μｍの前頭断切片にスライスした。切片をＰＢＳで簡単に洗浄し、室温（ＲＴ）にて３０分間、１Ｍ ＨＣｌで前処理し、次いで、細胞核に取り込まれたＢｒｄＵへの抗ＢｒｄＵ抗体のアクセシビリティーを増大させるために、ホウ酸ナトリウム（０．１Ｍ、ｐＨ８．０）で３０分間中和した。ＰＢＳですすいだ後、断片をＰＢＳ中０．２５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する溶液（ＰＢＳＴ）に３０分間移した。次いで、断片を３％ロバ正常血清を含有するＰＢＳＴ中で１時間ブロックし、その後、ＰＢＳＴ中で希釈したマウス抗ＢｒｄＵ（１：２００； DSHB, Iowa City, IA）またはヒツジ抗ＢｒｄＵ（１：１０００； Jackson IR Laboratories, Inc. West Grove, PA）で４℃にて一晩インキュベートした。次いで、断片をＰＢＳで洗浄し、それぞれ、マウスＩｇＧ２ｂモノクローナル抗ヒトｂＩＩＩ−チューブリン、クローンＳＤＬ３Ｄ１０（１：５００、Sigma）、ラットＩｇＧモノクローナル抗ＣｈＡＴ（１：５００、Boehringer-Mnnheim）およびヤギ抗ヒトグリア細線維タンパク質、Ｎ末端ヒトアフィニティー精製（１：２００、Research Diagnostics Inc., Flander, NJ））と共に４℃にて暗闇で一晩インキュベートした。ＰＢＳですすいだ後、ローダミンまたはＦＩＴＣ（Jackson IR Laboratories, Inc.）にコンジュゲートしたロバ抗マウス、ロバ抗ラット、ロバ抗ヤギまたはロバ腔ヒツジＩｇＧを室温にてＰＢＳＴ中１：２００希釈にて２時間添加した。次いで、断片をＰＢＳで完全に洗浄してから、スライドガラスに搭載した。核対比染色用のＤＡＰＩを含有するマウンティング培地で断片をカバースリップした。
ＮＢＭ中の増大したＧＦＡＰ免疫反応はサポニン損傷４週間後に観察された（図１２、グリーン：ＧＦＡＰ；ブルー：ＤＡＰＩ）。コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）免疫反応も損傷部位にあるＢｒｄＵ陽性細胞において観察され、移植された本発明の細胞によって損傷が置換されたことを示す。さらに、ＣｈＡＴ免疫反応性が損傷部位にあるヒト核陽性細胞において観察された（図１３ｄ、グリーン：ＣｈＡＴ；レッド：ヒト核；ブルー：ＤＡＰＩ）。ヒト核免疫反応陽性細胞が損傷領域で観察され（図１４、レッド：ヒト核；ブルー：ＤＡＰＩ）、ＧＦＡＰおよびヒト核免疫反応性が損傷部位で観察された（図１５、グリーン：ＧＦＡＰ；レッド：ヒト核；ブルー：ＤＡＰＩ）。多数の移植細胞が損傷部位に移動し、移植４週間後にはどちらかといえば成熟したニューロンおよびグリアに分化した。損傷が本発明の細胞を引き寄せるようであり、損傷部位からの移動因子の放出の可能性を示した。
実施例７
幹細胞におけるｒｅｅｌｉｎ、アルファ３−インテグリンおよびＤＡＢ−１の発現
細胞培養中のｒｅｅｌｉｎの機能を調査するために、ヒトＭＮＳＣを無血清条件下で分化させた。以前に、ヒトＭＮＳＣは無血清条件下で少なくとも３週間は生存するだけでなく、ｂ３−チューブリン、ＧＦＡＰおよびＯ４免疫陽性細胞に完全に分化することも観察された。
組換えｒｅｅｌｉｎへの暴露が、分化しつつあるヒトＭＮＳＣ培養を即座にそのプロセスを細胞クラスターに引き戻すという発見に基づくと、ｒｅｅｌｉｎは移動を調節する働きをするのであろう。細胞クラスターは未分化細胞培養からなり、移動し、細胞を分化させ、リーディングアウタープロセス(leading outer processes)を形成する。
ＨＮＳＣにおけるｒｅｅｌｉｎおよび反応性メカニズムを評価するために、ｒｅｅｌｉｎアルファ３−インテグリン（ａ３−インテグリン）およびＤＡＢ−１を認識する抗体を用いて、免疫細胞化学およびウェスタンブロット解析を行った。分化５日後、ｒｅｅｌｉｎ免疫反応性（グリーン）は主にニューロンを示す小双極細胞上に存在し、非常に小さなｒｅｅｌｉｎ免疫反応性がＧＦＡＰ陽性細胞（レッド）中で検出され、それはアストロサイトを示す（図１６ｂ）。ａ３−インテグリンの免疫反応性も小双極細胞上で検出されたが、ＧＦＡＰ陽性細胞では検出されず、これはニューロンで優勢なａ３インテグリンの発現を示し（図１６ｂ）、一方ＤＡＢ−１、細胞質アダプタータンパク質において、免疫反応性はニューロンのみならず、アストロサイトでも検出された（図１６ｃ）。ＤＡＢ−１の細胞内分布は、核で最も高く、細胞質では均一であった。電子顕微鏡を用いて、ａ３−インテグリン免疫反応性は、細胞膜に局在していることが観察された（図１７）。図１６において、ｒｅｅｌｉｎはｒｅｅｌｉｎ陽性細胞から放出されてしまっていて、隣接細胞に到達しているようである。モノクローナル抗体（Ｒｅｅｌｉｎ１４２）で分化したＨＮＳＣから免疫沈降することによって調製した試料のウェスタンブロット解析はｒｅｅｌｉｎ、ａ３−インテグリンおよびＤＡＢ−１免疫陽性帯を示し、これらの細胞がｒｅｅｌｉｎ信号カスケードにおいて互いに相互作用し、細胞集団から放出されたｒｅｅｌｉｎが幹細胞生物学のレギュレーターとしてこれらの細胞の移動を調整するであろうことを示した。
Ｒｅｅｌｉｎ免疫反応性は分化前の細胞クラスターにも存在するので（図１７ｄ）、ＨＮＳＣ運動はクラスター中心内でのｒｅｅｌｉｎの能動的産生(active production)によって統制されている可能性があり、それは分化の急速状態を防止する働きをする。一方、クラスターの外縁に位置する細胞は、より低濃度のｒｅｅｌｉｎに暴露されるであろう。その結果、これらの細胞はあまり制限されず、分化し、クラスターの中心から移動し始める。未分化幹細胞がｒｅｅｌｉｎを発現するので、マウス胚性幹細胞においてｒｅｅｌｉｎ発現も調査した。３日齢の胚において、胚性幹細胞のサブ集団がｒｅｅｌｉｎを発現し、ｒｅｅｌｉｎが幹細胞生物学を調節する因子であることが示された。なぜなら、カハール・レチウス細胞が皮質形成を開始する前に、それは胚性幹細胞中で発現されるからである。
実施例８
幹細胞のｒｅｅｌｅｒマウスへの移植
イン・ビボにおけるヒトＭＮＳＣの移動および分化のパターンに対するｒｅｅｌｉｎの影響を調べた。ヒトＭＮＳＣは上記したように分化せずに繁殖させ、ＢｒｄＵの核ＤＮＡへの取込みによって処理した。次いで、ヒトＭＮＳＣを１月齢の野生型（ｃ５７／ｂｌａｃｋ）およびｒｅｅｌｅｒマウスの側脳室に注入した。注入４週間後に、これらの動物からの脳をｂＩＩＩ−チューブリン、ＧＦＡＰおよびＢｒｄＵについての免疫細胞化学によって調査した。野生型動物は以前のラット移植研究で見られたものと同様の移植ＨＮＳＣの分化および分布パターンを示した（図２０）。
Ｒｅｅｌｅｒマウスに移植したヒトＭＮＳＣは宿主脳内でうまく移動しなかった。大脳皮質において、少数のＧＦＡＰ陽性細胞しか検出されなかったが（図２１ｄ）、ｂＩＩＩ−チューブリン陽性ＨＮＳＣは存在しなかった（図２１ａ）。注入部位の近くで見られたｂＩＩＩ−チューブリン陽性ヒトＭＮＳＣは異常なモルホロジーを示した（図２１ｂ）。Ｒｅｅｌｉｎ陽性ヒトＭＮＳＣは大脳皮質中の白質中に尾を引く移動パターンを示し（図２１ｆ）、環境ｒｅｅｌｉｎがＮＳＣの移動に必要なことおよびｒｅｅｌｉｎを発現する細胞はｒｅｅｌｅｒマウス中で移動する可能性を有することを示した。
実施例９
Ｒｅｅｌｅｒマウスにおける幹細胞集団の分析
ここに記載された実施例がｒｅｅｌｅｒマウスにおける質素な移動パターンを示すので、本発明者らは、内在性幹細胞について同様の移動パターンを疑った。野生型マウスと比較して、ｒｅｅｌｅｒマウス中の内在性幹細胞分を調査するために、ＢｒｄＵ（１００ｍｇ／ｋｇ／日）をｒｅｅｌｅｒホモ接合体、ｒｅｅｌｅｒヘテロ接合体および野生型マウスに４日間注入した。これらのマウスの海馬およびＳＶＺをＢｒｄＵにつき免疫蛍光染色した。注入期間中に増殖したマウスＮＳＣはＢｒｄＵをその核内に取込み、それはＢｒｄＵ陽性細胞として検出し得る。野生型マウスと比較して、ｒｅｅｌｅｒホモ接合体およびヘテロ接合体マウスの双方の海馬において、ＢｒｄＵ陽性細胞の顕著な減少が見られ（図２２）、幹細胞の増殖は影響されないが、ＳＶＺから海馬への幹細胞の移動はｒｅｅｌｉｎの欠如により劇的に減少することを示した。
実施例１０
Ｒｅｅｌｅｒマウスからの幹細胞の単離
ｂＦＧＦの反応体として成体マウス（４月齢、Ｃ５７／ｂｌａｃｋ）からＮＳＣを単離した。ヒトＭＮＳＣ培養で用いたものと同じ培地を用いてそれらをイン・ビトロで繁殖させた。細胞はクラスターを形成し（図２３ａ）、それらはＮＳＣによって形成されたものと同様であった。これらのＮＳＣはイン・ビトロ繁殖３月後分化によってニューロンおよびアストロサイトを産生できた（図２３ｂ）。
実施例１１
無血清条件下で分化したＭＮＳＣの特性
無血清分化の早期段階（１〜３日イン・ビトロ、ＤＩＶ）の間、多くのヒトＭＮＳＣは、細胞がアポトーシス細胞死ディスプレイを受ける収縮モルホロジーと同一型を示す。この型の細胞死をさらに評価するために、ＴＵＮＥＬアッセイを用いて、血清または無血清で分化したＨＮＳＣにおいて、アポトーシスの早期マーカーであるイン・シチュＤＮＡフラグメンテーションを検出した。多くの細胞が無血清分化条件下でＴＵＮＥＬ信号につき陽性であり、細胞体収縮を提示し、その後培養プレートから細胞離脱した。対照的に、血清分化条件下ではほんのわずかなＴＵＮＥＬ陽性細胞しか検出されなかった（図２４）。ニューロンは血清奪取後アポトーシスを受けること、およびＢ２７が培養皮質組織においてニューロン死を防ぐことが知られているので、無血清分化条件におけるヒトＭＮＳＣのアポトーシスは補充欠乏によるものであろう。１ＤＩＶの間、無血清非補充培地に接種したヒトＭＮＳＣの本発明者らによる時間経過ビデオ顕微鏡研究は、分化しつつあるヒトＭＮＳＣは上記のほぼモルホロジー的にアポトーシス細胞に接触しそうであることを明らかにした（図２５）。これらの結果は、ヒトＭＮＳＣが、先ず、無血清分化条件下でアポトーシス状態になり、引き続き、隣接する細胞の運命に影響する移動および／または分化因子を発現することを示唆する。
ＡＰＰのＮ末端を認識するモノクローナル抗体である２２Ｃ１１での免疫細胞化学と、ＴＵＮＥＬアッセイとの組合せが、隣接ヒトＭＮＳＣに見られるＡＰＰのバックグランドと比較して、無血清条件下でのＴＵＮＥＬ信号陽性細胞においてＡＰＰ免疫反応性の増大を明らかにした（図２６）。この結果は、ＡＰＰ発現がアポトーシス細胞中では上昇するという以前の結果を確認しただけではなく、隣接細胞の分化に影響するアポトーシス細胞中で産生される一つの因子がＡＰＰのＮ末端フラグメントであろうという重要な示唆をした。
実施例１２
ＡＰＰに対する抗体による無血清条件下でのヒトＭＮＳＣ分化の阻害
分化中に分泌されたＡＰＰフラグメントの関与を調査するために、ＨＮＳＣを血清または無血清分化条件下で３日間様々な２２Ｃ１１濃度で共インキュベートした。培養への２２Ｃ１１の添加は、用量依存的に（１２５、２５０、５００μｇ／ｍｌ）、無血清非補充条件下でヒトＭＮＳＣの分化を阻害した（図２７）。対照的に、２Ｃ１１処理は、非血清分化条件下でヒトＭＮＳＣの分化を阻害しなかった（データ示さず）。これらの結果は、ＡＰＰが無血清分化条件下でヒトＭＮＳＣの分化に関与するが、ＡＰＰ経路に依存しない分化因子が血清分化条件下で存在する。
実施例１３
分泌型ＡＰＰでのヒトＭＮＳＣの処理
ヒトＭＮＳＣ分化の２２Ｃ１１誘発性阻害が起こるかどうかを、ｓＡＰＰの分離によるか、または分化細胞の膜上にあるＡＰＰのＮ末端ドメインをブロックすることによって調査するために、ヒトＭＮＳＣを外来性ｓＡＰＰで処理した。組換えヒトｓＡＰＰを酵母中で産生し、それは９５％ｓＡＰＰ６９５Ｔ（６９５のアミノ酸５０５にて終了する）および５％ｓＡＰＰ６９５を含有する。細胞培養への組換えｓＡＰＰの添加は、用量依存的に（２５、５０および１００ｎｇ／ｍｌ）、無血清分化条件下でヒトＭＮＳＣを分化させた（図２８）。この結果は、２２Ｃ１１によるｓＡＰＰの分離がＨＮＳＣ分化を阻害するのに役割を演じるであろうことを示唆する。ｓＡＰＰ処理はヒトＭＮＳＣにおいてＴＵＮＥＬ信号を増大させなかった（データ示さず）。
無血清条件下で５ＤＩＶのｓＡＰＰ処理ヒトＭＮＳＣの個体数もＧＦＡＰおよびｂＩＩＩ−チューブリンの二重免疫蛍光標識によって特性決定された（図２９）。ｓＡＰＰでの処理は、用量依存的に（２５、５０および１００ｎｇ／ｍｌ）、最高濃度ｓＡＰＰ（５ＤＩＶにて１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて対照（無ｓＡＰＰ）における平均４５％から平均８３％にＧＦＡＰ陽性細胞の集団を増加させた。高用量のｓＡＰＰ（５０および１００ｎｇ／ｍｌ）は、分化ヒトＭＮＳＣの全集団中のｂＩＩＩ−チューブリン陽性ニューロンを、対照中の平均５１％から高濃度ｓＡＰＰ中の平均１３％にまで、用量依存的に減少させた（図３０）。これらの結果は、死に行く細胞から放出されたｓＡＰＰがヒトＭＮＳＣの分化を促進しつつ、高用量にてグリア形成を生じることを示した。ｓＡＰＰはグリア分化を増加させることによって細胞運命決定に影響し得；ｓＡＰＰはアストロサイトの加速移動を引き起こし、グリア細胞分化のレベルを増大させ；高濃度のｓＡＰＰはニューロンに分化するヒトＭＮＳＣ集団を減少させるかまたは除去する。なぜならば、ニューロン細胞系統における高ＡＰＰ発現がキャスパーゼ３(caspase 3)活性化によってアポトーシス細胞死を引き起こすことが報告されているからである。
実施例１４
ヒトＭＮＳＣへのＡＰＰトランスジーンの効果
ｓＡＰＰのグリア分化促進効果を確かめるために、ヒトＭＮＳＣを野生型ＡＰＰまたはｓＡＰＰに対する遺伝子を含有するほ乳類発現ベクターでトランスフェクトし、無血清非補充条件下で分化させた。５ＤＩＶにて、野生型ＡＰＰでトランスフェクトしたヒトＭＮＳＣは、ベクター単独でトランスフェクトしたヒトＭＮＳＣと比較して、グリア分化レベル顕著に高いことを明らかにした（図３１）。これらの結果は、ｓＡＰＰの発現に加えて、野生型ＡＰＰ過剰発現もＨＮＳＣのグリア分化を誘発することを示唆する。この発見は、トリソミー２１を引き起こす染色体異常であるダウン症（ＤＳ）に関連しているであろう。その特徴的な肉体的顕示に加えて、ＤＳ患者は、しばしば、早期発症ＡＤを示す。ＡＰＰ遺伝子は染色体２１にも局在するので、トリソミー２１によるＡＰＰ遺伝子発現の増大は脳内の過剰量のＡＰＰを説明できるであろう。ＡＰＰがニューロン発育に役割を演じ、成人ＤＳ患者におけるＡＤの早期発生は加齢に関わる異常変性プロセスに関連することは示唆されてきている。
実施例１５
ＨＭＳＣのＡＰＰノックアウトマウスへの移植
ＨＮＳＣをＡＰＰノックアウトマウスの脳に移植することによって、イン・ビボでのヒトＭＮＳＣ生物学へのＡＰＰの調節効果をさらに調査した。
宿主と移植細胞とを区別するために、移植前に、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）をＤＮＡに取り込ませることによって、ヒトＭＮＳＣをイン・ビトロ標識した。引き続き、これらの標識細胞（約１０５）を２月齢のｃ５７／ｂｌａｃｋ野生型およびＡＰＰノックアウトマウスの大脳側室に片側注入した。移植４週間後野生型脳断片の免疫組織化学試験は、上記の加齢性記憶障害ラットへのヒトＭＮＳＣ移植の以前の研究と同様の移動および分化パターンを明らかにした。単一および頭頂皮質（ＩＩ、ＩＶおよびＶ層）（図３２ａ）において両側に分布する細胞ならびに海馬（錐体細胞層）（図３５ｃ）は、ＢｒｄＵおよびヒトｂＩＩＩ−チューブリンにつき強烈にかつ広範囲に免疫反応性であった。移植ヒトＭＮＳＣも大脳皮質にあるＩＩＩ層のニューロン細線維と共局在するＧＦＡＰ免疫陽性細胞に分化する（図３２ｅ）。ｂＩＩＩ−チューブリン−またはＧＦＡＰ−陽性細胞のこれらのモルホロジーおよび分布は、ヒトＭＮＳＣ移植を受けなかった野生型マウスでは検出されなかった。
ＡＰＰノックアウトマウスに移植したヒトＭＮＳＣもｂＩＩＩ−チューブリン−およびＧＦＡＰ−陽性細胞に分化するが、分布および移動パターンは全身的であり、分化細胞数は対照野生型マウスと比較して少なかった。ＡＰＰノックアウトマウスの海馬においてどちらかといえば均一なｂＩＩＩ−チューブリン陽性細胞分布および構造にもかかわらず（図３２ｄ、ｆ）、ｂＩＩＩ−チューブリン陽性ＨＭＮＳＣは大脳皮質にほとんど分布せず、尖端樹状突起を欠如する（図３２ｂ）。移植ヒトＭＮＳＣのＡＰＰ発現が宿主脳におけるＡＰＰ欠損を部分的に補うことはあり得ないことではないが、そのような発現レベルは無視し得、環境ＡＰＰの不存在が移植ＨＮＳＣの移動パターンを明らかに変更することは実に明白である。これらの結果は、ＡＰＰノックアウトマウスにおけるＨＮＳＣの移動および分化を適正にガイドするのには十分な環境因子がないこと、および環境または分泌ＡＰＰは、イン・ビボでヒトＭＮＳＣの細胞運命および移動を調節するのに重要であろうことを示す。
実施例１６
ＡＰＰノックアウトマウスにおける幹細胞集団の分析
上記の結果はＡＰＰノックアウトマウスの適当ではない幹細胞移動パターンを示したので、同様の移動パターンが内在性幹細胞に期待された。これを調査するために、ＡＰＰマウスの内在性幹細胞集団を野生型マウスと比較した。ＢｒｄＵ（１００ｍｇ／ｋｇ／ｍｌ）をＡＰＰノックアウトおよび野生型マウスに４日間注入した。試験マウスの海馬およびＳＶＺをＢｒｄＵについて免疫蛍光染色した。マウスＮＳＣは、注入期間中に増殖し、ＢｒｄＵをそれらの核に取込み、それは免疫蛍光的に検出し得る。ＡＰＰノックアウトマウスの海馬におけるＢｒｄＵ陽性細胞は野生型マウスと比較して減少し（図３３）；一方、ＡＰＰノックアウトマウスのＳＶＺにおける幹細胞集団は保存され（図３３）；幹細胞の増殖は影響されないが、ＳＶＺから海馬への幹細胞の移動がＡＰＰ欠如によって低減されたことを示す。
上記の開示は本発明の特定の具体例を強調するものであり、それに均等な全ての修飾および変更は特許請求の範囲に記載されているように本発明の精神および範疇内にあるものと理解されるべきである。
図１は、本発明の細胞のある具体例の特性である浮遊する細胞凝集クラスターの位相コントラスト顕微鏡写真を示す。 図２は、モリス水迷路試験における記憶スコアへのＭＮＳＣ移植の影響を示す。（ａ）移植前後の個々の記憶スコアが大部分の動物において改善されたことを示す。ブルー：老齢記憶障害動物、グリーン：老齢非記憶障害動物、レッド：成熟動物。（ｂ）ＭＮＳＣ移植の前（細斜線バー）および後（黒色バー）での各動物群における平均記憶スコアが老齢記憶障害動物および若齢動物において顕著に改善されたことを示す。賦形剤注入された動物は、注入の前（太斜線バー）と後（ハッチ掛けバー）との間で有意差を示さなかった。 図３は、イン・ビボでのＭｅＳＣの網膜細胞への分化を示す。全ての核はＤＡＰＩで対比染色された（ブルー）。（ａ）損傷および本発明のＭｅＳＣの移植４週間後の網膜細分の典型的免疫細胞化学である（×１００）。この細分はＢｒｄＵ（レッド）およびオプシン（グリーン）マーカーで、それぞれ、ドナー細胞および視神経細胞について二重免疫蛍光染色された。本発明のＭｅＳＣは網膜組織の損傷領域に移動した。高倍率（ｂ、×４００）で、これらの移動するＭｅＳＣもオプシンの細胞質ゾルの発現を示す。（ｃ）ヒト特異的オプシン配列リボプローブ（グリーン）を用いたヒトオプシン遺伝子発現の典型的イン・シチュハイブリダイゼーション組織化学（×１００）。ヒトオプシン陽性細胞のラット網膜組織への取込みが観察される。 図４は、ＭＮＳＣ移植３０日後の老齢ラット脳の典型的蛍光免疫組織化学顕微鏡写真を示す。ｂＩＩＩ−チューブリンおよびＧＦＡＰ免疫反応性をそれぞれニューロンおよびグリアのマーカーとして用いた。（ａ）本発明のＭＮＳＣは大脳皮質に移動し、ｂＩＩＩ−チューブリン陽性細胞（グリーン）で示されるようにニューロンに分化し、頭頂皮質のＩＶおよびＶ層中の錐体細胞に典型的なモルホロジーを有する。尖端樹状突起は大脳皮質辺縁に向いていた。ＭＮＳＣはＢｒｄＵで前処理されていたので、移植細胞はＢｒｄＵ陽性核（レッド）を有している。対照的に、宿主細胞の核はＤＡＰＩで対比染色されている（ブルー）。ＩＩ層にｂＩＩＩ−チューブリン免疫反応性を持ち、ＩＩＩ層にｂＩＩＩ−チューブリン免疫反応性を持たないＢｒｄＵ陽性核を有する多くの細胞が観察される。（ｂ、ｃ）皮質ＩＶ層の頭頂皮質の高倍率：全てのｂＩＩＩ−チューブリン免疫反応性（グリーン）陽性細胞がＢｒｄＵ（レッド）陽性核を示すが、多くの他の宿主細胞の核はＤＡＰＩ（ブルー）ので染色されるだけである。ＭＮＳＣは宿主細胞よりも大きな核を持つ傾向にある。（ｄ）ＭＮＳＣは、ＣＡ１錐体細胞層中で、海馬に移動し、ｂＩＩＩ−チューブリン陽性細胞（グリーン）に分化した。これらのｂＩＩＩ−チューブリン陽性細胞はＢｒｄＵ陽性核（レッド）を有し、これらの細胞が移植細胞を起源とすることを示す。対照的に、ＤＡＰＩ（ブルー）で対比染色された宿主細胞核はｂＩＩＩ−チューブリン陽性ではない。（ｅ）歯状回において、ｂＩＩＩ−チューブリン陽性細胞（グリーン）およびＧＦＡＰ免疫陽性細胞（レッド）に加えて、多くの線維が、ｂＩＩＩ−チューブリン陽性であった。（ｆ）ｂＩＩＩ−チューブリン陽性細胞（グリーン）およびＧＦＡＰ陽性細胞（レッド）が、それぞれ、ＩＶ層およびＩＩＩ層で見られた。アストロサイトのそのような層はＭＮＳＣ移植をしていない正常ラットでは観察されなかった。 図５は、同一細胞中のｂＩＩＩ−チューブリン陽性細胞（ニューロンマーカー）およびＢｒｄＵ免疫反応性の共局在化を示す。（ａ〜ｃ）同一の顕微鏡図の３つの異なる平面。ｂＩＩＩ−チューブリン陽性細胞（グリーン）はＢｒｄＵ陽性核（レッド）を示し、これらの細胞が移植されたＮＳＣから誘導されたことを示す。 図６（Ｉ）は、ｂＩＩＩ−チューブリン（ａ）およびグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）（ｂ）に対する抗体を用いた分化ヒトＭＮＳＣの免疫組織化学を示す。 図６（ＩＩ）は、酸化損傷ＳＨ−Ｓｙ５ヒト神経芽腫との共培養中のＭＮＳＣ分化を示す：（左から右に向かって）淡灰色バー＝対象（０．０μＭ Ｈ２Ｏ２）；中間灰色バー＝低濃度Ｈ２Ｏ２（０．０１μＭ）；濃灰色バー＝中濃度Ｈ２Ｏ２（０．０３μＭ）；黒色バー＝高濃度Ｈ２Ｏ２（０．１μＭ）。 図７は、無血清基礎培地中のＭＮＳＣの自発分化を示す。分化細胞の混合集団は図の上部に位置する細胞クラスターから外側に冠状に移動している。 図８は、本発明の分化ヒトＭＮＳＣ（ａ）およびＭｅＳＣ（ｂ）の蛍光免疫組織化学を示す。ｂＩＩＩ−チューブリン（グリーン）およびＧＦＡＰ（レッド）免疫反応性はそれぞれニューロンおよびグリア分化を示す。ＤＡＰＩでの核対比染色をブルーで示す。 図９は、本発明の高発生能ＭｅＳＣの移植４〜６週間後のラット脳の典型的蛍光免疫組織化学を示す。ｂＩＩＩ−チューブリン免疫反応性をニューロンマーカーとして用いた。移植前にＭｅＳＣをＢｒｄＵで処理したため、移植細胞はＢｒｄＵ陽性核（レッド）を有する。ＭｅＳＣは大脳皮質に移動し、ｂＩＩＩ−チューブリン陽性細胞（グリーン）で示されるようにニューロンに分化し、錐体細胞に典型的なモルホロジーを有する（ａ、ｂ）。全てのヒト特異的ｂＩＩＩ−チューブリン（グリーン）陽性細胞がＢｒｄＵ（レッド）陽性核を示すが、多くの他の宿主細胞核はＤＰＩ（ブルー）で染色されるだけである。尖端樹状突起はＭＮＳＣから分化したニューロンと比較して波打っているが、大脳皮質辺縁に向いていた。ＭＮＳＣは宿主細胞よりも大きな核を有する傾向にある。ＭＮＳＣは、ＣＡ１錐体細胞層中で、海馬に移動し、ｂＩＩＩ−チューブリン陽性細胞（グリーン）に分化した（ｃ〜ｈ）。これらのｂＩＩＩ−チューブリン陽性細胞はＢｒｄＵ陽性核（レッド）を有し、これらの細胞が移植細胞を起源とすることを示す。対照的に、ＤＡＰＩ（ブルー）で対比染色された宿主細胞核はｂＩＩＩ−チューブリン陽性ではない。移植４週間後（ｃ、ｄ）にて、ｂＩＩＩ−チューブリン陽性細胞は双極ニューロンモルホロジーを示し、錐体細胞線にさらに移動するであろう。移植５週間後にて、いくつかの細胞はすでの錐体細胞線に到達し、モルホロジーが変化し始めている。移植６週間後（ｇ、ｈ）にて、細胞は錐体細胞様モルホロジーを示し始めていた。 図１０は、イン・ビボでのＭｅＳＣの網膜細胞への分化を示す。全ての核はＤＡＰＩで対比染色された（ブルー）。（ａ）損傷および本発明のＭｅＳＣ移植４週間後の網膜細分の典型的な免疫細胞化学である（×１００）。この細分はＢｒｄＵ（レッド）およびオプシン（グリーン）マーカーで、それぞれ、ドナー細胞および視神経細胞について二重免疫蛍光染色された。本発明のＭｅＳＣは網膜組織の損傷領域に移動した。高倍率（ｂ、×４００）で、これらの移動するＭｅＳＣもオプシンの細胞質ゾルの発現を示す。（ｃ）ヒト特異的オプシン配列リボプローブ（グリーン）を用いたヒトオプシン遺伝子発現の典型的イン・シチュハイブリダイゼーション組織化学（×１００）。ヒトオプシン陽性細胞のラット網膜組織への取込みが観察される。 図１１は、ヒトＭｅＳＣから抽出したゲノムＤＮＡの制限酵素消化に対するＢｒｄＵの影響を示す。ＢｒｄＵは、用量依存の様式でＤＮＡのメチル化感受性制限酵素消化を防ぎ、ＭｅＳＣのＢｒｄＵ処理がゲノムＤＮＡのＤＮＡメチル化部位を増加させることを示す。 図１２は、サポニン損傷４週間後の大細胞性基底核（ＮＢＭ）におけるＧＦＡＰ免疫反応性が増大したことを示す。グリーン：ＧＦＡＰ；ブルー：ＤＡＰＩ。 図１３は、損傷部位のＢｒｄＵ陽性細胞におけるコリン性アセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）免疫反応性を示し、本発明の移植細胞による損傷細胞の置換（ａ〜ｃ；グリーン：ＣｈＡＴ；レッド：ＢｒｄＵ；ブルー：ＤＡＰＩ）および損傷部位にあるヒト核陽性細胞におけるＣｈＡＴ免疫反応性を示す（ｄ；グリーン：ＣｈＡＴ；レッド：ヒト核；ブルー：ＤＡＰＩ）。 図１４は、損傷領域で観察されたヒト核免疫反応性陽性細胞を示す。レッド：ヒト核；ブルー：ＤＡＰＩ。 図１５は、損傷部位におけるＧＦＡＰおよびヒト核免疫反応性を示す。グリーン：ＧＦＡＰ；レッド：ヒト核；ブルー：ＤＡＰＩ。 図１６は、ヒトＭＮＳＣにおけるｒｅｅｌｉｎ、ａ３−インテグリンおよびＤａｂ−１の発現を示す。（ａ）ｒｅｅｌｉｎ免疫反応性は、主にニューロン様細胞（グリーン）で検出されたが、ＧＦＡＰ陽性細胞（レッド）もｒｅｅｌｉｎ免疫反応性を有する。（ｂ）ａ３−インテグリン（グリーン）は、特異的にニューロン様細胞内で発現するが、Ｄａｂ−１（レッド）はほとんどの細胞で発現する。（ｃ）Ｄａｂ−１免疫反応性（レッド）は核に高度に局在化される。（ｄ）ＭＮＳＣのクラスターの面でもｒｅｅｌｉｎ免疫反応性（グリーン）が検出された。 図１７は、ａ３−インテグリン免疫応答性が細胞膜上に局在化されていることを示す電子顕微鏡像を示す。 図１８は、（ａ）ｒｅｅｌｉｎ、（ｂ）ａ３−インテグリンおよび（ｃ）ＤＡＢ−１のウェスタンブロット解析を示す。 図１９は、胚性幹細胞におけるｒｅｅｌｉｎ発現を示す。ｒｅｅｌｉｎ免疫反応性はグリーンで示され、核はＤＡＰＩで染色された（ブルー）。 図２０は、ヒトＭＮＳＣ移植後の対照マウス脳の免疫組織化学を示す。（ａ）ヒトＭＮＳＣ移植後の対照マウス脳は大脳皮質に移動し、ｂＩＩＩチューブリン陽性細胞（グリーン）で示されるようにニューロンに分化した。（ｂ）高倍率下で、ＢｒｄＵ陽性核（レッド）を有するニューロン性分化細胞（グリーン）は錐体細胞に典型的なモルホロジーを有する。（ｃ）ヒトＭＮＳＣは海馬に移動し、ＢｒｄＵ陽性核（レッド）を有するｂＩＩＩ−チューブリン陽性細胞（グリーン）に分化し、それはＣＡ１錐体細胞層における錐体細胞に典型的なモルホロジーを有する。（ｄ）ＧＦＡＰ陽性ヒトＭＮＳＣの層（ブラウン）は大脳皮質で見られた。（ｅ）二重免疫染色によって、大脳皮質におけるＧＦＡＰ陽性細胞（レッド）とｂＩＩＩ−チューブリン陽性細胞との会合が明らかとなった。 図２１は、ヒトＭＮＳＣ移植後のｒｅｅｌｉｎマウス脳の免疫組織化学を示す。（ａ）ｂＩＩＩ−陽性細胞（グリーン）はあまり観察されなかった。（ｂ）高倍率下で、注入した側に、１群のＢｒｄＵ陽性細胞が観察された。（ｃ）海馬（グリーン）におけるヒトＭＮＳＣのｂＩＩＩ−チューブリン陽性細胞への分化であり、対照動物において、ＣＡ１錐体細胞層で観察された細胞とは異なるモルホロジーを有する。（ｄ）大脳皮質には、ほとんどＧＦＡＰ陽性ヒトＭＮＳＣ（ブラウン）が観察されなかった。（ｅ）大脳皮質における、ＢｒｄＵ陽性核（レッド）を有するｂＩＩＩ−チューブリン（グリーン）陽性細胞の異なるモルホロジーである。（ｆ）大脳皮質における、ｒｅｅｌｉｎ（グリーン）の連鎖移動である。 図２２は、海馬、嗅球およびＳＶＺにおけるヘテロ接合ｒｅｅｌｅｒ（＋／−）、ホモ接合ｒｅｅｌｅｒ（−／−）および野生型のマウスのＢｒｄＵ陽性細胞のニューロン数を示す。ＡＮＯＶＡ後のフィッシャーの保護ＬＳＤポストホック解析による野生型マウスとの比較で、ｒｅｅｌｅｒ（＋／−）およびｒｅｅｌｅｒ（−／−）のマウスにおいて、幹細胞数の著しい減少が海馬（ｐ＜０．００１）および嗅球（ｐ＜０．０１）で観察されたが、ＳＶＺでは観察されなかった。 図２３は、成体マウスから単離した幹細胞を示す。（ａ）イン・ビトロ繁殖中、幹細胞はＮＳＣで見られたものと同様の複数細胞のクラスターを形成する。（ｂ）幹細胞はｂＩＩＩＩ−チューブリン陽性細胞（グリーン）およびＧＦＡＰ陽性細胞（レッド）に分化し、これらの細胞の多分化能を示す。 図２４は、ヒトＭＮＳＣが、無血清非補充培地において分化の間（ａ）、血清分化（ｂ）と比較すると、より高い度合いのアポトーシス細胞死（イエロー）を受けていることを示す。フルオレッセイン・アポトーシス・ディテクション・システム（Promega, Madison, WI）を用いて、３ＤＩＶにてＨＮＳＣのＤＮＡフラグメンテーションをアッセイした。ＨＮＳＣの全ての核はヨウ化プロピジウムによって対比染色され（レッド）、ＤＮＡフラグメンテーション陽性細胞はグリーンで染色された。 図２５は、２ＤＩＶにて無血清培地中で接種したクラスターにおけるＭＮＳＣ分化の特性をモニターする時間経過ビデオ顕微鏡観察を示す。分化しつつあるＭＮＳＣ（矢印）は細胞のクラスターから移動する（ａ）。興味深いことに、これらの細胞は繁殖プロセスにあり、ほぼモルホロジー的には収縮し見かけ上はアポトーシス細胞であり（ｂ）、その後プロセスが撤回する。これらのプロセスはアポトーシス細胞に結合するようであり（ｄ）、それは細胞クラスターに引き戻される（ｅ）。アポトーシス細胞に分化しつつあるＮＳＣの使用の反応は、アポトーシス細胞のいくつかの成分が分化しつつあるＮＳＣの生理学的活性に影響を与え得る要因として機能することをさらに示唆する。 図２６は、無血清分化条件におけるアポトーシス細胞がＡＰＰ免疫陽性であることを示す。ＨＮＳＣの全ての核はＤＡＰＩで対比染色された（ａ、ブルー）。ＴＵＮＥＬ信号（ｂ、グリーン）および（ＡＰＰのＮ末端を認識する）２２Ｃ１１モノクローナル抗体によって認識されるＡＰＰに対する免疫反応性（ｃ、レッド）が、無血清分化条件において収縮モルホロジーの細胞に共局所化する（ｄ）。 図２７は、無血清非補充培地における、ＡＰＰのＮ末端を認識する２２Ｃ１１モノクローナル抗体でのヒトＭＮＳＣの処理がそれらの分化を用量依存的に阻害することを示す。パネルは、３ＤＩＶにて２２Ｃ１１で処理されたときのヒトＭＮＳの典型的なモルホロジーを示す（ａ；対照、ｂ；１２５μｇ／ｍｌ、ｃ；２５０μｇ／ｍｌおよびｄ；５００μｇ／ｍｌの２２Ｃ１１）。 図２８は、培養中のヒトＭＮＳＣの組替え分泌型アミロイド前駆体タンパク質（ｓＡＰＰ）で５日間の処理が無血清非補充条件下でヒトＭＮＳＣの分化を増大させることを示す（ａ；対照、ｂ、２５ｎｇ／ｍｌ、ｃ；５０ｎｇ／ｍｌおよびｄ；１００ｎｇ／ｍｌ）。 図２９は、無血清分化条件下５ＤＩＶにてのｓＡＰＰ処理ヒトＭＮＳＣの細胞集団は、それぞれアストロサイトおよびニューロンのマーカーであるＧＧＦＡＰ（レッド）およびｂＩＩＩ−チューブリン陽性細胞で二重免疫蛍光染色によって特徴付けられた。全ての核はＤＡＰＩで対比染色された（ブルー）。パネルは、（ａ）；対照、（ｂ）２５ｎｇ／ｍｌ、（ｃ）；５０ｎｇ／ｍｌおよび（ｄ）１００ｍｇ／ｍｌのｓＡＰＰで処理されたヒトＭＮＳＣの典型的モルホロジーおよび分化パターンを示す。低用量のｓＡＰＰ（例えば、２５ｎｇ／ｍｌ）にて、対照と比較してグリア（レッド）およびニューロン（グリーン）の増大した分化が観察された。より高い用量のｓＡＰＰで、多くのグリア分化ヒトＭＮＳＣ（レッド）が観察された。 図３０は、各分化型の定量的集団解析を示す。ＧＦＡＰおよびｂＩＩＩ−チューブリンにつき免疫染色された細胞はＤＡＰＩ標識核の総細胞数に対して記録した。全データ値は平均パーセント（±ＳＥＭ）で表現される。一要因ＡＮＯＶＡ後のポストホック解析（Student-Newman-Keuls）を用いて実験群と対照との間の統計学的有意差を立証した（＊：ｐ＜０．０１）。 図３１は、無血清非補充条件下で分化された野生型ＡＰＰ（ｗｔＡＰＰ）のいずれかの遺伝子を含有するほ乳類発現ベクターでトランスフェクトされたヒトＭＮＳＣが５ＤＩＶにてベクター単独でトランスフェクトされたヒトＭＮＳＣと比較してかなり高いレベルのグリア分化を提示したことを示す。画像は、それぞれアストロサイトおよびニューロンのマーカーであるＧＦＡＰ（レッド）およびｂＩＩＩ−チューブリン（グリーン）での二重免疫蛍光染色を示す。全ての核はＤＡＰＩ（ブルー）で対比染色された。 図３２は、ＡＰＰノックアウトマウス脳に移植されたヒトＮＳＣが、野生型対照マウスに移植された細胞と比較して、あまり移動せず、分化もしないことを示す。片側脳室注入前に、ヒトＭＮＳＣをＢｒｄＵで処理して、宿主細胞から識別される助けとする。脳組織は、注入４週間後にｂＩＩＩ−チューブリン、ＧＦＡＰおよびＢｒｄＵにつき免疫ブロットした。野生型マウスにおいて、ＢｒｄＵ（レッド）およびｂＩＩＩ−チューブリン（グリーン）に対して免疫陽性な細胞は、単一および頭頂皮質（ａ）および海馬の錐体層（ｃ）の両側に分布し、移植されたヒトＭＮＳＣのニューロン分化を示す。ヒトＭＮＳＣはＧＦＡＰ免疫陽性細胞（レッド）にも分化し、それは大脳皮質のＩＩＩ層のｂＩＩＩ−チューブリン染色ニューロン細線維と共に局在化する（ｅ）。移植ヒトＭＮＳＣの分化および分布パターンはラットでの本発明者らの以前の移植実験で観察されたものと同じであった。ＡＰＰノックアウトマウスにおいて、移植ヒトＭＮＳＣから誘導されたＢｒｄＵ（レッド）免疫陽性細胞を有するそれらのｂＩＩＩ−チューブリン陽性細胞（グリーン）は、大脳皮質に見られ、ほとんど分布せず、尖端樹状突起を欠如する（ｂ）。海馬において、ｂＩＩＩ−チューブリン（グリーン）およびＢｒｄＵ（レッド）免疫陽性細胞は、野生型マウスに見られる細胞と全く同じ分布および構造を有していた（ｄ、ｆ）。 図３３は、ＡＰＰノックアウトマウスにおいてノックアウトおよび野生型マウスにおける内在性ＮＳＣ集団の比較を示す（×１００）。増殖細胞の核に取り込まれたＢｒｄＵが蛍光免疫組織化学によって検出され（レッド）、全ての核はＤＰＡＩで対比染色された（ブルー）。上のパネルは、ＡＰＰノックアウトマウス（ａ）の海馬における幹細胞の個体数が野生型マウス（ｂ）と比較して劇的に減少したことを示す。下のパネルは、ＡＰＰノックアウトマウス（ｃ）の脳室下領域（ＳＶＺ）における幹細胞の集団が野生型マウス（ｄ）と比較して同程度であることを示す。

Claims (89)

  1. 低発生能細胞から高発生能細胞を作製する方法であって、低発生能細胞を有効量の置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドに接触させることを特徴とし、ここに、置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドの化合物接触低発生能細胞がその元来の細胞系譜または異なる細胞系譜の低発生能細胞に分化することが可能な高発生能細胞となる方法。
  2. さらに、デオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドと接触した低発生能細胞と神経系譜細胞または神経系譜細胞で調整された培地と一緒に共培養するステップを含み、ここに、置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシド接触低発生能細胞が神経系譜、その元来の系譜または異なる系譜の低発生能細胞に分化することが可能な高発生能細胞となる請求項１に記載の方法。
  3. 非被覆フラスコまたは細胞を退ける処理がされたフラスコ中で出発低発生能細胞を置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドに接触させる請求項１または２に記載の方法。
  4. 細胞が２以上の細胞のクラスターを形成する請求項１、２または３に記載の方法。
  5. 出発低発生能細胞が組織（または組織特異的）幹多分化能細胞である請求項１または２に記載の方法。
  6. 幹多分化能細胞が造血幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、表皮幹細胞、網膜幹細胞、脂肪幹細胞または間葉幹細胞である請求項５に記載の方法。
  7. 幹細胞が間葉幹細胞である請求項５に記載の方法。
  8. さらに、低発生能細胞を成長因子に接触させることを含む請求項１または２に記載の方法。
  9. 成長因子が線維芽成長因子、表皮成長因子またはそれらの組合せである請求項８に記載の方法。
  10. 成長因子が線維芽成長因子または表皮成長因子である請求項８に記載の方法。
  11. 成長因子が線維芽成長因子である請求項８に記載の方法。
  12. 成長因子が表皮成長因子である請求項８に記載の方法。
  13. さらに、出発低発生能細胞をヘパリンに接触させるステップを含む請求項１または２に記載の方法。
  14. 出発低発生能細胞を接合体、胞胚、胚、胎仔、小幼仔または成体から得る請求項１または２に記載の方法。
  15. 出発低発生能細胞をヒトから得る請求項１または２に記載の方法。
  16. 神経系譜細胞が神経幹細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトである請求項２に記載の方法。
  17. 置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドがハロ置換のデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドである請求項１または２に記載の方法。
  18. 置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドがブロモデオキシヌクレオチドまたはブロモデオキシヌクレオシドである請求項１または２に記載の方法。
  19. 置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドがヨードデオキシヌクレオチドまたはヨードデオキシヌクレオシドである請求項１または２に記載の方法。
  20. 置換デオキシヌクレチドまたはデオキシヌクレオシドがアルキル置換のデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドである請求項１または２に記載の方法。
  21. 置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドの化合物がメチルデオキシヌクレオチドまたはメチルデオキシヌクレオシドである請求項１または２に記載の方法。
  22. 請求項１、２、３、８または１３に記載の方法によって調製された高発生能細胞。
  23. 請求項４に記載の方法によって調製された高発生能細胞。
  24. 少なくとも約５０％未満の再分化細胞を含む請求項４に記載の２以上の高発生能細胞のクラスター。
  25. 少なくとも約２５％未満の再分化細胞を含む請求項４に記載の２以上の高発生能細胞のクラスター。
  26. 少なくとも約１０％未満の再分化細胞を含む請求項４に記載の２以上の高発生能細胞のクラスター。
  27. 少なくとも約５％未満の再分化細胞を含む請求項４に記載の２以上の高発生能細胞のクラスター。
  28. 少なくとも約１％未満の再分化細胞を含む請求項４に記載の２以上の高発生能細胞のクラスター。
  29. 医薬上許容される担体または補形剤および請求項１または２に記載の高発生能細胞を含む神経学的欠損または身体的な欠損を治療するための医薬組成物。
  30. 有効成分として、請求項２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８に記載の高発生能細胞を含む細胞または組織再生用の細胞製剤。
  31. 有効成分として、請求項２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８に記載の高発生能細胞を含む神経学的欠損または身体的な欠損を治療するための医薬組成物。
  32. さらに、医薬上許容される担体を含む請求項３１に記載の医薬組成物。
  33. 請求項３０に記載の細胞製剤を投与することを含む細胞または組織を再生させる方法。
  34. 神経学的欠損または身体的な欠損を有する患者を治療する方法であって、
    （ａ）請求項２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８に記載の高発生能細胞を患者に投与するステップを含み、
    ここに、高発生能細胞は組織損傷領域に移動し、組織特異的な様式で分化し、次いで、神経学的欠損または身体的な欠損を低減する様式で機能することが可能である方法。
  35. 高発生能細胞をシリンジで注入するか、高発生能細胞をカテーテルで挿入するか、または高発生能細胞を外科移植することによって、細胞を投与する請求項３３または３４に記載の方法。
  36. 高発生能細胞が２以上の細胞のクラスターを含む請求項３５に記載の方法。
  37. 高発生能細胞を神経学的または身体的な欠損の領域と流体連結している体腔にシリンジで注入する請求項３３または３４に記載の方法。
  38. 高発生能細胞を神経学的または身体的な欠損の領域と流体連結している体腔にカテーテルで挿入する請求項３３または３４に記載の方法。
  39. 高発生能細胞を神経学的または身体的な欠損の領域と流体連結している体腔に外科移植する請求項３３または３４に記載の方法。
  40. 高発生能細胞を神経学的または身体的な欠損の領域にシリンジで注入する請求項３３または３４に記載の方法。
  41. 高発生能細胞を神経学的または身体的な欠損の領域にカテーテルで注入する請求項３３または３４に記載の方法。
  42. 高発生能細胞を神経学的または身体的な欠損の領域に外科移植する請求項３３または３４に記載の方法。
  43. 神経学的欠損が神経変性症、外傷性傷害、神経毒傷害、虚血、発育障害、視覚に影響する障害、脊髄の傷害もしくは疾患、脱髄症、自己免疫症、感染、炎症性疾患によって生じたものである請求項３４に記載の方法。
  44. 身体的欠損が身体的な疾患、障害、傷害、外傷、不全、変性もしくは喪失によって生じたものである請求項３４に記載の方法。
  45. 最終分化細胞を作製する方法であって、
    （ａ）請求項２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８に記載の高発生能細胞を患者に投与するステップを含み、
    ここに、高発生能細胞は組織損傷領域に移動し、組織特異的な様式で分化し、次いで、神経学的欠損または身体的な欠損を低減する様式で機能することが可能である方法。
  46. 高発生能細胞をシリンジで注入するか、高発生能細胞をカテーテルで挿入するか、または高発生能細胞を外科移植することによって、高発生能細胞を投与する請求項４５に記載の方法。
  47. 高発生能細胞が２以上の細胞のクラスターを含む請求項４６に記載の方法。
  48. 高発生能細胞を神経学的または身体的な欠損の領域と流体連結している体腔にシリンジで注入する請求項４５に記載の方法。
  49. 高発生能細胞を神経学的または身体的な欠損の領域と流体連結している体腔にカテーテルで挿入する請求項４５に記載の方法。
  50. 高発生能細胞を神経学的または身体的な欠損の領域と流体連結している体腔に外科移植する請求項４５に記載の方法。
  51. 高発生能細胞を神経学的または身体的な欠損の領域にシリンジで注入する請求項４５に記載の方法。
  52. 高発生能細胞を神経学的または身体的な欠損の領域にカテーテルで注入する請求項４５に記載の方法。
  53. 高発生能細胞を神経学的または身体的な欠損の領域に外科移植する請求項４５に記載の方法。
  54. 神経学的欠損が神経変性症、外傷性傷害、神経毒傷害、虚血、発育障害、視力に影響する障害、脊髄の傷害もしくは疾患、脱髄症、自己免疫症、感染、炎症性疾患によって生じたものである請求項４５に記載の方法。
  55. 身体的欠損が身体的な疾患、障害、傷害、外傷、不全、変性もしくは喪失によって生じたものである請求項４５に記載の方法。
  56. 請求項２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８に記載の２以上の高発生能細胞のクラスターを脳室に導入することによって、この２以上の高発生能細胞のクラスターを脳に輸送する方法。
  57. 高発生能細胞をシリンジで注入するか、高発生能細胞をカテーテルで挿入するか、または高発生能細胞を外科移植することによって、２以上の高発生能細胞のクラスターを脳室に導入する請求項５６に記載の方法。
  58. ２以上の高発生能細胞のクラスターが脳室への輸送の間実質的に無傷のままである請求項５６または５７に記載の方法。
  59. 細胞の発生能表現型を変化させる方法であって、第１の発生能表現型の細胞を有効量の置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシドに有効期間接触させて、第１の発生能表現型とは異なる第２の発生能表現型に細胞を変化させるステップを含み、ここに、第２の発生能表現型が置換されたデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオシド接触細胞を取り巻く環境によって決定される方法。
  60. 第１の発生能表現型の細胞が幹細胞である請求項５９に記載の方法。
  61. 第１の発生能表現型の細胞が造血幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、表皮幹細胞、網膜幹細胞、脂肪幹細胞および間葉幹細胞である請求項５９に記載の方法。
  62. 第１の発生能表現型の細胞が間葉幹細胞である請求項５９に記載の方法。
  63. 請求項５９、６０、６１または６２に記載の方法によって作製された第２の発生能表現型の細胞。
  64. 請求項１または２に記載の高発生能細胞から作製された最終分化細胞。
  65. 神経学的欠損または身体的な欠損を有する患者を請求項６４に記載の最終分化細胞で治療する方法であって、この最終分化細胞を神経学的欠損または身体的な欠損を有する動物に投与するステップを含む方法。
  66. 高発生能細胞または高発生能細胞から作製された最終分化細胞を全身投与する請求項３３、３４、４５または６５に記載の方法。
  67. 網膜細胞を作製する方法であって、分化前またはその最中に、神経幹細胞起源の低発生能細胞を除く請求項２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８に記載の細胞をＴＧＦ−ｂ３、ＩＧＦ−１およびＣＮＴＦよりなる群から選択される有効量の成長因子に有効期間接触させることを含み、ここに、成長因子接触細胞が網膜細胞に分化することが可能になる方法。
  68. 細胞をＴＧＦ−ｂ３、ＩＧＦ−１およびＣＮＴＦよりなる群から選択される２以上の成長因子の組合せにも有効期間接触させることを含み、ここに、成長因子接触細胞が網膜細胞に分化することが可能になる請求項６７に記載の方法。
  69. 神経学的欠損を有する患者を治療する方法であって、
    （ａ）請求項６７または６８に記載の網膜細胞を患者に投与するステップを含み、
    ここに、網膜細胞は組織損傷領域に移動し、組織特異的な様式で分化し、次いで、神経学的欠損を低減する様式で機能することが可能である方法。
  70. 請求項６７または６８に記載の方法によって作製された細胞。
  71. ほ乳類におけるＡＰＰレベルを調節することによって、そのほ乳類の内在性または外来性多分化能幹細胞の移動を変更する方法。
  72. ほ乳類におけるｒｅｅｌｉｎレベルを調節することによって、そのほ乳類の内在性または外来性多分化能幹細胞の移動を変更する方法。
  73. ほ乳類におけるＡＰＰレベルを調節することによって、そのほ乳類の内在性または外来性多分化能幹細胞の分化を変更する方法。
  74. ほ乳類におけるＡＰＰ受容体の量または結合アフィニティーを変更することによって、そのほ乳類の内在性または外来性多分化能幹細胞の移動を変更する方法。
  75. ほ乳類におけるｒｅｅｌｉｎ受容体の量または結合アフィニティーを変更することによって、そのほ乳類の内在性または外来性多分化能幹細胞の移動を変更する方法。
  76. ほ乳類におけるＡＰＰ受容体の量または結合アフィニティーを変更することによって、そのほ乳類の内在性または外来性多分化能幹細胞の分化を変更する方法。
  77. ほ乳類におけるＡＰＰレベルを調節することによって、そのほ乳類の内在性または外来性多分化能幹細胞の移動を変更する方法であって、ここに、外来性多分化能幹細胞が請求項１または２に記載の方法によって作製された高発生能細胞である方法。
  78. ほ乳類におけるｒｅｅｌｉｎレベルを調節することによって、そのほ乳類の内在性または外来性多分化能幹細胞の移動を変更する方法であって、ここに、外来性多分化能幹細胞が請求項１または２に記載の方法によって作製された高発生能細胞である方法。
  79. ほ乳類におけるＡＰＰレベルを調節することによって、そのほ乳類の内在性または外来性多分化能幹細胞の分化を変更する方法であって、ここに、外来性多分化能幹細胞が請求項１または２に記載の方法によって作製された高発生能細胞である方法。
  80. ほ乳類におけるＡＰＰレベルを調節することによって、そのほ乳類の内在性または外来性多分化能幹細胞の移動を変更する方法であって、ここに、外来性多分化能幹細胞が請求項３６に記載の方法によって作製された高発生能細胞である方法。
  81. ほ乳類におけるｒｅｅｌｉｎレベルを調節することによって、そのほ乳類の内在性または外来性多分化能幹細胞の移動を変更する方法であって、ここに、外来性多分化能幹細胞が請求項３６に記載の方法によって作製された高発生能細胞である方法。
  82. ほ乳類におけるＡＰＰレベルを調節することによって、そのほ乳類の内在性または外来性多分化能幹細胞の分化を変更する方法であって、ここに、外来性多分化能幹細胞が請求項３６に記載の方法によって作製された高発生能細胞である方法。
  83. Ｒｅｅｌｉｎタンパク質、ｒｅｅｌｉｎレベルを変更する薬物またはｒｅｅｌｉｎを発現するベクターをほ乳類に投与することによって、ほ乳類におけるｒｅｅｌｉｎの量を変更する請求項７２に記載の方法。
  84. 抗ＡＰＰ抗体、ＡＰＰレベルを変更する薬物、ＡＰＰを発現するベクター、またはＡＰＰタンパク質をほ乳類に投与することによって、ほ乳類におけるＡＰＰの量を変更する請求項７１または７３に記載の方法。
  85. さらに、高発生能細胞の前、後または同時にｒｅｅｌｉｎを投与するステップを含む請求項３３、３４、４５または５６に記載の方法。
  86. さらに、高発生能細胞の前、後または同時に抗ｓＡＰＰ抗体を投与するステップを含む請求項３３、３４、４５または５６に記載の方法。
  87. さらに、高発生能細胞の前、後または同時にｓＡＰＰを投与するステップを含む請求項３３、３４、４５または５６に記載の方法。
  88. 分化細胞特異的生成物を作製する方法であって、
    （ａ）所望の細胞型の分化を誘発することが知られている有効量の因子の存在下、請求項１または２に記載の高発生能細胞を分化させ；
    （ｂ）所望の分化細胞特異的生成物を単離することを含む方法。
  89. 未分化細胞特異的生成物を作製する方法であって、
    （ａ）請求項１または２に記載の方法によって請求項１または２に記載の高発生能細胞を繁殖させ：
    （ｂ）所望の未分化細胞特異的生成物を単離することを含む方法。
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