KR102018313B1 - 환자 맞춤형 줄기세포 치료제의 스크리닝 방법 - Google Patents

환자 맞춤형 줄기세포 치료제의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 환자 맞춤형 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 환자 맞춤형 치료제의 스크리닝 방법을 이용 시, 질병 아형별 또는 질병 작용 인자에 대한 각기 다른 유래의 중간엽 줄기 세포의 치료능을 확인하고 이를 선별할 수 있다. 또한, 선별된 중간엽 줄기 세포가 분비하는 단백질을 분석하여 고효율 또는 저효율적으로 작용하는 분비 단백질의 특성을 확인할 수 있어, 환자 개개인의 질병 특이성에 대한 맞춤형 치료제를 제안할 수 있는 장점이 있다.

Description

환자 맞춤형 줄기세포 치료제의 스크리닝 방법{Method of screening for patient-specific stem cell treating agent}
본 발명은 환자 맞춤형 줄기세포 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
질환을 치료하기 위한 다양한 치료제가 개발되고 있으나, 질환별로 상이한 양상을 나타내고 있을 뿐만 아니라, 동일한 질환에도 다양한 종류의 유전적 특성을 가진 질환 유발 세포들이 존재하기 때문에, 동일한 질환을 가진 환자라 하더라도, 환자에 적합한 치료제는 상이할 수 있다.
하나의 치료제가 특정 질환 세포를 사멸시켜 치료 효과를 나타낸다 하더라도, 다른 유전적 특성을 가진 질환 유발 세포들까지 모두 사멸시키지는 못하기 때문에, 특정 환자에 적합한 치료제가 다른 환자에서는 치료 효과를 나타내지 못할 수도 있으며, 오히려 질환을 심화시키는 역효과를 유발할 수도 있다.
이와 같은 문제점을 해결하고자, 다양한 질병 유발 기전을 연구하고 이를 치료하기 위한 여러 약제들이 개발되고 있으나, 어떤 질환에 어떤 약제를 사용해야 목적하는 치료 효과를 나타낼 수 있는지 여부를 결정하는데 별도의 표준적인 방법은 보고되지 않은 상태여서, 치료제로 사용하는데 제약이 있는 실정이다.
따라서, 환자의 질환이 동일하다 하더라도 질환을 유발하는 변이가 환자마다 상이할 수 있으므로 환자 특이적 변이에 적합한 치료제를 선별하는 것이 매우 중요한 문제로 대두되고 있으며, 환자 맞춤형의 치료제를 스크리닝하기 위한 방법 확보가 필요한 실정이다.
본 발명의 발명자들은 환자 특이적인 맞춤형 치료제를 선별하기 위한 방법에 대하여 연구하던 중, 환자 유래의 세포와 후보군인 중간엽 줄기세포를 공동 배양하고, 공동 배양에 따른 환자 유래 세포의 변화를 확인하는 경우, 환자 또는 질병 특이적으로 우수한 효과를 나타내는 줄기세포를 빠르게 선별할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 환자 맞춤형 줄기세포 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (1) 환자 유래 세포 및 후보 줄기 세포를 공동 배양하는 단계; 및 (2) 환자 유래 세포의 증식능, 분화능 또는 병리학적 마커의 변화를 측정하여 줄기 세포를 선별하는 단계; 를 포함하는 환자 맞춤형 줄기세포 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 환자 맞춤형 줄기세포 치료제의 스크리닝 방법을 이용 시, 질병 아형별 또는 질병 작용 인자에 대한 각기 다른 유래의 중간엽 줄기 세포의 치료능을 확인하고 이를 선별할 수 있다. 또한, 선별된 중간엽 줄기 세포가 분비하는 단백질을 분석하여 고효율 또는 저효율적으로 작용하는 분비 단백질의 특성을 확인할 수 있어, 환자 개개인의 질병 특이성에 대한 맞춤형 치료제를 제안할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 알츠하이머형 치매(AD) 뉴런 세포에 우수한 치료 효과를 나타내는 줄기세포를 선별하기 위한 스크리닝 모델의 공동 배양 방법에 대한 개략적인 모식도를 나타낸 도이다.
도 2는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(UCB-MSC), 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(WJ-MSC) 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포(Adipose-MSC) 처리군에서 세포 활성 정도를 확인하여 세포 사멸 방지 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(WJ-MSC) 처리군의 분비 단백질을 기능별로 분류한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 지방 유래 중간엽 줄기세포(Adipose-MSC) 처리군의 분비 단백질을 기능별로 분류한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 알츠하이머형 치매 아형별 줄기세포 치료제 스크리닝 모델 구축 방법을 나타낸 도이다.
도 6은 지방 유래 중간엽 줄기세포(Adipose-MSC) 처리군 또는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(WJ-MSC) 처리군에서 APP-NPC 또는 PS-1-NPC의 SOX2 및 Nestin의 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 지방 유래 중간엽 줄기세포(Adipose-MSC) 처리군 또는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(WJ-MSC) 처리군에서 APP-NPC 또는 PS-1-NPC의 MAP2 및 Tuj1(Neuron-specific class III beta-tubulin) 의 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 알츠하이머 아형 유래 PS1-NPC, sAD(Sporadic AD)-NPC 와 지방 유래 중간엽 줄기세포(Adipose-MSC) 처리군 또는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(WJ-MSC) 처리군의 공동 배양에 따른 세포 증식능을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 알츠하이머 아형 유래 PS1-NPC, sAD-NPC 와 지방 유래 중간엽 줄기세포(Adipose-MSC) 처리군 또는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(WJ-MSC) 처리군의 공동 배양에 따른 세포 증식능을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 알츠하이머 아형 유래 PS1-NPC, sAD-NPC 와 지방 유래 중간엽 줄기세포(Adipose-MSC) 처리군 또는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(WJ-MSC) 처리군의 공동 배양에 따른 병리학적 인자 유비퀴틴 접합체의 발현 변화를 비교하고 정량화한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 알츠하이머형 치매 환자 유래 뉴런을 이용한 줄기세포 치료제 스크리닝 모델 구축 방법을 나타낸 도이다.
도 12는 알츠하이머 환자 유래 뉴런과 지방 유래 중간엽 줄기세포(Adipose-MSC) 처리군 또는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(WJ-MSC) 처리군의 공동 배양에 따른 유비퀴틴 접합체의 발현 변화를 비교하고 정량화한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 (1) 환자 유래 세포 및 후보 줄기 세포를 공동 배양하는 단계; 및 (2) 환자 유래 세포의 증식능, 분화능 또는 병리학적 마커의 변화를 측정하여 줄기 세포를 선별하는 단계; 를 포함하는 환자 맞춤형 줄기세포 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 스크리닝 방법은 환자 세포에 가장 효과를 나타낼 수 있는 줄기세포를 빠르게 선별할 수 있도록 하므로, 환자 맞춤형 줄기세포 치료제를 스크리닝하여 치료제로 개발하는데 효과적으로 이용할 수 있다. 이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 (1) 단계는 환자 유래 세포 및 후보 줄기 세포를 공동 배양하는 단계이다.
본 발명에 있어서 “환자 유래 세포”란, 환자로부터 분리, 수득된 세포를 의미하며, 환자로부터 직접 분리되었기 때문에 개별 환자가 가지고 있는 유전적, 병리적 인자를 모두 반영할 수 있는 특징을 가진 세포를 의미한다. 따라서 환자 유래 세포에 효과를 나타내는 선별된 줄기세포 치료제는 환자에서도 우수한 효과를 나타낼 것으로 기대할 수 있다.
상기 환자 유래 세포는 각 질병 아형을 갖는 환자로부터 유래된 세포일 수 있으며, 이를 이용하는 경우, 특정 질병 아형에 대하여 특히 효과를 갖는 줄기세포 치료제를 효과적으로 선별할 수 있다.
본 발명의 환자 유래 세포는 신경계 질환 환자 유래 세포, 바람직하게는 퇴행성 뇌질환 환자 유래 세포일 수 있으며, 상기 신경계 질환 환자 유래 세포는 퇴행성 뇌질환 환자 또는 이의 아형별 환자로부터 유래된 역분화 줄기 세포(Induced Pluripotent Stem Cell, iPSC), 신경 세포 또는 신경 전구 세포일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "퇴행성 뇌질환"은 뇌와 척수의 특정 뇌세포군이 서서히 그 기능을 잃고 뇌신경계의 정보전달에 가장 중요한 뇌신경세포의 사멸, 뇌신경세포와 뇌신경세포 사이의 정보를 전달하는 시냅스의 형성이나 기능상의 문제, 뇌신경의 전기적 활동성의 이상적 증가나 감소로 인하여 야기되는 질환이다. 퇴행성 뇌질환은 나타나는 주요 증상과 침범되는 뇌부위를 고려하여 구분되며, 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 파킨슨병(Parkinson's disease; PD), 헌팅톤병(Huntington's disease: HD) 등이 포함된다.
따라서 본 발명의 퇴행성 뇌질환은 건망증, 치매, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환 및 헌팅턴 질환으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 있어, 상기 “후보 줄기세포” 란, 가장 우수한 효과를 나타내는 줄기세포를 선별하기 위한 목적으로 이용하는 줄기세포 집단을 의미한다. 후보 줄기세포 중 다른 줄기세포와 비교하여 환자 유래 세포에 가장 우수한 효과를 나타내는 세포를 환자 맞춤형 줄기세포 치료제로 선별할 수 있다.
상기 (1) 단계의 후보 줄기세포는 제대혈, 탯줄, 골수, 지방, 태반, 와튼 젤리(Wharton jelly) 및 편도로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에서 유래될 수 있다. 본 발명의 목적 상, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포일 수 있다. 본 발명의 스크리닝 방법에 따르면 환자 특이적, 아형 특이적으로 가장 우수한 효과를 나타내는 줄기 세포를 선별할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 알츠하이머 환자 유래 세포를 이용하여 후보 줄기세포와 공동 배양하고, 각 후보 줄기세포가 알츠하이머 환자 유래 신경전구세포, 신경세포에 미치는 영향을 분석하고, 알츠하이머의 병리학적 상태를 개선하기 위해서는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포가 적절하며, 신경세포의 증식을 목적으로 하는 경우, 지방 유래 중간엽 줄기세포보다는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 선별하여 이용하는 것이 바람직함을 확인하였다.
본 발명의 (1) 단계의 공동 배양은 트랜스 웰을 이용하여 이루어질 수 있다. 예컨대 본 발명의 일 예에서는 트랜스 웰의 챔버의 상단에 환자 유래 세포를, 트랜스 웰 챔버의 하단에 후보 줄기세포를 접종하여 배양하는 방법을 제공한다. 이와 같이 배양하는 경우, 환자 유래 세포와 후보 줄기세포의 상호작용에 의하여, 후보 줄기세포에서는 환자 유래 세포에 영향을 줄 수 있는 다양한 물질을 분비할 수 있으며, 이를 통해 환자 유래 세포는 세포의 생장 증가가 촉진되거나, 병리학적 마커의 발현이 감소되거나, 세포 분화가 촉진 될 수 있다.
본 발명에서 용어 "배양"은 세포를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미하며, 바람직하게는 트렌스 웰에서 배양이 수행될 수 있다.
상기 환자 유래 세포 및 후보 줄기 세포는 통상의 배지에서 생육 가능하다. 상기 배지는 특정 세포를 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 세포가 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다. 상기 환자 유래 세포 및 후보 줄기 세포는 통상의 배양방법에 따라 배양할 수 있다.
상기 (1) 단계의 공동 배양은 약 5일 내지 14일, 바람직하게는 5일 내지 10일 동안, 더욱 바람직하게는 5일 내지 7일 동안 이루어질 수 있다. 이 때 배양액은 2 내지 3일 주기로 교체하는 것이 바람직하다.
본 발명의 (2) 단계는 환자 유래 세포의 증식능, 분화능 또는 병리학적 마커의 변화를 측정하여 중간엽 줄기 세포를 선별하는 단계이다.
상기 (2) 단계의 선별이란, 환자 유래 세포의 증식능, 분화능 또는 병리학적 마커의 변화를 측정하여, 다른 후보 줄기세포보다 목적하는 변화를 현저하게 유도할 수 있는 줄기세포를 환자 또는 질병 아형 맞춤형 줄기세포 치료제로 선택하는 것을 의미하며, 목적하는 변화는 세포의 증식을 촉진하거나, 분화를 촉진하거나, 병리학적 마커의 발현을 억제하는 변화를 제한없이 포함할 수 있다.
환자 유래 세포가 신경계 질환, 예컨대 퇴행성 뇌질환 환자 유래 세포인 경우, 상기 (2) 단계의 증식능은 신경계 질환, 예컨대 퇴행성 뇌질환 환자 유래 세포의 생존율 측정을 통해 확인할 수 있으며, 분화능은 MAP2 (microtubule associated protein 2), NF-200(neurofilament 200), Tuj1(Neuron-specific class III beta-tubulin) 및 VGLUT2(vesicular glutamate transporter 2) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 신경세포 분화 마커의 발현 측정을 통해 확인하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 (2) 단계의 병리학적 마커의 변화는 유비퀴틴 접합체, 아밀로이드 베타 및 타우 단백질, 염증 관련 사이토카인 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 병리학적 마커 발현 측정을 통해 확인하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 (2) 단계의 선별 단계 이후, (3) 상기 (2) 단계의 선별된 줄기 세포의 분비 단백질을 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 목적 상, 상기 줄기 세포의 분비 단백질은 기능별로 분류하여 특이적으로 발현된 분비 단백질을 선별할 수 있다. 예컨대 후보 줄기세포 중 환자 유래 세포와 공동 배양 시 환자 유래 세포의 증식을 현저하게 촉진하는 줄기세포가 선별된다면, 해당 선별된 줄기세포에서 분비되는 단백질을 농축, 분석하여 어떤 단백질이 증식을 현저하게 촉진할 수 있는지를 확인할 수 있다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 알츠하이머형 치매에 효과를 나타내는 중간엽 줄기세포 스크리닝 모델 구축
1-1. 알츠하이머형 치매(AD)에 대한 중간엽 줄기세포의 치료능 확인을 위한 스크리닝 모델 구축
알츠하이머형 치매(alzheimer's disease, AD)에 대한 다양한 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cells, MSC)의 치료능을 비교 확인하기 위하여 스크리닝 모델을 구축하였다. 구체적으로, 도 1에 나타낸 바와 같이, 마우스의 해마 신경 세포주인 HT22를 트렌스 웰 하부의 MEM-alpha(minimum essential medium-alpha) 배지에 접종하였다. 그 후, 알츠하이머형 치매 특이 바이오 마커이고, 독성을 갖는 분자인 아밀로이드 베타 42(Amyloid beta 42)를 올리고머(oligomer) 형태로 상기 HT22 세포가 접종된 트렌스 웰 하부의 배지에 첨가하여, 세포 사멸을 유도하여 알츠하이머 치매 모델을 구축하였다. 그 후, 트렌스 웰 상부에 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(UCB-MSC), 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(WJ-MSC) 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포(Adipose-MSC) 각각 접종하여 공동 배양을 수행하였다. 대조군으로 MSC를 접종하지 않은 군을 설정하고, 상기 각기 다른 유래의 MSC에 의한 세포 사멸 방지 효과를 확인하였다. 구체적으로 분화능 마커인 MAP2 의 발현량을 형광을 통해 확인하였다. MAP2 단백질은 신경세포 분화시 신경 세포 말단까지 뻗어나가는 단백질로, 신경세포 사멸로 인해 세포의 말단이 손상되는지 여부를 확인하는 지표가 될 수 있다. 따라서 MAP2 의 형광 측정을 통해 MSC 공동 배양을 통해 세포가 사멸되는지 여부를 확인할 수 있으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(UCB-MSC), 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(WJ-MSC) 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포(Adipose-MSC)를 각각 접종하여 공동배양한 군에서 MAP2 의 형광 발현의 증가를 확인하였으며 세포 사멸을 방지하는 효과가 나타나, 알츠하이머형 치매에 대한 치료능이 나타남을 확인하였으며, 이를 통해 다양한 중간엽 줄기 세포의 치료능을 확인하고, 후보 중간엽 줄기 세포군의 효과를 비교 분석할 수 있음을 확인하였다.
1-2. 알츠하이머형 치매의 치료능과 관련된 중간엽 줄기세포의 분비 단백질의 확인
상기 1-1의 각 군의 공동 배양에 따라, 각기 다른 유래의 MSC가 분비한 단백질을 확인하기 위하여, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(UCB-MSC), 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(WJ-MSC) 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포(Adipose-MSC) 처리군의 트렌스 웰 하부의 배양액을 수집하고, 분비된 단백질의 농도를 높이기 위하여, 상기 수집한 배양액을 농축하였다. 그 후, 상기 농축된 각 군의 배양액에 대한 항체 어레이를 수행하였다. 그 후, 어레이 결과를 분석 프로그램을 이용하여 각각의 소스에서 2배 이상의 fold change를 보이는 단백질을 확인하였다. 그 후, fold change가 다양하게 나타난 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(WJ-MSC) 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포(Adipose-MSC) 처리군의 분비 단백질 중 신경 단백질을 따로 분류하였다. 그 후, 상기 신경 단백질을 기능별로 다시 분류하여, 상기 각 처리군이 분비한 신경 단백질의 특징을 확인하였다. 그 결과를 도 3 및 4에 나타내었다.
도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(WJ-MSC) 처리군과 지방유래 중간엽 줄기세포 (Adipose-MSC) 처리군에서는 상이한 단백질 분비 특성을 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(WJ-MSC) 에서는 신경계 발달, 신경세포 생성, 액손 가이던스와 같은 분비 단백질을 더 많이 분비하였으며 신경세포의 생존과 관련된 분비 단백질을 많이 분비함을 확인하였다. 또한 도 4에 나타낸 바와 같이, 지방 유래 중간엽 줄기세포(Adipose-MSC) 처리군은 신경계 발달, 신호전달 경로에 관여하는 단백질, 신경세포 생성과 관련된 단백질을 더 많이 분비하였으며, 세포 생존 및 증식과 관련된 단백질들을 많이 분비함을 확인하였다.
이러한 결과를 통해, 중간엽 줄기세포라도 질병 치료를 위해 분비하는 분비 단백질의 집단은 상이할 수 있으며 이를 통해 치료 효과를 나타내는 특정 중간엽 줄기 세포를 선별하여 환자 맞춤형 치료제를 스크리닝할 수 있음을 확인하였다. 예컨대, 알츠하이머형 치매 인자를 변화시킬 수 있는 맞춤형 MSC 치료제를 선별하기 위하여, 각기 다른 유래의 MSC 와 환자 유래 질병 세포를 공동 배양함으로써, 질병 마커를 감소시키거나 신경 세포 사멸을 방지할 수 있는 최적의 MSC를 스크리닝할 수 있다. 또한, 각기 다른 유래의 MSC가 분비하는 단백질을 파악하여, 알츠하이머형 치매에 효과를 나타내는 단백질을 선별할 수 있다.
실시예 2. 중간엽 줄기세포를 이용한 알츠하이머형 치매 아형별 스크리닝
상기 실시예 1의 스크리닝 모델을 바탕으로, 한국형 알츠하이머형 치매의 아형별 스크리닝 모델을 구축하기 위하여, 한국형 알츠하이머형 치매 아형별 환자 유래 신경전구세포(neural progenitor cell, NPC)에 대한 중간엽 줄기세포의 치료능을 확인하였다.
구체적으로, 실시예 1의 스크리닝 모델을 바탕으로, 도 5에 나타낸 바와 같이 알츠하이머 환자 유래 NPC (AD-NPC) 와 MSC 를 공동 배양하고 치료 효과를 나타내는 MSC 를 선별하였다. 먼저 트렌스 웰 하부를 PLO(poly-L-ornithine) 및 라미닌(laminin)으로 코팅하였다. 그 후, 한국형 알츠하이머형 치매 아형인 APP 또는 PS-1에 해당하는 환자의 신경전구세포 APP-NPC 또는 PS-1-NPC를 트렌스 웰 하부에 2.5x104/cm2로 접종하였다. 상기 신경전구세포들은 삼성서울병원에 방문한 치매 환자로부터 체세포를 채취하고 이를 역분화시켜 제조한 환자 특이적 세포이다. insert chamber에 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(WJ-MSC) 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포(Adipose-MSC)를 각각 접종하였고, 상기AD-NPC와 MSC의 비율은 10:3이 되도록 하였다. 상기 각 아형별 APP-NPC 또는 PS-1-NPC 를 접종하고 하루 뒤에 이의 배양 상태를 확인하고 분화 배지(Neurobasal A media + B27 w/o vit.A + Glutamax +ｐ/s + BDNF + NT3)에서 7일간 공동 배양을 진행하였다. 그 후, 상기 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(WJ-MSC) 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포(Adipose-MSC)의 줄기세포능, 분화능 및 병리학적 마커를 확인하였다. 줄기세포능, 분화능은 각각 1주일간 공동배양한 AD-NPC에서 SOX2/Nestin 마커의 발현 정도와 MAP2/Tuj1 의 발현정도를 웨스턴 블랏, 면역세포화학법으로 확인하였다. 그 결과를 도 6 및 7에 나타내었다.
도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(WJ-MSC)와 지방 유래 중간엽 줄기세포(Adipose-MSC) 는 각각 아형에 대하여 다른 정도의 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 3. 환자 유래 신경 전구체 세포를 이용한 줄기세포 치료제 스크리닝
환자 유래 NPC 에 대한 맞춤형 중간엽 줄기세포 스크리닝을 위하여, 알츠하이머형 치매인 sAD 또는 PS-1에 해당하는 환자의 sAD(sporadic AD)-NPC 또는 PS-1-NPC 와 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(WJ-MSC) 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포(Adipose-MSC)를 각각 공동배양하고, 각각의 줄기세포가 NPC에 미치는 영향을 확인하였다. 실험은 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다.
3.1 우수한 증식 촉진능을 갖는 중간엽 줄기세포 스크리닝 - CCK -8 어세이
탯줄 유래 중간엽 줄기세포(WJ-MSC) 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포(Adipose-MSC) 에 의한 환자 유래 NPC 증식 촉진 효과를 확인하기 위하여 CCK-8 세포 생존율 어세이를 48시간 동안 수행하고 그 결과를 현미경 사진 및 CCK 흡광도 변화를 통해 확인하였다. 실험에 사용된 bFGF 는 신경전구세포 배양 및 증식시 첨가되는 물질로 신경 전구세포의 분화를 막아 전구세포를 상태를 유지하기 위해 처리된다. bFGF 유무에 따른 세포의 상태 또는 증식 정도의 변화를 확인하기 위하여 bFGF 를 처리하였다. 대조군으로 -bFGF군을 이용하였으며 이는 중간엽 줄기세포를 공동 배양했을 때 증식 촉진 효과를 확인하는 실험에서의 음성대조군이다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 접종한 MSC 의 종류에 따라 NPC 의 증식은 상이하게 나타냈다. sAD-NPC 또는 PS-1-NPC 모두 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(WJ-MSC) 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포(Adipose-MSC) 에 의해 증식이 증가하였으나, 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(WJ-MSC)가 더욱 우수한 세포 증식 촉진능을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, 신경세포의 증식을 목적으로 하는 경우, 지방 유래 중간엽 줄기세포보다는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 선별하여 이용하는 것이 바람직한 것으로 해석할 수 있다.
3.2 우수한 증식 촉진능을 갖는 중간엽 줄기세포 스크리닝 - BradU 어세이
탯줄 유래 중간엽 줄기세포(WJ-MSC) 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포(Adipose-MSC) 에 의한 환자 유래 NPC 증식 촉진 효과를 확인하기 위하여 BradU 어세이를 48시간 동안 수행하고 그 결과를 확인하였다. 대조군은 3.1 과 동일하게 설정하으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 접종한 MSC 의 종류에 따라 NPC 의 증식은 상이하게 나타냈다. 특히 PS-1-NPC 는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(WJ-MSC) 및 지방 유래 중간엽 줄기세포(Adipose-MSC) 에 의해 증식이 현저하게 증가함을 확인하였다. 한편, sAD-NPC의 경우 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(WJ-MSC)에 의해 세포 증식이 촉진되었으나, 지방 유래 중간엽 줄기세포(Adipose-MSC)와의 공동 배양에서는 이와 같은 효과를 확인할 수 없었다. BruU 실험은 세포가 증식하면서 분열할? DNA 사이에 끼어들어가는 원리를 사용하는 것으로 증식 이외에 세포 자체의 대사 작용에 의한 간섭을 배제할 수 있으므로 보다 정확한 증식 촉진능의 스크리닝을 가능하게 한다. 따라서, 신경세포의 증식을 목적으로 하는 경우, 지방 유래 중간엽 줄기세포보다는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 선별하여 이용하는 것이 바람직한 것으로 해석할 수 있을 뿐만 아니라, 각 환자별 질병 아형에 따라 적절한 줄기세포 치료제 조합이 있고, 이를 본 발명의 스크리닝 방법에 의하여 신속하게 확인할 수 있음을 알 수 있다.
3.3 유비퀴틴 접합체를 감소시키는 중간엽 줄기세포 스크리닝
신경전구체 세포에 대하여 병리학적으로 영향을 미치는 중간엽 줄기세포를 스크리닝하기 위하여 유비퀴틴 접합체의 증감에 대한 영향을 확인하였다. 신경전구체 세포에서는 비정상적인 세포 내 물질들이 쌓일 경우, 유비퀴틴 접합체가 증가하며, 알츠하이머와 같은 질병이 발생하면 유비퀴틴은 증가하게 된다. 따라서 알츠하이머 환자 유래 NPC 와 지방 유래 중간엽 줄기세포 또는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포와의 공동 배양을 실시예 2 에 따른 방법으로 수행하고, 환자 유래 NPC 에서 유비퀴틴 접합체의 증감을 확인하였다. 유비퀴틴 접합체의 증감은 웨스턴 블랏을 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 알츠하이머 질병이 없는 대조군과 비교하여, sAD 에서는 유비퀴틴 접합체가 증가하였으며, 탯줄 유래 중간엽 줄기세포와의 공동 배양에 의하여 유비퀴틴 접합체의 수준이 감소됨을 확인하였다. 또한 이와 같은 유비퀴틴 접합체 감소 효과는 지방유래 중간엽 줄기세포에서는 확인되지 않았고, 오히려 증가하는 양상을 나타내어, 유비퀴틴 접합체 감소에 적절하지 않음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 스크리닝 방법을 통해 알츠하이머의 병리학적 상태를 개선하기 위해 적합한 중간엽 줄기세포는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포임을 확인하고 선별할 수 있다.
실시예 4. 신경세포를 이용한 줄기세포 치료제 스크리닝
4.1 스크리닝을 위한 신경세포와 중간엽 줄기세포의 공동 배양
알츠하이머 환자의 신경세포(뉴런)을 이용하더라도 본 발명에 의한 맞춤형 스크리닝을 적용할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 NPC 를 분화시켜 치매 아형별 신경세포을 얻고 이를 이용한 스크리닝을 수행하였다. 치매 아형은 유전적 아형인 APP (Amyloid Precursor Protein)의 mutation / PS1 (Presenilin 1)의 mutation / 비유전적 아형인 sAD (sporadic AD)를 사용하였으며, 환자 유래 역분화줄기세포 (iPSC)를 제조 후, 신경계열로 분화시킨 세포를 수득, 실험에 사용하였다.
스크리닝 방법은 실시예 2의 방법과 유사하나, MSC 와 신경세포를 공동배양하기 위하여, 한국형 알츠하이머 치매 아형별 NPC 를 2x104 / cm2의 비율로 접종하고 10주 동안 분화를 진행하여 치매 아형별 신경세포를 수득하였다. 수득된 치매 아형별 신경세포는 트렌스웰 하부에 2.5x104/cm2로 접종하였으며, insert chamber에 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(WJ-MSC) 또는 지방 유래 중간엽 줄기세포(Adipose-MSC)를 1x104 / cm2 가 되도록 각각 접종하였다. 이 후 1일 동안 신경세포의 배양상태를 확인한 후, 분화 배지 조건하에서 7일간 공동 배양을 진행하였다. 사용된 공동 배양 과정은 도 11에 나타내었다.
4.2 유비퀴틴 접합체를 감소시키는 중간엽 줄기세포 스크리닝
상기 4.1 의 방법을 통해 공동 배양을 진행하고, 3.3 과 같은 방법을 통해 알츠하이머 질환의 병리학적 특징을 효과적으로 감소시킬 수 있는 중간엽 줄기세포를 스크리닝하여 선별하였다. 대조군으로는 신경전구세포에서 신경세포로 분화 시 사용되는 시약인 BDNF, GDNF, NT3 만을 첨가한 실험군 (B+G+N) 을 이용하였으며, 실험군으로 MSC 와 신경세포를 공동배양하고 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 치매환자 유래 신경세포에서는 유비퀴틴 접합체가 증가하였으며, 지방 유래 중간엽 줄기세포 또는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포와의 공동 배양에 의하여 유비퀴틴 접합체의 수준이 감소됨을 확인하였다. 또한 이와 같은 유비퀴틴 접합체 감소 효과는 지방유래 중간엽 줄기세포보다는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에서 더욱 우수한 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 스크리닝 방법을 통해 알츠하이머의 병리학적 상태를 개선하기 위해 적합한 중간엽 줄기세포는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포임을 확인하고 선별할 수 있다.
상기와 같은 결과를 통해 본 발명의 환자 맞춤형 치료제의 스크리닝 방법을 이용 시, 환자 개개인의 질병 또는 이의 아형별로 가장 적합한 환자 맞춤형 줄기 세포 치료제를 선별하여 적용 가능함을 확인하였다.

Claims (4)

  1. (1) 알츠하이머 질병 아형인 APP (Amyloid Precursor Protein), sAD(sporadic AD) 또는 PS-1 (Presenilin 1) 환자 유래 신경 전구세포 또는 이로부터 분화시킨 신경 세포를 트랜스웰 하단에 접종하고, 후보 줄기 세포 집단에서 선택된 후보 줄기세포를 트랜스웰 상부에 접종하여 트랜스웰에서 공동 배양하는 단계; 및
    (2) 알츠하이머 질병 아형인 APP (Amyloid Precursor Protein), sAD(sporadic AD) 또는 PS-1 (Presenilin 1) 환자 유래 신경 전구세포 또는 이로부터 분화시킨 신경 세포의
    i) 증식능;
    ii) MAP2 (microtubule associated protein 2), NF-200(neurofilament 200), Tuj1(Neuron-specific class III beta-tubulin) 및 VGLUT2(vesicular glutamate transporter 2) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 신경세포 분화 마커의 발현 측정에 의한 분화능; 또는
    ⅲ) 유비퀴틴 접합체, 아밀로이드 베타 및 타우 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 병리학적 마커의 변화를 측정하여 후보 줄기세포 집단에서 알츠하이머 환자의 병리학적 상태 개선능이 우수한 질병 아형 맞춤형 중간엽 줄기세포를 선별하는 단계; 를 포함하는 알츠하이머 질병 아형인 APP (Amyloid Precursor Protein), sAD(sporadic AD) 또는 PS-1 (Presenilin 1) 맞춤형 줄기세포 치료제의 스크리닝 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계의 줄기세포는 제대혈, 탯줄, 골수, 지방, 태반, 와튼 젤리(Wharton jelly) 및 편도로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에서 유래된 것을 특징으로 하는, 알츠하이머 질병 아형인 APP (Amyloid Precursor Protein), sAD(sporadic AD) 또는 PS-1 (Presenilin 1) 맞춤형 줄기세포 치료제의 스크리닝 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (2) 단계의 증식능은 신경계 질환 환자 유래 세포의 생존율 측정을 통해 확인하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머 질병 아형인 APP (Amyloid Precursor Protein), sAD(sporadic AD) 또는 PS-1 (Presenilin 1) 맞춤형 줄기세포 치료제의 스크리닝 방법.
  4. 제1항에 있어서, (3) 상기 (2) 단계의 선별된 줄기세포의 분비 단백질을 분석하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머 질병 아형인 APP (Amyloid Precursor Protein), sAD(sporadic AD) 또는 PS-1 (Presenilin 1) 맞춤형 줄기세포 치료제의 스크리닝 방법.
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