KR20010071601A

KR20010071601A - 뇌실막 신경 간세포 및 이의 분리 방법

Info

Publication number: KR20010071601A
Application number: KR1020007014792A
Authority: KR
Inventors: 얀슨안마리; 프리젠요나스; 요한슨클라스; 몸마스테판; 클라크다이아나; 쟈오밍; 렌달우르반; 델파니키오우마르스
Original assignee: 추후; 뉴로노바 악티에볼라그
Priority date: 1998-06-25
Filing date: 1999-06-24
Publication date: 2001-07-28
Also published as: AU4945999A; ATE293160T1; CN1307632A; DE69924728T2; AU770501B2; CA2330175A1; CN1325637C; EP1090105B1; ES2241297T3; SE9802264D0; US7320872B2; JP2002518043A; WO1999067363A9; BR9911509A; WO1999067363A1; US20030092176A1; MXPA00012078A; DE69924728D1; EP1090105A1

Abstract

본 발명은 뇌실막 신경 CNS 간세포에 관한 것이며, 이 세포는 표면 단백질 노치 1을, 노치 2, 노치 3, CAR(경막 단백질 결합 아데노바이러스) 및 CFTR(낭성 섬유증 경막 전도성 조절자)의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 표면 단백질과 함께 발현시키고, 이 세포는 또한 적어도 하나의 섬모를 포함한다. 본 발명은 또한, 뇌실막 신경 CNS 간세포를 포함하는, 약제학적 제제를 비롯한 제제, 이에 기초한 시험관내 및 생체내 검정 및 본 발명에 따른 신규한 뇌실막 세포의 많은 다른 용도에 관한 것이다.

Description

뇌실막 신경 간세포 및 이의 분리 방법{EPENDYMAL NEURAL STEM CELLS AND METHOD FOR THEIR ISOLATION}

최근까지, 중추 신경계(CNS)에서 신경 세포의 운명에 대해 '정적' 견해가, 신규한 신경원이 성인 포유류 뇌에서 생성되지 못한다는 가정을 근거로 하여, 보편적으로 우세했다. 그러나 이러한 신경원의 재생은 성인 CNS의 특정 영역에서, 예를 들어, 후각 기관으로부터의 신경원으로부터 신호가 뇌에 도달하는 후각구에서(Kaplan et al., Science 197:1092) 및 해마의 치상회에서(Bayer et al., Science 216:890) 나타났다. 신경원은 분리되지 못하므로, 신규한 신경원의 추가는 미숙한 세포, 즉 신경원을 생성할 수 있는 조상 또는 간세포의 존재를 암시한다. 성인 포유류 CNS에서 다능성 신경 간세포의 존재를 지지하는 증거가 수년 전에 제시되었다(Reynolds et al., Science 255:1707). 그러나 많은 다른 기관에서와 같이, 간세포 존재의 실현은 이를 확인하고 정위하는 것보다 선행되었다. 흥미롭게는, 성인 뇌에서 신경조직 발생은 설치류의 성년기 전체에 결쳐 주장되며(Kuhn PG, J. Neurosci. 16:20), 많은 포유동물에 존재하는 진화론적에 의해 잘 보존된 현상으로 여겨진다(Gould et al. J. Neurosci. 17:2492, Gould et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3168). 사람에 있어서, 논점에 역점을 두어 다루기는 힘들지만, 성인 뇌 조직의 배양물로부터 실험 데이터(Kirschenbaum et al., Cereb. Cortex 6:576)는 성인 CNS에도 연속적 신경조직의 발생이 존재할 수 있음을 시사한다.

성인 포유류 CNS에서 신경 간세포의 존재는 성인 래트 뇌 및 척수의 세포를 배양하여 먼저 입증된다. 특정한 배양 조건하에 다능성 신경 간세포의 집단은 해리된 성인 래트 뇌 및 척수로부터 증식될 수 있다(Reynolds et al., Science 255:1707, Dev. Biol. 175:1, Weiss et al., J. Neurosci. 16:7599). 배양 배지는 유사분열촉진 인자, 예를 들어, 표피 성장 인자(EGF) 또는 섬유아세포 성장 인자(FGF)를 함유해야 하며, 혈청은 제외해야 한다. 간세포와 반대로, 대부분의 다른 CNS 세포형은 이들 배양물에서 생존하지 않는다.

이들 조건하에, 단일 세포는 시험관내에서 증식되며, 자손은 응집된 세포의 클러스터를 형성한다(Reynolds et al., Science 255:1707, Dev. Biol. 175:1). 이러한 세포 클론은 시험관내에서 수일 후에 배양 접시로부터 분리된다. 세포는 계속 증식되고, 매우 밀집된 세포의 신경구로도 언급되는, 특징적 구상체 세포 응집물을 형성하며, 이들은 모두 단일 세포로부터 유도된다. 신경구에서 대부분의 세포는 네스틴을 발현하지만(Lendahl et al., Cell, 60:585), 분화된 세포에 대표적인 표지는 아니다. 이들 미분화 세포는, 접착성 기질 상에서 배양되거나 혈청이 배양 배지에 첨가되는 경우, 신속하게 분화된다. 중요하게는, 단일 세포로부터 유도된 세포의 클론은 신경원, 성상세포 및 희소돌기아교세포를 생성할 수 있으며, 이는 적어도 최초 세포가 다능성임을 입증한다(Reynolds et al., Science 255:1707, Dev. 같은 책, Biol. 175:1). 또한, 세포 클론이 해리되는 경우, 많은 세포가 미분화 다능성 세포의 새로운 클러스터를 형성하고(Reynolds et al., Dev. Biol. 175:1), 따라서 간세포에 대한 표준을 충족시킨다.

따라서, 상기 방법은 사용되는 세포 집단이 복잡하고 혼합된 조성물의 것이라는 심각한 단점으로 피해를 본다. 특정한 세포형의 성장을 증가시킬 수 있다해도, 수득된 세포의 원래 정위에 대한 결론을 유도하지 못한다.

결국, 성인 CNS 간세포의 정위를 결정하는 다른 방법이 제안되었으며, 여기에서 성인 설치류 전뇌의 상이한 부분을 조심해서 해부하고 배양하여 신경조직 발생 능력을 시험한다. 이들 연구는 간세포가 측뇌실의 벽 및 해마에 가장 풍부함을 입증하였다(Lois et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2074, Morsehead et al., Neuron 13:1071, Palmer et al., Mol. Cell. Neurosci. 6:474, 같은 책, 8:389). 또한, 간세포는 제3 및 제4 뇌실의 벽 뿐만 아니라 성인 척수로부터 분리될 수 있으며, 이는 전체 신경축을 따라 뇌실계에 인접한 간세포의 존재를 시사한다(Weiss et al., J. Neurosci. 16:7599).

그러나 신경 간세포의 정확한 정위 및 동일성은 불가능했다. 측뇌실의 벽은 상세한 형태학적 연구의 주제였다(Doetsch et al., J. Neurosci. 17:5046). 뇌실계는 뇌실막 세포의 단일 층에 의해 윤곽이 그려진다. 포유류 뇌실막 세포는 신경 조직 및 뇌척수액 사이에 장벽을 형성하는 주요 기능을 갖는 매우 특수한 세포로 통상적으로 고려되었으며(Del Bigio, Glia 14:1), 이는 이들 세포가 미분화 간세포라는 것에 강하게 반대한다. 뇌실막 층 아래에 뇌실하 영역으로도 공지된 뇌실막하 층이 있다. 이 영역은 성상교세포, 신경아세포 및 조상 세포를 포함한다(Doetsch et al., J. Neurosci. 17:5046). 뇌실막하 층에서 조상 세포는 빠른 증식 속도를 갖는다(Morsehead et al., J. Neurosci. 12:249). 일반적으로, 간세포는 매우 느리게 증식하며, 신속하게 증식되는 뇌실막하 세포가 선택적으로 사멸되는 경우, 간세포 집단은 결실되지 않으며, 이들 세포가 간세포라는 것을 반대한다(Morsehead et al., J. Neurosci. 12:249).

WO 97/44442(Johe)에는 포유동물의 CNS, 특히 측뇌실의 윤곽을 그리는 선조체의 뇌실막하 영역으로부터 간세포의 분리가 기술되어 있다. 그러나 뇌실막하 세포만 사용되며, 따라서 통상적인 것을 변화시키는 포유류 뇌실막 세포의 동일성 및 역할에 대한 추가 교시가 없다.

WO 95/13364(Weiss 등)는 포유동물의 CNS 뇌실에 의해 정위된 CNS 전구체 세포의 증식 방법에 관한 것이다. 그러나 전구체 세포만 기술되어 있으며, 다른 세포 단계, 예를 들어, 간세포에 대한 교시는 없다.

본 발명에 있어서, 흥미롭게도 후각구 및 해마 이외에, 포유류 뇌의 다른 영역에서 성년기 전체에 걸쳐 연속적 신경조직 발생에 대한 데이터가 부족함을 주의한다. 신경조직 발생이 더욱 광범위하게 퍼진 현상일 수 있는 예로서, 시험관내에서 신경원을 생성하는 능력을 갖는 소수의 세포가 선조체 및 격막으로부터 분리되었지만(Palmer et al., Mol. Cell. Neurosci. 6:474), 이들 세포가 간세포 특성을 갖거나 이들이 구속된 신경원 조상인 경우, 시험되지 않았다.

신경계 손상이 성인 CNS에서 간세포에 영향을 줄 수 있다는 증거가 늘어나고 있다. 척수 및 뇌 손상 후, 네스틴 발현이 중심관 안의 세포 및 뇌실하 영역에서 각각 증가된다(Frisen et al., J. Cell Biol. 131:453, Holmin et al. Eur. J. Neurosci. 9:65). 이들 세포는 간세포로부터 유도된다고 제안되었다. 시간 경과에 따라, 네스틴 발현 세포는 점차적으로 추가로 중심관 및 측뇌실로부터 보이며, 이들 세포는 성상교세포 표지를 발현한다(Frisen et al., J. Cell Biol. 131:453, Holmin et al. Eur. J. Neurosci. 9:65). 이들 데이터는 뇌실계에 의해 존재하는 간세포 또는 조상 세포가 증식하고, 손상 부위를 향해 이동하고, 성상교세포로 분화되도록 유도된다는 제안을 유도하였다. 또한, 해마 병변은 해마 조상 세포의 증식 및 해마에서 과립상 신경원의 수를 증가시킨다(Gould et al. Neurosci. 80:427). 그러나 간세포는 확인되거나 정확하게 정위되지 않았으므로, 간세포가 손상 과정에서 어떠한 역할을 하든지간에 분명하지 않다.

Doetsch 등(Cell 97:703)은 최근에 성인 뇌의 측뇌실의 벽에서 신경원 간세포의 동일성을 분석하기 위해서 시도하였다. 이들은 간세포가 신경교 원섬유 산성 단백질(GFAP)을 발현함을 제안하는 다수의 실험을 제공한다. GFAP는 많은 성상교세포에서 발현되며, Doetsch 등은 이들이 기술하는 간세포가 성상교세포라고 결론지었다. 그러나 GFAP가 많은 다른 세포형(예: 특정한 간 세포, 비-미엘린화 슈반세포, 타니사이트 및 뇌실막 세포)에서 발현됨을 확실하게 입증하는 이들 및 다른 집단의 많은 연구가 있다. 이에 의해, GFAP 발현을 근거로 하여, 이들이 기술하는 간세포가 성상교세포임을 결론짓는 것이 불가능하게 된다. 성상교세포-특이적 표지는 Doetsch 등 또는 다른 집단에 의해 신경 간세포에 의해 발현된다고 입증되지 않았다.

WO 99/16863에는 포유류 다능성 신경 간세포로부터 조혈 세포의 생성이 기술되어 있다. 따라서, 신경 간세포는 골수 이식 대신에 백혈병, 림프종 또는 면역 결핍증을 갖는 환자에게 투여할 수 있다. 그러나 문헌은 다른 기관의 재생에 대해 전혀 언급하지 않고 있다.

따라서, 포유동물의 성인 CNS에서 신경 간세포의 존재 발견은 중요하며, 새로운 신경원 또는 신경교 세포의 생성을 자극하는 방책을 개발가능하게 할 수 있다. 그러나 많은 중요한 문제가 응답되지 않은 채로 남아 있으며, 이들 세포를 배양하고 이를 생체내에서 정량적으로 연구하는 더 좋은 방법이 필요하다. 가장 중요하게는, 간세포를 추가로 연구하고 간세포로부터 새로운 신경원의 생성을 자극하기 위해서, 성인 CNS에서 간세포를 확인하고 정위하는 것이 절대적으로 필요하다.

또한, 오늘날 조직 배양의 초기 단계에서 간세포를 정제시키는 데에 유용한 방법은 없다. 다른 조직에서 세포 집단을 정제하기에 유용한 많은 일반적 방법이 있지만, 간세포의 정확한 동일성을 모르면서, 이들 방법을 사용하거나 신규한 방법을 개발하지 못한다. 더욱 잘 정의된 세포 집단의 추가 연구가 약제학적 조성물의 선별에 필요하다. 또한, 간세포 및 이의 자손을 생체내에서 표지하고 추적하여 예를 들어, 새로운 신경원의 생성 조절을 상세하게 연구함으로써 상이한 화학물질의 효과를 분석하거나 간세포를 유전학적으로 조작하는 정량적 방법의 개발이 필요하다. 다시, 사용하여 다른 세포 집단을 생체내에서 추적할 수 있는, 당해 분야에서 공지된 방법이 있지만, 이들 방법을 사용하거나 간세포를 추적하기 위한 신규한 방법을 개발하는 것이 불가능한데, 간세포의 동일성은 공지되지 않았기 때문이다. 간세포 및 이의 자손을 신경변성 장애 및 CNS 손상 동물 모델에서 추적하는 정량적 방법의 개발은 오늘날 신경원 손상 자체가 아니라, 몇가지 증상만 완화될 수 있는 사람의 상태에서 신규한 치료 방책을 선별하는 가능성을 열어 준다.

따라서, 당해 분야내의 문제는 신경 간세포가 존재한다고 공지되어 있다해도, 이의 정위 및 동일성은 공지되어 있지 않다는 것이다. 이것이 수행된다면, 큰 단계의 진보가 상기 정의된 목표를 제공시에 계획되는 연구에 의해 취해진다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 상기 정의된 문제를 해결하는 것이다. 이는 본 발명에 따라서 신경 간세포의 근원 및 동일성을 확인하고 이러한 간세포를 CNS 조직으로부터 선택적으로 분리하여 달성된다. 따라서, 본 발명은 뇌실막 층에서 발견된 세포가 신경 간세포라는 놀라운 발견에 있다. 따라서, 본 발명은 제1항에서 정의된 바와 같은 뇌실막 신경 CNS 간세포를 제공한다. 본 발명은 또한, 이러한 뇌실막 신경 CNS 간세포를 뇌실막 층으로부터 분리하는 방법을 제공한다. 따라서, 처음으로 항상, 신경 간세포의 실제적 동일성 및 정위가 본원에 기술되어 있으며, 따라서 의학 및 진단 분야에서 이의 많은 유리한 용도 및 적용을 가능하게 한다. 본 발명은 또한, 시험관내 및 생체내 검정 뿐만 아니라 약제학적 조성물에 관한 것이며, 여기에서 본 발명에 따른 새로운 발견이 유리하게 사용된다.

본 발명은 전에는 포유류 중추 신경계로부터 확인되고 분리되지 않았던, 뇌실막 신경 CNS 간세포를 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이러한 신규한 세포 자체를 포함하는 제제, 제제를 함유하는 약제학적 조성물 및 이의 많은 의학적 용도 뿐만 아니라 이를 사용하는 검정에 관한 것이다.

도 1은 뇌실막 세포의 특이적 표지를 예시하며, 성인 전뇌 및 측뇌실의 벽의 구조물에서 신경원의 이행을 도시하는 개략도이다.

도 2는 후각구 및 신경구의 생성을 예시한다.

도 3은 뇌실막 세포 특이적 표지를 갖는 신경원 간세포가 강화됨을 예시한다.

도 4는 2주 연속 BrdU 투여하거나(A,B), 또는 2주 투여한 후 1주는 BrdU의 부재하에(C,D) 측뇌실의 측벽에서 5-브로모-2'-데옥시유리딘(BrdU)의 면역조직화학적 검출을 나타냄으로써 뇌실막 세포의 증식을 예시한다.

도 5는 뇌실막 세포 증식이 손상에 의해 유도되는 방법을 나타낸다.

도 6은 척수 손상 후에 뇌실막 세포로부터 성상교세포의 생성을 도시한다.

도 7은 트랜스유전자 동물로부터 유도된 정제된 간세포의 이식을 나타낸다.

도 8은 성인 마우스에서 간세포로부터 흑질에서 신경원의 생성을 도시한다.

도 9는 간뇌에서 간세포 또는 이의 자손의 이행 스트림을 예시한다.

도 10은 뇌실막 층에 위치한 간세포로부터 해마에서 신경원의 생성을 나타낸다.

도 11은 뇌실막 CNS 간세포가 다수 기관의 발생에 기여하는 능력을 도시한다.

도 12는 성인 신경 뇌실막 간세포의 특수 조직에 대한 흉곽 기여를 나타낸다.

도 13은 성인 신경 뇌실막 간세포의 특수 조직에 대한 복부 기여를 나타낸다.

정의

본 출원에 있어서, "분리된"이란 용어는 동물 또는 사람으로부터 분리되고 약 10% 이상, 바람직하게는 약 30% 이상, 더욱 바람직하게는 약 50% 이상 및 가장 바람직하게는 약 60% 이상, 예를 들어, 약 80%까지 정제된 세포 분획을 언급한다. 본 발명의 이러한 측면의 특정한 양태에서, 분리된 세포의 순도는 100%, 예를 들어, 약 90%에 근접한다. 약 90% 이상의 순도를 갖는 이러한 세포 집단에서, 아마도 4%만의 간세포가 "활성" 간세포로서 명백하게 작용하지만, 간세포의 나머지는 이들이 이러한 "활성" 간세포로 형질전환되는 능력을 가질 수 있음에도 불구하고, 정지해 있다. "활성" 간세포는 자체-재생되고 다능성인 세포로서 정의된다. "신경 간세포"라는 용어는 미분화 세포의 응집물, 소위 신경구를, 적합한 조건하에, 예를 들어, 적합한 마이토젠을 함유하는 배지에서 생성할 수 있는 세포에 관한 것이다. "뇌실막 세포"는 CNS 뇌실계에서 뇌실막 층에 일부 또는 전부 존재하는 세포 또는 다른 곳에 위치한 동일한 세포형을 언급한다. "뇌실막 세포"는 출생 후 CNS 조직의 뇌실막 세포 층으로부터 분리된 뇌실막 세포에 특성을 갖는 세포를 포함하도록 본원에서 정의된다. 본 발명에서, 본 발명에 따른 간세포를 특성화하는 특징은 새로운 간세포, 전구체 또는 조상 세포 뿐만 아니라 신경원, 성상교세포 또는 희돌기교세포를 생성하는 이의 능력임을 이해한다.

뇌실막 신경 간세포는 또한, 분리 및 확인하기 위해서 사용할 수 있는 몇가지 특이적 세포 표면 표지, 예를 들어, 노치(Notch) 1(경막 수용체), 노치 2, 노치 3, CAR(경막 단백질 결합 아데노바이러스, Tomko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:3352) 및 CFTR(낭성섬유증 경막 전도성 조절자, Kunzelmann Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 137:1)를 발현한다. 뇌실막 신경 CNS 간세포는 또한, 하나 이상의 섬모를 포함한다. "성인"이란 용어는 본원에서 태아에서 이전에 확인된 신경 간세포를 출생 후 포유동물로부터 수득된 현존하는 신경 간세포와 구분하는 데에 사용된다. 따라서, 성인 간세포는 비-태아 간세포에 필수적으로 존재한다.

본 발명을 위해서, 뇌실막 조직의 해리는 바람직하게는 콜라게나제, 트립신 및 히알루로니다제 뿐만 아니라 카이누렌산의 군으로부터 선택된 해리 효소 중의 하나 또는 이들의 배합물을 사용하여 수행할 수 있다. 뇌실막 조직은 또한, 상기에서 언급된 효소를 단독으로 또는 이들 중의 하나 이상을 함께 기계적 해리하여 해리할 수 있다.

본 발명은 뇌실막 간세포인 성인 신경 CNS 간세포에 관한 것이며, 즉 신경 간세포는 뇌실막 층에 존재한다. 따라서, 본 발명은 신경 간세포를 제공하며, 이는 뇌실막 세포의 특성을 가짐으로써 규정될 수 있다. 특히, 제1 측면에서, 본 발명은 뇌실막 신경 CNS 간세포에 관한 것이며, 이 세포는 표면 단백질 노치 1을, 노치 2, 노치 3, CAR(경막 단백질 결합 아데노바이러스) 및 CFTR(낭성섬유증 경막 전도성 조절자)의 군으로부터 선택된 하나 이상의 표면 단백질과 함께 발현시키고, 이 세포는 또한 하나 이상의 섬모를 포함한다.

제2 측면에서, 본 발명은 성인 또는 출생 후 CNS 조직으로부터 뇌실막 신경 CNS 간세포를 분리하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 바람직하게는 뇌실막 조직을 해리시키고, 뇌실막 신경 CNS 간세포를 이로부터 회수함을 특징으로 한다. 해리는 당해 분야에서 전문가에 의해 용이하게 선택된 적합한 방법에 의해 수행할 수 있다. 세포는 적합한 기술에 의해 존재하는 바람직하지 않은 물질로부터 분리하여 회수되며, 이의 양 및 품질은 조직을 수득하기 위해 사용되는 방법 뿐만 아니라 이의 상태에 따라서 변화한다.

따라서, 본 발명의 이러한 측면은 출생 후 CNS 조직으로부터 특정한 세포형의 분리에 따른다. 당해 분야의 전문가는 이것이 다양한 방법으로 수행될 수 있음을 용이하게 이해한다. 따라서, 상기와 같이 예를 들어, 뇌실막 세포 층은 신경 조직으로부터 해부하고, 계속해서 처리하여 뇌실막 세포를 이로부터 분리할 수 있다. 따라서, 뇌실막 조직은 선택적으로 해리되고 뇌실막 간세포는 이로부터 분리되거나 회수될 수 있다.

또는, 뇌실막 간세포는 CNS 조직 제제로부터 선택적으로 분리될 수 있으며, 이는 불균질 조직형을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 뇌실막 세포 층 이외에 다른 조직을 함유할 수 있는 넓은 영역의 뇌 조직을 해부할 수 있으며, 뇌실막 세포는 이로부터, 예를 들어, 뇌실막 세포 특성을 갖는 세포만 회수하여 선택적으로 분리할 수 있다. 다음에서 더욱 상세히 논의된 바와 같이, 이는, 예를 들어,뇌실막 세포에 특이적인 세포 표면 표지에 대한 특이성을 갖는 친화성 시약으로 친화성 분리 기술을 사용하여 수행할 수 있다.

따라서, 뇌실막 간세포는, 바람직하게는 단일 세포로 해리된 후, 분리된다. 이는 수득된 세포를, 뇌실막 신경 간세포의 하나 이상의 특성 또는 특징을 나타내는 세포에 대한 방법에 의해 선별함으로써 제공된다. 성인으로부터 신경 간세포는 선행 기술에 나타나 있으며, 당해 분야의 전문가는 현 상황하에 최적 선별 방법을 결정한다.

본 발명 방법의 유리한 양태에서, 조직은 사람 또는 동물의 뇌 또는 척수의 심실계 벽의 뇌실막 층으로부터 수집된다. 조직의 이러한 해부 및 회수는 당해 분야의 전문가에 의해 적합한 통상의 방법에 의해 용이하게 수행된다. 해리 단계는 적합한 방법, 예를 들어, 효소성 및/또는 기계적 처리에 의해 수행되며, 목적하는 단일 세포가 이의 결과로서 수득되는 한, 어떠한 방법으로도 제한되지 않는다. 이러한 방법의 예는, 예를 들어, 분쇄, 트립신 처리, 콜라게나제 처리 및 히알루로니다제 처리이다. 가장 바람직하게는, 해리는 트립신을 사용하는 효소성 처리에 의해 수행된다. 조직의 해리는 현 상황하에 전문가에 의해 용이하게 선택된 다른 방법에 의해 대신해서 수행될 수 있다.

수득된 세포, 예를 들어, 단일 세포의 선별은 사용된 뇌실막 세포의 특징, 특성 또는 특질에 따라서 적합한 방법에 의해 상기에서 언급된 바와 같이 수행된다. 본 발명 방법의 한 양태에서, 선별은 특이적 세포 표면 표지, 예를 들어, 단백질의 발현을 사용하여 수행된다. 표면 단백질의 이러한 발현은, 예를 들어, 노치 1, 노치 2 및/또는 노치 3 수용체의 발현일 수 있으며, 이는 다른 내용에서가 아니라 문헌에 먼저 기술되어 있다. 이 방법의 가장 바람직한 양태에서, 단일 세포는 노치 1 수용체의 발현에 대해 선별된다. 본 발명의 이러한 측면의 대체 양태에서, 단일 세포는 미리 표지된 뇌실막 세포를 사용하기 위해 선별된다. 이러한 표지는 염료일 수 있으며, 유리하게는 실시예 1에 기술된 바와 같이, 형광 표지, 예를 들어, DiI이다. DiI는 또한, 다른 내용에 기술되어 있으며, 당해 분야의 전문가에게 익히 공지되어 있다. 세포의 표지화는 연구 범위내에 및 진단 방법에서 광범위하게 사용되며, 따라서 적합한 기술의 선택은 전문가에 의해 용이하게 이루어진다. 대체 양태에서, 바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스 또는 렌티바이러스가 사용될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 뇌실막 신경 CNS 간세포를 포함하는 제제에 관한 것이다. 이러한 제제는 본원에 기술된 분리 방법에 의해 수득할 수 있다. 이러한 제제는 신경 간세포의 약 10% 이상, 예를 들어, 10 내지 50%, 예를 들어, 약 35%의 또는 바람직한 양태에서 약 90% 이하의 또는 가장 바람직하게는 본질적으로 순수한 배양물을 포함한다. 바람직하게는, 이들 세포의 약 4% 이상은 완전히 활성인 간세포이다. 자연적으로, 훨씬 높은 농도가 선택된 선별 방법에 따라서 수득 가능하다. 이전에, 선행 기술 방법에서, 뇌의 일부가 해리되고, 특이적 성장 인자가 특이적 세포형의 성장을 유도하기 위해서 첨가되었다. 이러한 방법은 결국 비교적 높은 농도의 세포를 생성할 수 있으나, 이는 수일의 배양후이다. 가장 중요하게는, 이러한 방법은 간세포의 순수한 집단을 배양방법의 초기 단계에서 수득하는 것을 목표로 하지 않았는데, 간세포의 동일성 및 특성(예를 들어, 특이적 세포 표면 표지의 발현)은 본 발명 이전에 공지되지 않았기 때문이다. 따라서, 수행시에, 본 발명에 의해 바람직한 농도의 세포형, 즉 이전에 확인되고/거나 정위되지 않았던, 본원에서 기술된 뇌실막 간세포를 수득한다. 특이적 양태에서, 생성물은 약 90 내지 95%의 뇌실막 신경 간세포로 이루어진다. 한가지 유리한 양태에서, 이 방법의 생성물은 거의 전부, 즉 약 100%의 뇌실막 신경 간세포로 이루어진 세포 분획이다. 따라서, 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 분리된 신경 간세포 뿐만 아니라 분리된 신경 간세포의 분획에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명 방법에 의해 제조된 뇌실막 신경 간세포는 유전학적으로 변경될 수 있다. 조작은 세포의 많은 특성을 변경시키기 위해서, 예를 들어, 특정한 환경 조건에 더욱 적합하거나 내성으로 만들기 위해서 수행하여 이로부터 하나 이상의 특정한 물질의 생산을 유도할 수 있으며, 이 물질은, 예를 들어, 세포의 생존 능력을 개선시키거나 또는 약물 또는 약제로서 유용할 수 있다. 본 발명에 따른 이러한 조작된 세포의 가능성 및 장점에 대한 추가의 상세한 설명이 하기 "검토"절에 제공된다. 특정한 이러한 유전학적 변경은 세포를 이식에 사용하기에 더욱 적합하게 만들기 위해서, 예를 들어, 수용체로부터 이의 거부 반응을 방지하기 위해서 수행할 수 있다(유전자 치료 방법을 검토하기 위해서, 다음을 참조: Anderson,Science256:808; Nabel and FelgnerTIBTECH11:211; Mitani and CaskeyTIBTECH11:162; Mulligan Science 926; DillonTIBTECH11:167; MillerNature357:455; Van BruntBiotechnology6(10):1149; VigneRestorativeNeurology and Neuroscience8:35; Kremer and Perricaudet British Medical Bulletin 51(1) 31; Haddada et al. inCurrent Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler and Bohm (eds.) Springer-Verlag, Heidelberg Germany; and Yuet al., Gene Therapy 1:13). 따라서, 본 발명은 또한 유전자 치료 방법을 포함하며, 여기에서 신경 간세포 뿐만 아니라 본 발명에 따른 세포를 포함하는 방법에서 사용된다고 예정된 제제가 사용된다. 이러한 유전자 치료 방법을 사용하여 CNS에서 신경원 또는 신경교가 손상되거나 결손된 어떤 상태라도 치료하고/거나 방지할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 치료에, 예를 들어, 약제로서 사용하기 위한 신경 간세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 또한, 치료제, 예를 들어, 중추 신경계, 예를 들어, 뇌에서 신경조직발생 또는 신경교발생을 조절하기 위한 약제의 제조에서 신경 간세포의 용도에 관한 것이다. 이러한 조절은 유도성 또는 억제성이며, 치료는 파킨슨병, 알츠하이머병, 발작, 외상 등을 목표로 할 수 있다. 신경교 세포의 경우, 약제는 다발성 경화증 및 다른 신경교 관련 상태를 치료하기 위해 예정될 수 있다. 이들 조성물은 다른 조직, 예를 들어, 심장의 심방 및 심실벽을 포함하는 심근, 배대동맥, 및 생식융기 원기 및 중신 세관의 생성에 사용할 수 있다. 발생될 수 있는 기관의 다른 예는 눈의 안포경, 망막 층 및 수정체, 내이, 간, 췌장 및 다른 내분비 기관이다, 본 발명의 한가지 특정한 양태에서, 본 발명의 이들 측면은 상기에서 기술된 방법에 의해 수득된 신경 간세포를 사용하지만, 본 발명은 또한 신경 간세포, 예를 들어, 본 발명을 위해서 유전학적으로 변형된 어떤 신경 간세포의 사용을 포함한다.

따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 하나 이상의 뇌실막 신경 간세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 제제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 제제는 중추 신경계의 적합한 부분에 주사하기 위해 적합해질 수 있다. 이러한 약제학적 제제는 적합한 담체, 예를 들어, 수성 담체, 예를 들어, 완충된 식염수 등을 포함한다. 본 발명 제제의 활성 조성물은 일반적으로 멸균되고 바람직하지 않은 물질이 유리되어 있다. 또한, 제제는 생리 상태에 근접시키는 데 필요한 약제학적으로 허용되는 보조 물질, 예를 들어, pH 조절제 등을 함유할 수 있다. 제제에서 본 발명 신경 간세포의 농도는 이의 예정된 적용에 따라 변하며, 이의 용량은 환자의 주치의에 의해 상응하게 결정된다. 사용된 간세포는 본 발명 방법에 의해 또는 임의의 다른 적합한 방법에 의해 분리되거나 임의의 다른 방법으로 수득될 수 있었을지도 모른다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 간세포는 이의 예정된 용도에 특별히 적합시키기 위해서 유전학적으로 조작될 수 있었을지도 모른다.

다른 측면에서, 본 발명의 세포는 환자에게 투여될 수 있으며, 여기에서 이러한 투여는 치료상으로 유용하다. 또는, 본 발명의 세포는 사용되어 환자에서 상응하는 세포형을 본 발명의 세포의 투여에 의해 대체하거나 보충할 수 있다. 본 발명의 세포는 사용되어 이식물을 도포하고, 따라서 이식물 및 환자 사이에서 장벽으로 작용할 수 있다. 본 발명의 세포의 투여는 당해 분야의 전문가에게 공지된 방법에 의해 수행된다.

다른 측면에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 유전학적으로 변형된 뇌실막신경 간세포를 포함하는 동물, 예를 들어, 마우스에 관한 것이다. 이러한 동물은, 예를 들어, 연구시에 또는 신약의 시험 모델로서 유용할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 간세포를 자극하여 특정한 신경원 표현형 또는 신경교 아류형을 생성하는, 바람직하게는 시험관내 검정에서 "약물 표적"으로서 본 발명의 신경 간세포의 용도에 관한 것이다. 특정한양태에서, 본 발명은 새로운 신경원의 시험관내 배양에서 세포의 용도에 관한 것이다. 이러한 용도는, 예를 들어, 다음의 "검토" 절에서 더욱 상세히 기술된 바와 같이, 분리된 신경 간세포의 배양물을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한, 상기에서 정의된 용도에 의해 수득된 물질에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 바람직하게는 생체내 검정에서, 뇌의 많은 영역에서 간세포 자손의 신경조직발생 및 이행 스트림을 평가하는 무편향 정량적 또는 정성적, 바람직하게는 정량적 방법뿐만 아니라 뇌의 많은 영역으로 이행하는 간세포 및 이의 자손의 총수를 분석하는 기술에 관한 것이다. 이는 신규한 선별 방법을 개발하기 위한 것이며, 이 방법은 또한 첨부된 청구의 범위에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 범위내에 있다. 이는, 양전자 방출 단층촬영술(PET)에 적합한 뇌실막 세포 표지 또는 살아 있는 뇌를 충분한 해상도로 가시화할 수 있는 다른 조영 시스템의 개발에 의해 사람 CNS에서 간세포 자손의 결핍성 이행 및/또는 분화를 진단하게 하는 경우, 신경변성 질환으로 고생하는 환자의 진단에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 이러한 방법을 수행하기 위한 키트 및 검정 뿐만 아니라 본 발명의 방법에 의해 수득된 물질에 관한 것이다.

최종 측면에서, 본 발명은 신경변성 질환으로 고생하는 사람 또는 동물 환자를 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 약제학적으로 유효한 양의 뇌실막 신경 간세포를 사람 또는 동물에게 투여함을 특징으로 한다. 일반적으로, 이러한 방법은 사람의 CNS 장애에 따라서 신경원 또는 다른 세포형을 생성하는 비손상 기능 및 능력을 갖는 본 발명에 따른 뇌실막 간세포의 투여를 기본으로 한다. 또는, 시험관내 간세포로부터 생성된 신경원 또는 신경교 세포가 CNS에 투여될 수 있다. 대체 양태에서, 본 발명은 사람 또는 동물 환자에서 신경변성 장애의 치료 및/또는 방지 방법에 관한 것이며, 여기에서 존재하는 결핍성 신경 간세포가 신규한 신경원을 생성하거나 적합한 표적으로 이행시키는 능력이 회복된다. 이러한 방법은 신경원을 생성하는 신경 간세포의 본래 특성 및 능력을 자극하고 유도하는 물질의 투여를 기본으로 한다. 또는, 이러한 방법은 신경원의 변성 과정을 실제로 억제하는 물질의 투여를 기본으로 한다.

따라서, 본 발명의 세포는 이식 부위에 적합한 당해 분야에 공지된 방법에 의해 질환 또는 손상을 치료하기 위해 환자에게 이식할 수 있다.

본 발명의 세포를 투여하는 방법은 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비내 및 경막외 경로를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 세포는 편리한 경로에 의해, 예를 들어, 주입 또는 환괴 주사에 의해, 상피 또는 점액피부 내층(예: 경구 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여할 수 있으며, 생리학적 활성제와 함께 투여할 수 있다. 전신 또는 국소 투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 세포를 중추 신경계에, 뇌실내 및 포막내 주사를 포함하는 적합한 경로에 의해 도입하는 것이 바람직할 수 있다; 뇌실내 주사는, 예를 들어, 병원소, 예를 들어, Ommaya 병원소에 부착된 뇌실내 카테터에 의해 용이하게 될 수 있다.

본 발명의 세포를 치료가 필요한 부위에 국소 투여하는 것이 바람직할 수 있다; 이는, 예를 들어, 수술 동안에 국소 주입, 예를 들어, 수술 후에 상처 드레싱과 함께 국소 적용, 카테터에 의한 또는 이식물에 의한 주사에 의해 수행할 수 있지만, 이로 제한되지 않으며, 이식물은 막(예: 타액 막)을 포함하여, 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴 물질 또는 섬유로 제조된다.

다음은 형질전환된 세포의 이식에 대해 변경될 수 있는 예시적 방법을 기술한다: 사람에서 태아 조직의 분리 및 이식에 대한 프로토콜이 보고되었으며, 이들 연구를 포함하는 임상적 시도가 수행되고 있다. 예를 들어, 문헌(Lindvall, Science 247:574)에는 뇌에 이식 후에 태아 도파민 신경원의 이식 및 생존에 대한 결과가 기술되어 있다. 필요한 경우, 전구체 세포의 세정 및 부분적 해리는 문헌에 기술된 프로토콜의 변경에 의해 수행할 수 있다(Lindvall,Arch.Neurol. 46:615).

예를 들어, 뇌로의 세포의 이식은 다음과 같이 수행할 수 있다. 이식은 좌측 피각의 3군데 부위에서 정위 기술로 수행된다(Lindvall,Arch.Neurol. 46:615). 각 부위에서, 해리된 세포의 20æl을 기기(외부 직경 1.0mm)로 배출시킨다. 세포를 각각 10, 12 및 14mm 선형관을 따라 각각 15 내지 20초동안 2.5æl 부분에서 주사한다. 각 주사 사이에 2분이 지연되며, 그 후에 캐뉼러를 1.5 내지 1.7mm로 수축시킨다. 최종 주사 후, 캐뉼러를 발생 부위에 8분동안 둔 후, 뇌로부터 서서히 배출시킨다. 수술 후에 세포 생존 능력은 문헌의 방법에 따라 평가한다(Brundin,Brain.Res. 331:251).

다른 예가 Caplan 등의 1993년 미국 특허 제5,226,914호에 의해 개략되어 있다. 간단히, 골수 세포를 골수전 및 골수 간엽으로부터 수집한 후, 간세포를 원심분리에 의해 분리한다. 간세포는 조직 배양 접시의 플라스틱 또는 유리 표면으로 선택적 부착에 의해 추가로 분리된다. 간세포는 증식되지만, 분화되지는 않는다. 60% 하이드록시아파타이트 및 40% 인산삼칼슘으로 이루어진 다공성 세라믹 입방체를 세포에 약한 진공하에 첨가한다. 접착된 세포를 갖는 입방체를 발가벗은 마우스의 등을 따라 절개낭에 이식한다. 간엽 간세포는 골로 분화된다.

이식된 세포의 역가는 특정한 장애의 치료에 유효하거나 상태는 장애 또는 상태의 특성에 따라 다르며, 표준 임상적 기술에 의해 측정할 수 있다. 또한, 시험관내 검정을 사용하여 최적 용량 범위의 확인을 보조한다. 제형에 사용되는 정확한 용량은 또한, 투여 경로, 및 질병 또는 장애의 중증도에 따라 다르며, 개업의의 판단 및 각 환자의 환경에 따라 결정해야 한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 약제학적 조성물의 하나 이상의 성분 및/또는 본 발명의 약제학적 조성물을 제조하는 시약으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트를 제공한다. 임의로 이러한 용기(들)과, 약제 또는 생물학적 생산물의 제조, 사용 또는 판매를 조절하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 주의가 관련될 수 있으며, 이러한 주의는 사람에 투여하기 위해 제조, 사용 또는 판매에 대한 정부 기관의 승인에 영양을 준다.

본 발명의 세포는 또한, 의학 연구를 포함하여 연구에 사용하기 위한 배양물에 유지될 수 있다. 예를 들어, 세포는 본 발명의 세포를 상이한 세포형으로 분화시키는 이의 능력에 대해 공지된 기능을 갖는 화합물 중에서 시험 화합물을 선별하기 위해 사용할 수 있다.

도면의 상세한 설명

도 1: 뇌실막 세포의 특이적 표지화

성인 전뇌에서 및 측내실의 벽(A)의 구조물에서 신경원의 이행에 대한 개략도. 뇌실(V)은 뇌실막 세포(E)에 의해 내장된다. 뇌실막 층 및 선조체(S) 사이에 뇌실하 영역(SVZ)이 있으며, 여기에서 전구체 세포(담청색)은 나뉘어 미숙한 신경원(진청색)을 생성한다. 신경원은 후각구(청색 화살)로 이행한다. (B)뇌실막 세포의 표지화. DiI를 정위법으로 측뇌실로 주사하여, 뇌실막 세포를 뇌실계 전체에 걸쳐 표지화한다. 몇가지 이러한 동물에서, 절개(척수 횡단면에서 회색 영역)는 척수 배측삭에서 이루어진다. DiI 주사하여 측뇌실(C,D) 및 척수 중심관(E)에 내장된 뇌실막 층을 주사한 지 6시간 후에 표지한다. 맥락막총(CP)은 (C)에서 표지된다.

도 2: 후각구 신경원 및 신경구의 생성

DiI(A,C) 또는 LacZ(B,D)를 발현하는 복제-결핍성 아데노바이러스를 반대측성 측뇌실로 주사한 지 10일 후, 표지된 세포가 뇌실하 영역(A,B) 및 후각구(C,D)에서 관찰된다. (C)에서 삽입물은 DiI를 βIII-튜불린-면역반응성 신경원에서 나타낸다. 밝은 영역(E) 및 형광(F) 현미경사진은 뇌실내 DiI 주사를 수용한 동물의뇌로부터 신경구를 나타낸다. 두가지 매우 약하게 표지된 또는 비표지 신경구는 화살촉으로 지시되어 있다.

도 3: 신경 간세포의 뇌실막 세포 특이적 표지로 강화

측뇌실의 벽(A) 및 척수(B)에서 노치 1의 면역형광 정위. 노치 1 면역반응성은 측뇌실 및 중심관에 내장된 뇌실막 세포로 제한된다. 뇌실막 세포로의 노치 1의 선택적 정위는 급속 해리된 뇌 및 척수 조직의 뇌실막 세포의 강화를 가능하게 한다. 해리된 세포는 노치 1에 대해 생성된 항혈청으로 배양한 후, 자기 비드 공액된 2차 항체로 배양하고, 표지된(노치 1 분획) 및 비표지 세포(세척 분획)를 자기 분리한다. 대조 실험에서, 1차 항혈청은 생략된다. 각 분획에서 세포의 수를 계산하고, 상이한 배양물에서 생성된 신경구의 수를 계수한다(C).

도 4: 뇌실막 세포의 증식

2주 연속 BrdU 투여한 후(A, B) 또는 2주 투여한 후 1주는 BrdU의 부재하에(C, D) 측뇌실의 측벽에서 BrdU의 면역조직화학적 검출. (B) 및 (D)는 각각 (A) 및 (C)의 상세한 사항을 나타낸다. 표지된 뇌실막 세포는 (B) 및 (D)에서 화살촉으로 지시되어 있다.

도 5: 뇌실막 세포 증식은 손상에 의해 유도된다.

BrdU를 투여한 지 8시간 후(A, D-F) 또는 2주 후(B, C) 척수에서 BrdU의 면역조직화학적 검출. (G) 희생시키기전 마지막 8시간동안 투여된 BrdU를 혼입한 척수 뇌실막 세포의 비율(BrdU 표지된 핵/요드화프로피듐으로 가시화된 뇌실막 세포 핵의 총수, 각 시점에서 n = 3-5마리의 래트, 오차 막대는 SEM을 나타낸다).

도 6: 척수 손상 후에 뇌실막 세포로부터 성상교세포의 생성

척수에서 DiI, 네스틴- 및 GFAP-면역반응성의 분포. (D-F)에서 동물은 분석하기 4주 전에 배측삭 절개를 수행한다. 모든 동물은 손상 전에 뇌실내 DiI 주사를 수용한다. DiI 및 네스틴-면역반응성은 동일한 단면에 도시되며, GFAP-면역반응성은 (A-F)에서 인접한 영역에 도시된다. 손상된 영역의 근접한 윤곽은 (D)에서 점선으로 지시되어 있다. (G)는 발병한 지 2주 후에 배측삭에서 DiI(적색) 및 GFAP-면역반응성(녹색)을 나타낸다. 황색 신호는 DiI 및 GFAP-면역반응성의 동시 정위를 지시한다. (H) 손상된 지 2주 후에 흉터 조직에서 DiI 및 GFAP-면역반응성의 공초점 레이저 주사 현미경 가시화. 두개의 GFAP-면역반응성 DiI 표지된 세포는 화살촉에 의해 지시되며, 검출가능한 GFAP를 나타내지 않는 DiI 표지된 세포는 화살표로 지시되어 있다.

도 7: 신경 간세포의 이식

성숙 래트의 선조체에의 LacZ발현 트랜스게닉 마우스 유래의 정제 간세포의 이식. 화살표는 그래프트된 세포의 군을 가리킨다. (B)는 (A)의 상세도이다.

도 8

성숙 래트의 뇌실막 층의 간세포로부터 흑색질내 신경원의 생성. 4달전 성숙 동물에 이러한 형광 염료의 투여후에 설치류내에 DiI로 또한 표지된 흑색질 치밀부내의 흑색질 티로신 히드록실라제양성 신경원(녹색)의 현미경사진. 화살표는 형광표지 표지화 뇌실막, 신경 간세포를 함유하는 두 흑색질 도파민 신경원을 지시한다.

도 9

뇌실막 층으로부터의 간세포의 이행성 스트림 또는 마우스 중뇌내 그 자손. 화살표는 내측 흑색질 치밀부(*)에 도달하는 DiI 표지 뇌실막 세포의 내측 이행 스트림(적혈구)를 지시한다. SNR=흑색질 망상부, IP=각간핵. 화살표는 외측(I) 및 복측(V) 방향을 나타낸다. 각각 흑색질 치밀부의 문측, 미측, 내측 및 외측부에 도달하는 여러 경로가 확인되었다. 예시된 복내측 스트림이외에, 배측방 및 중심선 스트림이 확인되었다.

도 10

뇌실막 층에 정위되는 간세포로부터 마우스 해마 중의 신경원의 생성. DiI 표지 뇌실막 또는 그 자손이 해마의 치상회(DG)의 과립세포층으로 이주하는 것을 예시하는 현미경사진. 화살표는 외측(I) 및 복측(V) 방향을 나타낸다.

도 11

(A)에서 한 야생형 배아일 11일의 배아가 보이며(좌측) 성숙 Rosa26 마우스로부터 뇌 신경 간세포로 주입된 낭포로부터 생성된 잡종 배아가 보인다(우측). 야생형 배아 중의 이소포와 관련하여 내인성 표지화가 존재한다. 성체 신경 간세포 유래의 세포의 공헌은 주입된 배아의 예컨대 심장 및 CNS를 포함하는 여러 조직에서 분명하다. (B)에서 양막(A), 두부(H), 흉부(Th) 또는 미측부(C)가 RT-PCR에 의해 증폭되었다. 키메리즘을 보이는 lacZ mRNA 발현이 3 주입된 배아에서 관찰되었으나 대조구에서는 그렇지 않았다. L19에 대한 프라이머가 내재적 대조구로서 사용되었다.

도 12

배아일 11의 배아의 흉부강을 통한 절단면에서의 b-갈락토시다제(A,B) 및 데스민(C,D)면역조직화학적 검출. (E) 및 (F)에서 b-갈락토시다제(녹색) 및 데스민 면역표지화(적색)가 심장에서의 동시 정위를 함께 나타내며 보여진다.

도 13

11일령의 배아의 상부 복강을 통한 절단면에서의 b-갈락토시다제(A) 및 데스민(B)에 대한 면역표지화. 간은 강한 b-갈락토시다제 발현을 나타낸다. (C)에서 b-갈락토시다제 및 데스민 면역염색이 심장 첨부에서의 동시 정위를 함께 나타내며 보여진다. (D)는 장에서의 b-갈락토시다제 면역표지화를 나타낸다.

1. 생체내 뇌실막 세포 및 그 자손의 표지화

신경원이 뇌실막 세포로부터 생성될 수 있을 지를 시험하기 위해, 형광 표지 DiI 또는 리포터유전자LacZ를 발현하는 복제결핍 아데노바이러스를 성숙 래트 또는 마우스의 측실에 주입하였다. 280-320g 체중의 수컷 스프라그-도리 래트 또는 25-30g 체중의 수컷 C57BL/6 마우스를 수산화클로랄(400mg/kg)로 마취시켰다. DMSO 또는 50㎕의 아데노바이러스 용액(10⁹플라크형성 단위를 함유하는) 중 0.2% w/v DiI(분자 프로브) 10㎕(랫츠) 또는 3㎕(마우스)의 일측성 정위 주입이 브레그마에 대해 0.9 mm(래트) 또는 0.5 mm(마우스)뒤 및 1.4 mm(래트) 또는 0.7 mm(마우스) 측면에, 그리고, 측실로의 경막 아래 4mm(래트) 또는 2mm(마우스) 아래에 이루어졌다. 주입 결과 심실계에 걸쳐 뇌실막의 특이적 표지화가 이루어졌고, 심실하 구역도 뇌 실질도 표지화가 보이지 않았다(도 1). 따라서, 이 방법은 표지 뇌실막 세포 및 그 자손의 운명을 특이적으로 추적가능하게 한다. DiI의 분포분석결과 문측 이동성 스트림내의 표지 세포의 숫자를 증가시키는 것으로 확인되었고(Goldman et al., Trends Neurosci. 21:108), 10일 후 최초 DiI 표지된 신경원이, 신규 신경원이 성숙 포유동물에 연속적으로 추가되는 부위인 후각구에 보였다(도 2). 유사하게, 아데노바이러스가 주입된 동물에서, 아데노바이러스가 복제결핍되므로 표지가 감염 세포의 자손의 서브세트에만 유전될 것이기 때문에 예측된 DiI 주입동물에서보다 훨씬 작은 수이지만,LacZ발현 세포가 주입한 지 10일 경과후에 후각구에서 발견되었다(도 2). LacZ 발현은 기술한 X-gal 염색으로 검출되었다(Park et al., EMBO J. 16:3106).

2. 표지 뇌실막 세포의 배양에 의한 신경 간세포의 동정 및 정위

생체내 뇌실막의 특이적 표지는 표지 세포가 시험관내에서 간세포 특성을 갖는 지를 시험하기 위해 사용될 수 있다. DiI의 주입 후에(전술한), 래트를 CO₂로 죽여, 그 뇌를 제거하여 얼음처럼 차가운 PBS에 두었다. 측실의 측벽을 해부하였다. 조직을 가위로 잘게 썰고 해리 배지(0.075% 콜라게나제형1(Worthington), 0.075% 히알루로니다제(Sigma), 4 ㎖ 0.2M PIPES(Sigma) 중 2000U DNAse I)에 옮겨 30분 동안 37℃에서 배양시켰다. 5㎖ 및 1㎖ 파스테르 피펫으로 천천히 연속적으로 분쇄하여 기계적으로 해리시키고 2분동안 현탁액을 방치하여, 더 큰 분획이 바닥에 가라앉게 하였다. 그 다음 상청액을 40㎛ 메시(Falcon)를 통과시켰다. 그 여과된 현탁액에, 4㎖의 차가운 배지(DMEM/F12)를 가하였다. 세포를 4분동안 200g로 원심분리시켰다. 상청액을 제거하고, 펠릿을 10㎖ 설탕 용액(0.5xHBSS 중 0.9M)에서 재현탁시키고 10분동안 750g로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고 펠릿을 배양배지 2㎖ 중에서 재현탁시켜, EBSS 용액 중 10㎖ 4% BSA의 상부에 놓고 7분동안 200g로 원심분리한 후, DMEM/F12에서 세척시켰다. 배양배지는 0.5㎖ L-글루타민, 0.75㎖ 1M HEPES (15mM), 50μ 120μg/㎖ EGF(및/또는 50㎕ 10μg/㎖ bFGF), 1㎖ B27 보충제, 0.5㎖ 100x 페니실린/스트렙토마이신 스톡 및, 최종적으로, DMEM-F12 배지로 이루어지고 총 부피는 50㎖이었다. 세포배양은 37℃, 습공기 중 5% CO2에서 지속되었다. 이러한 조건하에, 미분화 세포의 특징적 구상체 세포 응집물이 배양액에 형성되었다. 이들 세포 응집물은 단일 간세포로부터 유래하고 따라서 세포의 클론을 나타낸다. 이들 구상체중, 측실 및 척수로부터의 88.6±1.20% 및 89.0±1.23%가 각각 명백히 DiI 표지화되었다(5번의 독립 실험±SEM의 평균). DiI 표지화 구상체를 수집하여 단일세포로 해리시켰다. 이들 세포 중 다수가 새로운 구상체를 형성하였고, 배지에 혈청을 가하여 분화를 유도했을 때, 이들 2차 구상체의 대부분이 신경원, 성상세포 및 희소돌기아교세포를 생성하였다. 분화된 자손의 발생은 다음의 세포형 특이 항체: 성상세포에 대한 항신경교 원섬유성 산성 단백질(Dako), 신경원에 대한 Tuj1(Babco) 및 희소돌기아교세포에 대한 O4(Boehringer Mannheim)로 면역조직화학적 표지화에 의해 입증되었다. 이들 실험은 시험관내 뇌실막 세포를 연구하기 위한 유용한 방법임을 확인하고 뇌실막 세포가 자기재생력을 가지고 다능성, 즉 진실한 간세포임을 증명한다.

3. 배양 프로토콜 및 배지

뇌실막 신경 간세포의 성장 및 선별에 적합한 배양 프로토콜은 Johansson et al, Cell 96:25에서 찾을 수 있다. 하지만, 뇌실막 신경 CNS 간세포에 대한 조직 배양 배지중 가장 중요한 성분은 표피성 성장 인자(EGF)나 섬유모세포 성장 인자(FGF)일 수 있는 미토겐이다. 두번째로 가장 중요한 인자는 공동인자 및 영양소, 바람직하게는 잘 알려진 보충제 B27 또는 N2를 충분히 공급하는 것이다. 다음의 특수배지가 사용되었다.

신경구를 위한 배지:

DMEM/F12 47㎖

B27 1㎖

L-글루타민(보존배지: 200mM) 0.5㎖

페니실린/스트렙토마이신(각각 10000U) 0.5㎖

HEPES(보존배지:1M) 0.75㎖

EGF-수용체 이종(보존배지: 20μg/㎖) 0.05㎖ 및/또는

BFGF(보존배지: 10μg/㎖) 0.05㎖

HBSS-포도당 용액 500㎖

HBSS, 10X 50㎖

D-포도당(보존배지: 300mg/㎖) 9.0㎖

HEPES(보존배지: 1M) 7.5㎖

ddH₂O 433.5㎖

**pH 7.5까지

설탕-HBSS 용액 500㎖

HBSS, 10X 25㎖

설탕 154g

ddH₂O 500㎖까지 나머지

**pH 7.5까지

BSA-EBSS-HEPES 용액 500㎖

BSA(시그마 카탈로그 제A4503호) 20g

HEPES(보존배지: 1M) 10㎖

EBSS, 1X 500㎖까지 나머지

**pH 7.5까지

4. 조직의 해리

13.3mg 트립신(시그마 카탈로그 제T4665호), 7.0mg 히알루로니다제(시그마 카탈로그 제H3884호) 및 2.0mg 키누렌산(시그마 카탈로그 제K3375호)을 37℃에서 HBSS-포도당 용액중에 함께 용해시켰다. 그 용액을 여과 멸균시킨 후, 200㎕ 4000 U/㎖ DNAse(시그마 카탈로그 제D4527호)를 가했다. 뇌실막 조직을 15분 동안 37℃의 이 배지중에서 해리시켰다. 그 반응물을 5㎖ 피펫으로 천천히 10회 분쇄시킨 후, 추가적으로 15분간 배양시켰다. 이 배지에서의 배양은 30분을 넘지 않아야 한다.

바로 그 후에, 해리된 조직을 70㎛ 나일론 세포 여과기(Falcon 제2350호)를 통해 통과시켰다. 혼합물을 15㎖ 원뿔형관내에서 5분동안 1500rpm으로 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 펠릿을 10㎖ 설탕-HBSS 용액 중에 재현탁시켰다. 상기 재현탁된 펠릿을 10분동안 2000rpm으로 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 펠릿을 2㎖ 1 X EBSS중에 재현탁시켰다. 신규 15㎖ 원뿔형관에 12㎖의 BSA-EBSS-HEPES용액을 채웠다. 2㎖ 세포현탁액을 조심스럽게 상부에 적용하고 그 혼합물을 1500rpm으로 7분동안 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 세포를 신경구 배지중에서 재현탁시키고 10㎝ 접시에 플레이팅하였다.

상기 과정은 대부분의 미엘린을 제거하기 때문에 척수에 대해 이상적이다. 하지만, 소량의 조직으로 그리고 심실벽으로부터 분리된 세포에 대하여, 설탕중에서 현탁시킨 후 에펜도르프관을 사용하는 것이 더 적합하고 더 많은 세포가 생길 것이다. 전형적으로, 펠릿을 4㎖의 설탕-HBSS 용액중에서 현탁시키고, 이 양을 4개의 1.5㎖관으로 나눈다. BSA-EBSS-HEPES용액의 부피는 그에 따라 축소되었다.

5. 신경구의 이동

트립신(라이프 테크놀로지스사, #45300027)을 37℃에서 24시간동안 배양한다. 그 다음 트립신을 5분이내(처리된 500㎖마다 실험적으로 결정되는) 신경구의 완전한 해리를 가져오는 수준까지 PBS(인산완충 염수)로 희석한다(필요한 경우).

신경구를 10㎝ 플레이트로부터 수집하고 15㎖ 원뿔형관에 서서히 가라앉힌다. 구가 바닥끝에서 수집되면, 상청액을 제거한다. 그 다음 신경구를 1 X PBS중에 현탁시키고, 1 ㎖ 에펜도르프관에 옮겨 가라앉게 한다. 상청액을 제거하고, 구에 500㎕ 트립신(37℃)을 가한다. 37℃에서 2분동안 배양시킨후, 구를 황색 200㎕ 피펫끝을 통해 부드럽게 분쇄시킨 후 추가적으로 3분동안 방치한다. 구를 다시 분쇄하고, 어떤 잔류 세균덩어리나 구라도 약 30초동안 가라앉도록 한다. 트립신화된 세포의 상부 400-450㎕를 제거하고 BSA-EBSS-HEPES용액의 같은 양을 함유하는 신규 에펜도르프관에 놓는다. 그 다음 세포를 1분동안 1500rpm으로 원심분리하고, 세포 펠릿을 1 X PBS중에서 재현탁시킨 후, 1분동안 1500rpm으로 다시 원심분리한다. 그 다음 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 50:50 신경구 배지:조정배지(조정배지는 적어도 1주동안 배양된 신경구 배양물로부터 수집된다. 배양물로부터 배지를 제거하여, 0.2㎛ 필터를 통해 여과한 후, 같은 양의 신선하게 제조한 신경구 배지와 혼합하였다.) 중에 재현탁시켰다. 그 다음 세포는 동일한 배지에서, 그러나 박테리아 플레이트(조직 배양용 플레이트가 아닌)상에 플레이팅되거나, 세포의 대부분은 최초에, 신규 구의 형성을 억제할 플레이트의 바닥에 부착될 것이다. 24시간 후, 원한다면, 세포는 조직 배양 플레이트상에 돌려놓을 수 있다.

6. 단일 뇌실막 신경 간세포의 배양

뇌실막 세포가 신경구를 형성하는 능력에 대한 직접적인 시험은 시험관내에서 개개의 뇌실막 세포를 배양하는 것이 될 것이다(Johansson et al. Cell 96:25). 이러한 목적으로, 두가지 기준에 의해 해리된 측실벽 조직으로부터 뇌실막 세포를 분리하였다. 첫째, 세포는 뇌실막 세포의 뚜렷한 형태학상 특징이지만, 심실하 구역으로부터의 세포에 대한 것은 아닌 섬모를 가져야 했다. 둘째, 희생되기 6시간전 DiI이 주입된 동물로부터 조직을 취했고, DiI 표지 세포만 수집하였다. 양 기준을 충족하는 세포만을 골라 마이크로웰에 옮겼다. 신경구 조정배지에서 웰 당 한 세포를 배양하였다. 이들 배양물에서, 뇌실막 세포의 58%(192세포 중에서 111)가 세포분열을 겪었다. 이들 웰(99웰)의 대부분에서, 세포는 수일내에 사멸하거나 매우 작은 세포 클러스터를 형성하였다. 하지만, 최초 세포의 6.2%(192 중에 12)가 큰 신경구를 형성하였다. 혈청이 신경구의 배지에 가해졌을 때, 신경원, 성상세포 및 희소돌기아교세포에 대한 세포발현 세포형 특이 표지가 동정되었다. 이로부터 단일 뇌실막 세포는 신경원, 성상세포 및 희소돌기아교세포를 생성할 수 있는 신경구를 행성할 수 있고, 즉 진실한 간세포라는 것이 밝혀졌다.

7. DiI 표지화 방법의 비준

어떤 결과는 심실하 구역의 세포가 아닌, 뇌실막세포의 특이한 DiI 표지화에 엄격히 좌우되기 때문에, 심실하 세포로의 DiI 이동의 가능성은 배제되어야 한다. 뇌실막 세포로부터 DiI의 세포이동을 위한 지시세포를 배제하기 위해서, ROSA 26 마우스로부터 유전적 표지 세포로 DiI 표지된 뇌실막 세포를 공배양하였다. 검출가능한 ROSA 26 세포로의 DiI의 이동이 관찰되지 않았다. 시간에 걸친 뇌척수액으로부터 심실하세포로의 수동 DiI 확산의 가능성을 배제하기 위해, 뇌척수액을 하루전 심실내 DiI 주입된 동물의 측실로부터 빨아내어 배양세표에 가했다. 약한 표지만이 발견되어, DiI 농도는 매우 낮음을 나타낸다. 더욱이, 뇌척수액의 다른 동물의 측실로의 주입의 결과 심실에 내장된 어떤 세포도 표지되지 않았다. 이러한 사실은 측실내 DiI 농도는 심실내 주입후에 급격히 떨어지고 심실하 구역내 세포의지연된 수동적 표지화가 아주 가망성이 없을 것임을 시사한다.

8. 세포 선별에 의한 신경 간세포의 정제

배아발달중 신경계에서 발현되는 세포표면수용체인 노치 1 단백질은(Kopan et al., Trends Genet. 13:465) 성숙 래트의 뇌 및 척수 중의 심실하 구역 세포가 아닌 뇌실막 세포에서 선택적으로 발현되는 것을 발견하였다(도 3). 노치 1 항혈청으로 자기 선별하여 급속 해리된 측실벽 및 척수 조직으로부터 뇌실막 세포를 분리하기 위해 노치 1의 이러한 선택적 발현을 이용하였다. 자기 선별을 위해, 세포를 상기와 같이 수집하여 상기 정의된 조성물의 100㎕의 배양배지중에서 재현탁시키고, 노치 1에 대해 제기된 1㎕의 래빗 항혈청을 가하여 20분동안 4℃에서 배양시켰다. 이어서, 세포를 6㎖의 DMEM/F12로 세척하고, 펠릿을 100㎕의 배양배지 중에서 재현탁시키고 30㎕의 예비세척된(PBS 중 0.5% BSA로) 자기비드 결합 항래빗 항혈청(1.8-2.1x10⁷비드, Dynal)을 가하여 때때로 교반해주면서 4℃에서 20분동안 배양하였다. 배양후, 배양배지 2㎖를 가하고, 현탁액을 2㎖ 에펜도르프관에 옮겨, Dynal 자기분리기에 놓고 2분간 방치하였다. 상청액을 35mm 비코팅 Nunc접시('세척'분획)내에 수집한 후, 자석을 분리기로부터 제거하고, 2㎖ 배양배지(상기 정의된 바와 같은)를 가하여 비드-세포 현탁액을 재현탁시키고 자기분리단계를 반복하였다. 상청액을 다시 배양플레이트에 옮겼다. 자석을 제거한 후, 2㎖의 배양 배지를 가하고, 잔여세포를 재현탁시키고 35mm 비코팅 Nunc 접시에 옮겼다. 전과정에 걸쳐, 모든 용액 및 세포 현탁액은 차갑게 유지되었다. 세포 배양이 습공기 중5% CO₂, 37℃에서 지속되었다. 배양배지(상기와 같은 조성물)를 3-4일마다 갈아주었다. 자기 비드가 부착된(선별된) 또는 그렇지 않은(세척분획) 세포를 그 후 배양하고 간세포의 존재에 대해 검정하였다. 신경구는 분리한지 4-5일경 후 보이기 시작했다. 노치 1 항혈청이 생략된 실험에서가 아닌, 세포가 노치 1 항혈청으로 선별된 경우의 실험에서, 대부분의 구는 선별분획에 형성되었다(도 3). 노치 1 선별분획에 형성된 구가 해리되었을 때 뇌실막 세포가 신경 간세포임을 확증하는 다능성 제2 구를 형성하였다.

다른 실험에서, DiI로 뇌실막 세포의 생체내 표지화(상기 참조)는 형광 활성화 세포 선별(FACS) 또는 형광 세포의 수동 채집되어 고도로 농축된 뇌실막 세포의 배양물을 가져왔다.

9. 뇌실막 세포는 낮은 증식율을 가지며 과도증폭 선구체 집단을 생성한다

1회 또는 수회 주입후에 표지 누클레오티드의 혼입의 결핍에 기초한, 전기 연구 결과는 뇌실막 세포는 성숙 포유동물에서 증식하지 않는다는 것을 알려준다. 간세포의 특유한 특질은 천천히 또는 드물게 증식하고 긴 시간에 걸쳐 표지 누클레오티드의 투여가 다른 조직에서 천천히 순환하는 간세포를 동정하는 데 사용되었다는 것이다. 따라서 간세포였다면 예상할 뇌실막 세포의 완만한 증식율은, 표지 누클레오티드의 단일 또는 수회 주입에 의해 분석된다면, 간과될 가능성이 있다. 뇌실막 세포의 증식을 특징짓기 위해, 티미딘 유사체 5-브로모-2'-데옥시유리딘(BrdU, 시그마)을 장시간에 걸쳐 연속적으로 공급하였다.주입을 반복하기 보다는, 분석 2 내지 6 주 전에 음용수를 통해 성숙 마우스에 BrdU를 투여하였다. 마우스 뇌의 장시간 표지화를 달성하기 위해, 1㎎/㎖ BrdU를 마우스의 음용수에 가하였다. 물을 일주일에 두번 교체하였고 알루미늄박으로 광차단하였다. BrdU는 장을 통해 효과적으로 섭취되어, 측실의 측벽에 내장된 뇌실막 세포의 표지화가 이루어졌다. 가장 활성인 신경발생 영역인 측벽에 대응하여, 측실의 루프 및 내측벽에 내장된 뇌실막세포는 거의 표지화되지 않았다. 매우 많은 수의 BrdU 표지 세포가 심실하 구역에 존재한다(도 4). 심실하 구역내의 표지 세포는 종종 매우 밀집된 세포 클러스터로 무리를 지어, 세포의 클론인 것같은 인상을 준다(도 4). 현저하게, 많은 경우에 그러한 세포 클러스터는 표지 뇌실막 세포에 아주 가깝게 위치되었다(도 4). 증식 선구체 세포는 심실하 구역에서 문측 이동성 스트림에 들어가는 측실의 전외측끝으로 밀집하게 함께 이동한다. 표지 뇌실막 세포와 심실하 구역 세포의 클러스터 간의 공간적 관계는 아주 많은 경우에 표지 뇌실막세포와 관련하여 뇌실막하 세포가 문측 이동성 스트림으로 이동되도록 한다(도 4).

간세포가 낮은 증식률을 가진다는 사실은 다른 조직에서의 간세포를 정위하는 데 사용되었다. 표지 누클레오티드가 연장된 시간에 걸쳐 투여될 때, 급속히 그리고 서서히 증식세포가 표지화될 것이다. 표지 누클레오티드의 투여 후 일정시간동안 동물을 생존시켜, 급속 증식 세포는 연속분열 또는 이동에 의해 표지를 희석하는 시간이 주어질 것이다. 따라서, 서행 증식 세포만이 시간과 더불어 표지를 보유할 것이다. BrdU를 연속적으로 2 내지 6주에 걸쳐 수용하고 BrdU없이 2주뒤의동물을 분석하였다. 이러한 동물에서, 심실하 구역에 아주 적은 표지 세포가 관찰되어, 많은 수의 세포가 반복된 분멸 또는 이동에 의해 표지를 희석하였다는 것을 알수 있다(도 4). 하지만, 상당한 수의 뇌실막 세포는 여전히 표지화되어 있다(도 4).

다음으로 척수 뇌실막 세포의 증식을 연구하였다. 중심관에 내장된 상당한 수의 뇌실막 세포는 음용수를 통해 BrdU의 연장된 투여 후에 표지화되었다(도 5). 측실 심실하 구역과 대비하여, 약간의 표지 세포가 중심관 뇌실막 바로 외부에 보였다(도 5). 하지만, 중심관에 근접하여 관찰되는 약간의 표지 세포는 종종 표지 뇌실막 세포와 아주 근접하여 존재하므로, 이러한 세포는 뇌실막으로부터 유래할 수 있다는 것을 시사한다(도 5).

10. 성인 뇌의 뇌실막 신경 CNS 간세포의 배양

간질성 병소를 제거하기 위한 수술중 2명의 성인 환자로부터 측실벽 조직을 제거하였다. 조직을 설치류 조직에 대해 상세히 기술된 대로 효소에 의해 해리시키고, 정확히 동일한 방식으로 처리하고 배양하였다. 약 1주후에, 통상적인 신경구가 배양접시에 나타났다. 폴리-L-오르니틴상에 신경구를 플레이팅하여 또는 혈청을 첨가하여 분화를 유도하였을 때, 신경원, 성상세포 및 희소돌기아교세포(설치류 실험에서와 동일한 세포 특이 표지로 연구되는)는 단일 신경구로부터 분화되었다.

11. 중뇌의 흑색질 치밀부와 같이 한정된 뇌 부위에서의 생체내 신경발생을 분석하는 정량적 방법

본 발명자로부터의 몇가지 미공표 사실은 파킨슨병으로 도파민 신경원이 사멸한 뇌 부위, 즉 흑색질(Date, Brain Res. Bull. 40:1)이 신경원의 연속적인 교체가 존재하는 신규 영역을 나타낸다는 것을 가정하게 하였다. '최고 기술 수준의' 원위치에서의 입체해석학적 세포 계수 기술이 이용되고 더욱 개발되어(Gundersen et al., APMIS 96:857;Janson et al., Neuroscience 57:931) 미숙 및 성숙 마우스 중의 흑색 신경원의 총수뿐만 아니라, 동일영역내의 세포자멸사 신경원의 총수가 분석되었다. 간단히 말해, 본 발명자의 미공표 결과(Janson et al.)는 적은 수의 신경원이 세포자멸사를 통해 자발적으로 사멸하지만, 미숙 및 성숙 마우스가 동일한 수의 흑색 도파민 신경원을 가진다는 것을 지적한다. 동시에 본 발명자들은 상기 신경원 조상세포에 대한 표지, 네스틴이 흑색 신경원의 부집단에 존재한다는 것을 발견하였다(미공표 사실, Janson et al.). 함께 해석되어 이러한 사실들을 신경원 세포자멸사, 즉 신경원 교체와 평형을 이룬 연속적 신경발생의 가능성을 지적하며, 이는 이하에서 기술된다. 정량적 방법은 신경발생 및/또는 신경원 이동을 증진시키는 물질의 생체내 선별을 허용한다.

성숙 래트 및 마우스에 상기 실시예에 기재된 바와 같이 심실내 주입을 통해 DiI를 투여하였다. 주입 후 여러 시간 간격(시-달)으로, 동물에 15㎖ 0.9% 염수, 뒤이어 pH6.9, 0.1 M 인산완충 염수 중의 +4℃ 4%(w/v) 파라포름알데히드 50㎖ 및 0.4%(v/v) 피크르산을 5분동안 심장투과 관류시켰다. 뇌를 제거한 후, 조직을 동일 정착제 중에서 추가의 90분 동안 고정시키고 4℃ 완충 설탕(24시간동안 10%, 2일동안 30%) 중에서 동결방지되었다. 중뇌 전체를 규칙적, 균일한 무작위 표본추출안을 사용하여 저온유지장치와 함께 절단하여, 40㎛두께의 전두골 절편을 6개의 평행 문미측열로 취했다. 절편의 한 열을 0.1 M PBS에 두고 변형된 전술한 프로토콜을 사용하여 형광 신호를 영구적 디아미노벤지딘(DAB) 신호로 즉시 전화시켰다 (Singleton et al., J. Neurosci. Meth. 64:47). 따라서, 표본화된 신선하게 절단된 유리 부동 절편을 0.1 M Tris(pH 8.2) 중 1% H₂O₂에서 10분동안 침지시킨 후 완충액으로 세척하였다. 그 다음 조직을 여과된 DAB(1.5㎎/㎖의 트리스 완충액 pH 8.2)로 +4℃에서 60분동안 어두운 데서 예비배양하고, 트리스 완충액으로 행군 후 유리 슬라이드상에 고정시키고 신선한 DAB용액으로 덮고, 광전화과정중에 매 30분마다 신선한 용액으로 교체하였다. 각각의 표본 슬라이드상에서 흑색질을 동정하고 절편을 에피플루오레슨스(epifluorescence microscope, Nikon)로 10x 대물렌즈 및 로다민 필터를 이용하여 자외선을 조사하였다. 광전환과정은 주의깊게 평가되어 흑색질 중 모든 형광신호는 갈색 DAB 생성물로 가시화되고, 절편은 아비딘-바이오틴-면역퍼옥시다제계(벡터)를 이용하여 도파민 신경원(티로신 히드록실라아제)에 대한 표지(벡터 SG, 벡터)로 면역조직화학적으로 표지화되었다(Janson et al., Neuroscience 57:931). 5개의 평형 절편열은 흑색질 치밀부 중 DiI 표지 세포의 신경원 표현형을 측정하기 위해 신경교 및 신경원(적절한 대조구와 함께)에 대한 여러 표지를 이용하여 면역조직화학에 대하여 처리되고 공초점 레이저 주사 현미경으로 분석될 때까지 -20℃에서 0.1 M PBS 중 30% 설탕에 대신 저장되었다(도 8). 크레실 바이올렛(TH/CV+신경원)으로 대비염색된 TH 면역반응성 세포체뿐만 아니라DiI 표지를 또한 함유하는 TH 면역반응성 세포체의 총수에 대한 정량적 평가가 좌우대칭 SNc에서 이루어졌다. 신경원 총수는 코드부 및 입체해석학적 기술, 광학 분할기를 사용하여 측정될 수 있다(Janson et al., Neuroscience 57:931). 간단히 말하면, 무편중 표본화된 문미측계 절편을 CAST-Grid장치(Computer Assisted Stereological Toolbox, Olympus, Albertslund, Denmark)로 분석하였으며, 이 장치는 동력설치 표본대를 구비한 Olympus BH2 현미경상의 비디오 카메라 및 z축으로의 이동을 모니터하는 마이크로카터로 구성되어 있고(Heidenhain, Traunret, Germany), 양자는 Grid 소프트웨어를 구비한 PC 및 고해상도 모니터에 연결되어 있다. 저확대상태의 각 표본절편의 SNc영역을 둘러싼 후에, 고확대(100x 오일침지, 조리개수 1.4)하여 분석하였다. 이로써 조직을 통해 촛점이 이동하면서 밀집 포위 영역내의 개별 세포의 명백한 명시화가 가능해졌고, 조직은 얇은 슬라이스로 광학적으로 절개되고 0.5㎛ 해상도의 마이크로카터로 평가되었다. 컴퓨터처리, 균일, 규칙적 무작위의 소량의 샘플링(절편의 두께를 따라 6-9㎛ 연장되어 있는)이 실행되었고 입체해석학적 기준을 충족하는 샘플링 부피내에 인과 함께 신경원이 전체 흑색부피의 공지된 분획으로 계수되었다. 전술된 바와 같이(Chan et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 280:439), 세포체 및/또는 수상돌기내에서 니슬 염색 페리카랴 및 TH 면역반응성을 보였다면 흑색 신경원이 계수되었다. DiI신호가 광전화되는 절편열에서, DiI를 함유하는 TH+ 신경원이 계수되었다(3,600x로 평가). 다른 카테고리의 표지 신경원 총수의 각 평가에 대한 에러율이 측정되었다. 얻어진 총수는 z-축을따라 측정되는 수축같은 과정 중의 조직에서의 어떤 치수 변화와도 독립적이다. 여러 시점(몇시간 내지 60일)에서의 흑색 도파민 신경원의 총수는 시간에 대하여 플로팅되었고 회귀곡선(r²=0.97)으로부터 175개의 신규 신경원이 이 뇌 영역에서 각 주마다 발생하는 것으로 발견되었으며, 이는 마우스내 흑색 도파민 신경원의 총수의 1%가량이다.

DiI 표지 세포의 여러 이동성 스트림은 흑색질 치밀부의 다른 부분에 도달하는 것으로 특징지워졌다(이전에는 공지되거나 기재되지 않음, 도 9). 형광현미경을 사용하는 세포계수를 위한 변형 프로토콜의 적용으로, 각각의 한정된 이동성 스트림내의 세포 총수가 측정되었다. DiI 표지 신경원이 실제로 새로 생성되었는가의 판단은 음용수를 통해 지속 투여되는 동물에 있어서 BrdU 표지로 확인되었다(1㎎/㎖, 상기 예 참조, 또는 BrdU의 반복적인 복막내 주입에 의해). 더욱이, '신규' 신경원이 작용성이고 투사신경원을 위한 적절한 신경원 과정을 개발했다는 증거는 TH+ 흑색 신경원 중의 DiI 및/또는 BrdU의 발견으로 지지되며 이는 선조체내의 신경종말부위로부터 역행 수송된 세포체 표지를 또한 입증하였다.

12. 표지 뇌실막 간세포의 자손은 여러 뇌부위에 그리고 여러 표현형의 신경원을 포함한다.

상기 생체내 형광 표지 프로토콜을 이용하여, DiI 표지 세포가 신경원으로써 동정된 뇌의 여러부위를 동정하였다. 이들 부위는 치상회의 과립세포층(도 10), 피질층 및 피질하 구조, 예컨대 생각컨대 시상하부내 감마-아미노부티르산(GABA)함유 신경원 및 흑색질 망상부뿐만 아니라 뇌핵솔기내 세로토닌작동성 신경원 및 코에루루스(coeruleus)부내 노르아드레날린작동성 신경원을 포함하여, 해마의 여러부분을 포함한다.

13. 시험관내 유전적 변형 간세포의 발생

유전적 가공된 간세포는 상기와 같이 간세포를 배양한 후, 발현 플라스미드 또는 바이러스 벡터로써 트랜스팩션함으로써 발생된다. 각 트랜스팩션에 대하여, 4㎍ DNA(방법은 리포터로서 녹색 형광 단백질(GFP)를 코드화하는, Clontech사의 CMV-GFP플라스미드를 사용하여 성립되었다)를 12 x 75mm 원뿔형관(15ml)내의 200㎕의 배양배지(상기 정의된)에 가하고 서서히 혼합시켰다. 제2 원뿔형관에 15㎕의 리포펙트아민시약을 200㎕의 배양배지에 가하고 서서히 와동시켰다. 두 용액은 그 후 제2 용액을 제1 용액에 가하므로써 합쳐지고 실온에서 45분 배양하여 DNA-리포좀 복합체를 형성하게 했다. 그 다음 1.6㎖의 배양배지를 DNA-리포좀 복합체를 갖는 관에 가하고 이 용액을 세포위에(그 배지의 대부분을 조심스럽게 제거한) 깔았다. 세포를 12시간동안 배양한 후 배지를 DNA없는 정규 배양배지로 교체하였다. GFP 검출은 트랜스팩션 후 48-72시간 경과 후 형광현미경으로 수행하였다. 이들 간세포는 클론으로 팽창하여 미분화 유전적 변형 간세포의 구를 발생할 수 있다.

14. 생체내 간세포에서의 변경 유전자 발현

생체내 간세포에서 변경 유전자 발현은 상기와 같이 측실내로 RSV 프로모터의 조절하에 리포터유전자 LacZ를 갖는 복제결핍 아데노바이러스를 주입하므로써 가능하다. X-gal 염색(상기의)은 뇌실막 간세포 중의 리포터유전자의 발현 및 그에 따른 간세포에서 변경 유전자 발현의 가능성을 증명하였다. 신경성장인자의 발현을 구동하는 유전자를 갖는 간세포, 신경교 세포계유래의 인자(신경원 생존인자), bcl-2(간세포의 생존을 증진시킬 유전자) 및 nurr1(간세포로부터 도파민작동 신경원의 발생을 증진시킬 수 있는)가 발생되고 있다.

15. 트랜스게닉 동물의 간세포의 사용

트랜스게닉 동물로부터 간세포를 배양하는 것이 가능함을 알아냈다. 이러한 연구를 위하여 LacZ 유전자를 그 게놈에 지니는 마우스를 사용하였다(Zambrowicz et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 94:3789). 이 마우스는 모든 조직에서 어디에서나 트랜스유전자를 발현한다(Zambrowicz et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 94:3789). 이들 마우스의 간세포를 정제하고 상기와 같이 배양하였다. 강한 트랜스유전자 발현이 상술한 X-gal 염색에 의해 밝혀졌다.

16. 외상성 손상에 의한 간세포 증식 및 분화의 조작

성숙 래트에서 흉부 깊이로 추궁절제술을 실행하여 척수를 노출시키고, 배측삭을 미세외과수술용 가위로 횡단절개하고, 이어서 그 손상을 배측삭내의 표면종절개에 의해 문측으로 연장하였다. 다른 동물에서, 두개골에 구멍을 뚫고 바늘을 뇌 조직에 삽입하여 손상을 일으켰다. 어떤 동물에서 뇌실막 세포는 상기와 같이 DiI주입에 의해 손상되기 1-10일 전에 표지되었다. 배측삭에서의 절개 후 다른 시점에서 증식하는 뇌실막 세포의 정량화에 의해 비손상 동물에 비교하여 손상 1일 후 거의 50배 증가하는 것으로 드러났다(도 5). 제1 일후, 증식은 한 달이내에 정상상태로 점점 감소하였다(도 5). 또, 뇌실막 세포 증식은 뇌손상을 수반하는 측실벽에서 크게 증가하였다.

척수 또는 뇌손상에 앞서 뇌실막세포가 DiI 주입에 의해 표지된 동물에서, DiI 표지 세포수의 증가가 손상 후 첫번째 4주에 걸쳐 뇌실막 외부에 더욱 진행해는 것으로 관찰되었다(도 6). DiI 표지 세포는 손상 후 1 주이내에 상처를 형성하는 조직에 풍부하였고 적어도 1 년 동안 지속되었다. 손상에서 형성되는 상처 조직내에 막대한 다수의 DiI 표지 세포가 신경교 원섬유성 산성 단백질, 성상세포 표지에 대해 면역반응성을 나타내므로써, 뇌실막 세포의 자손의 다수가 성상세포로 분화되었다는 것을 보였다(도 6). 하지만, 신경원 표지가 DiI 표지 세포에 발견되지 않으므로 간세포의 신경원 변형에 필요한 신호는 이 동물 모델에 존재하지 않음을 지적하였다.

17. 중뇌의 흑색질 치밀부에서의 신경발생을 증가시키는 화학약품

각 마우스에 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라히드로피리딘(MPTP, RBI, Natick, MA, USA)(생리식염수 희석된 40mg/kg, sc.)이 주어졌다. 이 물질은 인간 및 실험동물에서 파킨슨병을 유발하는 중뇌의 도파민 신경원에 대한 그 선택적 신경독성 작용에 대해 알려져 있다(Langston et al., Science 219:979, Heikkila et al., Science 224:1451). 하지만, 상기 분자는 파킨슨병의 동물모델에서 신경보호제로 작용하는 것으로 알려진 화합물, 예컨대 니코틴과 공통적인 구조를 또한 갖는다(Janson et al., Neuro Science 57:931). 우리의 실험에서, 동물에 MPTP 또는 부형제를 수여했고 DiI+ 흑색 도파민 세포의 수 또는 이 뇌 부위로 이동하는 DiI+ 세포의 이동성 스트림의 염색 형태의 변화의 정기과정이 분석되었다(상기 참조, 뇌실막 세포의 표지후 중뇌 흑색질 치밀부에서의 신경발생에 대한 정량적 연구방법). 처리결과 높은 수의 TH+/DiI+ 및 TH+/BrdU+ 흑색 신경원에 이르게 하였는 데 이는 신경발생의 증가를 나타낸다. 또한, 중뇌에서의 DiI+세포의 이동성 스트림은 MPTP로 처리된 동물에서 더욱 뚜렷하게 보였고, 이는 상기 변경된 입체해석학적 방법을 사용하여 정량적으로 분석될 수 있다.

18. 뇌실막 간세포의 이식

Rosa26 트랜스게닉 마우스의 뇌 또는 척수로부터의 뇌실막 간세포를 정제하고 상기와 같이 배양하였다. 이들 마우스로부터의 미분화 간세포 구를, 그 배양배지(상술한) 15㎕중에 구의 정위 주입에 의해, 성숙 래트의 선조체로 이식하였다. 동물을 2시간 후에 희생시키고 뇌를 절개하여 상술한 바와 같이 X-gal 염색에 의해 Rosa26마우스로부터 구동되는 LacZ 발현세포의 존재를 분석하였다. 이식된 세포를 삽입도관에 근접한 조직에 분산시켰다. 이들 세포는 종종 몇 과정을 거쳤다(도 7).

19. 신경 간세포 분화에 영향을 미치는 물질의 높은 작업처리량의 선별을 위한 검정의 발달

특정 신경교 또는 신경원 표현형으로의 뇌실막 신경 간세포의 분화를 증진하는 물질의 능력을 효율적으로 평가하는 시험장치가 개발되었다. 그 다음 그러한 물질을 상기 약술된 대로 생체내에서 시험할 수 있다.

20.모든 배엽의 조직을 생성하는 성숙 뇌 신경 간세포의 광범한 능력

20 a. NSC 배양

측실의 측벽을 상술한 바와 같이 효소에 의해 해리시켰다(Johansson et al.,Cell, 96:25). 배양배지는 DMEM-F12 배지(Life Technology) 중 20ng/㎖의 EGF(Collaborative Biomedical Products), B27 보충제(Life Technology), 2mM의 글루타민, 100U/㎖의 페니실린, 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신으로 구성되어 있다. EGF(20ng/㎖)를 세포의 최초 플레이팅 후 48시간마다 배지에 가했다.

20 b. RNA 분석

RNeasy(Qiagen)를 사용하여 조직 RNAs를 추출하고, 제조자에 의해 권장되는 조건하에, 50㎕의 반응부피중에서 전체 RNA의 500ng을 Superscript II(Life Technologies) 및 random hexamers(Pharmacia)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. PCR반응이 2.5mM MgCl2, 10mM 트리스-HCl(25℃에서 pH 8.8), 50mM KCl, 0.08% Nonidet P40, 0.2mM의 각각의 dNTP, 5 U Taq DNA 중합효소(Fermentas), 0.1㎎/㎖ BSA, 50pmoles의 각각의 올리고누클레오티드 프라이머의 존재하에 그리고 알파[³²P]dCTP의 존재하에 실행되었다. cDNA수득량을 표준화하기 위해, 반정량적 PCR 반응이 리보좀 단백질 L19에 특이적인 프라이머와 조합하여 cDNA 코드화 β-갈락토시다제에 특이적인 프라이머를 사용하여 실행되었다. 다음의 올리고누클레오티드 프라이머쌍: 센스 올리고누클레오티드 5'-TTG GAG TGA CGG CAG TTA TCT GGA-3'(SEQ. ID.NO.1) 및 안티센스 올리고누클레오티드 5'-TCA ACC ACC GCA CGA TAG AGA TTC-3'(SEQ. ID.NO.2)과 함께 94℃(1분), 64℃(1분), 및 72℃(1분)의 40사이클을 사용하여 β-갈락토시다제를 증폭하였다. 25사이클 후에, 반응은 5 U Taq DNA 중합효소로 보충되고 L19에 특이적인 올리고누클레오티드 프라이머: 센스 올리고누클레오티드 5'-CCT TGG ACA GAG TCT TGA TGA TCT CCT-3'(SEQ. ID.NO.3) 및 안티센스 올리고누클레오티드 5''-CTT CTC AGG AGA TAC CGG GAA TCT AAG-3'(SEQ. ID.NO.4)를 내부 대조구로서 첨가하였다.

20 c. 면역조직화학

저온유지 절편 및 배양세포를 37℃에서 1시간 또는 4℃에서 밤새 1차 항체와 함께 배양시키고, PBS중에서 씻어내고, 실온에서 45분동안 2차 항혈청과 함께 배양하였다.

20 d. 상실배 응집 및 낭포 주입

세포의 증식 구를 그 최초 분리 후 4 내지 6일이내에 트립신화하고 응집 또는 미세주입을 위해 1X PBS 중에서 재현탁시켰다.

신경 간세포는 CD-1 상실배로 응집되거나 C57BL 마우스로부터 유래하는 낭포로 주입되고 표준기술 및 방법을 사용하여 양모로 이식되었다.

20 e. 낭포의 세포내 덩어리 중 신경 간세포의 통합

성숙 신경 간세포의 분화력을 분석하기 위해서, 초기 배아 환경에 성숙 신경 간세포를 도입하므로써 다른 조직의 형성에 기여하는 이들 세포의 능력을 검정하고 그 자손의 운명을 추적한다.

다능성 신경 간세포는 일정 배양조건하에서 해리된 성숙 뇌 및 척수조직으로부터 증식될 수 있다. 이러한 조건하에서, 단일 세포가 증식되고 자손이 응집된 세포의 클러스터를 형성한다. 그러한 세포 클론은 시험관내에서 수일 후에 배양 접시로부터 분리된다. 미토겐, 예컨대 표피성 성장 인자(EGF)나 섬유모세포 성장인자(FGF)의 존재하에, 세포는 증식을 계속하고 특징적인 밀집하게 무리지은 세포의 구상 세포 응집체를 형성하며, 이는 신경구라고 불리우며, 모두 단일 세포로부터 유도된다(Reynolds et al., Science 255:1707).

성체-유래 신경 간세포가 아주 초기의 배아발생 미환경에서 살아남을 수 있을 지를 최초 시험하기 위해서, 신경 간세포 또는 여러 효소에 의해 해리되는 단일 세포의 단일 구는 8세포 들어찬 상실배로 최초 응집되고 초기 낭포단계로 시험관내 발달을 계속하게 하였다. 신경 간세포는 어디에서나 대장균 유래의 β-갈락토시다제를 발현하는 Rosa26 마우스로부터 배양되며, 이들 세포 및 그 자손은 고정 및 염색 후에 쉽게 동정될 수 있다. 초기 낭포에서, 많은 신경 간세포가 외부 영양외배엽상에 부착되어 증식하는 것으로 보인다(도 11A). 하지만, 약간의 세포는 상실배세포와 혼합될 수 있어 발달 낭포의 세포내 덩어리에서 발견되었다(도 11B). 이러한 신경 간세포는 8세포단계의 상실배로 성공적으로 응집되어 초기 낭포발달단계까지 세포내 덩어리로 살아남을 수 있기 때문에, 이들 세포가 배아 중추신경계의 형성 또는 가능하다면 다른 배조직에 적어도 부분적으로 기여할 수 있다고 그럴듯하게 추정하는 것이 그럴듯했다. 신경 간세포의 세포내 덩어리에 대한 보다 효율적인 기여는 초기 낭포에 세포를 직접 미세주입하므로써 얻어졌다.

20 f. 성숙 신경 간세포는 키메라 마우스 배아의 발생에 기여할 수 있다.

다른 조직의 발생에 기여하는 성숙 신경 간세포의 능력을 시험하기 위해, 10 내지 20 단일 신경 간세포로 주입된 C57/BL6 낭포를 양모로 옮겨 배아일 11까지 발달시켰다. 배아를 파라포름알데히드중에서 고정시키고 lacZ 발현을 β-갈락토시다제에 대한 항체를 사용하여 X-gal 조직화학 및 면역조직화학에 의해 검정하였다. RT-PCR을 사용하여 β-갈락토시다제 mRNA의 존재를 검출하기 위해 다른 배아를 사용하였다.

Rosa26마우스의 성숙 신경 간세포 유래의 β-갈락토시다제의 존재를 검출하기 위해 염색된 E11 전 배아를 검사한 결과, 분석된 배의 키메리즘도가 변한다는 것을 밝혀냈다. 한배 새끼내에 키메리즘도의 변화도가 컸고, 모든 한배 새끼에 lacZ 발현 세포가 완전히 결핍된 수개의 배아가 항상 존재하였다. 키메라 배아는 비키메라 배아와 유사한 크기였고, 어떠한 명백한 해부학적 이상도 보이지 않았다. 높은 키메리즘도를 나타내는 한 배아가 야생형 C57/BL6 비주입 대조구와 함께 도 11에 도시되었다. 주입 낭포 유래의 배아에 대한 표면 조사 결과, Rosa26 유래의 신경 간세포의 복측 척수, 중뇌, 눈, 심장 및 다른 많은 내장 및 조직에 대한 광범한 기여가 밝혀졌다. Rosa26 유래의 신경 간세포의 기여를 덜 보이는 배아는 주로 중장-후장 접합부나 심장에서 염색을 나타냈다. 내생적 염색의 상대적으로 낮은 수준이 이소포 및 제정맥 영역의 야생형 배아에서 빈번하게 관찰되었다. 하지만, 조사된 야생형 배아의 다른 영역에서 추가적인 내생적 활동이 관찰되지 않았다. 키메라 배아의 X-gal 염색 특이성이 β-갈락토시다제에 대한 항혈청으로 면역조직화학적 표지를 중복시켜 확인되었다. 야생형 배아에서의 활동과 같은 내생적 β-갈락토시다제를 보이는 영역은 β-갈락토시다제에 대한 항혈청으로 표지되지 않았다.

더욱이, 독립적 방식으로 Rosa26 유래의 세포의 기여를 시험하기 위하여,RT-PCR이 성숙 신경 간세포로 주입된 E11 배아 또는 비주입된 야생형 대조구로부터 분리된 전체 RNA중 β-갈락토시다제 mRNA의 존재를 검정하기 위해 사용되었다. 이러한 분석에서 사용된 배아는 세 절편, 두부(상완궁을 포함하여), 흉부(상완궁이하 및 탯줄 이상) 및 배아의 미측 부위(배꼽부, 후지, 및 꼬리를 포함하는)으로 횡단 절개되었다. β-갈락토시다제 유전자에 특이적인 올리고누클레오티드 프라이머를 각각의 배아 절편으로부터 수득된 cDNA를 증폭하는 데 사용되었다. L19 mRNA, 리보솜 단백질의 검출에 특이적인 2개의 추가적인 올리고누클레오티드 프라이머가 또한 PCR 반응에 추가되어 내부 대조구로 작용하였다. β-갈락토시다제 mRNA는 비주입된 배아로부터 취한 샘플에서는 검출되지 않은 반면, 중간정도의 신호가 배아의 두부 및 심장 및 중장을 함유하는 흉부에 주로 관찰되었다. lacZ 발현의 이러한 기여는 β-갈락토시다제 유전자 생성물의 발현형태를 검출하기 위한 다른 전체 염색 배아에서 관찰된 형태와 일치하였다.

20 g. 성숙 신경 간세포가 모든 배엽의 조직 발생에 참여할 수 있다

성숙 신경 간세포로 주입된 배아의 조직에서 관찰된 키메라 기여의 최대 수준을 나타내는 키메라 배아 절편의 실시예가 도 12 및 13에 각각 도시된다. 성숙 신경 간세포는 E11 마우스 배아에서 외배엽 기원의 몇몇 조직에 상당히 기여한다. 두개부위내에서, 기여는 척수의 복측 및 내측 부위, 종뇌의 종판, 간뇌의 누두, 눈의 안포경, 망막층 및 렌즈, 내이의 와우, 및 비판에 분명하였다. 하지만, 흉부내에서, 성숙 신경 간세포의 기여는 외배엽 유래의 조직에서는 비교적 적게 관찰되었고, 가장 현저하게는 표피에서 관찰될 수 있다.

성체 유래의 신경 간세포의 높은 키메라 기여는 또한 완전 배아 내배엽 유래의 조직에서 관찰될 수 있다. 이는 전장, 혀, 구강, 인두낭, 및 갑상선을 포함하는 인두부위에서 현저하게 관찰된다. 흉부내에서, 내배엽 기원의 조직에 대한 기여는 또한 식도, 기도, 폐아, 위, 장, 췌장 및 간에서 또한 상당하였다.

중배엽 기원의 여러 조직이 또한 성숙 간세포의 높은 수준의 기여를 나타낸다. 이들 조직은 척삭, 심장의 심방 및 심실벽을 포함하는 심근층, 배대동맥, 및 생식융기원기 및 중신성관을 포함하였다. 하지만, 여기서, 발달 골격근 및 뼈에 대한 성체 유래 신경 간세포의 비교적 감소된 기여를 주목하는 것이 또한 중요하다.

20 h. 조직특이적 세포형으로의 분화

키메라 배아에서 발견되는 성숙 신경 간세포 유래의 lacZ 발현 세포가 통합된 조직을 대표하는 세포형으로 분화되었는 지를 분석하기 위해, 이들 조직의 상당부를 통상 포함하는 세포에 의해 발현되는 독특한 세포 표지의 발현을 연구하였다. 본 발명자들은 이중 면역조직화학적 염색법을 사용하여 Tuj1, HB9, 티로신 히드록실라아제(TH), 음파 고슴도치(Shh), 평활근 액틴 및 데스민에 대해 특이적인 모노클로날 항체와 β-갈락토시다제의 발현의 중복을 입증하였다(도 12 및 13). 이들 항체는 β-튜불린 III(축삭 미세관에 특이적인), 운동신경원, 도파민작용 신경원, 복측 척수에서 발견되는 Shh 생성 세포, 심장 및 골격근내의 평활근 내 많은 동맥 및 정맥 및 중간 필라멘트를 각각 검출한다. 추가적인 항체가 β-갈락토시다제와 췌장의 인슐린 또는 글루카곤 분비 세포의 동시 정위를 검출하는 데 사용된다.

검토

세포손실은 많은 형태의 신경계 질환에서의 공통 요인이다. 예컨대 파킨슨병에서의 도파민작용 신경원, 근위축성 측삭 경화증에서의 운동신경원 및 다발성 경화증에서의 희소돌기아교세포와 같이 다른 세포형이 다른 질환에서 영향을 받는다. 특정 영역에서 여러 다른 세포형이 다른 상태, 예컨대 발작 또는 외상성 손상에서 영향을 받을 수 있다. 현재, 신경계에서 신규 세포의 발생을 자극하기 위한 임상적 실행에 이용가능한 방법은 없다. 인간 배아 또는 동물로부터의 세포의 이식은 몇가지 고무적인 결과와 함께 임상적으로 시험되어 왔다. 하지만, 이러한 방법은 몇 가지 문제, 주로 윤리적 및 면역학적인 문제를 가지고 있어, 더 많은 수의 환자에게 사용될 수 있을 것 같지 않게 한다. 성체 중추신경계에 다능 간세포의 집단이 존재한다는 최근의 깨달음은 환자의 자기 간세포로부터 성체 중추신경계에 신규 세포의 발생을 자극할 수도 있겠다는 희망을 야기시켰다. 하지만, 다소의 해결의 실마리가 되는 문제는 미해결상태로 남아 있어 이 분야의 진전을 어렵게 하였다. 본 간세포의 동정은 이제 이들 세포의 정제 방법, 생체내 정량적 연구방법, 생체내외에서 그것들을 유전적으로 변형시키고 여러 약제학적 화합물로 자극하는 방법을 개발할 수 있게 하였다. 또한, 본 발명은 간세포가 CNS에서 여러 신경해부학적 세포군으로의 신규 이동경로를 추적한다는 것과 생체내에서 신경원으로 변형될 수 있다는 증거를 제공한다. 본 발명은 또한 뇌의 여러 부위에서 신경발생을 평가하는 무편향 정량방법뿐만 아니라 뇌의 여러 부위로 이동하는 간세포 및 그 자손의 총수를 분석하는 기술을 포함한다. 전체적으로 보아, 본 발명에 의해 제공되는 발전은 중추신경계에서의 신규 세포의 발생을 자극하는 방법을 개발할 가능성을 크게 증가시킨다.

세포에서 유전자의 발현을 변경하는 것은 이들 세포가 정선한 주어진 단백질을 생산할 수 있게 하거나 원하지 않는 단백질의 생성을 방해할 수 있다. 본 발명에 따라 시험관내 또는 생체내에서 세포의 유전자를 조작하는 것은 광범한 상태에서 유익할 수 있다. 예를 들면, 성장인자, 시토킨, 호르몬 또는 임의의 다른 단백질을 발현하기 위해 가공된 세포는 예컨대 세포 신호발생 또는 세포 생존을 자극하는 그러한 단백질의 연속적인 투여를 필요로 할 수 있는 개별세포로 이식될 수 있다. 따라서, 세포는 약제학적 물질의 연속적인 투여제로서 작용할 것이다. 그러한 사용을 위한 세포는 예컨대 플라스미드 또는 바이러스 벡터로 트랜스팩션에 의해 유전학적으로 재단될 수 있거나 세포는 트랜스게닉 생물로부터 취해질 수 있다. 본 발명의 세포를 포함하는 트랜스게닉 생물은 또한 본 발명의 범위내이다. 또한, 유전자 발현은 플라스미드 또는 바이러스 벡터뿐만 아니라 안티센스 DNA 또는 RNA 단편으로 전위 유전자 발현을 유도하므로써 생물내에서 원위치에서 변경될 수 있다. 특정조건하에서, 특정 유전자가 결핍되거나 저수준의 유전자생성물을 생성하는 세포를 사용하는 것이 매우 유용할 수 있다. 예를 들면, 분화 개체간의 세포 또는 조직의 이식은 이식을 거부하는 숙주 면역계를 유도하는 세포의 표면상의 특정 단백질의 발현에 의해 제한된다. 이는 특히 두 개체가 다른 종의 것이면 주요한 문제이다. 이러한 문제를 우회하는 한 방법은 숙주 면역계에 의한 거부를 유도하는 유전자가 결핍된 유전적으로 변형된 세포 또는 동물을 발생하는 것이다.시험관내 또는 생체내 세포의 유전자 발현을 조작하기 위한 다른 중요한 암시는 내부의 또는 외부의 세포 사멸 신호를 억제하므로써 세포의 특정 세포 사멸로 미분화 세포의 분화를 유도하거나 또는 세포의 생존을 자극하는 것을 포함한다. 또한, 특정유전자를 도입하므로써 세포를 불멸화하고 특별한 특징을 갖는 클론 세포계를 생성하는 것이 가능하다. 성숙 중추신경계에서 신경 간세포의 동정 및 정위가 알려지지 않았기 때문에, 이전에는 특히 생체내에서 이들 세포를 유전적으로 변형시키기가 어려웠다. 세포 배양에서 간세포를 정제하기 위한 방법의 발명은 유전적 조작의 모든 형태, 예컨대 플라스미드 또는 바이러스 발현 벡터를 사용한 이들 세포의 트랜스팩션 또는 트랜스게닉 생물로부터의 세포의 정제 또는 예컨대 안티센스 DNA 또는 RNA 단편을 사용한 유전자 발현의 억제를 가능하게 한다. 생체내에서 간세포의 정위는 예컨대 바이러스 벡터로 원위치에서 이들 세포의 유전자 발현을 변경하게 한다.

상기에서, 성숙 뇌의 간세포가 키메라 마우스 배아내의 모든 배엽으로부터 유래하는 다조직의 형성에 기여할 수 있다는 것이 또한 입증되었다. 신경 간세포의 자손은 그들이 통합되고 신경계에서 발현되지 않는 조직에 적당한 조직 특이적 표지를 발현한다. 그들은 편리한 방식으로 통합되고 분화한다. 아마도 이것의 가장 현저한 예는 심장에 대한 신경 간세포 자손의 빈번한 큰 기여이며, 세포의 기능성은 분명한 정상적 해부된 고동치는 심장에 의해 여기서 명백해졌다.

세포 분화의 후성적 조절

특이 조직에서의 이들 간세포로부터 발생하는 조상의 세포운명은 자기 결정되지 않고, 외부 신호의 번식가능한 세트에 세포가 노출되어 결정된다. 실제로, 신경 간세포의 자손을 특징지움에 있어서, 외부 성장인자가 신경 간세포 운명을 직접적으로 변경하고 이어지는 분화를 편재할 수 있다는 증거가 있다. 설치류 해마 유래의 클론 간세포 집단이 일시적으로 섬모 향신경성인자(CNTF)에 노출되면, 신경원을 희생시켜 성상세포를 생성하고, 갑상선 호르몬(T3)에 일시적으로 노출되면, 신경원을 희생시켜 희소돌기아교세포를 생성한다. 배아 또는 성숙 신경 간세포로 동일한 결과가 관찰된다(Johe et al., Genes Dev. 10:3129). 이 사실은 성장인자가 직접적으로 간세포 운명에 영향을 주어 신경원, 성상세포, 또는 희소돌기아교세포의 발생에 연루된 조상세포의 생성을 가져온다는 것을 시사한다. 유사한 결과가 클론 배양된 신경 능세포를 사용하여 관찰되었고, BMP2는 슈반세포 사멸을 유도하는 자기 신경원 신경교 성장인자를 유도하고, 변형 성장인자-β(TGF-β)는 평활근 분화를 유도한다(Shah et al., Cell 77:349; Shah et al., Cell 85:331). 이 사실은 유전자 발현에 있어서 국부적 상위는 간세포의 분자적으로 상위한 집단을 초래할 수 있고 간세포 운명의 고유의 상위는 외부 신호에 노출되어 용이하게 변경될 수 있다는 것을 시사한다.

성숙 신경 간세포가 계통 제한이 결여되거나 탈분화되는가?

초기 배아에서의 이식 실험은 세포가 일정 계통에 한정되었을 때 시점이 한정되었다. 특정 운명에 대한 관련은 유전자의 특이적 조합의 발현에 의해 부과된다. 생체외조건에서 실험은 신경원 및 신경교 세포를 발생하는 성숙 신경 간세포의 능력을 입증하였다. 따라서 첫번째 고려에서 성숙 신경 간세포는 탈분화를 겪어 다른 계통의 세포를 발생하도록 하는 것이 당연하다. 하지만, 세포에 특정 계통 동일성및 제한을 수여함에 있어서 포함된 많은 유전자가 배아 발달 중에 일시적으로 발현된다는 것이 주목할 만하다. 간세포 집단은 특정 조직에 물리적으로 구속될 수도 있고 분자 환경은 신규 세포에 조직 특이적 운명을 강요할 수 있기 때문에 계통 결정 유전자의 발현은 조직의 발달 후에 필요하지 않을 수도 있다. 따라서, 성숙 중추신경계 간세포가 그 신경 책무를 상실하는 것이 가능하다. 성숙 중추신경계에 존재하는 간세포의 다능성을 한정하는 것은 그 정지상태를 떠나 결정된 세포 운명을 갖는 조상들을 생성하는 증식단계에 들어가는, 성숙 신경 간세포, 또는 대체로 간세포에 필요한 복잡한 분자 사건을 이해하기 시작하도록 할 수 있다.

다른 간세포 집단이 배아보다 성체에서 더 광범한 분화력을 가진 수 있다는 징후가 있다. 예를 들면, 뇌에 이식된 조혈 간세포는 성상세포를 발생할 수 있다. 이는 다른 성숙 조직의 간세포가 매우 유사하고 배아 간세포에 유사한 능력을 가질 가능성을 제기한다. 실제로, 성숙 생물에 존재하는 한 중요 간세포 집단만이 있을 수 있다.

성숙 뇌의 측실벽 유래의 신경 간세포의 세포 잠재력을 더욱 직접적으로 말하기 위해, 이들 세포를 초기 낭포 미환경에 두었고, 이들 세포가 배아발달 중에 모든 세 배엽으로부터 처음부터 유래하는 많은 기관 및 조직에 기여하는 것을 알게 되었다.

결론적으로, 본 발명은 CNS의 여러 질병, 신경변성의 지속 진행을 갖는 질병(알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증, 다발성 경화증)뿐만 아니라두부 또는 척수에 대한 급성외상의 임상적 상태에서 그리고 뇌혈관질환에 있어서 신규 치료법을 개발할 수 있게 할 것이다. 간세포가 여러 다른 신경원 표현형(도파민 신경원, GABA 신경원, 세로토닌 신경원)뿐만 아니라 완전히 다른 조직형태로 변형될 수 있다는 본 연구결과는 세포 손상이 우울증 및 다른 정신장애뿐만 아니라 심장수술을 포함하는, 가능한 신규 부위로의 질병의 전개에 주요한 상기 질병이상의 가능한 적용의 문을 열어놓았다.

본문에 인용된 여러 간행물은 그 전체로 참고로 포함되어 개시된다. 본 발명은 본 발명의 개별 측면의 단일 예시로서 의도되어 기술된 특정 구체예에 의해 영역에 있어 제한되어서는 아니되고, 기능적으로 동등한 방법 및 성분은 본 발명의 범위내이다. 본문에 나타나고 기술된 것이외에, 본 발명의 실제 여러 변형이 앞서의 기재 및 첨부 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 그러한 변형은 첨부된 청구범위 영역이내에 해당하는 것으로 의도된다.

Claims

노치 2, 노치 3, CAR(경막단백질 결합 아데노바이러스) 및 CFTR(낭성섬유증 경막 전도성 조절자)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 표면 단백질과 함께 표면단백질 노치 1을 발현하고, 또한 적어도 하나의 섬모를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 뇌실막 신경 CNS 간세포.
제 1 항에 있어서, 설치류 또는 인간과 같은 포유류로부터 생기는 것을 특징으로 하는 분리된 뇌실막 신경 CNS 간세포.
출생후 CNS 조직으로부터 뇌실막 신경 CNS 간세포를 분리하는 방법으로서, 상기 CNS 조직으로부터 뇌실막 세포를 선택적으로 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 뇌실막 조직이 해리되고 뇌실막 신경 CNS 간세포가 그 조직으로부터 회수되는 것을 특징으로 하는 뇌실막 신경 CNS 간세포의 분리방법.
제 4 항에 있어서, 뇌실막 조직이 가수분해효소, 예컨대 콜라게나제, 트립신, 또는 히알루로니다제로 효소에 의해 해리되거나, 키누렌산에 의해 해리되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 뇌실막 조직을 해리하므로써 방출된 세포가 EGF 및/또는 FGF를 포함하는 배양배지에 보존되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 뇌실막 신경 CNS 간세포의 회수가 뇌실막 신경 CNS 간세포의 적어도 하나의 특징에 대해 단일세포를 선별하므로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 단일세포가 노치 1, 적어도 하나의 섬모의 존재, 및 노치 2, 노치 3, CAR 및 CFTR로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 표면단백질의 발현에 대해 선별되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 뇌실막 신경 CNS 간세포의 상기 특징이 미리 만들어진 뇌실막 세포의 생체내 표지인 것을 특징으로 하는 방법.
뇌실막 신경 CNS 간세포를 포함하는 세포 제제로서, 제제가 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 80%, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 90%의 뇌실막 신경 CNS 간세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 제제.
제 10 항에 있어서, 간세포의 적어도 4%가 활성 간세포, 즉 자기재생을 겪고다능성인 것을 특징으로 하는 세포 제제.
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 제 3 항 내지 제 9 항 중 어느 하나의 항의 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 세포 제제.
제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 유전학적으로 조작된 뇌실막 신경 CNS 간세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 제제.
의학적 사용을 위한 것을 특징으로 하는 제 1 항 또는 제 2 항 중 어느 하나의 항의 뇌실막 신경 CNS 간세포.
약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제와 함께, 제 1 항 또는 제 2 항 중 어느 하나의 항의 뇌실막 신경 CNS 간세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
신경 조직을 발생하기 위한 약학적 조성물을 제조하기 위한 것을 특징으로 하는 제 1 항 또는 제 2 항의 뇌실막 신경 CNS 간세포의 용도.
비신경 조직, 예컨대 심장, 눈, 내이, 간, 신장, 췌장 및 다른 내분비기관의 조직을 발생하기 위한 약학적 조성물을 제조하기 위한 것을 특징으로 하는 제 1 항또는 제 2 항의 뇌실막 신경 CNS 간세포의 용도.
알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증, 다발성 경화증, 두부 또는 척수의 급성 외상, 뇌혈관질환, 근질환, 심장질환, 또는 눈, 귀, 간, 신장, 췌장 및 다른 내분비기관의 질환의 치료를 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 것을 특징으로 하는 제 1 항 또는 제 2 항의 뇌실막 신경 CNS 간세포의 용도.