CN1161744A - 中枢神经系统(cns)功能和机能障碍的体外模型 - Google Patents

Abstract

用正处于增殖或增殖了的多潜能神经干细胞和其子代构建一个CNS模型系统，应用于神经发育和功能的研究，以及用于测定新治疗剂和其他生物剂对CNS的作用。神经干细胞取自出生前和出生后个体正常的或患病的少量CNS组织。本发明使得能从相对少量的CNS组织中无性繁殖从而限定其变异性的大量组织。本发明描述了依靠神经干细胞分化的子代获得的CNS模型系统，其中包括CNS细胞的多种类型，包括神经元、星形细胞和少突神经胶质细胞。利用这一模型系统可筛选神经剂或其他生物剂的作用，以及在正常或患病供体的多潜能神经干细胞和干细胞衍生子代中分析基因的表达。

Description

中枢神经系统(CNS)功能和 机能障碍的体外模型

发明背景

成熟的人体神经系统由几十亿细胞构成，这些细胞是在发育过程中由位于神经管的少量前体产生而来。对中枢神经系统(CNS)发育途径，以及因机能障碍引发的成体哺乳动物中枢神经系统中质变的研究，由于哺乳动物CNS的复杂性而变得困难。用相对简单的CNS模型在确定条件下将会使这些问题得到较好研究。

通常采用两种方法研究培养的CNS细胞：使用原始神经培养物和用神经细胞系。哺乳动物原始神经培养物可来自几乎所有的脑部位，只要原材料取自胎儿或新出生动物。一般可产生三类培养物：富集的神经元，星形细胞或少突神经胶质细胞。已证明原始CNS培养物在发现许多神经功能的机理方面有价值，并被用来研究外源物质对发育中的细胞和成熟细胞的影响。CNS的原始培养物有许多优点，但存在两个主要缺陷。首先，由于原代神经细胞的增殖能力有限，新的培养物必须自几个不同的动物体增殖而来。虽然通常很注意去从相同的发育阶段和相同的脑部位获取组织，但要产生相同的原始培养物实际上是不可能的。因此，培养物与培养物之间存在着很大程度的差异。

原始培养物第二个不足之处，是必须从胎儿或早期新出生动物中获取组织。如果原始培养作为一种常用手段，这就需要有大量原材料来源。虽然这对某些种(如啮齿类动物)来说，增殖原始培养物并不是一个问题，但对其他动物(如灵长类动物)来说却是问题。由于供给的有限和伦理方面的原因，培养来自灵长类动物(人和非人的灵长类)的原代细胞是不实际的。

由于原代神经细胞的增殖能力有限，以前未能繁殖大量的同质细胞以用于神经功能、机能障碍和药物设计/筛选的研究。因此，采用细胞系来研究能大量繁殖而用于体外研究CNS功能的同质细胞群。神经细胞系的增殖可分为两类：1)自发形成的肿瘤，和2)专门设计的细胞系。

在自发形成的肿瘤中，神经生物学中研究得最多的可能是大鼠嗜铬细胞瘤(PC12)细胞，它能在神经生长因子(NGF)作用下分化成类似交感神经的神经元。这些细胞已被证实是一个有用的模型，用于研究生长因子对神经的发育和变化(分子和细胞的)影响的机理。神经母细胞瘤和神经胶质瘤细胞系已被用来研究神经元和神经胶质的功能(Lies等1987；Nister等，1988)。胚胎性癌(EC)细胞来自胎儿胚细胞的畸胎瘤，并能分化成大量的非神经细胞类型，有些细胞系(如P19细胞，Jones-Villeneuve等，1982)能分化成神经细胞(McBumey等，1988)。人的畸胎瘤衍生的细胞系NTera 2/cl.D1，它有类似于CNS神经元前体细胞的表型，在视黄酸存在时能被诱导分化。但分化成的细胞限于神经元表型[Pleasure和Lee(1993)，“神经科学研究杂志”(J.Neurosci.Res.35：585-602)]。虽然这些类型的细胞系能够增殖大量细胞，以供筛选外源物质对细胞存活或功能的影响，但由于这些细胞系的永生化，它们不适合于用作细胞程序死亡的研究，细胞程序死亡即哺乳动物细胞的自然程序死亡。此外，这些细胞系类型所能产生的有限的数目、有限的表型特征以及尚未清楚的永生化(可能以尚未明确的方式影响细胞的功能)，使它们作为神经功能的体外模型和在研究发现新的治疗法方面不太理想。

另一种产生自发细胞系的方法是有目的地构建永生化的原代细胞，通过导入癌基因而改变细胞的遗传组成，以此诱导细胞无限扩增。这一方法已被许多研究小组采用，以增殖大量感兴趣的神经细胞系(Bartlett等，1988；Frederiksen等，1988；Trotter等，1989；Ryder等，1989；Murphy等，1991，Almazan和Mckay，1992)。虽然这些细胞系在研究发生于细胞测定和分化过程中的决定方面，以及测试外源物质的影响方面可能有用，但它们仍有几方面缺陷。首先，加入癌基因而改变细胞的扩增状况会影响细胞其他特性(癌基因在细胞中除了调节细胞周期外可能还有其他作用)。这可以通过Almazan和Mckay(1992)的研究，以及视神经的少突神经胶质细胞前体因永生化而不能分化成II型星形细胞(正常的视神经少突神经胶质细胞可以)得到很好说明，作者提示，永生化抗原的出现可能改变细胞分化成星形细胞的能力。

另一个采用有目的构建的永生化细胞的缺陷在于：神经系统由几十亿个细胞构成，可能包含数千种不同细胞类型，每一种都有独特的基因表达和环境反应类型。一种专门设计的细胞系是单一母细胞永生化和其克隆扩增的结果。虽然可增殖出大量的一种类型的神经细胞，但这一方法没有考虑不同细胞类型中细胞的相互作用。此外，虽然可能将来自特定脑部位的一些细胞永生化，但由于缺少其细胞能用癌基因改造的对照，因而不可能对所需的一个细胞进行永生化。因此，虽然专门设计的细胞系与自发生成的肿瘤相比有一些优点，但仍有几个缺陷，对于了解CNS功能和机能障碍不太理想。

本发明概述

现有技术方法在提供大量的遗传上未改变的神经细胞，以用于研究CNS发育和功能，以及用于测定潜在治疗剂治疗CNS机能障碍的作用方面存在着缺陷，因此，需要改进CNS模型系统，使之能用于这些目的。

因此，本发明的一个目的是提供一种CNS模型系统，用于研究神经的发育和功能，以及测定新的治疗法和其他生物剂对CNS的作用。本发明的目的是使这样一种CNS系统能够从各个种所得的少量原材料增殖成大量细胞。所述种包括各年龄段的人，包括成年人。

本发明的一个目的是提供一种CNS模型系统，其包含的细胞为非自发形成的肿瘤，也不是通过插入癌基因以诱导无限繁殖的、有目的永生化细胞，因而消除了遗传改变对正常细胞功能影响的任何问题。

另一个目的是提供一种细胞来源于克隆的CNS模型，因此，代表了一个细胞群，它从模型的一次使用到下一次使用过程中细胞的变异程度低。

本发明的另一目的是提供一种CNS模型系统，其中的细胞增殖效应于一种外在的信号分子或几种分子的结合作用，这些分子可随意加入或去掉。

另一目的是提供一种CNS模型系统，其中增殖了的细胞可维持在未分化状态，并且在需要时可分化成哺乳动物CNS的三种主要细胞类型(神经元，星形细胞和少突神经胶质细胞)。

本发明的一个目的是提供一种CNS模型系统，依靠该系统，使CNS细胞的分化和功能研究能够在多种类型细胞组成的系统中，以可控方式进行——类似于活体内情形。

再一个目的是提供一种CNS模型系统，依靠它，可以从出生前和出生后的个体包括成体中繁殖CNS干细胞，使试验能基于单一个体进行。

本发明的一个目的是使基因表达分析能在正常供者的CNS干细胞和干细胞衍生子代中，以及在神经疾病患者的细胞中进行。

通过以下具体说明和所附权利要求，本发明其他的目的和特点能为本领域熟练技术人员所明了。

在一个实施例中，通过测定一种神经剂或其他生物剂，或者将神经剂和/或其他的生物剂相结合对神经细胞的影响的方法，实现上述目的。所述方法包括将含有至少一个多潜能干细胞的哺乳动物神经组织进行解离，把所述的解离后多潜能干细胞培养在含有至少一种生长因子的培养基上，增殖干细胞以获得产自于细胞的前体细胞，再将前体细胞与一种生物剂或几种生物剂相结合，测定这一生物剂或几种生物剂对所述前体细胞的影响。在另一实施例中，在含有一种生物剂或几种生物剂的条件下增殖干细胞，测定这一生物剂或这几种生物剂对干细胞及其增殖的影响。

在本发明的另一实施例中，哺乳动物神经组织取自一名患神经疾病或神经障碍的供体。

在另一个实施例中，增殖的前体细胞在这种生物剂或几种生物剂相结合的存在条件下诱导其分化。在又一个实施例中，在加入这种生物剂或几种生物剂前，对干细胞产生的子代细胞进行诱导，使其产生分化。附图的简要说明

图1.表皮生长因子(EGF)效应细胞的增殖：经2天体外培养的EGF效应细胞开始增殖(图1A)。经4天体外培养出现小的细胞群(图1B)，连续增殖的细胞群继续长大(图1C)直至它们升离基质而漂浮于悬浮液中(图1D)。在这一阶段，漂浮的球体很容易取走和解离成单个细胞，并且在EGF存在下，增殖可重新开始。(标尺50μm)。

图2.来源于单个EGF-产生小球的细胞分化成神经元、星形细胞和少突神经胶质细胞：采用微管相关蛋白(MAP-2)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和O4(一种细胞表面抗原)的抗体三重标记的免疫细胞化学法，在来自原始培养物的单个EGF-产生球体(图2A)中，分别检测神经元(图2B)、星形细胞(图2C)和少突神经胶质细胞(图2D)的存在。(标尺50μm)。

图3.与纹状星形细胞共培养的神经球的标记：图3A显示生长在星形细胞饲养层中8天的神经球的相关视野。神经球细胞的溴脱氧尿苷(Brd-U)标记显示出实际上所有细胞中都掺入了Brd-U(图3B)。图3C显示饲养层细胞的相差视野。饲养层细胞的GFAP标记显示：饲养层中细胞的大部分是星形细胞(GFAP-IR)(图3D)。经分化，BrdU标记的神经元(图3E和3G)对神经肽Y(NPY)(图3F)，或生长激素释放抑制因子(图3H)，及其他的神经递质，如谷氨酸和蛋氨酸脑啡肽(未显示)具免疫反应性。

图4.在脑衍生神经营养因子(BDNF)的存在下从一个神经球产生的神经元数目的增加：从单个EGF效应的干细胞产生的神经球，经体外培养天数(DIV)10天后神经元平均数目定量结果显示：在没有BDNF时，每一神经球增殖11.46±1.21个神经元。当培养基中含BDNF(10ng/ml)时，神经元数目(每一神经球为22.34±2.33个神经元)明显增加(P＜0.5)。

图5.在BDNF存在下神经元突起旁枝的增强：将在不含BDNF(图5A)和含有BDNF(图5B)的体外培养10天的神经球固定，并用γ-氨基丁酸(GABA)抗血清进行间接免疫细胞化学处理，生长在含有BDNF的多数神经元轴突伸长，与未用BDNF处理的神经球相比表现出大而复杂的分枝类型。

图6.一个神经球的细胞选择性群体对于BDNF的效应：采用间接免疫细胞化学法研究立即早期基因的产物c-fos显示，单一克隆来源的神经球中几乎所有细胞都对EGF(20ng/ml)刺激出现反应，这可从c-fos免疫反应性增加的测定中可看出(图6A)。用核抗原c-fos的抗血清和一种直接抗神经元特异性抗原β-微管蛋白的抗体进行双重标记的免疫细胞化学研究证明：当用β-微管蛋白抗血清(图6C)测定时，BDNF作用60分钟会导致c-fos的选择性表达(图6B)，主要为神经元细胞群。

图7.基础成纤维细胞生长因子(bFGF)和成骨蛋白2(BMP-2)对EGF产生的神经球增殖的影响：将分离自14天的胚胎期小鼠纹状体的细胞植板于96孔板中，浓度为25000细胞/ml，含有EGF(20ng/ml)、EGF+bFGF(各20ng/ml)或EGF+BMP-2(分别为20和10ng/ml)。经10DIV后，对EGF处理过的培养物定量显示：每孔(n＝8)增殖23±1.33个神经球。bFGF能促进EGF刺激的增殖作用，使每孔(n＝8)神经球数增至54.5±2.17，而BMP-2阻碍了EGF效应的细胞增殖(n＝8)。

图8.通过紫外透射显现乙锭琼脂糖凝胶，表明了在未分化和分化的干细胞衍生的子代中生长因子转录产物的检测结果：每一块凝胶的第一泳道为1kb的标准分子量梯。标明C的第二道是阴性对照，代表在没有任何cDNA模板时的PCR产物。第三道标明U是未分化的神经球的RT-PCR。标明D的第四道是分化的干细胞衍生子代的RT-PCR。存在表皮生长因子受体、成纤维生长因子受体和白血病抑制因子受体时，分别用EGF-R、FGF-R和LIF-R表示。

图9.由bFGF产生的神经元的电生理特性：图9A显示在膜片记录之前，一个显示两极形态的推定神经元的数字成像。图9B是在撤去脉冲电极后，带5-羧基荧光素的同一神经元的荧光数字成像。图9C是图9A和图9B中所述的由bFGF产生的神经元在注入电流时产生的分级动作电位。

发明的详细描述

对中枢神经系统(CNS)的神经干细胞(此处称为“CNS干细胞”)已有报道，并对其潜在用途有所披露(Reynolds和Weiss，“科学”(Science)255：1707[1992]；Reynolds等“神经科学杂志”(J.Neurosci.)12：4565[1992]；Reynolds和Weiss，“恢复神经学和神经科学”(Restorative Neurology and Neuroscience)4：208[1992]；Reynolds和Weiss，“神经元细胞的死亡和修复”(Neuronal CellDeath and Repair)，Cuello编[1993])。“干细胞”一词指相对静止未分化细胞，它可从胚胎、幼体或成体组织中获得，能增殖和自我维持而产生大量的子代细胞。神经干细胞的应用披露于待批的申请U.S.S.N.08/270,412；07/961,813；08/221,655；08/010,829和08/149,508。同其他哺乳动物组织中的干细胞一样，CNS干细胞也具有干细胞的突出特征，即自我维持。细胞的自我维持指该细胞能够产生自身克隆，因而能长时间维持其表型。

干细胞的子代在此指“前体细胞”，由两类细胞组成：a)新的干细胞和b)能够分化成功能细胞的祖细胞。

“祖细胞”是指来源于CNS干细胞的未分化细胞。祖细胞具有限的增殖能力，不能自我更新。祖细胞通过特殊的分化途径，在适当的条件下，分化成出现在CNS中的不同类型细胞，这些细胞包括神经元和胶质细胞。胶质细胞包括星形细胞和少突神经胶质细胞。

“少突神经胶质细胞”指分化的胶质细胞，它在中枢神经系统(CNS)中形成髓鞘质包围的轴突。少突神经胶质细胞的表型为半乳糖脑苷脂(+)，髓鞘质基础蛋白(+)和胶质原纤维酸性蛋白(-)[Gal C(+)，MBP(+)，GFAP(-)]。“星形细胞”指表型为GFAP(+)，Gal C(-)和MBP(-)的分化的胶质细胞，它具有一扁平原生质/成纤维细胞样形态，或能表现出带星状突起的形态。“神经元”指分化的神经元细胞，其表型为：神经元特异性烯醇化酶(+)、神经丝(+)、微管相关蛋白(+)、Tau-1(+)或β-微管蛋白(+)[NSE(+)、NF(+)、MAP-2(+)、Tau-1(+)或β-tub(+)]。因此，这里所用的“神经干细胞”或“CNS干细胞”是指多潜能干细胞，它能增殖产生更多的多潜能干细胞和祖细胞，它们能分化成神经元、星形细胞和少突神经胶质细胞。

神经干细胞能从哺乳动物CNS中分离和体外培养，方法可采用在以下实施例1或上述待批的申请中所述的方法。简要来说，将从哺乳动物(如人、猴、大鼠、小鼠等)组织中所得的干细胞，培养在至少含一种生长因子的确定的无血清培养基中。这里所用的“生长因子”指一种蛋白质、肽或其他分子，它们对干细胞和/或祖细胞有生长、增殖、分化或营养作用，可以用来诱导增殖的生长因子包括任何能使细胞增殖的因子，包括任何结合到细胞表面受体上、能对细胞产生生长诱导或存活影响的分子。这些因子包括：酸性和碱性基础成纤维细胞生长因子(aFGF和bFGF也被称为FGF-2)、血小板衍生生长因子(PDGF)、促甲状腺素释放激素(TRH)、表皮生长因子(EGF)、类EGF的配位体、双调蛋白、转化生长因子α(TGFα)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、纤毛神经营养因子(CNTF)、胶质衍生神经营养因子(GDNF)、类胰岛素生长因子1(IGF-1)等等。一种优选的生长因子是EGF，还有bFGF或将EGF和bFGF结合起来。用于调节干细胞和祖细胞发育的生长因子，它们除了促进增殖外，还对细胞有调节作用，这些生长因子包括：转化生长因子β(TGFβ)、视黄酸、活化素、成骨蛋白(BMP)、纤毛神经营养因子(CNTF)和巨噬细胞发炎蛋白(MIP-1α、MIP-1β、MIP-2)。

在生长因子存在下，一个多潜能干细胞可诱导分裂产生未分化的一团细胞，在此称为“神经球”。神经球主要包括多潜能干细胞和祖细胞。神经球细胞在此被统称为“前体细胞”。在体外，前体细胞通常生长成神经球形态，但也会因不同的培养条件和培养技术而出现不同的生长型。首先，神经球细胞对GFAP、NF、NSE或MBP无免疫反应性。但细胞具nestin(+)的表型特征，这是一种见于未分化的CNS细胞的中间丝状蛋白。nestin标记的特征描述见Lehndahl等“细胞”(cell)60：585-595(1990)。与细胞类型相关的成熟表型特征大多为nestin表型阴性，其中这些类型的细胞是从神经球细胞的子代中分化而成。

在分裂素如EGF等的继续存在下，神经球内的前体细胞继续分裂，结果使神经球变大和未分化细胞[nestin(+)，GFAP(-)，NF(-)，NSE(-)，MBP(-)]数量增多。在这一阶段，细胞为非粘附的，倾向于形成神经球特有的自由漂浮簇。经过6-7 DIV，神经球细胞能被解离。几乎所有的细胞附着在组织培养基质上。在生长因子的继续存在下，干细胞开始分裂，并升离基质，形成由无性繁殖细胞组成的新的自由漂浮神经球。因此，利用这一增殖、解离、再增殖方法，可在体外产生无限量的无性繁殖的前体细胞。

当去掉促分裂的生长因子后，干细胞的增殖就停止。未分化的细胞球能够粘附到如聚鸟氨酸处理过的塑料或玻璃基质上，在这些基质上细胞开始分化成神经元和胶质细胞。因此，生长因子起到一种外源信号分子的作用，它能随意加入或去除以控制增殖程度。

当促分裂的生长因子被去掉后，对生长因子能发生反应的干细胞子代可以在饲养层上共培养。有很多类型的饲养层可以应用，如：成纤维细胞、神经元、星形细胞、少突神经胶质细胞、肿瘤细胞系、遗传上改变了的细胞系或者是具生物活性特点的任何细胞或基质。饲养层通常产生较广范围的表型特征。在这种情况下，饲养层作为一种基质以及膜的结合和可溶性两种因子的来源，这些因子诱导和改变干细胞产生的子代的分化。例如，与较为惰性的物质如聚鸟氨酸相比，星形细胞饲养层能诱导出较广范围的神经元表型，这可通过间接免疫细胞化学法在7DIV时测定。当在由含1％胎牛血清的聚-L-鸟氨酸涂层的基质上分化时，神经元的表型几乎都是γ-氨基丁酸(GABA)能的或P物质能的。当在星形细胞饲养层上分化时，除了GABA能的神经元和P物质能的神经元外，还出现含生长激素释放抑制因子、神经肽Y(NPY)、谷氨酸和蛋氨酸-脑啡肽的神经元。星形细胞可来源于各种不同脑部位，如纹状体、皮层和脊髓的组织。

一旦去掉了生长因子，培养基中可含有血清，如0.5-1.0％的胎牛血清(FBS)。血清有助于分化过程和增强细胞存活能力，特别是当进行分化的细胞生长在低密度下时。

去掉生长因子后1-3天之内，将细胞放在有助于分化和存活的条件下，多数或全部的前体细胞开始失去对nestin的免疫反应性，并开始表达神经元、星形细胞或少突神经胶质细胞的特异性抗原。神经元的鉴定是用对NSE、NF、β-tub、NeuN(一种核抗原)、MAP-2和神经元特异性蛋白Tau-1的免疫反应性进行证实。星形细胞和少突神经胶质细胞的区分采用对GFAP和Gal C的免疫反应性进行鉴定。不表达神经元或星形细胞特异抗原的细胞，开始以恰当的瞬时方式表达少突神经胶质细胞特异性标记。即细胞首先对O4(一种表面抗原)和Gal C(一种髓鞘糖脂)产生免疫反应性，最后对MBP产生免疫反应性。这些细胞也具有特征性的少突神经胶质细胞的形态。

神经元也可以根据其特异性的神经递质表型和其形态的分析进行鉴定。采用单一、双重或三重标记的免疫荧光和免疫过氧化物酶的方法，分化的神经球培养物可用于分析神经递质的表达，或在某些情况下可用于分析对神经递质合成起作用的酶。或者可用对肽神经递质或神经递质合成酶mRNA特异的cDNA或RNA探针，进行原位杂交组织化学研究。这些技术可与免疫细胞化学方法相结合，以加强某些表型的鉴定。必要时，上述抗体和分子探针可分别应用于蛋白质印迹和Northern印迹步骤中，以助于细胞鉴定。

除了能从胚胎CNS的任何部位分离对EGF有效应的干细胞外，也可用常规的活组织检查法，从幼体和成体的各种CNS部位中分离CNS干细胞，这些部位包括脊髓圆锥，颈部、胸部和腰脊髓，脑干，下丘脑和纹状体。在上述各种情况下，分离的CNS干细胞表现出自我维持的性质，并能产生大量的能分化成神经元、星形细胞和少突神经胶质细胞的祖细胞。因而，多潜能干细胞出现在成体哺乳动物CNS中多个部位。CNS干细胞也可以从机能障碍的CNS组织；如早老性痴呆症(Alzheimer′s Disease)、帕金森病(Parkinson′sDisease)或唐氏综合症(Down′s Syndrome)的患病组织中分离到。

上述前体细胞可用于测定生物剂对神经细胞影响的方法中。“生物剂”指任何能对神经细胞产生作用，而无论这种作用是有害、有益或其他作用的物质，如：病毒、蛋白质、肽、氨基酸、脂、碳水化合物、核酸、核苷酸、药物、前体药物或其他物质。对神经细胞有益的生物剂此处称为“神经剂”，它包含任何能证明其对CNS细胞的增殖、存活、分化和/或功能有潜在作用，或者对神经性疾病或障碍治疗有潜在作用的生物学或药物学上的活性物质。例如，这一词可以包含某些神经递质、神经递质受体、生长因子、生长因子受体等，以及这些物质合成中所用的酶。

为测定一种潜在生物剂对神经细胞的作用，可用源自多潜能干细胞的前体细胞培养物，其中的多潜能干细胞取自患CNS疾病或障碍的的宿主，也可以用取自正常组织的培养物。培养物的选择取决于受试的具体的生物剂和所希望取得的效果。一旦从所需的供体组织中获得细胞，就在生长因子的存在下进行体外增殖。

按实施例1方法生长细胞用于测定生物剂对干细胞和祖细胞的增殖和存活的作用。例如，这些方法可能用于筛选增加祖细胞增殖能力的生物剂，这些祖细胞可用于繁殖大量细胞以供移植。这些方法也可能用于筛选抑制前体细胞增殖的生物剂。在这些研究中，将前体细胞植板于含有感兴趣的生物因子培养基中，并测定其发生的增殖程度(实施例4)。可以确定一个生物剂或多种生物剂结合对祖细胞和其子代细胞分化和存活的影响(实施例3)。也可能筛选在筛选之前已经被诱导分化的神经细胞。还可能在分化之前应用生物剂作用于前体细胞，以确定生物剂对分化过程的影响。通常将生物剂溶解，以不同浓度加入培养基中以测定其在不同剂量时的作用。培养基中可以每隔两天补加生物剂，以使生物剂的浓度在某种程度上保持恒定。

利用这些筛选方法，有可能通过测定生物剂对干细胞和祖细胞的增殖、祖细胞的分化或分化的CNS细胞的存活和功能的作用，来筛选对出生前和出生后的CNS细胞产生副作用的潜在药物。增殖后的前体细胞通常以5-10×10⁶细胞/ml浓度植板。如果需要测试生物剂对一种特定分化了的细胞类型或某一细胞组成的作用，可以通过分离不同类型的细胞调控分化后神经元与胶质细胞的比例。例如，O4抗体(可从Boerhinger Mannheim公司得到)结合少突神经胶质细胞及其前体。运用淘选方法，可将少突神经胶质细胞分离开，星形细胞可以用RAN2抗体(可从ATCC得到)经结合步骤而淘选出来。破伤风毒素(可以Boerhinger Mannheim公司得到)可用于选出神经元。通过改变分化时加入培养基中的营养因子，有可能有目的地改变表型的比例。这些营养因子包括：EGF、FGF、BDNF、CNTF、TGFα、GDNF等等。例如，在待批的申请U.S.Ser.No.08/22 1,655中公开了FGF能增加神经元的比例，CNTF能增加少突神经胶质细胞的比例。将培养物培养在不同CNS部位所得的胶质细胞的支持组织中，也会影响上述的分化过程。也可以用待批的申请U.S.Ser.No.08/482,079中所述方法，获得富集多巴胺能的神经元的培养物。这些培养物可用于试验那些影响多巴胺能的细胞功能和存活的生物剂。分化后的培养物至少能维持活的状态(表型完整)一个月。

从早老性痴呆症、帕金森氏病、唐氏综合症等患者异常的CNS组织中获得的培养物，可用于测试生物剂对异常组织的影响。例如，从帕金森氏病患者所得的培养物可用于试验多巴胺能的细胞的诱导。从早老性痴呆症或唐氏综合症病人所得的培养物，可用于测定生物剂对淀粉样前体蛋白(APP)含量的影响，APP含量在这些病人中异常高。此外，从早老性痴呆症(一种胆碱能相关疾病)患者所得的组织可用于测定生物剂对胆碱能神经元诱导的影响。

生物剂的作用隔时测定，按照相对于对照培养物的明显差别进行评价，所用的标准例如：基因表达中表达的表型比例(神经元：胶质细胞或神经递质或其他标记)、细胞生活力、增殖、改变和/或细胞程序死亡的程序。细胞的物理特性可以通过显微镜观察细胞和轴突的形态以及生长状况来分析。一些蛋白质如酶、受体和其他细胞表面分子，或者神经递质、氨基酸神经肽和生物胺新的表达诱导或含量增加的表达诱导，可以通过本领域所公知的任何可鉴定出这些分子含量改变的技术进行分析。这些技术包括用抗这些分子的抗体的免疫组织化学或生物化学分析技术。这些生物化学分析包括：蛋白质测定、酸促分析、受体结合试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、电泳分析、高效液相色谱分析(HPLC)、蛋白质印迹和放射免疫试验(RIA)。核酸分析如Northern印迹和聚合酶链式反应(PCR)可用于检测编码这些分子的mRNA含量，或合成这些分子的酶。基因组DNA可用标准方法定量和用于作为细胞程序死亡指示的DNA序列梯程度的分析(即DNA酶专一性降解)。

涉及干细胞增殖和干细胞子代的增殖、分化和存活，和/或这些细胞对生物剂效应的因子，可以应用本领域所知的技术，从不同发育阶段的干细胞或干细胞子代中，以构建cDNA文库的方式分离。从一个发育阶段所得的文库与其他不同阶段的文库相比较，以确定发育期间基因表达的序列，揭示CNS细胞中各种生物剂的作用或改变基因表达的新的生物剂。当从机能障碍的组织中构建成文库时，通过比较机能障碍组织的文库与正常的组织，可以鉴定出在机能障碍过程中起作用的遗传因子。这一资料可用于治疗疾病的方案设计。此外，可确定探针以用于各种遗传疾病的诊断或用于鉴定特殊发育阶段的神经细胞。

电生理分析可用于测定生物剂对神经元特性，如静息膜电位、引发电位、电流方向和离子特性以及离子通道动力学的作用。这些测定可采用本领域所知的任何技术，包括胞外单一单位电压记录、胞内电压记录、电压箝和膜片箝。也可用电压敏感染料和离子敏感电极。

为使此处所述的本发明更好地被理解，对以下实施例进行了阐述。人们应该明了，这些实施例仅仅是为了例证的目的，而不应认为是以任何方式限定本发明的范围。

实施例1

前体细胞的繁殖

将胚胎期第14天(E14)的CD₁白化病小鼠(从Charles River获得)以无菌操作断头，取出脑和纹状体。将组织用火焰加工光滑的巴斯德吸管机械解离到无血清培养基中，其组成为Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)和F-12营养混合液(Gibco产品)1∶1的混合物。细胞在800转/分(r.p.m)下离心5分钟，吸出上清液，细胞重悬于DMEM/F-12培养基中进行计数。

将细胞悬浮于无血清培养基(以下称“完全培养基”)中，其组成为DMEM和F-12(1∶1)，其中包括葡萄糖(0.6％)，谷氨酰胺(2mM)，碳酸氢钠(3mM)，HEPES(4-[2-羟乙基]-1-哌嗪乙磺酸)缓冲液(5mM)，和特定的激素和盐混合物(以代替血清)。这一混合物包括胰岛素(25μg/ml)、运铁蛋白(100μg/ml)、孕酮(20nM)、腐胺(60μM)和氯化硒(30nM)(除谷氨酰胺为Gibco产品外，其余均为Sigma产品)。此外，培养基中含16-20ng/ml EGF(从小鼠下颌纯化而来，购自Collaborative Research)或TGFα(人的重组体，Gibco产品)。将细胞以0.2×10⁶细胞/ml浓度。植板于75cm²的经不含底物预处理的组织培养瓶(Corning)中，置于温度箱37℃，温度100％，95％空气/5％CO₂下培养。

当细胞增殖的开始48小时和体外培养天数(DIV)3-4天时，细胞形成小簇，即“神经球”，在4-6DIV间升离基质(图1)。神经球含有未分化的前体细胞，即干细胞和祖细胞。

经7 DIV后，取出神经球，在400rpm下离心2-5分钟，在2ml完全培养基中用上述巴斯德吸管将沉淀机械解离成单个细胞。将1×10⁶细胞再植板于含EGF的20ml完全培养基的75cm²的组织培养瓶中。重新开始干细胞的增殖和新的神经球的形成。这一过程可每隔6-8天重复一次。

实施例2

神经球的分化

神经球的分化用下列示例。用以下的任何示例将产生神经元、星形细胞和少突神经胶质细胞。但加入某些生长因子或某些生长因子组合物可改变分化后所得的表型比例。此外，用神经胶质饲养支持组织可影响所得的表型比例。用于下列各示例的神经球的繁殖如实施例1所述。所有应用的神经球在分化之前至少传代1次。

示例1—神经球的快速分化

第一次传代后6-8天，取出神经球在400r.p.m下离心。吸出含EGF的上清液，将沉淀悬浮于含1％胎牛血清(FBS)的无EGF完全培养基中。

将神经球(约0.5-1.0×10⁶细胞/孔)植板于24孔Nuclon(1.0ml/孔)培养皿中的含聚-L-鸟氨酸涂层(15μg/ml)的玻璃盖玻片上。经24小时培养，将盖玻片转移到含0.5％FBS的完全培养基的12孔(Costar)培养皿上。每隔4-7天换一次培养基。这一分化过程称为“快速分化示例”或RDP。

示例2—解离的神经球的分化

第一次传代后6-8天，取神经球400rpm离心。吸去含EGF的培养基，将沉淀悬浮于含1％FBS的无EGF完全培养基中。用上述巴斯德吸管将神经球机械解离成单个细胞，并在800r.p.m下离心5分钟。将0.5×10⁶-1.0×10⁶细胞植板于24孔Nuclon(1.0ml/孔)培养皿中含聚-L-鸟氨酸涂层的(15μg/ml)玻璃盖片上。含1％FBS的无EGF培养基每隔4-7天换一次。

示例3—单个神经球的分化

通过系列转移经过无EGF培养基的方法，将神经球洗成不含EGF。单个神经球植板于24-孔板中的含聚-L-鸟氨酸涂层(15μg/ml)的玻璃盖玻片上。所用的培养基是含有或不含1％FBS的完全培养基，每隔4-7天换一次。三重标记的免疫细胞化学法显示：所有三种神经细胞，即神经元、星形细胞和少突神经胶质细胞都从单一神经球无性繁殖而来(图2)。

示例4—解离的单个神经球的分化

通过换无EGF培养基系列转移将神经球的EGF洗去，在一个0.5mlEppendorf离心管中将一个神经球用机械方法解离，并将所有细胞植板于35mm的经聚-L-鸟氨酸涂层的培养皿上。用含或不含1％FBS的完全培养基。

示例5—与纹状体星形细胞共培养的神经球的分化

将如实施例1所述的来自纹状体细胞的神经球用5-溴脱氧尿苷(Brd U)标记，并洗去EGF。将从出生后(0-24小时)小鼠的纹状组织中繁殖产生一个星形细胞饲养层，植板于24-孔培养皿中含聚-L-鸟氨酸涂层的玻璃盖玻片上。当星形细胞铺满时，将一个解离的或完整的神经球置于每一星形细胞支持组织上，第一次24小时换完全培养基，以后每隔48小时换一次。当在星形细胞饲养层上分化时，除了有GABA能和P物质能的神经元外，还出现含生长激素释放抑制因子、NPY、谷氨酸和蛋氨酸脑啡呔的神经元(图3)。

实施例3

各种作用的药物或其他生物剂的筛选

A.BDNF对神经元和神经胶质细胞分化和存活的作用

如实施例1所述繁殖前体细胞，分化采用实施例2中示例3所述的方法。在进行EGF-产生细胞的植板时，加入浓度为10ng/ml的BDNF。在体外培养天数(DIV)为3、7、14、21天时，细胞进行间接免疫细胞化学测定。用BrdU标记探测前体细胞的增殖。通过识别存在于神经元(MAP-2、NSE、NF)、少突神经胶质细胞(O4、Gal C、MBP)或星形细胞(GFAP)抗原的抗体检测培养物，以测定BDNF对神经元、少突神经胶质细胞和星形细胞的作用。在各时间点对免疫反应性细胞计数以测定细胞存活，并作形态观察。与对照条件相比较，BDNF可显著增加神经元的分化和存活数(图4)，而星形细胞和少突神经胶质细胞数目与对照值相比无显著改变。

B.BDNF对神经表型分化的作用

将按A部分所述方法用BDNF处理后的细胞，用能识别神经递质或涉及神经递质合成的酶的抗体检测。这些神经递质或酶类包括酪氨酸羧化酶(TH)、胆碱乙酰转移酶(ChAT)、P物质、GABA、生长激素释放抑制因子和谷氨酸。在对照和BDNF处理过的这两种培养条件下，检测神经元中P物质和GABA存在结果为阳性(图5)。生长在BDNF中的神经元与对照组相比较(图6)轴突伸展和分枝明显增加，并且数目增多。

C.对生长因子效应细胞的鉴定

通过实施例2示例3的方法和在1 DIV时加入约100ng/ml BDNF鉴别EGF-产生的子代细胞，以鉴定对生长因子处理有效应的细胞。在加入BDNF后1、3、6、12和24小时固定细胞，并用双重标记的免疫细胞化学法进行分析。识别神经元(MAP-2、NSE、NF)、少突神经胶质细胞(O4、GalC、MBP)或星形细胞(GFAP)的抗体，与识别c-fos和/或其他立即早期基因的一种抗体结合使用。用BDNF处理导致神经元细胞中c-fos表达的选择性增加(图6)。

D.BDNF对增殖和分化期间标记和调节因子表达的作用

按A部分所述方法将细胞用BDNF处理，然后按实施例5所述分析FGF-R1的表达，或者按照实施例6所述对其他标记和调节因子进行分析。

E.分化期间使用BDNF对神经元电生理特性的作用

将按照A部分所述方法、在分化期间用BDNF处理神经元，按实施例7所述方法，测定它们的电生理特性。

F.氯普马嗪对由生长因子作用产生的干细胞子代的增殖、分化和存活的作用

氯普马嗪(Chlorpromazine)是一种治疗精神病中广为使用的药物。将它以10ng/ml至1000ng/ml的浓度范围代替上述实施例3A至3E中的BDNF使用。测定该药物在不同浓度下对干细胞增殖和干细胞子代分化和存活的作用。测定分化的神经元基因表达和电生理特性的改变。

G.deprenyl对多巴胺能的细胞分化、存活的作用

用实施例1的方法制备原始培养物。分化细胞以增加多巴胺能的神经元的数目。将从原始产生的培养6天的单个未解离神经球，植板在来源于大鼠B-49神经胶质细胞系的条件培养基(75％)+20ng/ml FGF-2的完全培养基中涂有聚-L-鸟氨酸的玻璃盖玻片上，温育在37℃、湿度100％、95％空气/5％CO₂的条件下。deprenyl是用于治疗帕金森病的一种药物，将它在分化开始和/或分化开始以后以1ng/ml至1000ng/ml的浓度范围加入培养物中。将存活的多巴胺能的细胞间隔时间计数，并与对照培养物比较。此外，进行生化分析以测定神经递质表达和进行核酸分析。

实施例4

干细胞增殖试验

原代细胞取自E14小鼠，按实施例1所述制备。将EGF、EGF+FGF或EGF+BMP-2加入完全培养基中，除BMP-2以10ng/ml浓度加入外，其他各生长因子浓度都用20ng/ml。细胞用其中一种制备好的含生长因子的培养基稀释至浓度25,000细胞/ml。将200μl细胞/培养基结合物吸入用不含底物预处理的96-孔板(Nuclon产品)的每一孔中。细胞在与实施例1相同条件下温育。

经8-10DIV，对神经球计数并把结果制成表。如图7所示，生长在含EGF和FGF结合作用下的细胞比生长在只含EGF的细胞产生的神经球数明显要多。EGF和BMP-2相结合抑制神经球的发育。

实施例5

用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)比较未分化的和分化的干细胞衍生的子代中受体和生长因子的表达。

如实施例1所述制备神经球，其中一些按实施例2示例1进行分化。未分化或已分化的神经球RNA的分离按照Chomzynski和Sacchi的硫氰酸胍酸性苯酚的方法进行[“分析生物化学”(Anal.Biochem.)162：156-159，1987]。互补DNA(cDNA)的合成是用逆转录酶以寡脱氧胸苷(oligo dT)引导从总RNA合成。设计和合成基因特异性引物，并将这些引物用于PCR，以扩增不同生长因子和生长因子受体的cDNA。扩增的材料与分子量标准参照物一起进行琼脂糖凝胶电泳，确定PCR产物为所预计的分子量，同时通过限制性酶分析和测序验证PCR片段[Arcellana-Panlilio，“酶学方法”(methods Enzymol.)225：303-328(1993)]。图8是乙锭染色的琼脂糖凝胶通过紫外透射的一张照片，显示在未分化的和分化的干细胞衍生的子代中检测三种生长因子受体转录产物，即EGF-R，FGF-R和LIF-R。表1列出了分析引物对以及未分化的和分化的细胞的结果。

表1  分析的引物对

	未分化细胞	分化的细胞
			肌动蛋白(Actin)	+	+
神经生长因子(NGF)	+	nd
			表皮生长因子rm(EGFrm)	+	+
基础成纤维细胞生长因子r(bFGFr)	+	+
			白血病抑制因子rm(LIFrm)	+	+
酪氨酸羟化酶	+	+
			胆碱乙酰转移酶m	nd	+
缩胆囊肽m	nd	+
			脑啡肽m	nd	+
酪氨酸激酶-rA	+	+
			酪氨酸激酶-rB	+	+++++
酪氨酸激酶-rC	+	+

r＝受体

m＝来源于小鼠

nd＝无可用数据

实施例6

有关神经干细胞增殖和分化的新标记和调节因子的分离

用CD1白化病小鼠(来自Charles River)的CNS组织按实施例1所述方法制备神经球。让其中一些神经球按照实施例2中快速分化示例分化，产生富含神经元、星形细胞和少突神经胶质细胞的培养物。按照实施例5所述的硫氰酸胍酸性苯酚方法从未分化的和分化的细胞中提取总RNA。信使RNA(mRNA)是利用其Poly A序列与U或T的序列的亲和性进行分离。由mRNA逆转录产生的cDNA，接着在质粒[Rothstein等“酶学方法”(Methodsin Enzymology)225：587-610(1993)]或λ噬菌体载体中构建初级文库。为分离出对未分化或已分化的干细胞衍生子代特异性的cDNA，将其中一段cDNA与其他的RNA杂交，反之亦然。那些不杂交的，因而是培养类型特异性的cDNA接着用于构建扣除文库[Lopez-Fernandez和delMazo，“生物技术”(Biotechniques)15(4)：654-658(1993)]，或用于筛选初级文库。

干细胞衍生的未分化细胞特异的和分化细胞特异的cDNA文库，为涉及CNS干细胞增殖和分化的新标记和调节因子提供了克隆来源。通过测序分析研究特异性cDNA以检测特异性基序作为同一性或功能的线索，以及作为与已知转录产物同源检索的数据库。用cDNA与经琼脂糖甲醛凝胶电泳、并转至尼龙膜的RNA样品杂交，可估算大小、相对丰度和转录产物的特异性。将cDNA序列的全部或部分用于筛选其他文库，以获得全部mRNA序列或基因组序列信息。以免疫细胞化学或蛋白质印迹分析方法，用直接针对产自特异cDNA的融合蛋白的抗体检测对特定细胞群特异的蛋白质。用特异的基因序列分离那些与推断的控制基因表达的调节因子相互作用的蛋白质。这些调节因子然后被用于控制一个外源基因如β-半乳糖苷酶的表达。

实施例7

产生于生长因子效应干细胞并且在生物剂作用下的神经元的电生理分析

如实施例1所述制备神经球，然后的实施例2示例2所述技术进行解离。这些克隆繁殖的细胞以低浓度植板，并在bFGF存在下分化。细胞的电生理特性和伴随的神经元形态特征按Vescovi等[“神经元”(Neuron)11：951-966(1993)]所述方法进行测定。在全细胞电流夹下，平均静息电位和输入电阻为-62±9mV和372±MΩ。矩形阈上电流阶(～100pA)引出再生电位反应，其中的幅度和时间过程依赖于刺激(图9)。完成电生理实验后，细胞形态通过5-羧基荧光素在胞内激发而显现。

实施例8

测定药物或其他生物剂对从神经疾病患者组织产生的对生长因子有效应的干细胞子代的影响

用实施例3中A至E方法，测定BDNF对亨廷顿病(Huntington′s disease)患者活组织检查时所得的CNS组织来源的对EGF有效应的干细胞子代的影响。BDNF是GABA能的神经元强分化因子，并能促进神经元分枝的伸展(图5B)。亨廷顿病的特征为纹状体中失去GABA能的神经元(仍有其他神经元)。

实施例9

通过生长因子调节淀粉样前体蛋白(APP)

从唐氏综合症胎儿中取CNS组织，用实施例1的方法产生神经球，并传代至获得所需细胞数量。用实施例2中所述任意示例方法分化细胞。植板时，将CNTF、BMP-2、活化素、FGF-2或视黄酸以10ng/ml浓度，加入到实验孔的培养基中，并且每隔一天加入2ng/ml。经3、7和14DIV，测定APP mRNA和蛋白质的含量。用异硫氰酸胍/氯化硒的方法[Goodison等，“神经病理学与实验神经病学杂志”(J.Neuropathol.Exp.Neurol.)52(3)：192-198(1993)]提取RNA用于Northern印迹分析。进行Northern印迹，并用编码APPKPI蛋白酶抑制剂功能域的人cDNA或一段30bp的对APP695有特异性的寡核苷酸探针进行检测。为进行蛋白质印迹分析，将细胞在Laemmli缓冲液中匀浆，煮沸并进行SDS-PAGE凝胶电泳。凝胶进行免疫印迹并用1:1000稀释的抗-APP进行检测。与对照培养物比较APP mRNA和蛋白质表达的含量。

实施例10

用增殖的神经干细胞子代分析细胞程序死亡

A.自发性细胞程序死亡的分析

用实施例1方法制备进行增殖的小鼠神经球，在培养3、5、7、9、12和15天后收获。用实施例2示例1的方法分化小鼠神经球并于培养1、4、7、10、13和16天后收集。细胞在1ml DNAzol试剂(Gibco/BRL产品)中裂解，用500μl乙醇沉淀后从溶液中收集基因组DNA。在260nm处用光密度定量基因组DNA。作为细胞程序死亡的指示的DNA序列梯的范围，是通过将250ng DNA溶于50μl的含100mM二甲基胂酸钾(pH7.2)、2mMCoCl₂、0.2mM DTT、50μCi[α³²P]dATP和25单位的末端脱氧核苷酸转移酶溶液进行检测。反应在37℃下温育60分钟。放射性产物以2％琼脂糖凝胶和放射自显影进行分析。正在增殖和已分化的神经球培养物的形态学和生化分析表明：随着培养天数的增加，活跃进行自发性细胞程序死亡的细胞数从少于20％变化至大于50％。

B.神经元干细胞培养物中细胞程序死亡的潜在调节因子的RT-PCR分析

已知的推断出的细胞程序死亡调节因子的活性通过RT-PCR分析确定。用实施例1和2的方法制备鼠神经元干细胞培养物中正在增殖和分化了的子代。对已知的推断出的细胞程序死亡调节性mRNA转录产物进行逆转录-PCR分析。细胞裂解于1ml RNAzol试剂(Gibco/BRL)中，加入0.2倍体积的氯仿分离有机相和水相，再通过加入等体积异丙醇进行沉淀而将总RNA从水相中分离出来。以260nm和280nm的光密度进行RNA定量。在25μl20mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM KCl、0.2mM dNTPs、1.5mM MgCl₂、0.5μM引物和1.25单位Taq聚合酶中进行0.5μl逆转录产物的聚合酶链反应分析。典型循环参数为94℃30秒、60℃30秒和72℃1分钟，重复30循环。对三十多个神经元细胞程序死亡的潜在调节物进行分析，包括生长因子成员、生长因子受体、转录因子、Bcl-2蛋白族成员和蛋白酶中的白细胞介素转化酶族。检测每一蛋白族中被不同表达的蛋白。

C.神经元细胞程序死亡未知的潜在调节物的检测和克隆

利用mRNA指纹分析确定对神经元细胞程序死亡有潜在调节作用的未知转录产物的活性。按上述方法制备和收集鼠神经元干细胞培养物中正在增殖和已分化的子代，并进行推断出的未知细胞程序死亡调节分子的mRNA指纹分析。将细胞裂解于1ml RNAzol试剂(Gibco/BRL产品)，加入0.2倍体积氯仿分离有机相和水相，加入等体积异丙醇沉淀分离水相中的总RNA。以260nm和280nm的光密度测RNA量。按上面所述进行逆转录和聚合酶链反应分析。放射性产物在8％丙烯酰胺测序凝胶上分离，并以放射自显影进行分析。将表达不同的带从凝胶上割下，重新扩增并测序。

D.建立遗传上修饰过的干细胞用于抗-细胞程序死亡化合物的高流通量测定

对人和鼠的神经元干细胞进行遗传修饰，以便为用于潜在治疗的抗细胞程序死亡的化合物提供一种高流通量的测试系统。用大量直接转染技术，将含有细胞程序死亡调节分子启动子(包括Bcl-2、ICE和Nur-77)控制的胞质(绿色荧光蛋白(GFP)或分泌的碱性磷酸酶(SEAP))标记蛋白的DNA构建体，稳定地转化到鼠和人的神经元干细胞中。为了用脂质转染胺试剂(BRL产品)进行转化，将细胞以每个35mm培养平板上接种2-3×10⁶细胞的量进行接种，与200μl DNA-脂质体复合物(200μl培养基中含3μgDNA和20μl脂质转染胺试剂(BRL产品))一起在37℃温育12小时。各种化合物对神经元细胞程序死亡的作用，是通过化合物的应用对标记基因的表达的作用来确定的，其中标记基因的表达是在已知的细胞程序死亡调节基因的启动子控制之下，通过荧光(GFP)或分泌的碱性磷酸酶活性(SEAP)体现出来。

提到的所有文献和待审的申请引入此文作为参考。

Claims (36)

1.一种测定至少一种生物剂对神经前体细胞作用的方法，包括：

(a)解离含有至少一种多潜能干细胞的哺乳动物神经组织，

(b)在至少含一种生长因子的培养基中增殖所述的多潜能干细胞，以获得增殖的前体细胞培养物，

(c)用所述的生物剂接触所述的增殖的前体细胞，和

(d)测定所述生物剂对所述前体细胞的作用。

2.如权利要求1的方法，其中所述生长因子选自由EGF、bFGF，或者为EGF和bFGF相结合组成的一组生长因子。

3.如权利要求1的方法，其中所述的培养基是确定的。

4.如权利要求1的方法，其中所述的哺乳动物神经组织取自出生后的哺乳动物。

5.如权利要求1的方法，其中所述的哺乳动物神经组织取自一个人体供体。

6.如权利要求5的方法，其中所述人体患有神经疾病或神经障碍。

7.如权利要求6的方法，其中所述生物剂对所述的神经疾病或障碍是一种潜在治疗剂。

8.如权利要求7的方法，其中所述的神经疾病或障碍选自由早老性痴呆病(Alzheimer′s Disease)、帕金森氏病(Parkinson′s Disease)或唐氏综合症(Down′sSyndrome)组成的一组。

9.如权利要求1或6的方法，其中所述的步骤(d)的作用，是通过比较接触过所述生物剂的步骤(c)的增殖的前体细胞的基因文库与未接触过所述生物剂的步骤(b)的增殖的前体细胞的基因文库而确定的。

10.一种测定至少一种生物剂对神经细胞分化作用的方法，包括：

(a)解离含有至少一种多潜能干细胞的哺乳动物神经组织，

(b)在含有至少一种生长因子的第一种培养基中，增殖所述的多潜能干细胞，以获得经增殖的前体细胞培养物，

(c)在含有所述生物剂的第二种培养基中，诱导所述经增殖的前体细胞分化，和

(d)测定所述生物剂对所述前体细胞分化的作用。

11.如权利要求10的方法，其中所述生长因子选自由EGF、bFGF，或者EGF和bFGF相结合组成的一组生长因子。

12.如权利要求10的方法，其中所述第一种培养基是确定的。

13.如权利要求10的方法，其中所述哺乳动物神经组织取自一个幼体或成体。

14.如权利要求10的方法，其中所述哺乳动物神经组织取自一个人体供体。

15.如权利要求16的方法，其中所述人体患神经疾病或障碍。

16.如权利要求16的方法，其中所述生物剂是所述神经疾病或障碍的一种潜在治疗剂。

17.如权利要求16的方法，其中所述的神经疾病或障碍选自由早老性痴呆病(Alzheimer′s Disease)、帕金森氏病(Parkinson′s Disease)或唐氏综合症(Down′sSyndrome)组成的一组疾病。

18.如权利要求10或15的方法，其中所述的步骤(d)的作用是通过比较接触过所述生物剂的步骤(c)的增殖的前体细胞的基因文库与未接触过所述生物剂的步骤(b)的增殖的前体细胞的基因文库而确定的。

19.如权利要求10的方法，其中所述的增殖的前体细胞在一种营养因子存在下被诱导分化，以控制所述已分化细胞的表型。

20.权利要求10的方法，其中所述第二种培养基包含一种神经胶质饲养细胞层。

21.一种测定至少一种生物剂对分化的神经细胞作用的方法，包括：

(a)解离含至少一种多潜能干细胞的哺乳动物神经组织，

(b)在含有至少一种生长因子的第一种培养基上增殖所述多潜能干细胞，以获得增殖的前体细胞培养物，

(c)在第二种培养基中诱导所述增殖的前体细胞分化，以获得分化的神经细胞培养物，

(d)将所述的分化的神经细胞与一种生物剂接触，和

(e)测定所述生物剂对所述分化的神经细胞的作用。

22.如权利要求21的方法，其中所述生长因子选自由EGF、bFGF或者EGF和bFGF相结合组成的一组生长因子。

23.如权利要求21的方法，其中所述第一种培养基是确定的。

24.如权利要求21的方法，其中所述哺乳动物神经组织取自一个幼体或成体。

25.如权利要求21的方法，其中所述的哺乳动物神经组织取自一个人体供体。

26.如权利要求25的方法，其中所述的人体患一种神经疾病或障碍。

27.如权利要求26的方法，其中所述的生物剂是所述神经疾病或障碍的一种潜在治疗剂。

28.如权利要求26的方法，其中所述的神经疾病或障碍选自由早老性痴呆病、帕金森氏病或唐氏综合症构成的一组疾病。

29.如权利要求21或26的方法，其中所述的步骤(e)的作用是通过比较接触过所述生物剂的步骤(d)的分化的神经细胞的基因文库与未接触过所述生物剂的步骤(c)的分化的神经细胞的基因文库而确定的。

30.如权利要求21的方法，其中所述增殖的前体细胞在营养因子的存在下诱导其分化，以控制所述分化了的细胞的表型。

31.如权利要求21的方法，其中所述的第二种培养基含有一种神经胶质饲养细胞层。

32.一种从神经细胞制备的cDNA文库。

33.如权利要求32的cDNA文库，其中所述神经细胞为神经干细胞。

34.如权利要求32的cDNA文库，其中所述神经细胞为前体细胞。

35.如权利要求32的cDNA文库，其中所述神经细胞为分化了的细胞，选自由神经元、星形细胞和少突神经胶质细胞组成的一组细胞。

36.如权利要求32的cDNA文库，其中所述的神经细胞来源于患神经疾病或障碍的人体。

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