JP2004511266A - 間葉間質細胞に対する治療的利用法 - Google Patents
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Abstract
ヒトの間葉間質細胞は、それぞれ乏突起膠細胞および神経細胞に分化するように誘導されうる。したがってこれらの細胞型に関しては、パーキンソン病、アルツハイマー病、卒中、および頭部外傷のような神経細胞の喪失によって、または、テイ−サックス病、G1ガングリオシドーシス、異染性白質ジストロフィー、および多発性硬化症のようなガングリオシドの蓄積もしくは脱ミエリン化における機能不全によって特徴づけられる中枢神経系の病状を治療する状況において、インビトロもしくはインビボのいずれかにおいてMSCが治療的供給源となることができる。
Description
【0001】
発明の背景
1.発明の分野
本発明は、神経細胞および乏突起膠細胞の機能不全または喪失にそれぞれ関係する中枢神経系(CNS)の病状を軽減するために、別個の種類の細胞を調製し利用することに関する。
【0002】
2.関連技術の説明
哺乳動物のCNSの二成分である乏突起膠細胞および神経細胞は有糸分裂を容易に行わず、したがって疾患や外傷によって引き起こされたそれらの喪失に対してインビボでは置換されない。例えばパーキンソン病には、ドーパミンを産生する脳の一部における神経細胞の喪失が関与する。ドーパミンレベルは結果として低下し、筋肉の震せん、筋肉および関節の硬直、ならびに全体的な協調性の欠如の発生となって現れる。別の神経崩壊性の疾患である多発性硬化症(MS)は、出生後の早期の成長段階で、乏突起膠細胞によって構成されるミエリンの軸策鞘が脱落することに特徴づけられる。この脱ミエリン化により、軸策に沿ったシグナル伝達が妨害され、視力障害、協調性の喪失、および記憶喪失までも引き起こされる。
【0003】
このような疾患の痛烈な効果は、CNSの神経細胞および乏突起膠細胞を含む支持細胞に細胞をインビトロで分化させるのに適応できる細胞系および培養条件に関する研究の動機となってきた。例えば、ラットのO−2A細胞である乏突起膠細胞の前駆体が増殖培地からマイトジェンを除去することによって、成熟乏突起膠細胞への分化を促しうることが調べられている。バレス(Barres)ら、Development 120: 1097(1994)。また、疎水性の細胞表面受容体に対する甲状腺ホルモン、糖質コルチコイドおよびレチノール酸などのリガンドが存在するのであれば、マイトジェンが存在する血清非含有培地で培養された場合には、ラットのO−2A細胞が成熟乏突起膠細胞に分化すると考えられる。同上。ヒトの奇形癌腫細胞系は「NT2」と称され、インビトロでの操作を行う複雑な管理下の手段によって6週間から10週間の期間の間に有糸分裂後のCNS神経細胞に分化できる。ユンキン(Younkin)ら、Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 90: 2174 (1993)。
【0004】
多能性神経幹細胞は神経細胞を得るための別の可能なルートである。したがって米国特許第5,851,832号は、神経細胞系統に分化できる能力があると言われる、前頭の側脳室の裏にある上衣下の領域から得られた構成的増殖細胞の亜集団を開示している。乏突起膠細胞または神経細胞に分化する能力があるものの、神経幹細胞を可能性を秘めている治療的利用に十分なほどの量で得ることは困難である。奇形癌腫誘導性のNT2系のような既知の細胞系が関わるこの事実および欠点は、乏突起膠細胞または神経細胞のレベルの減少によって特徴づけられる疾患を治療するために利用できる治療方法がほとんどないことを意味している。
【0005】
発明の概要
したがって本発明の目的は、神経幹細胞およびありきたりの細胞系とは無関係のそれぞれ分化した乏突起膠細胞および神経細胞に対する供給源を提供することにある。
【0006】
本発明の別の目的は、神経細胞および/または乏突起膠細胞の喪失によって特徴づけられた、CNSに影響する病状に対して実行可能な治療的アプローチを提供することにある。
【0007】
これらおよびその他の目的を達成する場合において、本発明の一局面によると、損傷を受けたミエリンまたは神経学的な変性によって特徴づけられる病状を治療するための方法であって、以下の段階を含む方法が提供される:(A)(i)間葉間質細胞、即ち「MSC」および(ii)それに対する生理学的適合性の担体から本質的になる組成物をインビトロで提供する段階;(B)MSCが神経細胞および/または乏突起膠細胞に分化するような条件に、前記組成物を曝露する段階;並びにその後(C)前記分化細胞が、問題となっている病状に罹患した患者における神経学的変性または損傷を受けたミエリンについて補償することを可能にする段階。好ましい態様ではこの組成物は、患者の神経系に導入される。
【0008】
本発明の別の局面によると分化細胞は、MSCが神経細胞および/または乏突起膠細胞にインビトロで分化するような条件に、上記に記載したようにMSC含有組成物を曝露することによって調製される。
【0009】
関連する特質において本発明は、不死化した間葉間質細胞と生理学的に悪影響を及ぼさない担体から本質的になる組成物をさらに提供する。また本発明は、不死化した間葉間質細胞、一つまたは複数の外因性遺伝子、および生理学的適合性の担体から本質的になる組成物を包含する。
【0010】
好ましい態様の詳細な説明
間葉間質細胞、即ち非造血細胞の幹細胞様前駆体がそれぞれ乏突起膠細胞および神経細胞に分化できることが判明している。本発明以前には、MSCが乏突起膠細胞または神経細胞に分化できるという指摘はなかった。骨髄から単離された少なくとも一つのサブセットの細胞が、星状膠細胞、別のCNS細胞型の進化経路を追随できることが示唆された。アジジ(Azizi)らの、Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95: 3908 (1999)参照。しかしこれまでは、MSCが乏突起膠細胞または神経細胞組織に至る系統に沿って分化できることを予測する根拠はなかった。
【0011】
本発明者らによって発見されたこの驚くべき能力により、MSCおよびMSC分化細胞は、本発明にしたがって(A)パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、および卒中のような神経細胞喪失に特徴付けられるCNSの病状、ならびに(B)テイ−サックス病、GM1ガングリオシドーシス、アデノ白質ジストロフィー、クラッベ病、異染性白質ジストロフィーおよび多発性硬化症のような乏突起膠細胞の喪失が関与する代謝性の脂質貯蔵性疾患を治療するための治療供給源となる。同じ特徴によって本発明はまた、頭部の傷害または他の外傷によってもたらされた神経細胞の喪失を軽減するためのMSCおよびMSC分化細胞の利用法も提供する。
【0012】
これらのために本発明はその局面の一つにおいて、乏突起膠細胞および神経細胞のいずれかを必要としている患者に、治療上有効量のMSCまたはMSC分化細胞を投与する段階を企画している。これに関連して「MSC分化細胞」とは、未成熟なおよび成熟した、乏突起膠細胞および神経細胞の両方をそれぞれ含むMSCから分化した何らかの細胞を指す。「治療上有効な」とは、治療を受けている患者のCNS疾患の有害な作用を減少させる(「軽減する」)MSCまたはMSC分化細胞の量を意味する。
【0013】
下記により詳細に記載したように、局所麻酔して採取することのできる骨髄の吸引物からMSCを単離することは比較的容易である。またそれらを培養して拡張し、外因性DNAを用いてトランスフェクトすることも、プロコップ(Prockop)、Science 276: 71 (1997)に報告されているように比較的容易である。インサイチューでの移動性と多能性といった幹細胞様の質と併せてこれらの利点があるため、例えば脳の癌のようなCNS疾患を治療する状況で治療用DNAを供給するためのビヒクルとして使用できるMSCが本発明によって推奨された。
【0014】
MSC自体は本発明によって治療用に投与できるが、多くの例ではCNS疾患に罹患した患者にMSC分化細胞を投与するほうがより実用的であると考えられる。このためMSCは、経験的に決定された適切な培養条件下で、神経細胞の分化または乏突起膠細胞の分化に影響を与えることがわかっている種々の栄養因子を添加および除去してインビボでの生理的条件を擬態させることによってそれぞれ乏突起膠細胞および神経細胞に分化できる。
【0015】
骨髄からの MSC の単離
本発明の目的のためのMSCは、例えばアジジ(Azizi)ら(1999)の同上文献に開示された既知の方法論によって入手できる。このため骨髄を、本発明によって治療されるべき患者となりうるドナーの腸骨稜から吸引することができる。骨髄のドナーは肝炎およびHIVについてスクリーニングすべきである。続いてMSCを、アジジ(Azizi)ら(1999)の同上文献によって例示されている従来の技術によって骨髄から単離する。
【0016】
このアプローチにより、骨髄の吸引物を、ウシ胎児血清(FBS)を用いて希釈し、遠心分離する。その後で上清と界面を混合し、再び希釈してから遠心分離を行う。続いて核のある細胞を望ましい濃度のFBSで懸濁し、適切な密度で培養皿にプレーティングする。細胞を約3日間インキュベートし、続いて非付着性の細胞を培地を置換することによって取り除く。培養物がコンフルエントに達してから細胞をトリプシン処理して取り上げる。希釈段階と再プレーティング段階を、第2代目の継代開始の際、血小板誘導性の成長因子αα(PDGF−AA;GIBCO/BRL)を添加し、3代から5代の継代を繰り返すことができる。
【0017】
神経細胞前駆細胞のインビトロでの増殖および分化
MSCは、増殖と分化を高める基質上で増殖させねばならない。そのような適当な基質はゴットリーブ(Gottlieb)らのCULTURING NERVE CELLS、202−06 (MIT Press、1998)の方法論によって得られるのであるが、彼らは組織培養フラスコの底部を0.1%のゼラチンで被覆し、神経細胞の前駆細胞を増殖させ分化させることに導く表面を入手した。ゴットリーブ(Gottlieb)らはまた、MSCの増殖に影響を与えるのに適した培養培地も開示しており、ピルビン酸塩、およびFBSを含まないグルタミン、仔ウシ血清、白血病阻害因子(LIF)、β−メルカプトエタノール、並びに蒸留水にさまざまな濃度の5’−ヌクレオシドを含むヌクレオシドストックを加えたダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)である。
【0018】
ゴットリーブ(Gottlieb)の方法論は、胚幹細胞(ES)が神経細胞に分化する前に胚幹細胞を増殖させるために用いられ、それはMSCの増殖/分化を刺激する目的に容易に適用される。同様に神経細胞の前駆細胞の増殖を誘導するための他の方法を、本発明によるインビトロでのMSCの増殖に影響を与えるように適合させることが可能である。例えばブルストル(Brustle)らのNature Biotechnology 16: 1040 (1998)はこの目的にふさわしい増殖培地を開示しており、それはDMEM、グルコース、グルタミン、炭酸水素ナトリウム、インシュリン、ヒトアポ−トランスフェリン、プロゲステロン、プトレッシン、亜セレン酸ナトリウム、ペニシリン/ストレプトマイシン、繊維芽細胞成長因子(FGF2)、および上皮成長因子(EGF)を含む。
【0019】
LIFおよびβ−メルカプトエタノールはどちらも培養物中のMSCの自然な分化を抑制する点で重要であるため、MSCを増殖させる際にはLIFとβ−メルカプトエタノールのレベルをモニターすべきである。また、培養物の密度をモニターすること、また確立された限度内のレベル、即ち60%〜70%のコンフルエントを維持することも重要である。
【0020】
MSCの継代は簡単な手順である。骨髄を最初にプレーティングした後、MSCを、アジジ(Azizi)ら(1999)の同上文献に開示されたように、付着性に差異があることを利用して造血細胞から精製する。引き続くMSCの継代は標準的なトリプシンプロトコールの手段、例えばハンクの塩(GIBCO−BRL No. 15050)に0.25%のトリプシンをEDTAとともに入れた手段によって行われる。MSCをプレーティングした後のほぼ2日目には培養物は全体で約3×106個の細胞を持っているはずであり、その後で細胞は、ほとんどコンフルエントになっているフラスコの細胞の例えば10分の1が新しい基質に植えられるように継代することができる。
【0021】
MSCを神経細胞の形態に分化させるために、MSCの増殖を刺激する任意の成長因子が培養物から通常は抜き取られ、そして細胞の分化を刺激する神経成長因子(NGF)およびレチノール酸(RA)のような物質が添加される。分化を誘導するための代表的な培養条件はロネット(Ronnet)ら、Science 248: 603 (1990)、およびプレジャー(Pleasure)ら、Neuroscience 12: 1802 (1992)によって開示されており、彼らは1−イソブチル−3−メチルキサンチン(IBMX)、ジブチリルアデノシン3’,5’−モノホスフェート(cAMP)、および神経成長因子(NGF)を添加し、続いて2日から4日後に細胞培養物にRAを導入した。RA処理を行った後細胞を低密度で再プレーティングすることができる。約2日以上の期間が経過した後、同濃度のRAを用いて培地を置換した。この段階ではNGFは、神経の分化に影響を与える適当な成長因子を残している。さらにNGFはまた、リチャード(Reichardt)およびファリナス(Farinas)がMOLECULAR AND CELLULAR APPROACHES INTO NEURAL DEVELOPMENT 220−263(Oxford Univ. 1997)によって報告したように成熟神経細胞の生存を促進する点での役割も果たしており、したがって利用可能である。
【0022】
細胞を置換する場合、それらが増殖している基質からそれらを単離すべきである。この目的への一アプローチは、培養フラスコを揺すってフラスコから細胞を無理やり移動させることを伴い、これにより細胞が浮く。その後で浮遊する細胞を培地で洗浄し、そして再プレーティングする。この際の細胞培養に適した基質はMATRIGEL(登録商標)(Becton Dickinson、Bedford MA、USAの製品)であり、基底膜マトリックスには成長因子のほかに、コラーゲンIV、ラミニン、エンタクチン、およびなかでもヘパラン サルフェート プロテオグリカン(ペルレカン)(perlecan)が含まれる。次に細胞を、FBSとペニシリン/ストレプトマイシンを含み、約1μlのシトシンアラビノシド、およびそれぞれ10μlのフルオロデオキシウリジンとウリジンを補充したDMEM高グルコース(HG)に植えることができる。
【0023】
神経細胞系統に沿った分化に影響を与えるさらに別のアプローチは、MSCを条件培地(CM)に導入することを伴う。例えばヘンダーソン(Henderson)らのProc. Nat’l Acad. Sci. USA 78: 2625 (1981)には、ニワトリの胚抽出物を含む適当なCMが開示されている。ヘンダーソン(Henderson)らによって開示された方法論に従うと、培養段階は基質に細胞をプレーティングするこから始まるのであるが、基質はゼラチンでコーティングされたプラスチック皿であってもよい。培養内地は、三成分最小必須培地、一成分培地199、10%(vol/vol)の熱不活性化ウシ血清、1%のニワトリ胚抽出物、2mMのグルタミン、100ユニット/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンを含む。アラビノシトシンの量は、当業者には明らかとなる時間が経過した後、分割中の細胞を殺せるように添加されうる。1日から4日後、培地を除去し、細胞を最小必須培地(2mMのグルタミン、100ユニット/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンを含むイーグル)で二度洗浄する。続いて細胞を新しい(「非適合」)最小必須培地に載せる。1日から4日以上の培養を行った後、培地、ここでは「適合」培地を除去し、保存してから新しい、非適合培地によって置換するが、それはまた約4日間で適合する。適合培地は数週間、4℃でその活性を保持したまま保存できる。
【0024】
神経細胞系統に沿ったMSC分化を誘導するために、LIFおよびβ−メルカプトエタノールを存在させるべきではない。分化する状況ではしたがって、LIFおよびβ−メルカプトエタノールを両方とも存在させない前述した培地のどれかにおいて、MSCを培養することが好ましい。
【0025】
本発明に従ってインビトロでの培養物が40%から60%の神経細胞を含む時点まで分化段階が達した場合に、見かけの密度レベル100%までさらに「精製」することは、例えばNT2細胞を精製するのに採用された戦略を用いて可能である。クレップナー(Kleppner)らのJ. Comp. Neurology 357: 618−632 (1995)は、適当な「精製」段階を記載している。この段階は、トリプシンを用いて神経細胞細胞を無理に移動させることを伴い、その後で細胞を再プレーティングしてからそれらに、5%のウシ胎児血清(FBS)(Hyclone、Logan、UTの製品)、1%のペニシリン/ストレプトマイシン(JRH)(Biosciences、Lenexa、KSの製品)、および有糸分裂阻害剤とともにDMEM−HGを含む、適合培地の1:1希釈物を二度与える。適当な有糸分裂阻害剤は、1μMのウリジン、1μMの5−フルオロ−2’−デオキシウリジン(FUDR)、および0.1MのAraC(Sigma、St. Louis、MOの製品)を含む。この培養段階を行った約1週間後、細胞培養物は、約99%の純粋な有糸分裂後の神経細胞を含んでいるはずである。
【0026】
細胞発生のモニタリング
培養培地における栄養因子の濃度を変化させ、それによって目的の系統をMSCに分化させるのに好ましいようにするための計画は、上記に記載したように所定のプロトコールの経過で起こる細胞発生をモニターすることによって経験的に決定されうる。特定の細胞の発生段階と同様に、生きている細胞の濃度は同じく従来の手法によって決定できる。例えば成熟神経細胞の表現形があることは、細胞が軸策および樹状突起を含む高度に分極した神経細胞形態を含んでいた場合に明らかとなる。さらに細胞を、ニューロフィラメントサブユニット、タウタンパク質、微小管関連タンパク質2(MAP2)、および神経細胞接着分子(N−CAM)のような神経細胞特異性遺伝子産物を産生する効力によって培養物中で同定できる。
【0027】
このように、神経細胞遺伝子の産物に結合するか、さもなければヒト神経細胞自体を同定する抗体に細胞を接触させること、続いて選択された培養条件下でマーカーに結合する細胞濃度を確かめることが日常的に行われる実験である。この方式で、MSCの神経細胞への分化を促進できる最適の培養条件を決定できる。この目的のための適当な抗体の例は、MOCH−1、M12、T14、RMO93、RMO24、RMO217、およびRMO301である。クレップナー(Kleppner)ら(1995)の同上文献、およびミヤゾノ(Miyazono)ら、J. Comp. Neurol. 357: 818 (1995)には、ヒトの神経細胞を同定するためにこれらの抗体を使用することが記載されている。例えばMOCH−1は、神経細胞を識別できるポリペプチドのN−CAMにあるヒト特異的エピトープを結合できる。ブルメンドルフ(Brummendorf)らのCurr. Opin. Neurobiol. 6: 584 (1996)は、N−CAMが発見されたために神経接着タンパク質および認識タンパク質を含む100以上のIgドメインが同定されたことを報告している。N−CAMと同様に、これらのタンパク質はこの状況において神経細胞特異的マーカーとして機能できる。
【0028】
本発明はまた、より特異的マーカーが必要とされるのであればそのマーカーの利用法も包含する。パーキンソン病はドーパミン作動性神経細胞に悪い影響を与えるため、例えばチロシンヒドロキシラーゼおよびドーパミンβ−ヒドロキシラーゼのようなドーパミン作動性神経細胞に特異的なマーカーは、本発明によって培養物中で産生されたドーパミン作動性神経細胞を検出する際に都合がよい。同様にコリンアセチルトランスフェラーゼはアルツハイマー病に罹患した患者に影響を与えるコリン作動性神経細胞に対するマーカーであり、またトリプトファンヒドロキシラーゼはセロトニン作動性神経細胞に対するマーカーである。
【0029】
インビトロでの乏突起膠細胞前駆細胞の増殖および分化
培養培地と栄養因子を適切に組み合わせた場合、MSCはまた、インビトロで乏突起膠細胞に分化するように本発明によって刺激できる。上述したように本質的に分化の進行をモニターすることが可能で、それによって分化段階を容易にする栄養因子を添加したり、取り除いたり、および/または濃度を変えたりして適当な計画を立てることができる。
【0030】
MSCを前述したように骨髄から単離し、望ましい培養密度にまで増殖させた後で細胞を、例えばバレス(Barres)ら(1994)の同上文献によって記載されているように乏突起膠細胞の増殖および分化に適した条件で、ポリ−D−リジン(PDL)でコーティングされた組織培養上に、血清非含有培地に入れてプレーティングすることができる。こうして培養物は、DMEM、ウシ血清アルブミン(BSA)、セレン、プトレッシン、チロキシン、トリヨードチロニン、トランスフェリン、プロゲステロン、亜セレン化ナトリウムおよび適当な栄養因子を含むことができる。ウシ血清培地は純度が高く、結晶レベルの品質のBSA(Sigma A4161)を用いて調製することによって、残存する因子が含まれるのを避けるべきである。またピルベート(1mM)の助けが存在すると、細胞培養の早期の段階でのMSCが支持される。温度を30℃〜40℃の範囲に維持する必要がある。
【0031】
二つの群の栄養因子、即ちサイトカインと成長因子は、MSCの乏突起膠細胞への増殖と分化に特に関連する。この状況で用いられる成長因子の例は、PDGF−αおよびPDGF−ααを含む血小板由来成長因子(PDGF)、塩基性繊維芽細胞由来成長因子(bFGF)、トランスフォーミング成長因子α(TGF−α)、インシュリン様成長因子−1(IGF−1)、ニューロトロフィン−3(NT3)、および甲状腺ホルモンである。バレス(Barres)らのDevelopment 118: 283 (1993)、loc. cit. 120: 1097 (1994)、およびGlial Cell Development 71: (1996)、ゴクハン(Gokhan)らの16A COMPANION TO METHODS IN ENZYMOLOGY 345−58 (Academic Press、1998)参照。サイトカインは例えば、毛様体神経栄養因子(CNTF)、白血病阻害因子(LIF)、インターロイキン6、インターロイキン11およびインターロイキン12(IL−6、IL−11、IL−12)、並びにコロニー刺激因子(CSF)の中から選択することができる。同上文献。
【0032】
マイトジェンである成長因子は細胞の増殖を促進するが、分化は誘導しない。bFGFは乏突起膠細胞およびその子孫のためのマイトジェンであり、系統の進行(progression)を調節する。NT−3およびPDGFも、乏突起膠細胞系統に関わってゆく細胞に対する強力なマイトジェンである。PDGFに対する乏突起膠細胞の増殖性の反応は、Pro−OL段階では保持されているが(下記の表参照)、PDGF−α受容体の下方制御前のPre GalC段階で失われる。IGF−1は、Pro−OLの分化および可能ならば増殖の増強によって、培養物における乏突起膠細胞の産生を促進して増加させる。したがって、IGF−1を少なくともPro−OL段階で始まる培養物に導入することが有効であると考えられる。
【0033】
甲状腺ホルモンが存在するとミエリンになるまでの早期の段階から乏突起膠細胞系統の分化に影響するため、ホルモンは乏突起膠細胞の発生に重要な役割を果たしていると考えられる。バレス(Barres)ら(1994)の同上文献。甲状腺ホルモンは、マイトジェンの存在下で前駆細胞が乏突起膠細胞に分化するのを可能にすると考えられる。しかしマイトジェンが存在しない場合は、分化を誘導する必要はない。同上。
【0034】
本発明の一態様では、bFGFおよび/またはPDGF−ααのような成長因子を用いて分化していない細胞を予め処理し、その後因子の除去とサイトカインの添加が連続して行われることが有用である。サイトカインは本明細書に記載されたものの組み合わせであってもよい。乏突起膠細胞の分化が起きている間は培養温度をモニターし、当業者にとって明らかになりうる確立された範囲内の温度に維持することが重要である。
【0035】
マウスの胎児から得られる海馬と大脳の子孫が関与する実験に基づいて、ゴクハン(Gokhan)ら(1998)の同上文献は、別個の因子からなる5個のサブクラスから得られるサイトカインが、乏突起膠細胞系統種を進化させる系統への傾倒と細胞の成熟をプログラムするために用いられると考えられることを報告した。さらに具体的には、bFGF、PDGF−αα、IGF−1、NT3、およびCNTF/IL−6のサブクラスのメンバーの組み合わせが解明された。さらに、たとえばCNTF、LIF、IL−11、IL−12、およびG−CSFなどのgp−130関連リガンドにより、複数の系列の移行における様々な細胞活性を示す能力が示された。このようにゴクハン(Gokhan)らは、MSCの乏突起膠細胞への分化を誘導するのに必須である栄養因子を適当に組み合わせるための眼識を提供した。
【0036】
さらにバレス(Barres)ら(1993)の同上文献は、インビトロで乏突起膠細胞が長期間生存するのを促進する3つのクラスの栄養因子、即ち(1)IGF、(2)ニューロトロフィン、特にNT−3、ならびに(3)CNTF、LIFおよびIL−6の重要性を報告した。代(3)群の分子は同種のサイトカインのファミリーに属する。CNTFは、インビボで乏突起膠細胞の生存を促進する別の生存(survival)因子である。即ちそれは、星状膠細胞特異性タンパク質GFAPを発現させるために培養物中に乏突起膠細胞前駆体を誘導するとともに、それはまた、インビトロ精製乏突起膠細胞に対する生存因子でもある。LFおよびIL−6は両方とも、精製された乏突起膠細胞の生存を促進する。バレス(Barres)ら(1993)によって開示されているように、インビトロでは、プラトーに達した濃度のLIFまたはIL−6によって、精製された乏突起膠細胞の約50%の生存が促進された。
【0037】
ルイス(Louis)らのJ. Neurosic. Res. 31: 193−204 (1992)によって開示されたB104 CMのような神経芽細胞腫CMは、本発明によってMSCを乏突起膠細胞に分化させるのに適した別の種類の培地である。このために前述したようにMSCを骨髄から単離し、適当な基質上で望ましい培養密度にまで増殖させてからそこから分離した。この単離されたMSCを上述したように、約10μg/mlのポリ−D−リジンでコーティングされた組織培養皿またはガラス製のカバーグラス片(Bellco Glass)などの基板上に移すことができる。基板はさらに、1.5Mのホウ酸塩でコーティングされていてもよい。
【0038】
MSCを、ペニシリンおよびストレプトマイシンの混合物に入れた2mMのグルタミンとともに、DMEMに入れた約10%のウシ胎児血清を含む培地にある基板上にプレーティングすることができる。好ましくは細胞を、1/2コンフルエントと完全なコンフルエントの間の密度、例えば約5,000個の細胞/cm2になるようプレーティングする。細胞をプレーティングした後、乏突起膠細胞前駆体への分化を誘導するB104 CMのような培地を添加する前に、それらの細胞がその基質表面に接着できるようにすることが好ましい。この接着段階は、MSCをプレーティングした後の通常約24時間で自然に起こると考えられる。
【0039】
充分な濃度の細胞が基質に接着したら細胞を最小必須培地で洗浄し、選択した神経芽細胞腫適合培地で培養する。この目的でB104 CM培地を作製するために、B104 CM培地のような神経芽細胞腫の細胞の培養物を、10%の熱不活性化ウシ胎児血清(Hyclone、Hogan、UTの製品、またはSigma、St. Louis、MOの製品)、2mMのグルタミン、および100μg/mlのペニシリンを補充したDMEM中で増殖させる。培養物がコンフルエントの約2分の1から完全なコンフルエントまでの濃度に達してからそれを例えばハンクの塩溶液(Hank’s salt solution)で二度洗浄し、そしてボッテンスタイン(Bottenstein)らのExp. Cell Res. 135: 183 (1980)に記載されたように、2mMのグルタミン、100μg/mlのペニシリン、およびN1サプリメントを組み合わせた血清非含有DMEM中でインキュベートする。N1サプリメントは、50μg/mlのトランスフェリン、5μg/mlのインシュリン、100mMのプトレッシン、20nMのプロゲステロン、および30nMのセレンを含む。約3日または4日の培養を行った後、培地を取り出し、濾過してから必要とされるまで−20℃で保存する。培地を一週間以内に用いることが好ましい。
【0040】
MSCの乏突起膠細胞前駆体への分化を誘導するために、記載されたように単離およびプレーティングされたMSCを、その容積の約30%のB104 CM培地を含むN1培地中で培養する。(N1培地は、5μg/mLのトランスフェリン、16.1μg/mLのプトレッシン、6.3ng/mLのプロゲステロン、3.3ng/mLのセレン、10ng/mLのビオチン、2mMのグルタミン、および5μg/mLのインシュリンを含むDEMEを含む。) 得られた「B104/N1」培地は凍結したストックから、好ましくは1週間以上は保存されていないストックから調整できる。この段階での細胞培養物は、乏突起膠細胞前駆細胞に分化した、またはさもなくば似ている、任意の細胞を検出するためにモニターするべきである。
【0041】
MSCの乏突起膠細胞前駆細胞への細胞分化は約6時間から12時間の素早さで起こり、B104/N1培地で細胞を培養した約24時間後までに容易に起こると考えられる。乏突起膠細胞の前駆細胞は、前駆細胞型に小さなプロセスが存在すること、同様にそれが相対的に小さい大きさであって丸い形状になっていることで他の細胞型と識別できる。一方MSCは通常、乏突起膠細胞前駆細胞に比べてかなり扁平で長い。また乏突起膠細胞前駆細胞を、従来の免疫組織化学的手法を用いて培養物に含まれる他の細胞と識別できる。このプロセスを実行するのに適した抗体には、下記の表に列挙したようなA2B5およびGD3が含まれる。B104適合培地はまた、MSCから分化した乏突起膠細胞前駆細胞の急速な増殖も誘導する。したがって、一部のMSCが乏突起膠細胞前駆体に分化した後でもB104 CMが存在し続けていると、より高濃度の乏突起膠細胞前駆体を得ることができる。
【0042】
乏突起膠細胞前駆細胞が100%の培養集団を含んでいない場合には、培養物に含まれる乏突起膠細胞前駆細胞の純度を高めるために、培養物を、例えばグリンスパン(Grinspan)ら、J. Neurobiol. 43: 1−17 (2000)に記載されているような従来の免疫パニング法(immunopanning techniques)に供することができる。この免疫パニング精製方法は、カルシウムまたはマグネシウムを含まないハンクス溶液中でトリプシン処理または粉砕処理を行い、続いてペレット化、計数、および培養培地への細胞の再懸濁を行うことで培養物から細胞を取り出す段階を包含する。この培地は例えば、10μg/mlのインシュリン、30mMの亜セレン化ナトリウム(sodium selenite)、10μg/mlのヒトトランスフェリン、10−11のトリヨードチロニン、0.05μg/mlのヒドロコルチゾン、50倍に濃縮された最小必須アミノ酸10μg/mlの10倍濃縮されたMEMビタミン類、ならびにペニシリンおよびストレプトマイシン(1%vol/vol)を入れたHam’s F12を含む。
【0043】
この細胞は、例えば非組織培養用のプラスチック製ペトリ皿であってもよい一つまたは複数の予めコーティングされた免疫パニング用皿に移されるまで懸濁液に入れたままにしてもよい。この免疫パニング用皿は、懸濁液に含まれる他の細胞から乏突起膠細胞前駆細胞を分離するのに有用な基質でコーティングされている。したがって免疫パニング用皿に細胞を植える前に、懸濁液に含まれる細胞型に対する親和性をその少なくとも一個が持っているような一つまたは複数の抗体で、皿をコーティングする。
【0044】
一態様においては免疫パニング用皿をまず、二次抗体、即ち一次抗体に対して親和性を持つ抗体で被覆する。この状況での「一次抗体」とは、免疫パニング用皿に植えられる細胞の懸濁液に含まれる少なくとも一つの細胞型に対する親和性を持つ抗体である。選択された二次抗体は、用いた一次抗体によって異なると考えられる。例えば、一次抗体が「Ran−2」である場合の二次抗体はIgGでありうるし、また一次抗体が「A2B5」もしくは「04」である場合はIgMでありうる。二次抗体が免疫パニング用皿にコーティングされた後で二次抗体を約6時間〜18時間、4℃でインキュベートすることによって、充分な量の抗体を免疫パニング用皿に接着させることができる。その後皿を約1回から5回、例えば滅菌性のPBSで洗浄することにより、プレートが乾燥しないように注意を払って非接着性の二次抗体を除去することができる。
【0045】
その後で一次抗体を免疫パニング用皿に添加することができ、皿を約1時間、例えば約25℃でインキュベートすることができる。非接着性の抗体は、免疫パニング用皿を約1回〜5回、好ましくは2回、滅菌性PBSを用いて、例えばプレートを乾燥させないように注意を払って洗浄することによって除去できる。このために洗浄溶液を、最後の洗浄をした後で免疫パニング用皿に残ったままにしておくことができる。
【0046】
一次抗体を免疫パニング用皿に被覆してから、培地、即ち例えば上述したとおりのサプリメントを補充したHam’s F12を含む約8mlの培地に入れた細胞が一皿あたり約2,000,000個〜4,000,000個、好ましくは2,500,000個〜3,000,000個の密度となるように、細胞を皿に植えることができる。皿内の組成物を、一次抗体が細胞に結合するのに充分な時間、約25℃でインキュベートすることができる。インキュベート時間は、約15分間から2時間、好ましくは約30分間であってよい。
【0047】
この皿の一次抗体は乏突起膠細胞前駆体に対する親和性を持っていないものであってもよいが、その代わり懸濁液に含まれる別の細胞型に対する親和性を持っている。例えば一次抗体は、ラットの星状膠細胞または星状膠細胞の前駆体に結合し、おそらくヒトの星状膠細胞にも結合できるRan−2であってもよい。したがってこのような抗体は、「望ましくない」細胞および/または他の混入物に結合すると考えられる。よって、一次抗体と複合体を形成しない細胞に乏突起膠細胞前駆体が含まれると考えられる。非接着性細胞(即ち一次抗体に結合しない細胞)を従来の手法によって皿から取り出すことができ、別の免疫パニング用皿に移すことができる。
【0048】
非接着性細胞が移された新しい免疫パニング用皿は同様に、乏突起膠細胞前駆細胞に結合しないが、その代わりに懸濁液中に存在する可能性のある他の細胞に結合する一次抗体を含むと考えられる。例えば一次抗体はここでもRan−2であってもよいし、または乏突起膠細胞前駆体ではない一つまたは複数の細胞型を認識する別の抗体であってもよい。非乏突起膠細胞前駆細胞が乏突起膠細胞前駆細胞よりもRan−2に対して親和性が高いため、Ran−2はこれに関して適当な抗体である。前述したように一次抗体と複合体を形成しない細胞には乏突起膠細胞前駆体が含まれ、それは簡単な技術によって皿から取り出されうり、別の免疫パニング用皿に植えられる。本発明は、乏突起膠細胞前駆細胞には結合しないが、その代わり懸濁液に存在する可能性のある他の望ましくない細胞および/または混入物に結合する一次抗体を含む免疫パニング用皿上で、細胞を一回、二回、またはそれ以上継代することを提供する。
【0049】
細胞が移された免疫パニング用皿も、乏突起膠細胞前駆細胞に特異的か、または乏突起膠細胞前駆細胞に対して別のように親和性を持つ一次抗体を含むと考えられる。例えば一次抗体は、ロイ(Roy)ら、J. Neurosci. 19: 9986−1003 (1999)に開示されているように、A2B5または04、即ちヒト前駆体も認識するラットの乏突起膠細胞前駆体に対する抗体であってもよい。細胞と抗体からなる組成物をインキュベートさせると、一次抗体が乏突起膠細胞前駆細胞に結合すると考えられる。培養培地などの非接着性材料は皿を洗浄して除去されうる。残っている乏突起膠細胞前駆細胞を、トリプシン−バーシン(versine)溶液を用いて一次抗体から分離できる。続いて結合しなかった乏突起膠細胞前駆体を、上述したように、N1/B104培地を含む培地中の新しいペトリ皿に植えることができる。
【0050】
B104 CMが乏突起膠細胞前駆体がさらに分化するのを阻害しうる成長因子を含んでいるため、乏突起膠細胞前駆細胞が成熟乏突起膠細胞に分化する段階には、B104 CMを別の培地と置換する段階が通常は含まれる。したがって上述した乏突起膠細胞前駆体をB104/N1培地から単離でき、例えばトランスフェリン、プトレッシン、プロゲステロン、セレン、ビオチン、グルタミン、インシュリン、T4、およびグルコースの混合物を含む50%DMEMおよび50%Ham’s F12を含んでいる培地(「DMEM/F12分化用培地」)で増殖させることができる。特に、この混合物は、50μg/mLのトランスフェリン、5mg/mLのプトレッシン、3ng/mLのプロゲステロン、2.6ng/mLのセレン、10ng/mLのビオチン、2mMのグルタミン、12.5μg/mLのインシュリン、0.4μg/mLのT4、および0.3%のグルコースを含むことができる。乏突起膠細胞前駆体を成熟乏突起膠細胞に分化させるのに適した別の培地は、上述したように栄養因子CNTFおよびNT−3を含む。このためにCNTFおよびNT−3を、それぞれ2ng/ml〜5ng/mlおよび100ng/mlでDMEM/F12分化用培地に添加することができる。
【0051】
星状膠細胞のCMは本発明の細胞を乏突起膠細胞に分化させるためのさらに別の適当な培地である。ゴットリーブ(Gottlieb)らのCULTURING NERVE CELLS 517−530 (MIT Press、1998)はこの培地の調整法を開示しており、それは、星状膠細胞の培養物をDMEM−BS中で48時間増殖させる段階、培地を収集する段階、続いて培地を新しいDMEM−BSと置換してさらに48時間増殖させる段階からなる。約500mlのDMEM−BSの適当な混合物は次の成分を含んでいる:25μg/mlのゲンタマイシン(Gibco BRL no. 15750−011)を加えた469mlのD−MEM(Gibco BRL No.11995−065);10mlの調製インシュリン;5mlの調製トランスフェリン;5mlのグルタミン;および11mlの「サプリメント混合物」。サプリメント混合物は444mlの容量で作製されうる。第1段階は、200mlのPBS+0.72mLのウシ血清アルブミン(BSA)パス(path)−o−サイト(cyte)4(ICN Biochemicals、St. Louis、MO)、200mlのH2O+322mgのプトレッシン(Sigma no. P−7505)、20mlのエタノール(EtOH)+8.0mgのチロキシン(T4、Sigma no.T−2501)、および20mlのEtOH+6.74mgのトリヨードチロニン(T3、Sigma no.T−2752)を組み合わせることである。甲状腺ホルモン非含有培地が必要な場合には、T3およびT4を対応する量のEtOHと置換することができる。次に、20mlのEtOH+12.46mgのプロゲステロン(Sigma No.P−0130)、および20mlのH2O+7.74mgのセレン(Sigma No.S−1382)からそれぞれ2mlずつ加える。次にこの混合物全体を0.22μmのフィルターを通過させて濾過し、11mlのアリコートに分離してから−20℃で保存することができる。上述した調製トランスフェリンは、二度蒸留した水に10mg/mlのトランスフェリン(Sigma No.T−2252)を混合し、続いて濾過段階を行うことによって得られる。200mgのインシュリン(Sigma No.I−5500)を100mLのH2O中で前もって希釈し、その後インシュリンが溶解するまでHCl(1N/約、10ml)を添加することによって、調製インシュリンを作製する。0.22μmのフィルターを通過させて混合液を濾過した後、最終容量が400mlになるまで滅菌水を加える。
【0052】
細胞発生のモニタリング
前述したように、栄養因子を添加したり、取り除いたりおよび/または濃度を変えたりする必要性は、特定のプロトコールで細胞が発生するのをモニターすることによって経験的に決定できる。この状況では、特定の細胞の発生段階はもちろん、生きている細胞の濃度もこの技術分野で既知の方法によって測定できる。
【0053】
例えばインビトロの生存細胞の濃度は、バレス(Barres)ら(1993)の同上文献に記載されているようなMTT生存アッセイ法によってモニターできる。この段階によって3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(MTT、Sigmaの製品)を、ミリポア(Millipore)フィルター(0.22μm)を通過させることによって滅菌したPBSに溶解する。このストック溶液を37℃で約1時間かけて培養物に添加する。活性なミトコンドリアを持つ生存細胞はテトラゾリウム環を開裂することによって、可視性のダークブルー ホルマザン反応生成物を形成できる。可視化細胞の割合は、明視野相(phase)の顕微鏡によって計数できる。
【0054】
さらに、発生段階が異なると異なる濃度の栄養因子が必要であると考えられ、同様にそのプロトコールに他の変化も必要となると考えられるため、特定の培養条件で乏突起膠細胞前駆細胞の発生段階を決定することが有用である。特定の乏突起膠細胞前駆体段階に対して特異的な既知のマーカーのうちのどれかが、例えば既知の免疫組織化学的方法によってインビトロでの細胞分化を追跡する際に使用できると考えられる。
【0055】
このようにMSCおよび/またはMSC分化細胞は、さまざまな量の栄養因子によって特徴づけられる別個の培養条件下でガラス製のカバーグラス上で培養できる。上述した経験的な計画によって細胞を培養した後で細胞を固定化し、続いて乏突起膠細胞の発生段階に対応する特定のマーカーの存在を検出するために抗血清を用いて処理する。このように得られた情報は、成熟乏突起膠細胞にMSC分化するのに最適な培養条件を決定する際の助けとなる。
【0056】
フェイファー(Pfeiffer)らのTrends in Cell Biol. 3: 191 (1993)は、乏突起膠細胞の既知の発生段階を同定するために用いることのできる種々の段階特異的マーカーを開示している。これらの発生段階、およびそれぞれの段階を同定するマーカーが以下の表に示されている。
【0057】
さらに具体的には、この表は、これらの異なる段階における段階特異的マーカーとカップリングした既知の段階の乏突起膠細胞発生を列挙していて、いくつかのマーカーを同定する抗体が括弧内に示されている。最も早期の段階は、細胞が増殖し一極性になっている場合のPre−GD3(Pre−O−2A)であって、胚の神経細胞接着分子を発現する。この段階の細胞は、増殖性で遊走性の、双極GD−3(O−2A)細胞に分化する。O−2A前駆細胞は、モノクローナル抗体(Mabs)GD3およびA2B5によって認識されるガングリオシドを発現する。プロ−オリゴデンドロブラスト(Pro−OL)段階は、次に乏突起膠細胞の発生系統になり、二つのMab、O4およびAOO7と反応することによって同定できる多極性で後遊走性の増殖性細胞に特徴があって、硫酸塩化した表面抗原のPOAを認識する。次の一過性のPre−GalC発生段階は、Mab Rとは反応するが、抗GalC Mab O1とは反応しないという前駆細胞の能力によって同定される。未成熟なOL段階の開始は、GalCおよびスルファチドの合成と細胞表面への輸送によって、同様に2’−3’−環状ヌクレオチド3’−ホスホヒドロラーゼ(CNP)の合成によって同定される。成熟乏突起膠細胞は、プロテオリピドタンパク質(PLP)、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)、およびミエリン/乏突起膠細胞糖タンパク質(MOG)のようなマーカーの調節性の発現とともに発生した。したがってこれらの段階特異的マーカーは、それぞれの乏突起膠細胞発生段階における最適の培養条件を推定するための強力なツールを提供する。
【0058】
MSC の不死化
本発明はまた、不死化したMSCの細胞系を作製し、それによって細胞の活力とMSCの供給量を増加させることも包含する。ある条件で不死化されたMSCは、本明細書に開示された細胞系に分化する能力を有する同種のヒト細胞を無限的で更新可能に供給できるようにし、インビトロで細胞の収率を最大にする。
【0059】
まず細胞を、増殖を実質的に阻害しない表面にプレーティングする。MSCは、増殖促進性タンパク質の産生および/または活性が外部因子によって調節可能になるように、増殖促進遺伝子、即ち適当な条件下でトランスフェクトした細胞の増殖を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含む適当なベクターを用いてプレーティングした細胞をトランスフェクトまたは感染することによって、条件付けして不死化できる。一態様では増殖促進遺伝子は、myc遺伝子、SV40ラージT抗原遺伝子、および突然変異p53遺伝子(国際公開公報第98/10058号参照)のような癌遺伝子である。別の態様では、ミエルソン(Myerson)らのCell 90: (1997)(GenBankアクセッション番号第AFO 18167号参照)によって報告されているように、テロメラーゼ遺伝子(hTERT)の2kDの触媒性フラグメントは調節性のプロモーターの調節下におかれている。また、ランゲ(Lange)らのScience 283(5404): 947−9 (1999)も参照。
【0060】
外因性遺伝子を用いるMSCのトランスフェクションは、さまざまな従来の方法、即ち限定するわけでないが、レトロウイルスまたはアデノウイルスの感染、エレクトロポレーション法、およびリン酸カルシウム法−外因性遺伝子のDNAの取り込み促進法を含む方法によって達成できる。MSCをトランスフェクトした後、本明細書に記載した培養条件を整えることによって、それらを維持し、かつ乏突起膠細胞および神経細胞にそれぞれ分化させることが可能である。
【0061】
したがって本発明は、hTERTをコードする能力を有するDNA分子を含むベクター(例えば、レトロウイルス構築物)をMSCに供給する段階を企図している。本発明はまた、毒素の選択性に対して適合するタンパク質をコードする遺伝子(例えばneo耐性またはハイグロマイシン耐性の遺伝子)をMSCに供給する段階も提供する。この毒性選択性遺伝子を従来技術によって使用することによって、毒性選択遺伝子、およびこうして不死化された遺伝子をゲノムに統合したMSCを単離することが可能になる。例えば、毒性薬剤である例えばハイグロマイシンによって殺されない形質導入されたMSCは、ポリクローナル細胞増殖巣(focus)を形成する。形質導入したMSCの別の特徴的な指標は、不死化遺伝子を発現しないMSCに比べて、急速に増殖することである。一旦単離されると、感染細胞集団には、hTERTのような不死化遺伝子を発現しないMSCが、存在するとしてもほんの少ししか含まれていないことが好ましい。一旦不死化されると、本明細書に開示された方法論によって、MSCは乏突起膠細胞または神経細胞系統のいずれかに分化されうる。
【0062】
本発明はまた、h−tertとともに一つまたは複数の別の外因性DNA分子を用いてMSCを感染させる段階も提供する。例えばヒトMSCを不死化するには、癌遺伝子(例えばH−ras、T抗原、またはmyc)を活性化することが必要であると考えられ、かつ、腫瘍抑制遺伝子(例えばp53)のような、増殖を阻害する一つまたは複数のタンパク質を抑制することも必要であると考えられる。
【0063】
さらに本発明は、他の種類の外因性遺伝子を用いるMSCのトランスフェクション、または感染も企図している。例えば下記に記載したような遺伝子治療の状況では、不死化されたMSCを、例えば必要とされる神経伝達物質をコードする外因性DNA分子を用いてトランスフェクトできる。
【0064】
CNS 疾患の患者の治療
本発明により、CNS疾患を有する患者の治療段階は、疾患のあるCNSの領域を含むCNSへ、MSCまたはMSC分化細胞を脳内移植する段階を含むことができる。MSC分化細胞には例えば、B104 CMを含む培地中でMCSを培養することによって分化された乏突起膠細胞前駆体が挙げられる。本発明の細胞を、脳内室領域、実質組織(盲注射として、または定位注射により特定部位へ、のいずれかとして)、およびクモ膜下または軟膜下の空間などの多くの部位に注射できる。注射の特定の部位は、皮質の灰白室、白室、基底核、および脊髄の部分であることができる。原理的には、本明細書に記載されたようなCNS疾患による影響を受けている任意の動物は、本明細書に記載された一つまたは複数の方法論によってそのように治療されうる。
【0065】
移植についての従来の技術は、例えばNEURAL GRAFTING IN THE MAMMALIAN CNS、ブルヨクランド(Bjorklund)およびステネビ(Stenevi)編 (1985)に記載されており、文献の内容は参照として本明細書に組み入れられる。段階は実質組織の移植を含んでおり、それは宿主の脳組織に本発明の細胞を注射することによって達成される。しかしながら本発明の細胞を移植することで、多くのCNS領域に影響を与えることが可能になる。
【0066】
本発明によると、患者の脳の選択的領域への細胞の投与は、穴を開ける段階、そしてミクロシリンジのニードルの挿入が可能になるように硬膜を補強する段階によってなされると考えられる。または、その細胞は、脊髄領域にクモ膜下腔より注射することができる。本発明の細胞調整物は、脳または脊髄の任意の予め決められた部位への細胞の移植を可能にする。別個の解剖学的領域から得られる細胞の混合物と同様に、同一の細胞懸濁液を用いて数カ所の部位で同時に多重移植を作用させることも可能である。
【0067】
本発明による患者の治療はMSCの移動能力を利用することが可能であり、それらを用いてペプチド、タンパク質またはその他の物質を、それらの物質に関連する機能不全または欠陥によって影響されるCNSの領域へと提供できる。このため本発明の細胞(成熟神経細胞に分化したMSCを含む)は、CNS疾患に罹患した患者が欠いている産物をコードする外因性DNAを含んでいてもよい。例えばDNAは、アセチルコリンもしくはGABAのような伝達物質、または例えば伝達物質に対する受容体をコードしうる。患者がグルタミン酸誘導性の障害に罹患した場合には、グルタミン酸誘導性の細胞毒性を減少させることの可能なグルタミン酸輸送タンパク質についてコードしている遺伝子を患者に導入することが望ましいと考えられる。ドーパミン、アドレナリン、ノルアドレナリン、エピネフリン、ノルエピネフリンおよびセロトニンのような他の伝達物質は、合成されるためには別個の遺伝子によってコードされる多数の酵素が必要である。
【0068】
さらなるアプローチでは、成長因子またはサイトカインをコードするDNAがMSCにトランスフェクトされることができ、その後、その病因または合成が遺伝子発現産物における欠陥または機能不全と関連するような、CNS疾患に罹患した患者に投与される。このため本発明は、例えば、発現の際の、NGF、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア細胞系由来神経栄養因子(GDNF)、IGF−1またはCNTFを産生する遺伝子の使用を企図している。さらに、選択される遺伝子は、LIFをコードしていてもよいし、または例えばリチャード(Reichardt)およびファリナス(Farinas)(1997)の同上文献によって開示されている、細胞の生存もしくは分化を促進する任意の他のサイトカインをコードしていてもよい。
【0069】
本発明にかかる治療法は、皮質または基底核に好ましくは定位で細胞を注射することによって効果を発現させることができる。その後でMSCによって分泌される要求されたリガンドの拡散および取り込みは、患者の神経細胞が例えば遺伝子産物の産生に欠陥を与えている場合に起こる疾患の症状を緩和する点で有効でありうる。こうして神経成長因子(NGF)のような神経栄養因子を分泌するように遺伝子的に修飾されたMSCを、処理をしなかったなら死んでしまった可能性のあるコリン作動性神経細胞の変性を抑制するために用いることができる。また、パーキンソン病のようなドーパミン神経の喪失によって特徴づけられる疾患に罹患した患者に移植されるべきMSCを、L−DOPA、即ちドーパミンの前駆体をコードする外因性DNAを含むように修飾することができる。
【0070】
本発明によると他のCNS疾患、即ちアルツハイマー病、ガングリオシド貯蔵性疾患、卒中によるCNSの損傷、および脊髄損傷を含む疾患も同様に治療できる。例えばアルツハイマー病は、基底前脳のコリン作動性神経細胞の変性に特徴がある。これらの神経細胞のための神経伝達物質はアセチルコリンであって、それは神経細胞の生存のために必須である。これらの神経細胞の生存を促進できる因子に対する外因性遺伝子を含むMSCの移植を、本発明によって記載したとおりに達成できる。
【0071】
別の態様では、本発明の細胞は、患者の免疫応答を下方制御する能力を有する遺伝子を用いてトランスフェクトされ、続いて本明細書に記載された方法の一つによって患者に投与されうる。この種類の治療は、多発性硬化症のような炎症性の疾患を治療するためにも役立つ。この態様に係る好ましい遺伝子は、IL−4またはIL−10のような抗炎症性サイトカインをコードする遺伝子である。またこの遺伝子は、プロ炎症性サイトカインの阻害剤であってもよい。インターフェロンβ(IFN−β)は炎症性疾患を治療するためのさらに別の候補である。例えばカデミ(Khademi)らのJ. Neuroimmunol. 103: 202 (2000)は、IFN−βが抗炎症性のサイトカイン(例えばIL−4およびIL−10)を刺激し、かつインターフェロンγ(IFN−γ)および腫瘍壊死因子α(TNF−α)のようなプロ炎症性サイトカインを阻害する能力があると報告している。
【0072】
以下の実施例は本発明の制限でなく、例示を意図している。それらは用いられる可能性のあるものの典型であるが、当業者に既知の他の方法も用いられうる。
【0073】
実施例1.骨髄由来のラット間葉間質細胞(MSC)の調製/単離
ラットのMSCを単離するために、生後8週目〜12週目のラットから頸骨および大腿骨を切り出した。この骨の端部を切断して、針とシリンジを用いて5mlのDMEM(GIBCO/BRL)により、髄液を除いた。100×106個〜200×106個の完全骨髄細胞を、DMEM/10%のFBSに入れた175cm2組織培養フラスコにプレーティングした。24時間後、非接着細胞を培地を置換することによって除去した。培地は、細胞がコンフルエントに達するまで成長するように、2日〜3日毎に取り替えた。細胞を、4分の3が、0.25%のトリプシンおよび1mMのEDTAとともにインキュベートして取り出した。
【0074】
実施例2.骨髄由来のヒトMSCの調製/単離
ヒトMSCは、正常な男性と女性のボランティアの腸骨稜(iliac crest)から採取した吸引物より増殖させた。吸引物をα−MEM/10%のウシ胎児血清(FBS)を用いて1:1に希釈し、1,000×Gで30分間、密度勾配遠心分離を行った(Ficoll−Paque Plus; 1.077g/ml; Pharmacia)。上清と境界部を混合し、約40mlまでα−MEM/10%のFBSを用いて希釈してから遠心分離を行った。核のある細胞をα−MEM/10%FBS中で1×107/mlの濃度で懸濁し、25cm2の培養皿に3×106/cm2でプレーティングした。細胞を3日間インキュベートし、培地を取り替えることによって非接着細胞を除去する。培養物がコンフルエントに達してから細胞を、0.25%のトリプシンおよび1mMのEDTAとともに37℃で3分間から4分間インキュベートすることによって取り上げた。細胞を1:2または1:3に希釈し、その後置換した。方法を3回から5回の継代(passage)で繰り返した。2回目の継代の開始時には、5ng/mlの血小板由来の成長因子αα(PDGF−AA;GIBCO/BRL)が培地に加えられた。
【0075】
実施例3.免疫拒絶しない新生ラットにヒトMSCを投与した
ヒトMSCは、細菌性LacZおよび緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するウイルスに感染させた。フラックス(Flax)らのNature Biotech、16: 1033 (1998)は、この様式で細胞を感染するための方法を開示している。約50,000個のヒトMSCを新生ラットの側脳室に注射し、その後フラックス(Flax)らの (1998)、同上文献に開示されたような方法論を行った。ラットをさまざまな間隔において殺し、脳の断片をβ−ガラクトシダーゼ活性(LacZ遺伝子の産物)について染色した。多くの細胞がラットの神経系に統合されており、青色に染色された(β−ガラクトシダーゼ活性の産物)。さらに免疫拒絶の明らかなサインはなかった。したがって移植は、若い動物では免疫拒絶と直接的には関連せず効果を示した。
【0076】
実施例4.ヒトMSCは、ミエリン欠損ラットに投与されると、乏突起膠細胞に分化する能力を発現した
ミエリン欠損(MD)ラットはプロテオリピドタンパク質(PLP)遺伝子に遺伝的欠陥を持っていて、結果的にCNSにおいてミエリンを形成する能力がない。その結果これらの動物は生後三週で死ぬ。50,000個台の細胞をこの技術分野で周知の方法を用いて新生ラットの脳側室に注射することにより、MSCが乏突起膠細胞に分化できるかどうかが試験される。
【0077】
移植後一週目か二週目に、移植したラット(DNAのテールクリップ(tail clip)分析によって試験した)と正常のラットの両方を殺し、それらの脳を光学顕微鏡によって調べた。Luxol耐性青色染色法を用いると、いくつかのミエリンがMDラットに存在していることが明らかであった。また、間接的免疫蛍光分析法はPLPの発現を表したが、それは注射したMSCおよび宿主細胞には通常は存在していない(PLP遺伝子の突然変異による)。これらの細胞がヒトPLPを発現するという知見は、ヒトMSCが乏突起膠細胞に分化するという概念と一致している。
【0078】
実施例5.ヒトMSCは新生ラットに投与されると神経細胞に分化する能力を示す
実施例4と同様に、ヒトMSCを、細菌のLacZおよび緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するウイルスを用いて感染させた。約50,000個のヒトMSCを新生ラットの側脳室に注射した。動物を殺し、脳を検査したところ、β−ガラクトシダーゼを発現する細胞が存在していて、かつ神経組織を持つ細胞が存在することが明らかとなった。免疫ペルオキシダーゼ研究法を組織断片について行うことによって、これらの細胞がヒト神経細胞であることを確認できた。この目的に対して選択された抗体は、ヒト神経細胞にあるエピトープを認識するモノクローナル抗体、MOC1であった。MOC1を用いて染色した後に断片を調べるとMOC1陽性の数個の細胞が認められ、このことはヒトMSCが起源であるヒト神経細胞がラットの脳に存在していたことを示している。
【0079】
実施例5.ラットMSCは、hTERTを用いたレトロウイルス感染により不死化された
継代2代目のMSC(Ocirus)を50%コンフルエントでプレーティングし、レトロウイルスpBABEハイグロマイシンhTERT(PA317タンパク質エンベロープにパッケージングされている)を用いて37℃の加湿したインキュベーター中で6時間感染させた。感染後、細胞を3回リン酸緩衝生理食塩水を用いて洗浄し、培養培地に配置した(10%のウシ胎児血清(Atlanta Biologicals)および2mMのL−グルタミン(GIBCO/BRL)を添加したαMEM)。4日後選抜用薬剤であるハイグロマイシンを培養培地に50マイクログラム/mLの濃度で添加した。数週間後ポリクローナルコロニーを単離し、拡張してからhTERT転写産物をRT−PCRによって分析した。これらの細胞巣に含まれる細胞の集団は形態学的に均一で、MSCに対する分化の欠陥経路である脂肪物質(adipocte)を形成する可能性があった。RT−PCRデータによって、これらの急速に増殖するラットのMSCにおいて、hTERTのメッセージレベルが増加することが確認される。このデータは、不死化したMSC分化がさまざまな系統に分化する能力を有することを強く示唆している。
発明の背景
1.発明の分野
本発明は、神経細胞および乏突起膠細胞の機能不全または喪失にそれぞれ関係する中枢神経系(CNS)の病状を軽減するために、別個の種類の細胞を調製し利用することに関する。
【0002】
2.関連技術の説明
哺乳動物のCNSの二成分である乏突起膠細胞および神経細胞は有糸分裂を容易に行わず、したがって疾患や外傷によって引き起こされたそれらの喪失に対してインビボでは置換されない。例えばパーキンソン病には、ドーパミンを産生する脳の一部における神経細胞の喪失が関与する。ドーパミンレベルは結果として低下し、筋肉の震せん、筋肉および関節の硬直、ならびに全体的な協調性の欠如の発生となって現れる。別の神経崩壊性の疾患である多発性硬化症(MS)は、出生後の早期の成長段階で、乏突起膠細胞によって構成されるミエリンの軸策鞘が脱落することに特徴づけられる。この脱ミエリン化により、軸策に沿ったシグナル伝達が妨害され、視力障害、協調性の喪失、および記憶喪失までも引き起こされる。
【0003】
このような疾患の痛烈な効果は、CNSの神経細胞および乏突起膠細胞を含む支持細胞に細胞をインビトロで分化させるのに適応できる細胞系および培養条件に関する研究の動機となってきた。例えば、ラットのO−2A細胞である乏突起膠細胞の前駆体が増殖培地からマイトジェンを除去することによって、成熟乏突起膠細胞への分化を促しうることが調べられている。バレス(Barres)ら、Development 120: 1097(1994)。また、疎水性の細胞表面受容体に対する甲状腺ホルモン、糖質コルチコイドおよびレチノール酸などのリガンドが存在するのであれば、マイトジェンが存在する血清非含有培地で培養された場合には、ラットのO−2A細胞が成熟乏突起膠細胞に分化すると考えられる。同上。ヒトの奇形癌腫細胞系は「NT2」と称され、インビトロでの操作を行う複雑な管理下の手段によって6週間から10週間の期間の間に有糸分裂後のCNS神経細胞に分化できる。ユンキン(Younkin)ら、Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 90: 2174 (1993)。
【0004】
多能性神経幹細胞は神経細胞を得るための別の可能なルートである。したがって米国特許第5,851,832号は、神経細胞系統に分化できる能力があると言われる、前頭の側脳室の裏にある上衣下の領域から得られた構成的増殖細胞の亜集団を開示している。乏突起膠細胞または神経細胞に分化する能力があるものの、神経幹細胞を可能性を秘めている治療的利用に十分なほどの量で得ることは困難である。奇形癌腫誘導性のNT2系のような既知の細胞系が関わるこの事実および欠点は、乏突起膠細胞または神経細胞のレベルの減少によって特徴づけられる疾患を治療するために利用できる治療方法がほとんどないことを意味している。
【0005】
発明の概要
したがって本発明の目的は、神経幹細胞およびありきたりの細胞系とは無関係のそれぞれ分化した乏突起膠細胞および神経細胞に対する供給源を提供することにある。
【0006】
本発明の別の目的は、神経細胞および/または乏突起膠細胞の喪失によって特徴づけられた、CNSに影響する病状に対して実行可能な治療的アプローチを提供することにある。
【0007】
これらおよびその他の目的を達成する場合において、本発明の一局面によると、損傷を受けたミエリンまたは神経学的な変性によって特徴づけられる病状を治療するための方法であって、以下の段階を含む方法が提供される:(A)(i)間葉間質細胞、即ち「MSC」および(ii)それに対する生理学的適合性の担体から本質的になる組成物をインビトロで提供する段階;(B)MSCが神経細胞および/または乏突起膠細胞に分化するような条件に、前記組成物を曝露する段階;並びにその後(C)前記分化細胞が、問題となっている病状に罹患した患者における神経学的変性または損傷を受けたミエリンについて補償することを可能にする段階。好ましい態様ではこの組成物は、患者の神経系に導入される。
【0008】
本発明の別の局面によると分化細胞は、MSCが神経細胞および/または乏突起膠細胞にインビトロで分化するような条件に、上記に記載したようにMSC含有組成物を曝露することによって調製される。
【0009】
関連する特質において本発明は、不死化した間葉間質細胞と生理学的に悪影響を及ぼさない担体から本質的になる組成物をさらに提供する。また本発明は、不死化した間葉間質細胞、一つまたは複数の外因性遺伝子、および生理学的適合性の担体から本質的になる組成物を包含する。
【0010】
好ましい態様の詳細な説明
間葉間質細胞、即ち非造血細胞の幹細胞様前駆体がそれぞれ乏突起膠細胞および神経細胞に分化できることが判明している。本発明以前には、MSCが乏突起膠細胞または神経細胞に分化できるという指摘はなかった。骨髄から単離された少なくとも一つのサブセットの細胞が、星状膠細胞、別のCNS細胞型の進化経路を追随できることが示唆された。アジジ(Azizi)らの、Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95: 3908 (1999)参照。しかしこれまでは、MSCが乏突起膠細胞または神経細胞組織に至る系統に沿って分化できることを予測する根拠はなかった。
【0011】
本発明者らによって発見されたこの驚くべき能力により、MSCおよびMSC分化細胞は、本発明にしたがって(A)パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、および卒中のような神経細胞喪失に特徴付けられるCNSの病状、ならびに(B)テイ−サックス病、GM1ガングリオシドーシス、アデノ白質ジストロフィー、クラッベ病、異染性白質ジストロフィーおよび多発性硬化症のような乏突起膠細胞の喪失が関与する代謝性の脂質貯蔵性疾患を治療するための治療供給源となる。同じ特徴によって本発明はまた、頭部の傷害または他の外傷によってもたらされた神経細胞の喪失を軽減するためのMSCおよびMSC分化細胞の利用法も提供する。
【0012】
これらのために本発明はその局面の一つにおいて、乏突起膠細胞および神経細胞のいずれかを必要としている患者に、治療上有効量のMSCまたはMSC分化細胞を投与する段階を企画している。これに関連して「MSC分化細胞」とは、未成熟なおよび成熟した、乏突起膠細胞および神経細胞の両方をそれぞれ含むMSCから分化した何らかの細胞を指す。「治療上有効な」とは、治療を受けている患者のCNS疾患の有害な作用を減少させる(「軽減する」)MSCまたはMSC分化細胞の量を意味する。
【0013】
下記により詳細に記載したように、局所麻酔して採取することのできる骨髄の吸引物からMSCを単離することは比較的容易である。またそれらを培養して拡張し、外因性DNAを用いてトランスフェクトすることも、プロコップ(Prockop)、Science 276: 71 (1997)に報告されているように比較的容易である。インサイチューでの移動性と多能性といった幹細胞様の質と併せてこれらの利点があるため、例えば脳の癌のようなCNS疾患を治療する状況で治療用DNAを供給するためのビヒクルとして使用できるMSCが本発明によって推奨された。
【0014】
MSC自体は本発明によって治療用に投与できるが、多くの例ではCNS疾患に罹患した患者にMSC分化細胞を投与するほうがより実用的であると考えられる。このためMSCは、経験的に決定された適切な培養条件下で、神経細胞の分化または乏突起膠細胞の分化に影響を与えることがわかっている種々の栄養因子を添加および除去してインビボでの生理的条件を擬態させることによってそれぞれ乏突起膠細胞および神経細胞に分化できる。
【0015】
骨髄からの MSC の単離
本発明の目的のためのMSCは、例えばアジジ(Azizi)ら(1999)の同上文献に開示された既知の方法論によって入手できる。このため骨髄を、本発明によって治療されるべき患者となりうるドナーの腸骨稜から吸引することができる。骨髄のドナーは肝炎およびHIVについてスクリーニングすべきである。続いてMSCを、アジジ(Azizi)ら(1999)の同上文献によって例示されている従来の技術によって骨髄から単離する。
【0016】
このアプローチにより、骨髄の吸引物を、ウシ胎児血清(FBS)を用いて希釈し、遠心分離する。その後で上清と界面を混合し、再び希釈してから遠心分離を行う。続いて核のある細胞を望ましい濃度のFBSで懸濁し、適切な密度で培養皿にプレーティングする。細胞を約3日間インキュベートし、続いて非付着性の細胞を培地を置換することによって取り除く。培養物がコンフルエントに達してから細胞をトリプシン処理して取り上げる。希釈段階と再プレーティング段階を、第2代目の継代開始の際、血小板誘導性の成長因子αα(PDGF−AA;GIBCO/BRL)を添加し、3代から5代の継代を繰り返すことができる。
【0017】
神経細胞前駆細胞のインビトロでの増殖および分化
MSCは、増殖と分化を高める基質上で増殖させねばならない。そのような適当な基質はゴットリーブ(Gottlieb)らのCULTURING NERVE CELLS、202−06 (MIT Press、1998)の方法論によって得られるのであるが、彼らは組織培養フラスコの底部を0.1%のゼラチンで被覆し、神経細胞の前駆細胞を増殖させ分化させることに導く表面を入手した。ゴットリーブ(Gottlieb)らはまた、MSCの増殖に影響を与えるのに適した培養培地も開示しており、ピルビン酸塩、およびFBSを含まないグルタミン、仔ウシ血清、白血病阻害因子(LIF)、β−メルカプトエタノール、並びに蒸留水にさまざまな濃度の5’−ヌクレオシドを含むヌクレオシドストックを加えたダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)である。
【0018】
ゴットリーブ(Gottlieb)の方法論は、胚幹細胞(ES)が神経細胞に分化する前に胚幹細胞を増殖させるために用いられ、それはMSCの増殖/分化を刺激する目的に容易に適用される。同様に神経細胞の前駆細胞の増殖を誘導するための他の方法を、本発明によるインビトロでのMSCの増殖に影響を与えるように適合させることが可能である。例えばブルストル(Brustle)らのNature Biotechnology 16: 1040 (1998)はこの目的にふさわしい増殖培地を開示しており、それはDMEM、グルコース、グルタミン、炭酸水素ナトリウム、インシュリン、ヒトアポ−トランスフェリン、プロゲステロン、プトレッシン、亜セレン酸ナトリウム、ペニシリン/ストレプトマイシン、繊維芽細胞成長因子(FGF2)、および上皮成長因子(EGF)を含む。
【0019】
LIFおよびβ−メルカプトエタノールはどちらも培養物中のMSCの自然な分化を抑制する点で重要であるため、MSCを増殖させる際にはLIFとβ−メルカプトエタノールのレベルをモニターすべきである。また、培養物の密度をモニターすること、また確立された限度内のレベル、即ち60%〜70%のコンフルエントを維持することも重要である。
【0020】
MSCの継代は簡単な手順である。骨髄を最初にプレーティングした後、MSCを、アジジ(Azizi)ら(1999)の同上文献に開示されたように、付着性に差異があることを利用して造血細胞から精製する。引き続くMSCの継代は標準的なトリプシンプロトコールの手段、例えばハンクの塩(GIBCO−BRL No. 15050)に0.25%のトリプシンをEDTAとともに入れた手段によって行われる。MSCをプレーティングした後のほぼ2日目には培養物は全体で約3×106個の細胞を持っているはずであり、その後で細胞は、ほとんどコンフルエントになっているフラスコの細胞の例えば10分の1が新しい基質に植えられるように継代することができる。
【0021】
MSCを神経細胞の形態に分化させるために、MSCの増殖を刺激する任意の成長因子が培養物から通常は抜き取られ、そして細胞の分化を刺激する神経成長因子(NGF)およびレチノール酸(RA)のような物質が添加される。分化を誘導するための代表的な培養条件はロネット(Ronnet)ら、Science 248: 603 (1990)、およびプレジャー(Pleasure)ら、Neuroscience 12: 1802 (1992)によって開示されており、彼らは1−イソブチル−3−メチルキサンチン(IBMX)、ジブチリルアデノシン3’,5’−モノホスフェート(cAMP)、および神経成長因子(NGF)を添加し、続いて2日から4日後に細胞培養物にRAを導入した。RA処理を行った後細胞を低密度で再プレーティングすることができる。約2日以上の期間が経過した後、同濃度のRAを用いて培地を置換した。この段階ではNGFは、神経の分化に影響を与える適当な成長因子を残している。さらにNGFはまた、リチャード(Reichardt)およびファリナス(Farinas)がMOLECULAR AND CELLULAR APPROACHES INTO NEURAL DEVELOPMENT 220−263(Oxford Univ. 1997)によって報告したように成熟神経細胞の生存を促進する点での役割も果たしており、したがって利用可能である。
【0022】
細胞を置換する場合、それらが増殖している基質からそれらを単離すべきである。この目的への一アプローチは、培養フラスコを揺すってフラスコから細胞を無理やり移動させることを伴い、これにより細胞が浮く。その後で浮遊する細胞を培地で洗浄し、そして再プレーティングする。この際の細胞培養に適した基質はMATRIGEL(登録商標)(Becton Dickinson、Bedford MA、USAの製品)であり、基底膜マトリックスには成長因子のほかに、コラーゲンIV、ラミニン、エンタクチン、およびなかでもヘパラン サルフェート プロテオグリカン(ペルレカン)(perlecan)が含まれる。次に細胞を、FBSとペニシリン/ストレプトマイシンを含み、約1μlのシトシンアラビノシド、およびそれぞれ10μlのフルオロデオキシウリジンとウリジンを補充したDMEM高グルコース(HG)に植えることができる。
【0023】
神経細胞系統に沿った分化に影響を与えるさらに別のアプローチは、MSCを条件培地(CM)に導入することを伴う。例えばヘンダーソン(Henderson)らのProc. Nat’l Acad. Sci. USA 78: 2625 (1981)には、ニワトリの胚抽出物を含む適当なCMが開示されている。ヘンダーソン(Henderson)らによって開示された方法論に従うと、培養段階は基質に細胞をプレーティングするこから始まるのであるが、基質はゼラチンでコーティングされたプラスチック皿であってもよい。培養内地は、三成分最小必須培地、一成分培地199、10%(vol/vol)の熱不活性化ウシ血清、1%のニワトリ胚抽出物、2mMのグルタミン、100ユニット/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンを含む。アラビノシトシンの量は、当業者には明らかとなる時間が経過した後、分割中の細胞を殺せるように添加されうる。1日から4日後、培地を除去し、細胞を最小必須培地(2mMのグルタミン、100ユニット/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンを含むイーグル)で二度洗浄する。続いて細胞を新しい(「非適合」)最小必須培地に載せる。1日から4日以上の培養を行った後、培地、ここでは「適合」培地を除去し、保存してから新しい、非適合培地によって置換するが、それはまた約4日間で適合する。適合培地は数週間、4℃でその活性を保持したまま保存できる。
【0024】
神経細胞系統に沿ったMSC分化を誘導するために、LIFおよびβ−メルカプトエタノールを存在させるべきではない。分化する状況ではしたがって、LIFおよびβ−メルカプトエタノールを両方とも存在させない前述した培地のどれかにおいて、MSCを培養することが好ましい。
【0025】
本発明に従ってインビトロでの培養物が40%から60%の神経細胞を含む時点まで分化段階が達した場合に、見かけの密度レベル100%までさらに「精製」することは、例えばNT2細胞を精製するのに採用された戦略を用いて可能である。クレップナー(Kleppner)らのJ. Comp. Neurology 357: 618−632 (1995)は、適当な「精製」段階を記載している。この段階は、トリプシンを用いて神経細胞細胞を無理に移動させることを伴い、その後で細胞を再プレーティングしてからそれらに、5%のウシ胎児血清(FBS)(Hyclone、Logan、UTの製品)、1%のペニシリン/ストレプトマイシン(JRH)(Biosciences、Lenexa、KSの製品)、および有糸分裂阻害剤とともにDMEM−HGを含む、適合培地の1:1希釈物を二度与える。適当な有糸分裂阻害剤は、1μMのウリジン、1μMの5−フルオロ−2’−デオキシウリジン(FUDR)、および0.1MのAraC(Sigma、St. Louis、MOの製品)を含む。この培養段階を行った約1週間後、細胞培養物は、約99%の純粋な有糸分裂後の神経細胞を含んでいるはずである。
【0026】
細胞発生のモニタリング
培養培地における栄養因子の濃度を変化させ、それによって目的の系統をMSCに分化させるのに好ましいようにするための計画は、上記に記載したように所定のプロトコールの経過で起こる細胞発生をモニターすることによって経験的に決定されうる。特定の細胞の発生段階と同様に、生きている細胞の濃度は同じく従来の手法によって決定できる。例えば成熟神経細胞の表現形があることは、細胞が軸策および樹状突起を含む高度に分極した神経細胞形態を含んでいた場合に明らかとなる。さらに細胞を、ニューロフィラメントサブユニット、タウタンパク質、微小管関連タンパク質2(MAP2)、および神経細胞接着分子(N−CAM)のような神経細胞特異性遺伝子産物を産生する効力によって培養物中で同定できる。
【0027】
このように、神経細胞遺伝子の産物に結合するか、さもなければヒト神経細胞自体を同定する抗体に細胞を接触させること、続いて選択された培養条件下でマーカーに結合する細胞濃度を確かめることが日常的に行われる実験である。この方式で、MSCの神経細胞への分化を促進できる最適の培養条件を決定できる。この目的のための適当な抗体の例は、MOCH−1、M12、T14、RMO93、RMO24、RMO217、およびRMO301である。クレップナー(Kleppner)ら(1995)の同上文献、およびミヤゾノ(Miyazono)ら、J. Comp. Neurol. 357: 818 (1995)には、ヒトの神経細胞を同定するためにこれらの抗体を使用することが記載されている。例えばMOCH−1は、神経細胞を識別できるポリペプチドのN−CAMにあるヒト特異的エピトープを結合できる。ブルメンドルフ(Brummendorf)らのCurr. Opin. Neurobiol. 6: 584 (1996)は、N−CAMが発見されたために神経接着タンパク質および認識タンパク質を含む100以上のIgドメインが同定されたことを報告している。N−CAMと同様に、これらのタンパク質はこの状況において神経細胞特異的マーカーとして機能できる。
【0028】
本発明はまた、より特異的マーカーが必要とされるのであればそのマーカーの利用法も包含する。パーキンソン病はドーパミン作動性神経細胞に悪い影響を与えるため、例えばチロシンヒドロキシラーゼおよびドーパミンβ−ヒドロキシラーゼのようなドーパミン作動性神経細胞に特異的なマーカーは、本発明によって培養物中で産生されたドーパミン作動性神経細胞を検出する際に都合がよい。同様にコリンアセチルトランスフェラーゼはアルツハイマー病に罹患した患者に影響を与えるコリン作動性神経細胞に対するマーカーであり、またトリプトファンヒドロキシラーゼはセロトニン作動性神経細胞に対するマーカーである。
【0029】
インビトロでの乏突起膠細胞前駆細胞の増殖および分化
培養培地と栄養因子を適切に組み合わせた場合、MSCはまた、インビトロで乏突起膠細胞に分化するように本発明によって刺激できる。上述したように本質的に分化の進行をモニターすることが可能で、それによって分化段階を容易にする栄養因子を添加したり、取り除いたり、および/または濃度を変えたりして適当な計画を立てることができる。
【0030】
MSCを前述したように骨髄から単離し、望ましい培養密度にまで増殖させた後で細胞を、例えばバレス(Barres)ら(1994)の同上文献によって記載されているように乏突起膠細胞の増殖および分化に適した条件で、ポリ−D−リジン(PDL)でコーティングされた組織培養上に、血清非含有培地に入れてプレーティングすることができる。こうして培養物は、DMEM、ウシ血清アルブミン(BSA)、セレン、プトレッシン、チロキシン、トリヨードチロニン、トランスフェリン、プロゲステロン、亜セレン化ナトリウムおよび適当な栄養因子を含むことができる。ウシ血清培地は純度が高く、結晶レベルの品質のBSA(Sigma A4161)を用いて調製することによって、残存する因子が含まれるのを避けるべきである。またピルベート(1mM)の助けが存在すると、細胞培養の早期の段階でのMSCが支持される。温度を30℃〜40℃の範囲に維持する必要がある。
【0031】
二つの群の栄養因子、即ちサイトカインと成長因子は、MSCの乏突起膠細胞への増殖と分化に特に関連する。この状況で用いられる成長因子の例は、PDGF−αおよびPDGF−ααを含む血小板由来成長因子(PDGF)、塩基性繊維芽細胞由来成長因子(bFGF)、トランスフォーミング成長因子α(TGF−α)、インシュリン様成長因子−1(IGF−1)、ニューロトロフィン−3(NT3)、および甲状腺ホルモンである。バレス(Barres)らのDevelopment 118: 283 (1993)、loc. cit. 120: 1097 (1994)、およびGlial Cell Development 71: (1996)、ゴクハン(Gokhan)らの16A COMPANION TO METHODS IN ENZYMOLOGY 345−58 (Academic Press、1998)参照。サイトカインは例えば、毛様体神経栄養因子(CNTF)、白血病阻害因子(LIF)、インターロイキン6、インターロイキン11およびインターロイキン12(IL−6、IL−11、IL−12)、並びにコロニー刺激因子(CSF)の中から選択することができる。同上文献。
【0032】
マイトジェンである成長因子は細胞の増殖を促進するが、分化は誘導しない。bFGFは乏突起膠細胞およびその子孫のためのマイトジェンであり、系統の進行(progression)を調節する。NT−3およびPDGFも、乏突起膠細胞系統に関わってゆく細胞に対する強力なマイトジェンである。PDGFに対する乏突起膠細胞の増殖性の反応は、Pro−OL段階では保持されているが(下記の表参照)、PDGF−α受容体の下方制御前のPre GalC段階で失われる。IGF−1は、Pro−OLの分化および可能ならば増殖の増強によって、培養物における乏突起膠細胞の産生を促進して増加させる。したがって、IGF−1を少なくともPro−OL段階で始まる培養物に導入することが有効であると考えられる。
【0033】
甲状腺ホルモンが存在するとミエリンになるまでの早期の段階から乏突起膠細胞系統の分化に影響するため、ホルモンは乏突起膠細胞の発生に重要な役割を果たしていると考えられる。バレス(Barres)ら(1994)の同上文献。甲状腺ホルモンは、マイトジェンの存在下で前駆細胞が乏突起膠細胞に分化するのを可能にすると考えられる。しかしマイトジェンが存在しない場合は、分化を誘導する必要はない。同上。
【0034】
本発明の一態様では、bFGFおよび/またはPDGF−ααのような成長因子を用いて分化していない細胞を予め処理し、その後因子の除去とサイトカインの添加が連続して行われることが有用である。サイトカインは本明細書に記載されたものの組み合わせであってもよい。乏突起膠細胞の分化が起きている間は培養温度をモニターし、当業者にとって明らかになりうる確立された範囲内の温度に維持することが重要である。
【0035】
マウスの胎児から得られる海馬と大脳の子孫が関与する実験に基づいて、ゴクハン(Gokhan)ら(1998)の同上文献は、別個の因子からなる5個のサブクラスから得られるサイトカインが、乏突起膠細胞系統種を進化させる系統への傾倒と細胞の成熟をプログラムするために用いられると考えられることを報告した。さらに具体的には、bFGF、PDGF−αα、IGF−1、NT3、およびCNTF/IL−6のサブクラスのメンバーの組み合わせが解明された。さらに、たとえばCNTF、LIF、IL−11、IL−12、およびG−CSFなどのgp−130関連リガンドにより、複数の系列の移行における様々な細胞活性を示す能力が示された。このようにゴクハン(Gokhan)らは、MSCの乏突起膠細胞への分化を誘導するのに必須である栄養因子を適当に組み合わせるための眼識を提供した。
【0036】
さらにバレス(Barres)ら(1993)の同上文献は、インビトロで乏突起膠細胞が長期間生存するのを促進する3つのクラスの栄養因子、即ち(1)IGF、(2)ニューロトロフィン、特にNT−3、ならびに(3)CNTF、LIFおよびIL−6の重要性を報告した。代(3)群の分子は同種のサイトカインのファミリーに属する。CNTFは、インビボで乏突起膠細胞の生存を促進する別の生存(survival)因子である。即ちそれは、星状膠細胞特異性タンパク質GFAPを発現させるために培養物中に乏突起膠細胞前駆体を誘導するとともに、それはまた、インビトロ精製乏突起膠細胞に対する生存因子でもある。LFおよびIL−6は両方とも、精製された乏突起膠細胞の生存を促進する。バレス(Barres)ら(1993)によって開示されているように、インビトロでは、プラトーに達した濃度のLIFまたはIL−6によって、精製された乏突起膠細胞の約50%の生存が促進された。
【0037】
ルイス(Louis)らのJ. Neurosic. Res. 31: 193−204 (1992)によって開示されたB104 CMのような神経芽細胞腫CMは、本発明によってMSCを乏突起膠細胞に分化させるのに適した別の種類の培地である。このために前述したようにMSCを骨髄から単離し、適当な基質上で望ましい培養密度にまで増殖させてからそこから分離した。この単離されたMSCを上述したように、約10μg/mlのポリ−D−リジンでコーティングされた組織培養皿またはガラス製のカバーグラス片(Bellco Glass)などの基板上に移すことができる。基板はさらに、1.5Mのホウ酸塩でコーティングされていてもよい。
【0038】
MSCを、ペニシリンおよびストレプトマイシンの混合物に入れた2mMのグルタミンとともに、DMEMに入れた約10%のウシ胎児血清を含む培地にある基板上にプレーティングすることができる。好ましくは細胞を、1/2コンフルエントと完全なコンフルエントの間の密度、例えば約5,000個の細胞/cm2になるようプレーティングする。細胞をプレーティングした後、乏突起膠細胞前駆体への分化を誘導するB104 CMのような培地を添加する前に、それらの細胞がその基質表面に接着できるようにすることが好ましい。この接着段階は、MSCをプレーティングした後の通常約24時間で自然に起こると考えられる。
【0039】
充分な濃度の細胞が基質に接着したら細胞を最小必須培地で洗浄し、選択した神経芽細胞腫適合培地で培養する。この目的でB104 CM培地を作製するために、B104 CM培地のような神経芽細胞腫の細胞の培養物を、10%の熱不活性化ウシ胎児血清(Hyclone、Hogan、UTの製品、またはSigma、St. Louis、MOの製品)、2mMのグルタミン、および100μg/mlのペニシリンを補充したDMEM中で増殖させる。培養物がコンフルエントの約2分の1から完全なコンフルエントまでの濃度に達してからそれを例えばハンクの塩溶液(Hank’s salt solution)で二度洗浄し、そしてボッテンスタイン(Bottenstein)らのExp. Cell Res. 135: 183 (1980)に記載されたように、2mMのグルタミン、100μg/mlのペニシリン、およびN1サプリメントを組み合わせた血清非含有DMEM中でインキュベートする。N1サプリメントは、50μg/mlのトランスフェリン、5μg/mlのインシュリン、100mMのプトレッシン、20nMのプロゲステロン、および30nMのセレンを含む。約3日または4日の培養を行った後、培地を取り出し、濾過してから必要とされるまで−20℃で保存する。培地を一週間以内に用いることが好ましい。
【0040】
MSCの乏突起膠細胞前駆体への分化を誘導するために、記載されたように単離およびプレーティングされたMSCを、その容積の約30%のB104 CM培地を含むN1培地中で培養する。(N1培地は、5μg/mLのトランスフェリン、16.1μg/mLのプトレッシン、6.3ng/mLのプロゲステロン、3.3ng/mLのセレン、10ng/mLのビオチン、2mMのグルタミン、および5μg/mLのインシュリンを含むDEMEを含む。) 得られた「B104/N1」培地は凍結したストックから、好ましくは1週間以上は保存されていないストックから調整できる。この段階での細胞培養物は、乏突起膠細胞前駆細胞に分化した、またはさもなくば似ている、任意の細胞を検出するためにモニターするべきである。
【0041】
MSCの乏突起膠細胞前駆細胞への細胞分化は約6時間から12時間の素早さで起こり、B104/N1培地で細胞を培養した約24時間後までに容易に起こると考えられる。乏突起膠細胞の前駆細胞は、前駆細胞型に小さなプロセスが存在すること、同様にそれが相対的に小さい大きさであって丸い形状になっていることで他の細胞型と識別できる。一方MSCは通常、乏突起膠細胞前駆細胞に比べてかなり扁平で長い。また乏突起膠細胞前駆細胞を、従来の免疫組織化学的手法を用いて培養物に含まれる他の細胞と識別できる。このプロセスを実行するのに適した抗体には、下記の表に列挙したようなA2B5およびGD3が含まれる。B104適合培地はまた、MSCから分化した乏突起膠細胞前駆細胞の急速な増殖も誘導する。したがって、一部のMSCが乏突起膠細胞前駆体に分化した後でもB104 CMが存在し続けていると、より高濃度の乏突起膠細胞前駆体を得ることができる。
【0042】
乏突起膠細胞前駆細胞が100%の培養集団を含んでいない場合には、培養物に含まれる乏突起膠細胞前駆細胞の純度を高めるために、培養物を、例えばグリンスパン(Grinspan)ら、J. Neurobiol. 43: 1−17 (2000)に記載されているような従来の免疫パニング法(immunopanning techniques)に供することができる。この免疫パニング精製方法は、カルシウムまたはマグネシウムを含まないハンクス溶液中でトリプシン処理または粉砕処理を行い、続いてペレット化、計数、および培養培地への細胞の再懸濁を行うことで培養物から細胞を取り出す段階を包含する。この培地は例えば、10μg/mlのインシュリン、30mMの亜セレン化ナトリウム(sodium selenite)、10μg/mlのヒトトランスフェリン、10−11のトリヨードチロニン、0.05μg/mlのヒドロコルチゾン、50倍に濃縮された最小必須アミノ酸10μg/mlの10倍濃縮されたMEMビタミン類、ならびにペニシリンおよびストレプトマイシン(1%vol/vol)を入れたHam’s F12を含む。
【0043】
この細胞は、例えば非組織培養用のプラスチック製ペトリ皿であってもよい一つまたは複数の予めコーティングされた免疫パニング用皿に移されるまで懸濁液に入れたままにしてもよい。この免疫パニング用皿は、懸濁液に含まれる他の細胞から乏突起膠細胞前駆細胞を分離するのに有用な基質でコーティングされている。したがって免疫パニング用皿に細胞を植える前に、懸濁液に含まれる細胞型に対する親和性をその少なくとも一個が持っているような一つまたは複数の抗体で、皿をコーティングする。
【0044】
一態様においては免疫パニング用皿をまず、二次抗体、即ち一次抗体に対して親和性を持つ抗体で被覆する。この状況での「一次抗体」とは、免疫パニング用皿に植えられる細胞の懸濁液に含まれる少なくとも一つの細胞型に対する親和性を持つ抗体である。選択された二次抗体は、用いた一次抗体によって異なると考えられる。例えば、一次抗体が「Ran−2」である場合の二次抗体はIgGでありうるし、また一次抗体が「A2B5」もしくは「04」である場合はIgMでありうる。二次抗体が免疫パニング用皿にコーティングされた後で二次抗体を約6時間〜18時間、4℃でインキュベートすることによって、充分な量の抗体を免疫パニング用皿に接着させることができる。その後皿を約1回から5回、例えば滅菌性のPBSで洗浄することにより、プレートが乾燥しないように注意を払って非接着性の二次抗体を除去することができる。
【0045】
その後で一次抗体を免疫パニング用皿に添加することができ、皿を約1時間、例えば約25℃でインキュベートすることができる。非接着性の抗体は、免疫パニング用皿を約1回〜5回、好ましくは2回、滅菌性PBSを用いて、例えばプレートを乾燥させないように注意を払って洗浄することによって除去できる。このために洗浄溶液を、最後の洗浄をした後で免疫パニング用皿に残ったままにしておくことができる。
【0046】
一次抗体を免疫パニング用皿に被覆してから、培地、即ち例えば上述したとおりのサプリメントを補充したHam’s F12を含む約8mlの培地に入れた細胞が一皿あたり約2,000,000個〜4,000,000個、好ましくは2,500,000個〜3,000,000個の密度となるように、細胞を皿に植えることができる。皿内の組成物を、一次抗体が細胞に結合するのに充分な時間、約25℃でインキュベートすることができる。インキュベート時間は、約15分間から2時間、好ましくは約30分間であってよい。
【0047】
この皿の一次抗体は乏突起膠細胞前駆体に対する親和性を持っていないものであってもよいが、その代わり懸濁液に含まれる別の細胞型に対する親和性を持っている。例えば一次抗体は、ラットの星状膠細胞または星状膠細胞の前駆体に結合し、おそらくヒトの星状膠細胞にも結合できるRan−2であってもよい。したがってこのような抗体は、「望ましくない」細胞および/または他の混入物に結合すると考えられる。よって、一次抗体と複合体を形成しない細胞に乏突起膠細胞前駆体が含まれると考えられる。非接着性細胞(即ち一次抗体に結合しない細胞)を従来の手法によって皿から取り出すことができ、別の免疫パニング用皿に移すことができる。
【0048】
非接着性細胞が移された新しい免疫パニング用皿は同様に、乏突起膠細胞前駆細胞に結合しないが、その代わりに懸濁液中に存在する可能性のある他の細胞に結合する一次抗体を含むと考えられる。例えば一次抗体はここでもRan−2であってもよいし、または乏突起膠細胞前駆体ではない一つまたは複数の細胞型を認識する別の抗体であってもよい。非乏突起膠細胞前駆細胞が乏突起膠細胞前駆細胞よりもRan−2に対して親和性が高いため、Ran−2はこれに関して適当な抗体である。前述したように一次抗体と複合体を形成しない細胞には乏突起膠細胞前駆体が含まれ、それは簡単な技術によって皿から取り出されうり、別の免疫パニング用皿に植えられる。本発明は、乏突起膠細胞前駆細胞には結合しないが、その代わり懸濁液に存在する可能性のある他の望ましくない細胞および/または混入物に結合する一次抗体を含む免疫パニング用皿上で、細胞を一回、二回、またはそれ以上継代することを提供する。
【0049】
細胞が移された免疫パニング用皿も、乏突起膠細胞前駆細胞に特異的か、または乏突起膠細胞前駆細胞に対して別のように親和性を持つ一次抗体を含むと考えられる。例えば一次抗体は、ロイ(Roy)ら、J. Neurosci. 19: 9986−1003 (1999)に開示されているように、A2B5または04、即ちヒト前駆体も認識するラットの乏突起膠細胞前駆体に対する抗体であってもよい。細胞と抗体からなる組成物をインキュベートさせると、一次抗体が乏突起膠細胞前駆細胞に結合すると考えられる。培養培地などの非接着性材料は皿を洗浄して除去されうる。残っている乏突起膠細胞前駆細胞を、トリプシン−バーシン(versine)溶液を用いて一次抗体から分離できる。続いて結合しなかった乏突起膠細胞前駆体を、上述したように、N1/B104培地を含む培地中の新しいペトリ皿に植えることができる。
【0050】
B104 CMが乏突起膠細胞前駆体がさらに分化するのを阻害しうる成長因子を含んでいるため、乏突起膠細胞前駆細胞が成熟乏突起膠細胞に分化する段階には、B104 CMを別の培地と置換する段階が通常は含まれる。したがって上述した乏突起膠細胞前駆体をB104/N1培地から単離でき、例えばトランスフェリン、プトレッシン、プロゲステロン、セレン、ビオチン、グルタミン、インシュリン、T4、およびグルコースの混合物を含む50%DMEMおよび50%Ham’s F12を含んでいる培地(「DMEM/F12分化用培地」)で増殖させることができる。特に、この混合物は、50μg/mLのトランスフェリン、5mg/mLのプトレッシン、3ng/mLのプロゲステロン、2.6ng/mLのセレン、10ng/mLのビオチン、2mMのグルタミン、12.5μg/mLのインシュリン、0.4μg/mLのT4、および0.3%のグルコースを含むことができる。乏突起膠細胞前駆体を成熟乏突起膠細胞に分化させるのに適した別の培地は、上述したように栄養因子CNTFおよびNT−3を含む。このためにCNTFおよびNT−3を、それぞれ2ng/ml〜5ng/mlおよび100ng/mlでDMEM/F12分化用培地に添加することができる。
【0051】
星状膠細胞のCMは本発明の細胞を乏突起膠細胞に分化させるためのさらに別の適当な培地である。ゴットリーブ(Gottlieb)らのCULTURING NERVE CELLS 517−530 (MIT Press、1998)はこの培地の調整法を開示しており、それは、星状膠細胞の培養物をDMEM−BS中で48時間増殖させる段階、培地を収集する段階、続いて培地を新しいDMEM−BSと置換してさらに48時間増殖させる段階からなる。約500mlのDMEM−BSの適当な混合物は次の成分を含んでいる:25μg/mlのゲンタマイシン(Gibco BRL no. 15750−011)を加えた469mlのD−MEM(Gibco BRL No.11995−065);10mlの調製インシュリン;5mlの調製トランスフェリン;5mlのグルタミン;および11mlの「サプリメント混合物」。サプリメント混合物は444mlの容量で作製されうる。第1段階は、200mlのPBS+0.72mLのウシ血清アルブミン(BSA)パス(path)−o−サイト(cyte)4(ICN Biochemicals、St. Louis、MO)、200mlのH2O+322mgのプトレッシン(Sigma no. P−7505)、20mlのエタノール(EtOH)+8.0mgのチロキシン(T4、Sigma no.T−2501)、および20mlのEtOH+6.74mgのトリヨードチロニン(T3、Sigma no.T−2752)を組み合わせることである。甲状腺ホルモン非含有培地が必要な場合には、T3およびT4を対応する量のEtOHと置換することができる。次に、20mlのEtOH+12.46mgのプロゲステロン(Sigma No.P−0130)、および20mlのH2O+7.74mgのセレン(Sigma No.S−1382)からそれぞれ2mlずつ加える。次にこの混合物全体を0.22μmのフィルターを通過させて濾過し、11mlのアリコートに分離してから−20℃で保存することができる。上述した調製トランスフェリンは、二度蒸留した水に10mg/mlのトランスフェリン(Sigma No.T−2252)を混合し、続いて濾過段階を行うことによって得られる。200mgのインシュリン(Sigma No.I−5500)を100mLのH2O中で前もって希釈し、その後インシュリンが溶解するまでHCl(1N/約、10ml)を添加することによって、調製インシュリンを作製する。0.22μmのフィルターを通過させて混合液を濾過した後、最終容量が400mlになるまで滅菌水を加える。
【0052】
細胞発生のモニタリング
前述したように、栄養因子を添加したり、取り除いたりおよび/または濃度を変えたりする必要性は、特定のプロトコールで細胞が発生するのをモニターすることによって経験的に決定できる。この状況では、特定の細胞の発生段階はもちろん、生きている細胞の濃度もこの技術分野で既知の方法によって測定できる。
【0053】
例えばインビトロの生存細胞の濃度は、バレス(Barres)ら(1993)の同上文献に記載されているようなMTT生存アッセイ法によってモニターできる。この段階によって3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(MTT、Sigmaの製品)を、ミリポア(Millipore)フィルター(0.22μm)を通過させることによって滅菌したPBSに溶解する。このストック溶液を37℃で約1時間かけて培養物に添加する。活性なミトコンドリアを持つ生存細胞はテトラゾリウム環を開裂することによって、可視性のダークブルー ホルマザン反応生成物を形成できる。可視化細胞の割合は、明視野相(phase)の顕微鏡によって計数できる。
【0054】
さらに、発生段階が異なると異なる濃度の栄養因子が必要であると考えられ、同様にそのプロトコールに他の変化も必要となると考えられるため、特定の培養条件で乏突起膠細胞前駆細胞の発生段階を決定することが有用である。特定の乏突起膠細胞前駆体段階に対して特異的な既知のマーカーのうちのどれかが、例えば既知の免疫組織化学的方法によってインビトロでの細胞分化を追跡する際に使用できると考えられる。
【0055】
このようにMSCおよび/またはMSC分化細胞は、さまざまな量の栄養因子によって特徴づけられる別個の培養条件下でガラス製のカバーグラス上で培養できる。上述した経験的な計画によって細胞を培養した後で細胞を固定化し、続いて乏突起膠細胞の発生段階に対応する特定のマーカーの存在を検出するために抗血清を用いて処理する。このように得られた情報は、成熟乏突起膠細胞にMSC分化するのに最適な培養条件を決定する際の助けとなる。
【0056】
フェイファー(Pfeiffer)らのTrends in Cell Biol. 3: 191 (1993)は、乏突起膠細胞の既知の発生段階を同定するために用いることのできる種々の段階特異的マーカーを開示している。これらの発生段階、およびそれぞれの段階を同定するマーカーが以下の表に示されている。
【0057】
さらに具体的には、この表は、これらの異なる段階における段階特異的マーカーとカップリングした既知の段階の乏突起膠細胞発生を列挙していて、いくつかのマーカーを同定する抗体が括弧内に示されている。最も早期の段階は、細胞が増殖し一極性になっている場合のPre−GD3(Pre−O−2A)であって、胚の神経細胞接着分子を発現する。この段階の細胞は、増殖性で遊走性の、双極GD−3(O−2A)細胞に分化する。O−2A前駆細胞は、モノクローナル抗体(Mabs)GD3およびA2B5によって認識されるガングリオシドを発現する。プロ−オリゴデンドロブラスト(Pro−OL)段階は、次に乏突起膠細胞の発生系統になり、二つのMab、O4およびAOO7と反応することによって同定できる多極性で後遊走性の増殖性細胞に特徴があって、硫酸塩化した表面抗原のPOAを認識する。次の一過性のPre−GalC発生段階は、Mab Rとは反応するが、抗GalC Mab O1とは反応しないという前駆細胞の能力によって同定される。未成熟なOL段階の開始は、GalCおよびスルファチドの合成と細胞表面への輸送によって、同様に2’−3’−環状ヌクレオチド3’−ホスホヒドロラーゼ(CNP)の合成によって同定される。成熟乏突起膠細胞は、プロテオリピドタンパク質(PLP)、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)、およびミエリン/乏突起膠細胞糖タンパク質(MOG)のようなマーカーの調節性の発現とともに発生した。したがってこれらの段階特異的マーカーは、それぞれの乏突起膠細胞発生段階における最適の培養条件を推定するための強力なツールを提供する。
【0058】
MSC の不死化
本発明はまた、不死化したMSCの細胞系を作製し、それによって細胞の活力とMSCの供給量を増加させることも包含する。ある条件で不死化されたMSCは、本明細書に開示された細胞系に分化する能力を有する同種のヒト細胞を無限的で更新可能に供給できるようにし、インビトロで細胞の収率を最大にする。
【0059】
まず細胞を、増殖を実質的に阻害しない表面にプレーティングする。MSCは、増殖促進性タンパク質の産生および/または活性が外部因子によって調節可能になるように、増殖促進遺伝子、即ち適当な条件下でトランスフェクトした細胞の増殖を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含む適当なベクターを用いてプレーティングした細胞をトランスフェクトまたは感染することによって、条件付けして不死化できる。一態様では増殖促進遺伝子は、myc遺伝子、SV40ラージT抗原遺伝子、および突然変異p53遺伝子(国際公開公報第98/10058号参照)のような癌遺伝子である。別の態様では、ミエルソン(Myerson)らのCell 90: (1997)(GenBankアクセッション番号第AFO 18167号参照)によって報告されているように、テロメラーゼ遺伝子(hTERT)の2kDの触媒性フラグメントは調節性のプロモーターの調節下におかれている。また、ランゲ(Lange)らのScience 283(5404): 947−9 (1999)も参照。
【0060】
外因性遺伝子を用いるMSCのトランスフェクションは、さまざまな従来の方法、即ち限定するわけでないが、レトロウイルスまたはアデノウイルスの感染、エレクトロポレーション法、およびリン酸カルシウム法−外因性遺伝子のDNAの取り込み促進法を含む方法によって達成できる。MSCをトランスフェクトした後、本明細書に記載した培養条件を整えることによって、それらを維持し、かつ乏突起膠細胞および神経細胞にそれぞれ分化させることが可能である。
【0061】
したがって本発明は、hTERTをコードする能力を有するDNA分子を含むベクター(例えば、レトロウイルス構築物)をMSCに供給する段階を企図している。本発明はまた、毒素の選択性に対して適合するタンパク質をコードする遺伝子(例えばneo耐性またはハイグロマイシン耐性の遺伝子)をMSCに供給する段階も提供する。この毒性選択性遺伝子を従来技術によって使用することによって、毒性選択遺伝子、およびこうして不死化された遺伝子をゲノムに統合したMSCを単離することが可能になる。例えば、毒性薬剤である例えばハイグロマイシンによって殺されない形質導入されたMSCは、ポリクローナル細胞増殖巣(focus)を形成する。形質導入したMSCの別の特徴的な指標は、不死化遺伝子を発現しないMSCに比べて、急速に増殖することである。一旦単離されると、感染細胞集団には、hTERTのような不死化遺伝子を発現しないMSCが、存在するとしてもほんの少ししか含まれていないことが好ましい。一旦不死化されると、本明細書に開示された方法論によって、MSCは乏突起膠細胞または神経細胞系統のいずれかに分化されうる。
【0062】
本発明はまた、h−tertとともに一つまたは複数の別の外因性DNA分子を用いてMSCを感染させる段階も提供する。例えばヒトMSCを不死化するには、癌遺伝子(例えばH−ras、T抗原、またはmyc)を活性化することが必要であると考えられ、かつ、腫瘍抑制遺伝子(例えばp53)のような、増殖を阻害する一つまたは複数のタンパク質を抑制することも必要であると考えられる。
【0063】
さらに本発明は、他の種類の外因性遺伝子を用いるMSCのトランスフェクション、または感染も企図している。例えば下記に記載したような遺伝子治療の状況では、不死化されたMSCを、例えば必要とされる神経伝達物質をコードする外因性DNA分子を用いてトランスフェクトできる。
【0064】
CNS 疾患の患者の治療
本発明により、CNS疾患を有する患者の治療段階は、疾患のあるCNSの領域を含むCNSへ、MSCまたはMSC分化細胞を脳内移植する段階を含むことができる。MSC分化細胞には例えば、B104 CMを含む培地中でMCSを培養することによって分化された乏突起膠細胞前駆体が挙げられる。本発明の細胞を、脳内室領域、実質組織(盲注射として、または定位注射により特定部位へ、のいずれかとして)、およびクモ膜下または軟膜下の空間などの多くの部位に注射できる。注射の特定の部位は、皮質の灰白室、白室、基底核、および脊髄の部分であることができる。原理的には、本明細書に記載されたようなCNS疾患による影響を受けている任意の動物は、本明細書に記載された一つまたは複数の方法論によってそのように治療されうる。
【0065】
移植についての従来の技術は、例えばNEURAL GRAFTING IN THE MAMMALIAN CNS、ブルヨクランド(Bjorklund)およびステネビ(Stenevi)編 (1985)に記載されており、文献の内容は参照として本明細書に組み入れられる。段階は実質組織の移植を含んでおり、それは宿主の脳組織に本発明の細胞を注射することによって達成される。しかしながら本発明の細胞を移植することで、多くのCNS領域に影響を与えることが可能になる。
【0066】
本発明によると、患者の脳の選択的領域への細胞の投与は、穴を開ける段階、そしてミクロシリンジのニードルの挿入が可能になるように硬膜を補強する段階によってなされると考えられる。または、その細胞は、脊髄領域にクモ膜下腔より注射することができる。本発明の細胞調整物は、脳または脊髄の任意の予め決められた部位への細胞の移植を可能にする。別個の解剖学的領域から得られる細胞の混合物と同様に、同一の細胞懸濁液を用いて数カ所の部位で同時に多重移植を作用させることも可能である。
【0067】
本発明による患者の治療はMSCの移動能力を利用することが可能であり、それらを用いてペプチド、タンパク質またはその他の物質を、それらの物質に関連する機能不全または欠陥によって影響されるCNSの領域へと提供できる。このため本発明の細胞(成熟神経細胞に分化したMSCを含む)は、CNS疾患に罹患した患者が欠いている産物をコードする外因性DNAを含んでいてもよい。例えばDNAは、アセチルコリンもしくはGABAのような伝達物質、または例えば伝達物質に対する受容体をコードしうる。患者がグルタミン酸誘導性の障害に罹患した場合には、グルタミン酸誘導性の細胞毒性を減少させることの可能なグルタミン酸輸送タンパク質についてコードしている遺伝子を患者に導入することが望ましいと考えられる。ドーパミン、アドレナリン、ノルアドレナリン、エピネフリン、ノルエピネフリンおよびセロトニンのような他の伝達物質は、合成されるためには別個の遺伝子によってコードされる多数の酵素が必要である。
【0068】
さらなるアプローチでは、成長因子またはサイトカインをコードするDNAがMSCにトランスフェクトされることができ、その後、その病因または合成が遺伝子発現産物における欠陥または機能不全と関連するような、CNS疾患に罹患した患者に投与される。このため本発明は、例えば、発現の際の、NGF、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア細胞系由来神経栄養因子(GDNF)、IGF−1またはCNTFを産生する遺伝子の使用を企図している。さらに、選択される遺伝子は、LIFをコードしていてもよいし、または例えばリチャード(Reichardt)およびファリナス(Farinas)(1997)の同上文献によって開示されている、細胞の生存もしくは分化を促進する任意の他のサイトカインをコードしていてもよい。
【0069】
本発明にかかる治療法は、皮質または基底核に好ましくは定位で細胞を注射することによって効果を発現させることができる。その後でMSCによって分泌される要求されたリガンドの拡散および取り込みは、患者の神経細胞が例えば遺伝子産物の産生に欠陥を与えている場合に起こる疾患の症状を緩和する点で有効でありうる。こうして神経成長因子(NGF)のような神経栄養因子を分泌するように遺伝子的に修飾されたMSCを、処理をしなかったなら死んでしまった可能性のあるコリン作動性神経細胞の変性を抑制するために用いることができる。また、パーキンソン病のようなドーパミン神経の喪失によって特徴づけられる疾患に罹患した患者に移植されるべきMSCを、L−DOPA、即ちドーパミンの前駆体をコードする外因性DNAを含むように修飾することができる。
【0070】
本発明によると他のCNS疾患、即ちアルツハイマー病、ガングリオシド貯蔵性疾患、卒中によるCNSの損傷、および脊髄損傷を含む疾患も同様に治療できる。例えばアルツハイマー病は、基底前脳のコリン作動性神経細胞の変性に特徴がある。これらの神経細胞のための神経伝達物質はアセチルコリンであって、それは神経細胞の生存のために必須である。これらの神経細胞の生存を促進できる因子に対する外因性遺伝子を含むMSCの移植を、本発明によって記載したとおりに達成できる。
【0071】
別の態様では、本発明の細胞は、患者の免疫応答を下方制御する能力を有する遺伝子を用いてトランスフェクトされ、続いて本明細書に記載された方法の一つによって患者に投与されうる。この種類の治療は、多発性硬化症のような炎症性の疾患を治療するためにも役立つ。この態様に係る好ましい遺伝子は、IL−4またはIL−10のような抗炎症性サイトカインをコードする遺伝子である。またこの遺伝子は、プロ炎症性サイトカインの阻害剤であってもよい。インターフェロンβ(IFN−β)は炎症性疾患を治療するためのさらに別の候補である。例えばカデミ(Khademi)らのJ. Neuroimmunol. 103: 202 (2000)は、IFN−βが抗炎症性のサイトカイン(例えばIL−4およびIL−10)を刺激し、かつインターフェロンγ(IFN−γ)および腫瘍壊死因子α(TNF−α)のようなプロ炎症性サイトカインを阻害する能力があると報告している。
【0072】
以下の実施例は本発明の制限でなく、例示を意図している。それらは用いられる可能性のあるものの典型であるが、当業者に既知の他の方法も用いられうる。
【0073】
実施例1.骨髄由来のラット間葉間質細胞(MSC)の調製/単離
ラットのMSCを単離するために、生後8週目〜12週目のラットから頸骨および大腿骨を切り出した。この骨の端部を切断して、針とシリンジを用いて5mlのDMEM(GIBCO/BRL)により、髄液を除いた。100×106個〜200×106個の完全骨髄細胞を、DMEM/10%のFBSに入れた175cm2組織培養フラスコにプレーティングした。24時間後、非接着細胞を培地を置換することによって除去した。培地は、細胞がコンフルエントに達するまで成長するように、2日〜3日毎に取り替えた。細胞を、4分の3が、0.25%のトリプシンおよび1mMのEDTAとともにインキュベートして取り出した。
【0074】
実施例2.骨髄由来のヒトMSCの調製/単離
ヒトMSCは、正常な男性と女性のボランティアの腸骨稜(iliac crest)から採取した吸引物より増殖させた。吸引物をα−MEM/10%のウシ胎児血清(FBS)を用いて1:1に希釈し、1,000×Gで30分間、密度勾配遠心分離を行った(Ficoll−Paque Plus; 1.077g/ml; Pharmacia)。上清と境界部を混合し、約40mlまでα−MEM/10%のFBSを用いて希釈してから遠心分離を行った。核のある細胞をα−MEM/10%FBS中で1×107/mlの濃度で懸濁し、25cm2の培養皿に3×106/cm2でプレーティングした。細胞を3日間インキュベートし、培地を取り替えることによって非接着細胞を除去する。培養物がコンフルエントに達してから細胞を、0.25%のトリプシンおよび1mMのEDTAとともに37℃で3分間から4分間インキュベートすることによって取り上げた。細胞を1:2または1:3に希釈し、その後置換した。方法を3回から5回の継代(passage)で繰り返した。2回目の継代の開始時には、5ng/mlの血小板由来の成長因子αα(PDGF−AA;GIBCO/BRL)が培地に加えられた。
【0075】
実施例3.免疫拒絶しない新生ラットにヒトMSCを投与した
ヒトMSCは、細菌性LacZおよび緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するウイルスに感染させた。フラックス(Flax)らのNature Biotech、16: 1033 (1998)は、この様式で細胞を感染するための方法を開示している。約50,000個のヒトMSCを新生ラットの側脳室に注射し、その後フラックス(Flax)らの (1998)、同上文献に開示されたような方法論を行った。ラットをさまざまな間隔において殺し、脳の断片をβ−ガラクトシダーゼ活性(LacZ遺伝子の産物)について染色した。多くの細胞がラットの神経系に統合されており、青色に染色された(β−ガラクトシダーゼ活性の産物)。さらに免疫拒絶の明らかなサインはなかった。したがって移植は、若い動物では免疫拒絶と直接的には関連せず効果を示した。
【0076】
実施例4.ヒトMSCは、ミエリン欠損ラットに投与されると、乏突起膠細胞に分化する能力を発現した
ミエリン欠損(MD)ラットはプロテオリピドタンパク質(PLP)遺伝子に遺伝的欠陥を持っていて、結果的にCNSにおいてミエリンを形成する能力がない。その結果これらの動物は生後三週で死ぬ。50,000個台の細胞をこの技術分野で周知の方法を用いて新生ラットの脳側室に注射することにより、MSCが乏突起膠細胞に分化できるかどうかが試験される。
【0077】
移植後一週目か二週目に、移植したラット(DNAのテールクリップ(tail clip)分析によって試験した)と正常のラットの両方を殺し、それらの脳を光学顕微鏡によって調べた。Luxol耐性青色染色法を用いると、いくつかのミエリンがMDラットに存在していることが明らかであった。また、間接的免疫蛍光分析法はPLPの発現を表したが、それは注射したMSCおよび宿主細胞には通常は存在していない(PLP遺伝子の突然変異による)。これらの細胞がヒトPLPを発現するという知見は、ヒトMSCが乏突起膠細胞に分化するという概念と一致している。
【0078】
実施例5.ヒトMSCは新生ラットに投与されると神経細胞に分化する能力を示す
実施例4と同様に、ヒトMSCを、細菌のLacZおよび緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するウイルスを用いて感染させた。約50,000個のヒトMSCを新生ラットの側脳室に注射した。動物を殺し、脳を検査したところ、β−ガラクトシダーゼを発現する細胞が存在していて、かつ神経組織を持つ細胞が存在することが明らかとなった。免疫ペルオキシダーゼ研究法を組織断片について行うことによって、これらの細胞がヒト神経細胞であることを確認できた。この目的に対して選択された抗体は、ヒト神経細胞にあるエピトープを認識するモノクローナル抗体、MOC1であった。MOC1を用いて染色した後に断片を調べるとMOC1陽性の数個の細胞が認められ、このことはヒトMSCが起源であるヒト神経細胞がラットの脳に存在していたことを示している。
【0079】
実施例5.ラットMSCは、hTERTを用いたレトロウイルス感染により不死化された
継代2代目のMSC(Ocirus)を50%コンフルエントでプレーティングし、レトロウイルスpBABEハイグロマイシンhTERT(PA317タンパク質エンベロープにパッケージングされている)を用いて37℃の加湿したインキュベーター中で6時間感染させた。感染後、細胞を3回リン酸緩衝生理食塩水を用いて洗浄し、培養培地に配置した(10%のウシ胎児血清(Atlanta Biologicals)および2mMのL−グルタミン(GIBCO/BRL)を添加したαMEM)。4日後選抜用薬剤であるハイグロマイシンを培養培地に50マイクログラム/mLの濃度で添加した。数週間後ポリクローナルコロニーを単離し、拡張してからhTERT転写産物をRT−PCRによって分析した。これらの細胞巣に含まれる細胞の集団は形態学的に均一で、MSCに対する分化の欠陥経路である脂肪物質(adipocte)を形成する可能性があった。RT−PCRデータによって、これらの急速に増殖するラットのMSCにおいて、hTERTのメッセージレベルが増加することが確認される。このデータは、不死化したMSC分化がさまざまな系統に分化する能力を有することを強く示唆している。
Claims (14)
- 損傷を受けたミエリンまたは神経学的な変性によって特徴づけられる病状を治療するための方法であって、以下の段階を含む方法:
(i)間葉間質細胞(mesenchymal stromal cell)およびそれに対する生理学的適合性の担体から本質的になる組成物をインビトロで提供する段階;(ii)該間葉間質細胞が、神経細胞(neuron)および乏突起膠細胞(oligodendrocyte)より選択される種類の分化細胞に分化するような条件に該組成物を曝露する段階;ならびに(iii)該分化細胞が、該病状に罹患した患者における該神経学的変性または損傷を受けたミエリンについて補償することを可能にする段階。 - 段階(ii)が、組成物を患者の神経系に導入する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 段階(ii)がインビトロで実行され、かつ段階(iii)が、分化細胞が損傷を受けたミエリンまたは神経学的な変性について補償するように、患者の神経系に分化細胞を導入する段階を含む、請求項1記載の方法。
- 分化細胞を調製するための方法であり、以下の段階を含む方法:
(i)間葉間質細胞およびそれに対する生理学的適合性の担体から本質的になる組成物を提供する段階;ならびに(ii)該間葉間質細胞が神経細胞または乏突起膠細胞にインビトロで分化するような条件に該組成物を曝露する段階。 - 不死化した間葉間質細胞およびそれに対する生理学的適合性の担体から本質的になる組成物。
- 不死化した間葉間質細胞、一つまたは複数の外因性遺伝子、およびそれらに対する生理学的適合性の担体から本質的になる組成物。
- 外因性遺伝子がhTERTである、請求項6記載の組成物。
- 損傷を受けたミエリンによって特徴づけられる病状を治療するための方法であって、以下の段階を含む方法:
(i)間葉間質細胞およびそれに対する生理学的適合性の担体から本質的になる組成物をインビトロで提供する段階;(ii)神経芽細胞腫適合(conditioned)培地を含む培地において該細胞を培養する段階であって、乏突起膠細胞に分化できる乏突起膠細胞の前駆細胞を提供する段階;および(iii)該分化細胞が、該病状に罹患した患者における該損傷を受けたミエリンについて補償することを可能にする段階。 - 神経芽細胞腫適合培地がB104適合培地である、請求項8記載の方法。
- 段階(iii)が、分化細胞が損傷を受けたミエリンについて補償するように、患者の神経系に乏突起膠細胞の前駆細胞を導入する段階を含む、請求項9記載の方法。
- 間葉間質細胞を乏突起膠細胞の前駆細胞に分化させる方法であって、以下の段階を含む方法:
(i)該間葉間質細胞およびそれに対する生理学的適合性の担体から本質的になる組成物をインビトロで提供する段階;ならびに(ii)神経芽細胞腫適合培地を含む培地において該細胞を培養する段階であって、乏突起膠細胞に分化できる乏突起膠細胞の前駆細胞を提供する段階を含む方法。 - 神経芽細胞腫適合培地がB104適合培地である、請求項11記載の方法。
- 間葉間質細胞を乏突起膠細胞に分化させる方法であって、以下の段階を含む方法:
(i)請求項12記載の方法を行う段階;および(ii)該乏突起膠細胞の前駆細胞の少なくとも一部が乏突起膠細胞に分化するような条件に、該乏突起膠細胞の前駆細胞を曝露する段階を含む方法。 - 段階(ii)が、B104適合培地から乏突起膠細胞の前駆細胞を単離する段階を含む、請求項13記載の方法。
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