ES2241297T3

ES2241297T3 - Celulas madre no embrionarias neuronales ependinales y metodo que sirvve para aislar estas.

Info

Publication number: ES2241297T3
Application number: ES99933396T
Authority: ES
Inventors: Ann Marie Janson; Jonas Frisen; Clas Johansson; Stefan Momma; Diana Clarke; Ming Zhao; Urban Lendahl; Kioumars Delfani
Original assignee: NeuroNova AB
Current assignee: NeuroNova AB
Priority date: 1998-06-25
Filing date: 1999-06-24
Publication date: 2005-10-16
Anticipated expiration: 2019-06-24
Also published as: MXPA00012078A; KR20010071601A; ATE293160T1; BR9911509A; CA2330175A1; EP1090105A1; AU4945999A; DE69924728T2; SE9802264D0; WO1999067363A9; EP1090105B1; WO1999067363A1; CN1325637C; AU770501B2; US7320872B2; US20030092176A1; DE69924728D1; CN1307632A; JP2002518043A

Abstract

Una célula madre del SNC neural ependimal no embrionaria aislada, cuya célula expresa la proteína de superficie Notch 1 junto con al menos una proteína de superficie seleccionada entre el grupo de Notch 2, Notch 3, CAR (adenovirus que se une a proteínas de transmembrana) y CFTF (regulador de la conductancia de transmembrana en la fibrosis quística) y cuya célula tiene también al menos un cilio.

Description

Células madres no embrionarias neuronales ependinales y método que sirve para aislar éstas.

Campo técnico

La presente invención se relaciona con un método de aislamiento de células madre del SNC neural ependimal que nunca antes han sido identificadas y aisladas del sistema nervioso central de mamíferos. La invención se relaciona también con preparaciones que contienen dichas nuevas células per se, con composiciones farmacéuticas que contienen las preparaciones y con diversos usos médicos de las mismas, así como con ensayos que las utilizan.

Antecedentes

Hasta hace pocos años, prevalecía universalmente una vista "estática" del destino de las células nerviosas en el sistema nervioso central (SNC), en base a la suposición de que no se podrían generar nuevas neuronas en el cerebro del mamífero adulto. Sin embargo, dicha renovación de neuronas ha sido descrita en ciertas regiones del SNC del adulto, por ejemplo, en el bulbo olfatorio, donde las señales procedentes de las neuronas del órgano del olfato alcanzan el cerebro (Kaplan y col., Science 197: 1092), y en la circunvolución dentada del hipocampo (Bayer y col., Science 216: 890). Como las neuronas son incapaces de dividirse, la adición de nuevas neuronas sugería la existencia de células inmaduras, es decir, de células progenitoras o madre, que pueden generar neuronas. Se presentó evidencia que apoya la existencia de una célula madre neural multipotente en el SNC del mamífero adulto hace unos cuantos años (Reynolds y col., Science 255: 1707). Sin embargo, como en varios otros órganos, la constatación de la existencia de una célula madre ha llegado antes de identificar y localizar la misma. Es interesante el hecho de que la neurogénesis en el cerebro adulto persiste a través de toda la vida adulta en roedores (Kuhn, P.G., J. Neurosci. 16: 20) y parece ser un fenómeno evolutivo bien conservado presente en una variedad de mamíferos (Gould y col., J. Neurosci. 17: 2492; Gould y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 3168). En humanos, esta cuestión es difícil de abordar, aunque los datos experimentales de cultivos de tejido cerebral humano adulto (Kirschenbaum y col., Cereb. Cortex 6: 576) sugieren que puede haber una neurogénesis continua también en el SNC humano adulto.

Se demostró por vez primera la existencia de células madre neurales en el SNC de mamíferos adultos cultivando células del cerebro y de la médula espinal de ratas adultas. En determinadas condiciones de cultivo, se puede propagar una población de células madre neurales multipotentes a partir de cerebro y médula espinal de rata adulta disociados (Reynolds y col., Science 255: 1707, Dev. Biol. 175: 1; Weiss y col., J. Neurosci. 16: 7599). El medio de cultivo tiene que contener un factor mitogénico, por ejemplo, un factor de crecimiento epidérmico ("EGF") o un factor de crecimiento fibroblástico ("FGF") y se debe excluir el suero. Contrariamente a las células madre, la mayoría de los otros tipos de células del SNC no sobreviven en estos cultivos.

En estas condiciones, las células individuales proliferan in vitro y la progenie forma un grupo de células agregadas (Reynolds y col., Science 255: 1707; Dev. Biol. 175: 1). Dichos clones celulares se desprenden de la placa de cultivo después de unos cuantos días in vitro. Las células continúan proliferando y forman un agregado celular esferoideo característico, al que se hace referencia como neuroesfera, de células estrechamente agrupadas, que derivan todas ellas de una sola célula. La mayoría de las células de la neuroesfera expresan nestina (Lendahl y col., Cell, 60: 585), pero no marcadores típicos para células diferenciadas. Estas células indiferenciadas se diferencian rápidamente si se plaquean en un substrato adhesivo o si se añade suero al medio de cultivo. Es importante el hecho de que un clon de células derivadas de una sola célula puede generar neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, lo que demuestra que al menos la célula inicial era multipotente (Reynolds y col., Science 255: 1707, antes citado; Dev. Biol. 175: 1). Más aún, si se disocia un clon celular, muchas de las células formarán nuevos grupos de células multipotentes indiferenciadas (Reynolds y col., Dev. Biol. 175: 1), satisfaciendo así los criterios para ser células madre.

Así, el método anterior sufre del grave inconveniente de que la población celular usada es de composición mixta compleja. Incluso aunque haya sido posible intensificar el crecimiento de algunos tipos celulares, es imposible sacar ninguna conclusión en cuanto a la localización original de las células obtenidas.

En consecuencia, se han propuesto otros métodos para determinar la localización de las células madre del SNC del adulto, donde se han disecado cuidadosamente partes diferentes del cerebro anterior de roedores adultos y se han cultivado para estudiar la capacidad de neurogénesis. Estos estudios han demostrado que las células madre son más abundantes en la pared del ventrículo lateral y en el hipocampo (Lois y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2074; Morsehead y col., Neuron 13: 1071; Palmer y col., Mol. Cell. Neurosci. 6: 474, antes citado, 8: 389). Más aún, se pueden aislar células madre de las paredes del tercer y cuarto ventrículo, así como de la médula espinal del adulto, lo que sugiere la presencia de células madre adyacentes al sistema ventricular a lo largo de todo el neuroeje (Weiss y col., J. Neurosci. 16: 7599).

Sin embargo, la localización exacta y la identidad de la célula madre neural han resultado enigmáticas. La pared de los ventrículos laterales ha sido objeto de estudios morfológicos detallados (Doetsch y col., J. Neurosci. 17: 5046). El sistema ventricular está revestido por una sola capa de células ependimales. Las células ependimales de mamífero han sido tradicionalmente consideradas como células altamente especializadas con la función principal de formar una barrera entre el tejido nervioso y el fluido cerebroespinal (Del Bigio, Glia 14: 1), lo que constituye un fuerte argumento en contra de que estas células sean células madre indiferenciadas. Por debajo de la capa ependimal está la capa subependimal, también conocida como la zona subventricular. Esta área alberga astrocitos, neuroblastos y células progenitoras (Doetsch y col., J. Neurosci. 17: 5046). Las células progenitoras de la capa subependimal tienen una alta tasa de proliferación (Morsehead y col., J. Neurosci. 12: 249). En general, las células madre proliferan muy lentamente y, cuando se mataban selectivamente las células subependimales de rápida proliferación, no se suprimía la población de células madre, lo que constituye un argumento en contra de que estas células sean las células madre (Morsehead y col., Neuron 13: 1071).

WO 97/44442 (Johe) describe el aislamiento de células madre del SNC de mamíferos y más concretamente de la región subependimal del estriado que reviste los ventrículos laterales. Sin embargo, sólo se usan las células subependimales y, por lo tanto, no hay ninguna enseñanza más en cuanto a la identidad y función de las células ependimales de mamíferos que altere la convencional.

WO 95/13364 (Weiss y col.) se relaciona con un método de proliferación de células precursoras del SNC localizadas por el ventrículo del SNC de un mamífero. Sin embargo, sólo se describen las células precursoras y no se enseña nada en cuanto a otros estadíos celulares, tales como las células madre.

En este contexto, es interesante observar que, además del bulbo olfatorio y del hipocampo, los datos sobre la neurogénesis continua a través de la vida adulta en otras regiones del cerebro de mamíferos han sido escasos. Como un ejemplo de que la neurogénesis puede ser un fenómeno más extendido, se ha aislado un pequeño número de células con la capacidad de generar neuronas in vitro del estriado y del septo (Palmer y col., Mol. Cell. Neurosci. 6: 474), aunque no se ha estudiado si estas células tienen propiedades de células madre o si son progenitoras neuronales declaradas.

Hay una creciente evidencia de que las lesiones en el sistema nervioso pueden afectar a las células madre del SNC del adulto. Después de lesiones tanto de la médula espinal como del cerebro, la expresión de nestina aumenta en las células que revisten el canal central y en la zona subventricular, respectivamente (Frisén y col., J. Cell. Biol. 131: 453; Holmin y col., Eur. J. Neurosci. 9: 65). Se ha sugerido que estas células derivan de células madre. Con el tiempo, se ven células que expresan nestina progresivamente más allá del canal central y del ventrículo lateral y estas células expresan marcadores astrocíticos (Frisén y col., J. Cell. Biol. 131: 453; Holmin y col., Eur. J. Neurosci. 9: 65). Estos datos han llevado a la sugerencia de que las células madre o las células progenitoras que residen en el sistema ventricular son inducidas a proliferar, a migrar hacia el sitio de la lesión y a diferenciarse en astrocitos. Más aún, las lesiones del hipocampo aumentan la proliferación de células progenitoras del hipocampo y el número de neuronas granulares en el hipocampo (Gould y col., Neurosci. 80: 427). Sin embargo, como la célula madre no ha sido identificada o localizada con exactitud, no está claro si las células madre juegan un papel en los procesos de lesiones.

Doetsch y col., Cell 97: 703, han tratado recientemente de analizar la identidad de una célula madre neural en la pared del ventrículo lateral del cerebro adulto. Presentan varios experimentos que sugieren que una célula madre expresa proteína ácida fibrilar glial ("GFAP"). La GFAP se expresa en muchos astrocitos y Doetsch y col. concluyen que la célula madre que describen es un astrocito. Sin embargo, existe una plétora de estudios de ellos y de otros grupos que demuestran inequívocamente que GFAP se expresa en otros varios tipos celulares, tales como ciertas células hepáticas, células de Schwann no mielinizantes, tanicitos y células ependimales. Esto hace imposible concluir, en base a la expresión de GFAP, que la célula madre que describen sea un astrocito. No se ha demostrado que se exprese ningún marcador específico de astrocitos por las células neuronales por parte de Doetsch y col. o por cualquier otro grupo.

WO 99/16863 describe la generación de células hematopoyéticas a partir de células madre neurales multipotentes de mamífero. Por consiguiente, se pueden administrar células madre neurales a pacientes que tienen leucemia, linfoma o deficiencia inmune en lugar de un trasplante de médula ósea. Sin embargo, el documento no dice nada sobre la regeneración de otros órganos.

En consecuencia, el descubrimiento de la existencia de células madre neurales en el SNC adulto de mamíferos es importante y puede hacer posible desarrollar estrategias para estimular la generación de nuevas neuronas o células gliales. Sin embargo, varias cuestiones importantes han quedado sin responder y se necesitan mejores métodos para cultivar estas células y para estudiarlas cuantitativamente in vivo. Lo que es más importante, es absolutamente vital identificar y localizar la célula madre en el SNC adulto para poder estudiar aún más estas células y para estimular la generación de nuevas neuronas a partir de células madre.

Más aún, no se dispone de métodos actualmente para purificar células madre en una etapa precoz en cultivo de tejidos. Aunque se dispone de varios métodos generales para purificar poblaciones celulares en otros tejidos, es imposible utilizar estos métodos o desarrollar nuevos métodos sin conocimiento de la verdadera identidad de la célula madre. Se requieren mayores estudios de una población celular mejor definida para rastrear compuestos farmacéuticos. Lo que es más, se necesita el desarrollo de métodos cuantitativos para marcar y seguir las células madre y su progenie in vivo para permitir que estudios detallados de, por ejemplo, la regulación de la generación de nuevas neuronas analicen el efecto de diferentes agentes químicos o para manipular genéticamente las células madre. Una vez más, aunque existen métodos conocidos en la técnica que pueden ser usados para seguir otras poblaciones celulares in vivo, es imposible utilizar estos métodos o desarrollar nuevos métodos para seguir las células madre, ya que la identidad de la célula madre es desconocida. El desarrollo de métodos cuantitativos para seguir la célula madre y su progenie en modelos animales de trastornos neurodegenerativos y lesiones del SNC abriría la posibilidad de rastrear nuevas estrategias de tratamiento en condiciones humanas en las que actualmente sólo se pueden aliviar algunos de los síntomas, pero no la pérdida neuronal per se.

Así, un problema en este campo es que, incluso aunque se sepa que existen células madre neurales, no se conoce la localización e identidad de las mismas. Si se pudiera conseguir esto, se habría dado un gran paso hacia delante gracias a la investigación dirigida a cumplir los objetivos antes definidos.

Resumen de la invención

El objeto de la presente invención es resolver el problema antes definido. Se consigue esto según la presente invención identificando el origen y la identidad de las células madre neurales y aislando selectivamente dichas células madre del tejido del SNC. La invención se basa, por lo tanto, en el sorprendente descubrimiento de que las células que se encuentran en la capa ependimal son células madre neurales. Así, la presente invención proporciona una célula madre del SNC neural ependimal según se define en la reivindicación 1. La invención también proporciona un método de aislamiento de dichas células madre del SNC neural ependimal de la capa ependimal. En consecuencia, por vez primera se describen aquí la identidad real y la localización de las células madre neurales, permitiendo de este modo diversos usos ventajosos y sus aplicaciones en el campo médico y diagnóstico. La invención se relaciona también con composiciones farmacéuticas, donde los nuevos hallazgos según la invención son ventajosamente empleados.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra el marcaje específico de células ependimales y es un dibujo esquemático de la migración de neuronas en el cerebro anterior del adulto y de la estructura de la pared del ventrículo lateral.

La Figura 2 ilustra la generación de neuronas y de neuroesferas del bulbo olfatorio.

La Figura 3 ilustra el enriquecimiento de células madre neurales con un marcador específico de células ependimales.

La Figura 4 ilustra la proliferación de células ependimales mostrando una detección inmunohistoquímica de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) en la pared lateral del ventrículo lateral después de dos semanas de administración continua de BrdU (A, B) o de dos semanas de administración seguidas de una semana sin BrdU (C, D).

La Figura 5 describe cómo se induce la proliferación de células ependimales por lesión.

La Figura 6 muestra la generación de astrocitos a partir de células ependimales después de una lesión en la médula espinal.

La Figura 7 describe el trasplante de células madre purificadas derivadas de animales transgénicos.

La Figura 8 muestra la generación de neuronas en la substantia nigra de células madre en el ratón adulto.

La Figura 9 ilustra las corrientes migratorias de células madre o de su progenie en el cerebro medio.

La Figura 10 describe la generación de neuronas en el hipocampo a partir de células madre localizadas en la capa ependimal.

La Figura 11 muestra la capacidad de las células madre del SNC ependimales para contribuir a la generación de múltiples órganos.

La Figura 12 presenta la contribución torácica de células madre ependimales neurales del adulto a tejidos especializados.

La Figura 13 presenta la contribución abdominal de células madre ependimales neurales del adulto a tejidos especializados.

Definiciones

En la aplicación del presente contexto, el término "aisladas" se refiere a fracciones celulares aisladas de un animal o de un humano y purificadas hasta en al menos aproximadamente un 10%, preferiblemente al menos aproximadamente un 30%, más preferiblemente al menos aproximadamente un 50% y más preferiblemente al aproximadamente un 60%, tal como aproximadamente un 80%. En una realización particular de este aspecto de la invención, la pureza de las células aisladas está próxima al 100%, tal como aproximadamente el 90%. En dicha población celular que tiene una pureza de aproximadamente un 90%, quizá sólo un 4% aproximadamente de las células madre actúan claramente como células madre "activas", pero el resto de las células madre son quiescentes, aunque pueden tener la capacidad de transformarse en dichas células madre "activas". Una célula madre "activa" se define como una célula que sufre auto-renovación y que es multipotente. El término "células madre neurales" se relaciona con células capaces de generar agregados de células indiferenciadas, así llamadas neuroesferas, en condiciones adecuadas. Por ejemplo, un medio que contiene mitógenos apropiados. "Células ependimales" se refiere a cualquier célula que resida parcial o completamente en la capa ependimal del sistema ventricular del SNC o el mismo tipo de célula localizado en cualquier otro lugar. Una "célula ependimal" se define aquí de forma que incluye cualquier célula que tenga las características de una célula ependimal aislada de la capa de células ependimales del tejido del SNC post-natal. En el presente contexto, hay que entender que la característica que caracteriza a las células madre según la invención es su capacidad para generar nuevas células madre, precursores o células progenitoras, así como nuevas neuronas, astroglía u
oligodendroglía.

Las células madre neurales ependimales también expresan algunos marcadores de la superficie celular específicos que pueden ser usados con fines de aislamiento e identificación, tales como Notch 1 (receptor de transmembrana), Notch 2, Notch 3, CAR (adenovirus que se une a proteínas de transmembrana, Tomko y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 3352) y CFTR (regulador de la conductancia de transmembrana de la fibrosis quística, Kunzelmann, Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 137: 1). Las células madre del SNC neural ependimal también tienen al menos un cilio. El término "adulto" es usado aquí para diferenciar las células madre neurales previamente identificadas en embriones de las presentes células madre neurales obtenidas de mamíferos post-natales. Así, las células madre de adultos son, en esencia, células madre no embrionarias.

Para los fines de la presente invención, se puede llevar a cabo preferiblemente la disociación del tejido ependimal usando una o una combinación de enzimas de disociación seleccionadas entre el grupo de la colagenasa, la tripsina y la hialuronidasa, así como ácido quinurénico. El tejido ependimal puede también disociarse por disociación mecánica, sola o en combinación con una o más de las enzimas antes mencionadas.

Descripción detallada de la invención

La invención se relaciona con una célula madre del SNC neural de adulto que es una célula madre ependimal, en otras palabras una célula madre neural que reside en la capa ependimal. La invención proporciona así células madre neurales, que pueden caracterizarse por poseer las características de una célula ependimal. Más concretamente, en un primer aspecto, la presente invención se relaciona con una célula madre del SNC neural ependimal, cuya célula expresa la proteína de superficie Notch 1 junto con al menos una proteína de superficie seleccionada entre el grupo de Notch 2, Notch 3, CAR (adenovirus que se une a proteínas de transmembrana) y CFTR (regulador de la conductancia de transmembrana de la fibrosis quística) y cuya célula también tiene al menos un cilio.

En un segundo aspecto, la presente invención se relaciona con un método de aislamiento de células madre del SNC neural ependimal de tejido del SNC adulto o post-natal, cuyo método preferiblemente consiste en disociar tejido ependimal y recuperar dichas células madre del SNC neural ependimal del mismo. Dicha disociación puede ser realizada por cualquier método adecuado fácilmente escogido por alguien experto en este campo. Se recuperan las células por separación mediante cualquier técnica adecuada de cualquier material no deseado presente, cuya cantidad y calidad variarán dependiendo del procedimiento usado para obtener el tejido, así como de su condición.

Este aspecto de la invención se basa, por lo tanto, en el aislamiento de un tipo celular particular del tejido del SNC post-natal. El experto en la técnica entenderá fácilmente que se puede conseguir esto de varias formas. Así, por ejemplo como antes, se podría disecar la capa de células ependimales del tejido neural y procesarla a continuación para aislar células ependimales de la misma. Así, se puede disociar selectivamente el tejido ependimal y aislar las células madre ependimales o recuperarlas del mismo.

Alternativamente, se pueden aislar selectivamente las células madre ependimales de una preparación de tejido del SNC, que puede contener tipos heterogéneos de tejidos. Así, por ejemplo, se puede disecar una región mayor de tejido cerebral, que puede contener tejidos distintos de la capa de células ependimales, y se pueden aislar del mismo selectivamente las células ependimales, por ejemplo recuperando sólo células que tienen características de células ependimales. Como se discutirá con mayor detalle a continuación, se puede conseguir esto, por ejemplo, usando técnicas de separación por afinidad con reactivos de afinidad que tienen especificidad por marcadores de la superficie celular específicos para células ependimales.

Así, se disocian las células madre ependimales, preferiblemente a células simples, y se separan después. Se hace esto rastreando las células obtenidas por el método para células que exhiben al menos una característica o rasgo de célula madre neural ependimal. Las células madre neurales de adultos han sido descritas en la técnica anterior y el experto en este campo decidirá sobre los métodos óptimos de rastreo para las condiciones reinantes.

En una realización ventajosa del presente método, se recoge el tejido de la capa ependimal de las paredes del sistema ventricular del cerebro o de la médula espinal de dicho humano o animal. Dicha disección y recuperación de tejido es fácilmente realizada por el experto en este campo por cualquier método rutinario adecuado. La etapa de disociación es realizada por cualquier método adecuado, tal como un tratamiento enzimático y/o mecánico, y no se restringe en modo alguno, en la medida en que las células simples deseadas se obtengan como resultado del mismo. Son ejemplos de tales métodos, por ejemplo, la trituración, el tratamiento con tripsina, el tratamiento con colagenasa y el tratamiento con hialuronidasa. Más preferiblemente, se realiza la disociación por tratamiento enzimático con tripsina. La disociación de tejido puede ser alternativamente realizada por cualquier otro método fácilmente seleccionado por el experto en la técnica a la vista de las condiciones reinantes.

El rastreo de las células resultantes, tales como células simples, es realizado, como se ha indicado anteriormente, por cualquier método adecuado, dependiendo de las característica, rasgo o propiedad de una células ependimal usada. En una realización del presente método, se realiza el rastreo usando la expresión de un marcador de la superficie celular específico, tal como una proteína. Dicha expresión de una proteína de la superficie puede, por ejemplo, ser la expresión de los receptores Notch1, Notch2 y/o Notch3, que han sido previamente descritos en la literatura, pero en otros contextos. En la realización más preferida de este método, se rastrean las células simples en cuanto a su expresión del receptor Notch I. En una realización alternativa de este aspecto de la invención, se rastrean las células simples para la utilización de células ependimales previamente marcadas. Dicho marcaje puede ser un colorante y es ventajosamente un marcaje fluorescente, tal como Dil, como se muestra en el ejemplo 1. El Dil ha sido también descrito en otros contextos y es bien conocido para el experto en este campo. El marcaje de células es ampliamente usado en investigación y en métodos de diagnóstico y la elección de una técnica adecuada es, por lo tanto, fácilmente hecha por el experto. En una realización alternativa, se puede usar un virus, tal como un adenovirus o un lentivirus.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una preparación consistente en células madre del SNC neural ependimal. Dicha preparación puede ser obtenida por cualquiera de los métodos de aislamiento aquí descritos. Dichas preparaciones contienen al menos aproximadamente un 10%, tal como de un 10 a un 50%, por ejemplo aproximadamente un 35%, o, en la realización preferida, hasta aproximadamente un 90%, o más preferiblemente un cultivo esencialmente puro, de células madre neurales. Preferiblemente, al menos aproximadamente un 4% de estas células son células madre totalmente activas. Naturalmente, son posibles de obtener concentraciones mucho mayores, dependiendo del método de rastreo seleccionado. Previamente, en los procedimientos de la técnica anterior, se han disociado partes de un cerebro y se han añadido factores de crecimiento específicos para inducir el crecimiento de un tipo celular específico. Dichos procedimientos pueden haber generado concentraciones relativamente altas de células al final; sin embargo, esto ocurre después de varios días de crecimiento. Lo que es muy importante, dichos procedimientos no han sido dirigidos nunca a la obtención de una población pura de células madre en una etapa precoz del procedimiento de cultivo, ya que la identidad y las características (por ejemplo, expresión de marcadores de la superficie celular específicos) de la célula madre eran desconocidas con anterioridad a la presente invención. Así, en la práctica, el presente método da la concentración deseada de un tipo celular, es decir, las células madre ependimales aquí descritas, que nunca ha sido identificado y/o localizado con anterioridad. En una realización específica, el producto consiste en aproximadamente un 90-95% de células madre neurales ependimales. En una realización ventajosa, el producto del método es una fracción celular consistente casi por completo, es decir, en aproximadamente un 100%, en las células madre neurales ependimales. En consecuencia, la presente invención se relaciona también con células madre neurales aisladas obtenibles por el método según la presente invención, así como con cualquier fracción de células madre neurales aisladas.

En otro aspecto, las células madre neurales ependimales preparadas por el presente método pueden ser genéticamente modificadas. Se pueden realizar manipulaciones para modificar diversas propiedades de la célula, por ejemplo, para hacerla más adaptada o resistente a determinadas condiciones ambientales, para inducir la producción de una o más substancias determinadas a partir de ella, cuyas substancias pueden, por ejemplo, mejorar la viabilidad de la célula o pueden ser alternativamente de utilidad como fármacos o medicamentos. A continuación, en la sección de "Discusión", se facilitan más detalles concernientes a las posibilidades y ventajas de dichas células manipuladas según la invención. Algunas de tales alteraciones genéticas pueden ser realizadas para hacer que la célula resulte más adecuada para uso en trasplante, por ejemplo, para evitar su rechazo del receptor (para revisiones de procedimientos de terapia génica, véanse Anderson, Science 256: 808; Nabel y Felgner, TIBTECH 11: 211; Mitani y Caskey,
TIBTECH 11: 162; Mulligan, Science 926; Dillon TIBTECH 11: 167; Miller, Nature 357: 455; Van Brunt, Biotechnology 6(10): 1149; Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8: 35; Kremer y Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1): 31; Haddada y col., en Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler y Böhm (eds.), Springer-Verlag, Heidelberg, Alemania; y Yu y col., Gene Therapy 1: 13). Así, la presente invención también incluye métodos de terapia génica, donde se usan células madre neurales, así como preparaciones que se pretende usar en dichos métodos, que contienen las células según la invención. Dichos métodos de terapia génica pueden ser usados para tratar y/o prevenir cualquier condición en la que se hayan alterado o estén defectuosas las neuronas o la glía del SNC.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con una composición consistente en células madre neurales para uso en terapia, por ejemplo, como medicamento. Además, la invención se relaciona también con el uso de una célula madre neural en la preparación de una terapia, por ejemplo, de un medicamento, para regular la neurogénesis o la gliogénesis en el sistema nervioso central, tal como el cerebro. Dicha regulación es inductora o inhibidora y el tratamiento puede estar dirigido a la enfermedad de Parkinson, a la enfermedad de Alzheimer, al accidente cerebrovascular, al trauma, etc. En el caso de las células gliales, el medicamento puede estar concebido para tratar la Esclerosis Múltiple y otras condiciones relacionadas con la glía. Estas composiciones podrían ser usadas en la generación de otros tejidos, tales como el miocardio, que consiste en las paredes atriales y ventriculares del corazón, la aorta dorsal y el primordio del reborde genital y los túbulos mesonéfricos. Otros ejemplos de órganos que podrían generarse son el tallo óptico, la capa retiniana y la lente del ojo, el oído interno, el hígado, el páncreas y otros órganos endocrinos. En una realización particular de la invención, estos aspectos de la invención utilizan células madre neurales obtenidas por el método antes descrito, incluso aunque la invención incluya también los usos de cualquier célula madre neural, tal como células madre neurales genéticamente modificadas, para los presentes fines.

Por consiguiente, la invención se relaciona con una preparación farmacéutica consistente en al menos una célula madre neural ependimal según la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las preparaciones según la invención pueden ser adaptadas para inyección en una parte adecuada del sistema nervioso central. Dicha preparación farmacéutica contiene un vehículo adecuado, tal como un vehículo acuoso, por ejemplo, solución salina tamponada, etc. La composición activa de la presente preparación es generalmente estéril y está libre de cualquier materia no deseada. Además, las preparaciones pueden contener substancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, según sea necesario, para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes para el ajuste del pH, etc. La concentración de la presente célula madre neural en la preparación variará dependiendo de su aplicación pretendida y se deciden sus dosificaciones en consecuencia por parte del médico del paciente. Las células madre usadas pueden haber sido aisladas por el presente método o por cualquier método adecuado o pueden ser obtenidas de cualquier otro modo. En una realización preferida, la presente célula madre puede haber sido genéticamente manipulada para adaptarse especialmente a su uso pretendido.

En otro aspecto, las células de la invención pueden ser administradas a un paciente, donde dicha administración es terapéuticamente útil. Alternativamente, las células de la invención pueden ser usadas para substituir o suplementar el correspondiente tipo celular en un paciente por administración de las células de la invención. Se pueden usar las células de la invención para revestir implantes, actuando así como barrera entre el implante y el paciente. La administración de las células de la invención es realizada por métodos conocidos para los expertos en la técnica.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona también con un animal, tal como un ratón, que contiene una célula madre neural ependimal genéticamente modificada según la invención. Dichos animales pueden, por ejemplo, ser útiles como modelos en investigación o para estudiar nuevos fármacos.

En aún otro aspecto, la presente invención se relaciona con el uso de las presentes células madre neurales como "blancos de fármacos", preferiblemente en ensayos in vitro, para estimular las células madre y que generen un fenotipo neuronal o subtipo glial particular. En una realización particular, la invención se relaciona con el uso de dichas células en el cultivo in vitro de nuevas neuronas. Dicho uso puede, por ejemplo, conllevar el cultivo de células madre neurales aisladas, como se describe con más detalle en la sección "Discusión" que se dará más adelante. La presente invención se relaciona también con las substancias obtenidas mediante el uso antes definido.

La presente invención hace posible un método sin influencia cuantitativo o cualitativo, preferiblemente cuantitativo, para determinar la neurogénesis y las corrientes migratorias de la progenie de las células madre, preferiblemente en ensayos in vivo, en diversas regiones del cerebro, así como técnicas para analizar el número total de células madre y su progenie que migra a diversas regiones del cerebro. Esto podría ser de utilidad al diagnosticar a pacientes que sufren de enfermedades neurodegenerativas, si el desarrollo de marcadores de células ependimales adecuados para la tomografía de emisión de positrones ("PET") u otros sistemas de imagen para visualizar el cerebro vivo con suficiente resolución permite el diagnóstico de una migración y/o una diferenciación defectuosas de la progenie de las células madre en el SNC humano.

La presente invención abre vías de tratamiento de un paciente humano o animal que sufre de una enfermedad neurodegenerativa, cuyo método consiste en la administración a dicho humano o animal de una cantidad farmacéuticamente efectiva de células madre neurales ependimales. En general, dicho método se basa en la administración de células madre ependimales según la invención con una función inalterada y capacidad para producir neuronas u otros tipos celulares, dependiendo del trastorno del SNC del humano. Alternativamente, se pueden administrar neuronas o células gliales generadas de células madre in vitro al SNC. La invención hace también posible un método de tratamiento y/o prevención de trastornos neurodegenerativos en un paciente humano o animal, donde se restaura la capacidad de las células madre neurales defectuosas existentes para producir nuevas neuronas o migrar al objetivo apropiado. Dicho método se basa en la administración de una substancia que estimula e induce las propiedades nativas de las células madre neurales y su capacidad para producir neuronas. Alternativamente, dicho método puede basarse en la administración de una substancia que realmente inhiba el proceso degenerativo de las
neuronas.

En consecuencia, las células de la presente invención pueden ser trasplantadas a un paciente para el tratamiento de una enfermedad o lesión por cualquier método conocido en la técnica que sea apropiado para el sitio del trasplante.

Como métodos de administración de las células de la invención, se incluyen, aunque sin limitación, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal y epidural. Las células de la invención pueden ser administradas por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección de bolo, por absorción a través de los revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, la mucosa oral, la mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden ser administradas junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, puede ser deseable introducir las células de la invención en el sistema nervioso central por cualquier vía adecuada, incluyendo la inyección intraventricular e intratecal; la inyección intraventricular puede ser facilitada mediante un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un reservorio, tal como un reservorio Ommaya.

Puede ser deseable administrar las células de la invención localmente en el área que necesite tratamiento; se puede hacer esto, por ejemplo y como limitación, por infusión local durante la cirugía, aplicación tópica, por ejemplo junto con vendaje de herida tras la cirugía, por inyección, por medio de un catéter o por medio de un implante, siendo dicho implante un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas, o fibras.

Lo que sigue describe ejemplos de métodos que pueden ser modificados para el trasplante de células transformadas. Se han descrito protocolos para el aislamiento y el trasplante de tejidos fetales en humanos y se han realizado pruebas clínicas que incluyen estos estudios. Por ejemplo, Landvall, Science 247: 574, ha descrito resultados referentes a injertos y a la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas fetales tras su trasplante al cerebro. Se pueden llevar a cabo el lavado y la disociación parcial de células precursoras, de ser necesario, por una modificación del protocolo descrito por Lindvall, Arch. Neurol. 46: 615.

A modo de ejemplo, se puede realizar la implantación de células en el cerebro como sigue. Se hace la implantación en tres sitios en el putamen izquierdo con una técnica estereotáxica (Lindvall, Arch. Neurol. 46: 615). Por cada sitio, se toman 20 a el de las células disociadas con el instrumento (diámetro externo, 1,0 mm). Se inyectan las células a lo largo de un tracto lineal de 10, 12 y 14 mm, respectivamente, en porciones de 2,5 a el durante 15 ó 20 segundos cada uno. Entre cada inyección, hay un retraso de 2 minutos y se retrotrae entonces la cánula 1,5 a 1,7 mm. Después de la inyección final, se deja la cánula in situ durante 8 minutos antes de ser retirada lentamente del cerebro. Tras la cirugía, se valora la viabilidad celular siguiendo el procedimiento de Brundin, Brain Res. 331: 251.

Caplan y col., 1993, en la Patente EE.UU. Nº 5.226.914, muestran otro ejemplo. Resumiendo, después de recoger células medulares de tapones de médula ósea, se separan por centrifugación las células madre mesenquimales de la médula. Se aíslan las células madre aún más por adherencia selectiva a la superficie de plástico o de vidrio de una placa de cultivo de tejidos. Se deja que las células madre proliferen, pero no que se diferencien. Se añaden cubos de cerámica porosa compuestos por un 60% de hidroxiapatito y un 40% de fosfato tricálcico a las células con un ligero vacío. Se implantan los cubos con células adheridas en bolsillos incisos a lo largo de los dorsos de ratones desnudos. Las células madre mesenquimales se diferencian en hueso.

El título de las células trasplantadas efectivo en el tratamiento de un trastorno o condición particular dependerá de la naturaleza del trastorno o condición y puede ser determinado por técnicas clínicas estándar. Además, se pueden emplear eventualmente ensayos in vitro para ayudar a identificar los rangos óptimos de dosificación. La dosis precisa que se habrá de emplear en la formulación dependerá también de la vía de administración y de la gravedad de la enfermedad o trastorno y deberá ser decidida según el juicio del médico y las circunstancias de cada
paciente.

La invención proporciona también un paquete o kit farmacéutico consistente en uno o más recipientes llenos de uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención y/o reactivos para preparar las composiciones farmacéuticas de la invención. Eventualmente asociado con dicho(s) recipiente(s), puede haber una nota en la forma prescrita por una agencia gubernamental reguladora de la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o de productos biológicos, cuya nota refleje la aprobación por la agencia de la fabricación, el uso o la venta para administración a humanos.

Las células de la invención pueden también mantenerse en cultivo para uso en investigación, incluyendo la investigación médica. Por ejemplo, se pueden usar las células para rastrear compuestos de ensayo con función conocida en cuanto a su capacidad para diferenciar las células de la invención en diferentes tipos celulares.

Descripción detallada de los dibujos

Figura 1

Marcaje específico de células ependimales

Dibujo esquemático de la migración de neuronas en el cerebro anterior adulto y de la estructura de la pared del ventrículo lateral (A). El ventrículo (V) está revestido por células ependimales (E). Entre la capa ependimal y el estriado (S), está la zona subventricular ("SVZ"), donde las células precursoras (azul claro) se dividen para dar lugar a neuronas inmaduras (azul obscuro). Las neuronas migran al bulbo olfatorio (flecha azul). (B) Marcaje de células ependimales. Se inyecta Dil estereotáxicamente en un ventrículo lateral, dando lugar al marcaje de células ependimales a través de todo el sistema ventricular. En algunos de estos animales, se hizo una incisión (área gris en la sección transversal de la médula espinal) en el funículo dorsal de la médula espinal. La inyección de Dil marca la capa ependimal que reviste el ventrículo lateral (C, D) y el canal central de la médula espinal (E) seis horas después de la inyección. El plexo coroide ("CP") está marcado en (C).

Figura 2

Generación de neuronas y neuroesferas del bulbo olfatorio

A los diez días de la inyección de Dil (A, C) o de adenovirus deficiente en replicación que expresa LacZ (B, D) en el ventrículo lateral contralateral, se ven las células marcadas en la zona subventricular (A, B) y el bulbo olfatorio (C, D). La inserción en (C) muestra Dil en una neurona inmunorreactiva a \betaIII-tubulina. Micrografías de campo brillante (E) y fluorescencia (F) que muestran neuroesferas del cerebro de un animal que había recibido una inyección de Dil intraventricular. Dos neuroesferas muy débilmente marcadas o sin marcar están indicadas mediante cabezas de
flecha.

Figura 3

Enriquecimiento de células madre neurales con un marcador específico de células ependimales

Localización por inmunofluorescencia de Notch 1 en la pared del ventrículo lateral (A) y en la médula espinal (B). La inmunorreactividad Notch está restringida a las células ependimales que revisten el ventrículo lateral y el canal central. La localización selectiva de Notch 1 en las células ependimales permitía el enriquecimiento de células ependimales de tejido agudamente disociado de cerebro y de médula espinal. Se incubaron las células disociadas con antisuero producido contra Notch 1, seguido de incubación con anticuerpos secundarios conjugados a perlas magnéticas y separación magnética de células marcadas (fracción Notch 1) y no marcadas (fracción de lavado). En experimentos control, se omitió el antisuero primario. Se calculó el número de células en cada fracción y se contó el número de neuroesferas generadas en los diferentes cultivos (C).

Figura 4

Proliferación de células ependimales

Detección inmunohistoquímica de BrdU en la pared lateral del ventrículo lateral después de dos semanas de administración continua de BrdU (A, B) o de dos semanas de administración seguidas de una semana sin BrdU (C, D). (B) y (D) muestran los detalles de (A) y (C), respectivamente. Las células ependimales marcadas están indicadas con cabezas de flecha en (B) y (D).

Figura 5

La proliferación de células ependimales se reduce por lesión

Detección inmunohistoquímica de BrdU en la médula espinal despuésde 8 horas (A, D-F) o dos semanas (B, C) de administración de BrdU. (G) Proporción de células ependimales de la médula espinal que incorporan BrdU administrado durante las últimas 8 horas antes del sacrificio (núcleos marcados con BrdU/número total de núcleos de células ependimales visualizados con yoduro de propidio, n = 3,5 ratas en cada punto temporal; las barras de error muestran el SEM).

Figura 6

Generación de astrocitos a partir de células ependimales tras lesión de la médula espinal

Distribución de Dil y de la inmunorreactividad con nestina y GFAP en la médula espinal. El animal en (D-F) fue sometido a incisión en el funículo dorsal 4 semanas antes del análisis. Todos los animales recibieron una inyección intraventricular de Dil antes de la lesión. Se muestra el Dil y la inmunorreactividad con nestina en las mismas secciones y la inmunorreactividad con GFAP en una sección adyacente en (A-F). La delineación aproximada del área lesionada está indicada por la línea discontinua en (D). (G) muestra el Dil (rojo) y la inmunorreactividad con GFAP (verde) en el funículo dorsal 2 semanas después de la lesión. Una señal amarilla indica la co-localización de Dil y la inmunorreactividad con GFAP. (H) Visualización con el microscopio de barrido con láser confocal de Dil y de la inmunorreactividad con GFAP en el tejido cicatricial 2 semanas después de la lesión. Se indican dos células marcadas con Dil inmunorreactivas con GFAP mediante cabezas de flecha y se indica con una flecha una célula marcada con Dil que no muestra ninguna GFAP detectable.

Figura 7

Trasplante de células madre neurales

Trasplante de células madre purificadas derivadas de ratones transgénicos que expresan LacZ al estriado de ratas adultas. Las flechas señalan un grupo de células injertadas. (B) muestra un detalle de (A).

Figura 8

Generación de neuronas en la substantia nigra a partir de células madre en la capa ependimal en la rata adulta. Microfotografía de neuronas de la substantia nigra positivas a tirosina hidroxilasa (verde) en la pars compacta de la substantia nigra también marcadas con Dil (rojo) en roedores tras la administración de este tinte fluorescente al animal adulto cuatro meses antes. Las flechas señalan dos neuronas dopaminérgicas de la substantia nigra que contienen el marcador fluorescente que marca las células madre neurales ependimales.

Figura 9

Corrientes migratorias de células madre desde la capa ependimal o de su progenie en el cerebro medio de ratones. Las flechas señalan las corrientes migratorias ventromediales (células rojas) de las células ependimales marcadas con Dil que alcanzan la pars compacta de la substantia nigra medial (*). SNR = pars reticulata de la substantia nigra, IP = núcleo interpeduncular. Las flechas muestran las direcciones lateral (l) y ventral (v). Se identificaron varias rutas que alcanzan las partes rostral, caudal, medial y lateral de la pars compacta de la substantia nigra, respectivamente. Además de la corriente ventromedial ilustrada, se identificaron una corriente dorsolateral y una en la línea media.

Figura 10

Generación de neuronas en hipocampo de ratón a partir de células madre localizadas en la capa ependimal. Microfotografía que ilustra que las células ependimales marcadas con Dil o su progenie migran a la capa celular granular del giro dentado ("DG") del hipocampo. Las flechas muestran las direcciones lateral (l) y ventral (v).

Figura 11

En (A), se muestra un embrión de 11 días embrionarios de tipo salvaje (izquierda) y un embrión quimérico generado a partir de un blastocisto que fue inyectado con células madre neurales de cerebro de ratones Rosa26 adultos (derecha). Hay un marcaje con X-gal endógeno en asociación con la vesícula ótica en el embrión de tipo salvaje. La contribución de las células a partir de las células madre neurales adultas es obvia en diversos tejidos, incluyendo, por ejemplo, el corazón y el SNC en el embrión inyectado. En (B), se amplificó el ADNc lacZ del amnios (A), de la región de la cabeza ("H") o de la región torácica ("Th") o caudal (C) por RT- PCR. Se ve expresión del ARNm lacZ que indica quimerismo en los 3 embriones inyectados, pero no en el control. Se usaron cebadores para L19 como control interno.

Figura 12

Detección inmunohistoquímica de \beta-galactosidasa (A, B) y desmina (C, D) en una sección a través de la cavidad torácica de un embrión de día embrionario 11. En (E) y (F), se muestra conjuntamente el inmunomarcaje de \beta-galactosidasa (verde) y desmina (rojo), demostrando co-localización en el corazón.

Figura 13

Inmunomarcaje para \beta-galactosidasa (A) y desmina (B) en una sección a través de la cavidad abdominal superior de un embrión de 11 días de edad. El hígado muestra una fuerte expresión de \beta-galactosidasa (A). En (C), se muestran conjuntamente la inmunotinción de \beta-galactosidasa y desmina, demostrando co-localización en la punta del corazón. (D) muestra inmunomarcaje de \beta-galactosidasa en el intestino.

Ejemplos 1. Marcaje de células ependimales y su progenie in vivo

Para estudiar si se pueden generar neuronas a partir de células ependimales, inyectamos el marcaje fluorescente Dil o un adenovirus deficiente en replicación que expresa el gen informador LacZ en los ventrículos laterales de ratas o ratones adultos. Se anestesiaron ratas Sprague-Dawley machos de 280-320 g de peso o ratones C57BL/6 machos de 25-30 g de peso con hidrato de cloral (400 mg/kg). Se realizaron inyecciones estereotáxicas unilaterales de 10 \mul (ratas) o de 3 \mul (ratón) de Dil (Molecular Probes) al 0,2% p/v en DMSO ó de 50 \mul de solución de adenovirus (que contenía 10^{9} unidades formadoras de placa) a 0,9 mm (ratas) ó 0,5 mm (ratones) en posición posterior y 1,4 mm (ratas) ó 0,7 mm (ratones) en posición lateral al bregma y 4 mm (ratas) ó 2 mm (ratones) por debajo de la duramadre en el ventrículo lateral. Las inyecciones dieron lugar a un marcaje específico de la capa ependimal por todo el sistema ventricular; no se observó marcaje en la zona subventricular ni en el parénquima cerebral (Fig. 1). Así, este método hace posible seguir específicamente el destino de las células ependimales marcadas y de su progenie. El análisis de la distribución del Dil reveló un número creciente de células marcadas en la corriente migratoria rostral (Goldman y col., Trends Neurosci. 21: 108) y, después de 10 días, se observaron las primeras neuronas marcadas con Dil en el bulbo olfatorio, una región en la que se añaden nuevas neuronas continuamente en mamíferos adultos (Fig. 2). De forma similar, en animales inyectados con el adenovirus, se hallaron células que expresaban LacZ en el bulbo olfatorio 10 días después de la inyección, aunque en números mucho menores que en los animales inyectados con Dil, según se esperaba, ya que el adenovirus es deficiente en cuanto a replicación y el marcaje sólo será heredado, por lo tanto, por un subgrupo de la progenie de la célula infectada (Fig. 2). Se detectó la expresión de LacZ con tinción con X-gal, según se ha descrito (Park y col., EMBO J. 16: 3106).

2. Identificación y localización de células madre neurales cultivando células ependimales marcadas

Se puede usar el marcaje específico de epéndimos in vivo para estudiar si las células marcadas tienen propiedades de células madre in vitro. Después de una inyección de Dil (como se ha descrito anteriormente), se mataron las ratas con CO_{2}, se extrajeron los cerebros y se mantuvieron en PBS helado. Se disecaron las paredes laterales de los ventrículos laterales. Se cortó el tejido con tijeras, se cambió a 4 ml de medio de disociación (0,075% de colagenasa tipo 1 (Worthington), 0,075% de hialuronidasa (Sigma) y 2.000 U de ADNasa I en 4 ml de PIPES 0,2 M (Sigma) y se incubó a 37ºC durante 30 min. Tras la disociación mecánica por trituración sucesiva suave a través de pipeta Pasteur de 5 ml y de 1 ml, se dejó la suspensión durante 2 min., dejando que los fragmentos mayores se sedimentaran en el fondo. Se pasó entonces el sobrenadante a través de un tamiz de 40 \mum (Falcon). Se añadieron a la suspensión filtrada 4 ml de medio frío (DMEM/F12). Se centrifugaron las células a 200 g durante 4 min. Se retiró el sobrenadante, se resuspendió la pella en 10 ml de solución de sacarosa (0,9 M en 0,5xHBSS) y se centrifugó durante 10 min. a 750 g. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendió la pella en 2 ml de medio de cultivo, se puso encima de 10 ml de solución de BSA al 4% en EBSS y se centrifugó a 200 g durante 7 min., seguido de una etapa de lavado en DMEM/F12. El medio de cultivo estaba constituido por: 0,5 ml de L-glutamina, 0,75 ml de HEPES 1 M (15 mM), 30 \mul de 120 \mug/ml de EGF (y/ó 50 \mul de 10 \mug/ml de bFGF), 1 ml de suplemento B27, 0,5 ml de stock de penicilina/estreptomici-na 100x y, finalmente, medio DMEM-F12 hasta un volumen total de 50 ml. Se mantuvieron los cultivos celulares a 37ºC con un 5% de CO_{2} en una atmósfera húmeda.

En estas condiciones, se formaron en los cultivos agregados celulares esferoides característicos de células indiferenciadas. Estos agregados celulares derivan de una sola célula madre y, por lo tanto, representan un clon de células. De estas esferas, un 88,6 \pm 1,20% y un 89,0 \pm 1,23% del ventrículo lateral y de la médula espinal, respectivamente, estaban claramente marcadas con Dil (media de 5 experimentos independientes \pm SEM). Se recogieron las esferas marcadas con Dil y se disociaron en células sencillas. Muchas de estas células formaron nuevas esferas y, al inducir su diferenciación añadiendo suero al medio, la mayoría de estas esferas secundarias generaron neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. La generación de una progenie diferenciada quedó demostrada por marcaje inmunohistoquímico con los siguientes anticuerpos específicos de tipos celulares: anti-proteína ácida fibrilar glial (Dako) para astrocitos, Tuj1 (Babco) para neuronas y 04 (Boehringer Mannheim) para oligodendrocitos. Estos experimentos identifican un método útil para estudiar células ependimales in vitro y demuestran que las células ependimales tienen capacidad de auto-renovación y que son pluripotentes, es decir, que son células madre bona fide.

3. Protocolo y medios de cultivo

Se pueden encontrar protocolos de cultivo adecuados para cultivar y rastrear células madre neurales ependimales en Johansson y col., Cell 96: 25. Sin embargo, el ingrediente más importante en el medio de cultivo de tejidos para las células madre del SNC neural ependimal es un mitógeno que puede ser el factor de crecimiento epidérmico ("EGF") o el factor de crecimiento fibroblástico ("FGF"). El segundo factor más importante es tener un suministro adecuado de cofactores y nutrientes, preferiblemente los bien conocidos suplementos B27 o N2. Se usaron los siguientes medios especiales:

Medio para neuroesferas:
DMEM/F12	47 ml
B27	1 ml
L-glutamina (stock: 200 mM)	0,5 ml
Penicilina/estreptomicina (10.000 U de cada una)	0,5 ml
HEPES (stock: 1 M)	0,75 ml
Grado de receptor de EGF (stock: 20 \mug/ml)	0,05 ml
BFGF (stock: 10 \mug/ml)	y/o 0,05 ml

\vskip1.000000\baselineskip

Solución de HBSS-glucosa	500 ml
HBSS, 10 X	50 ml
D-Glucosa (stock: 300 mg/ml)	9,0 ml
HEPES (stock: 1 M)	7,5 ml
ddH_{2}O	433,5 ml
** pH a 7,5

\vskip1.000000\baselineskip

Solución de sacarosa-HBSS	500 ml
HBSS, 10 X	25 ml
Sacarosa	154 g
ddH_{2}O	resto hasta 500 ml
** pH a 7,5

\vskip1.000000\baselineskip

Solución de BSA-EBSS-HEPES	500 ml
BSA (Nº de catálogo de Sigma A4503)	20 g
HEPES (stock: 1 M)	10 ml
EBSS, 1X	resto hasta 500 ml
** pH a 7,5

4. Disociación del tejido

Se disolvieron 13,3 mg de tripsina (Nº de catálogo de Sigma T4665), 7,0 mg de hialuronidasa (Nº de catálogo de Sigma H3884) y 2,0 mg de ácido quinurénico (Nº de catálogo de Sigma K3375) conjuntamente en solución de HBSS-glucosa a 37ºC. Se esterilizó la solución por filtración y se añadieron luego 200 \mul de 4.000 U/ml de ADNasa (Nº de catálogo de Sigma D4527). Se disoció tejido ependimal en este medio a 37ºC durante 15 minutos. Se trituró la reacción suavemente 10 veces con una pipeta de 5 ml y se continuó luego incubando durante 15 minutos más. La incubación en este medio no debe ser durante más de 30 minutos.

Inmediatamente después, se pasó el tejido disociado a través de un filtrador de células de nilón de 70 \mum (Falcon Nº 2350). Se centrifugó la mezcla a 1.500 rpm durante 5 minutos en un tubo cónico de 15 ml, se eliminó el sobrenadante y se resuspendió la pella en 10 ml de solución de sacarosa-HBSS. Se centrifugó la pella resuspendida a 2.000 rpm durante 10 minutos. Se desechó el sobrenadante y se resuspendió la pella en 2 ml de EBSS 1X. Se llenó un nuevo tubo cónico de 15 ml con 12 ml de la solución de BSA-EBSS-HEPES. Se aplicaron cuidadosamente los 2 ml de suspensión de células a la parte superior y se centrifugó la mezcla resultante durante 7 minutos a 1.500 rpm, se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron las células en medio de neuroesferas y se plaquearon en placas de 10 cm.

El procedimiento anterior es ideal para la médula espinal, ya que elimina la mayor parte de la mielina. Sin embargo, con pequeñas cantidades de tejido y para células aisladas de las paredes ventriculares, el uso de tubos Eppendorf tras la suspensión en sacarosa es más adecuado y dará como resultado más células. Típicamente, se suspendió la pella en 4 ml de solución de sacarosa-HBSS y se dividió esta cantidad en cuatro tubos de 1,5 ml. Se graduó el volumen de la solución de BSA-EBSS-HEPES correspondientemente.

5. Pase de neuroesferas

Se incuba tripsina (Life Technologies #45300027) durante 24 horas a 37ºC. Se diluye entonces la tripsina (si es necesario) con PBS (solución salina tamponada con fosfatos) a un nivel que dará la disociación completa de las neuroesferas en 5 minutos (empíricamente determinado para cada 500 ml tratados).

Se recogen las neuroesferas de placas de 10 cm y se dejan sedimentar suavemente en un tubo cónico de 15 ml. Una vez se han recogido las neuroesferas en la punta del fondo, se elimina el sobrenadante. Se suspenden entonces las neuroesferas en PBS 1X, se transfieren a un tubo Eppendorf de 1 ml y se les deja sedimentar. Se elimina el sobrenadante y se añaden 500 \mul de tripsina (37ºC) a las esferas. Después de 2 minutos de incubación a 37ºC, se trituran suavemente las esferas a través de una punta de pipeta de 200 \mul amarilla y se dejan luego durante tres minutos más. Se trituran de nuevo las esferas y se deja que cualquier resto de grumos o de esferas sedimente durante aproximadamente 30 segundos. Se retiran los 400-450 \mul superiores de células tripsinizadas y se ponen en un nuevo tubo Eppendorf que contiene igual volumen de solución de BA-EBSS-HEPES. Se centrifugan entonces las células a 1.500 rpm durante 1 minuto, se resuspende la pella celular en PBS 1X y se centrifuga luego de nuevo a 1.500 rpm durante 1 minuto. Se elimina entonces el sobrenadante y se resuspende la pella celular en medio de neuroesferas 50:50: medio condicionado (se recoge el medio condicionado de los cultivos de neuroesferas que han estado en cultivo durante al menos una semana. Se retira el medio de los cultivos, se filtra a través de un filtro de 0,2 \mum y se mezcla después con igual volumen de medio de neuroesferas recién preparado). Se plaquean entonces las células en el mismo medio, pero en placas bacterianas (no en placas tratadas para cultivo de tejidos), o una gran proporción de las células se adherirán inicialmente al fondo de la placa, lo que inhibirá la formación de nuevas esferas. Al cabo de 24 horas, se pueden trasladar las células a placas de cultivo de tejidos, si se desea.

6. Cultivo de células madre neurales ependimales sencillas

Una prueba directa del potencial de las células ependimales para formar neuroesferas sería cultivar células ependimales individuales in vitro (Johansson y col., Cell 96: 25). Con este fin, aislamos células ependimales de tejido de la pared del ventrículo lateral disociado según dos criterios. En primer lugar, las células tenían que poseer cilios, una característica morfológica distintiva de las células ependimales, pero no para células de la zona subventricular. En segundo lugar, el tejido fue tomado de animales que habían recibido una inyección de Dil 6 horas antes del sacrificio y sólo se recogieron las células marcadas con Dil. Se cogieron las células que satisfacían ambos criterios y se transfirieron a micropocillos. Se cultivo una célula por pocillo en medio condicionado de neuroesferas. En estos cultivos, el 58% (111 de 192 células) de las células ependimales sufrieron división celular. En la mayoría de estos pocillos (99 pocillos), las células murieron en pocos días o formaron grupos celulares muy pequeños. Sin embargo, un 6,2% de las células iniciales (12 de 192) formaron grandes neuroesferas. Cuando se añadió suero al medio de estas neuroesferas, se identificaron las células que expresaban marcadores específicos de tipos celulares para neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Esto reveló que las células ependimales simples son capaces de formar neuroesferas que pueden generar neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, es decir, que son células madre neurales bona fide.

7. Validación del método de marcaje con Dil

Como algunos resultados dependen de manera crítica del marcaje único con Dil de células ependimales, pero no de células de la zona subventricular, se tuvo que excluir la posibilidad de la transferencia del Dil a las células subventriculares. Para excluir la transferencia directa de célula a célula de Dil desde las células ependimales, co-cultivamos células ependimales marcadas con Dil con células genéticamente marcadas de ratones ROSA 26. No se pudo observar ninguna transferencia detectable de Dil a las células ROSA 26. Para excluir la posibilidad de difusión pasiva de Dil del fluido cerebroespinal a las células subventriculares a lo largo del tiempo, aspiramos el fluido cerebroespinal del ventrículo lateral de animales que habían recibido una inyección intraventricular de Dil el día antes y lo añadimos a las células cultivadas. Sólo encontramos un débil marcaje, lo que indica que la concentración de Dil era muy baja. Más aún, la inyección del fluido cerebroespinal en el ventrículo lateral de otro animal no dio lugar a marcaje alguno de las células que revisten el ventrículo. Estos datos sugieren que la concentración de Dil en el ventrículo lateral cae rápidamente después de una inyección intraventricular y que el marcaje pasivo retardado de células en la zona subventricular es muy improbable.

8. Purificación de células madre neurales por clasificación celular

Hemos visto que la proteína Notch, un receptor de la superficie celular expresado en el sistema nervioso durante el desarrollo embrionario (Kopan y col., Trends Genet. 13: 465), se expresa selectivamente en células ependimales, pero no en células de la zona subventricular en el cerebro y la médula espinal de la rata adulta (Fig. 3). Nos aprovechamos de esta expresión selectiva de Notch 1 para aislar células ependimales de tejido de la pared del ventrículo lateral y de la médula espinal agudamente disociado por clasificación magnética con antisuero Notch 1. Para la clasificación magnética, se recogieron las células como antes y se resuspendieron en 100 \mul de medio de cultivo de la composición antes definida. Se añadió 1 \mul de antisuero de ratón producido contra Notch 1 y se incubó a 4ºC durante 20 min. A continuación, se lavaron las células con 6 ml de DMEM/F12, se resuspendió la pella en 100 \mul de medio de cultivo y se añadieron 34 \mul de antisuero anti-conejo conjugado a perlas magnéticas (1,8-2,1 x 10^{7} perlas, Dynal) prelavado (con 0,5% de BSA en PBS) y se incubó durante 20 min. a 4ºC con agitación ocasional. Tras la incubación, se añadieron 2 ml de medio de cultivo, se transfirió la suspensión a un tubo Eppendorf de 2 ml, se puso en un separador magnético Dynal y se dejó durante 2 min. Se recogió el sobrenadante en una placa Nunc sin revestir de 35 mm (fracción "de lavado"), se retiró entonces el imán del separador, se añadieron 2 ml de medio de cultivo (como se ha definido anteriormente) para resuspender la suspensión de perlas-células y se repitió la etapa de separación magnética. Se volvió a transferir el sobrenadante a una placa de cultivo. Tras la eliminación del imán, se añadieron 2 ml de medio de cultivo, se resuspendieron las células restantes y se transfirieron a una placa Nunc sin revestir de 35 mm. A lo largo de todo el procedimiento, todas las soluciones y las suspensiones celulares fueron conservadas en frío. Se mantuvieron los cultivos celulares a 37ºC con un 5% de CO_{2} en una atmósfera húmeda. Se renovó el medio de cultivo (composición como se ha descrito antes) cada 3-4 días. Se cultivaron entonces las células que tenían perlas magnéticas unidas (clasificadas) o no (fracción de lavado) y se estudiaron en cuanto a la presencia de células madre. Empezaron a aparecer neuroesferas hacia el día 4-5 después del aislamiento. En experimentos en los que las células habían sido clasificadas con el antisuero Notch 1, pero no en experimentos en los que se omitió el antisuero Notch 1, la mayoría de las esferas se formaron en la fracción clasificada (Figura 3). Cuando se disociaron las esferas formadas en la fracción clasificada con Notch 1, formaron esferas secundarias, las cuales eran pluripotentes, lo que corrobora que las células ependimales son células madre neurales.

En otros experimentos, el marcaje in vivo de las células ependimales (véase lo anterior) con Dil fue seguido de clasificación celular activada por fluorescencia ("FACS") o recogida manual de células fluorescentes y se obtuvieron como resultado cultivos altamente enriquecidos de células ependimales.

9. Las células ependimales tienen una lenta velocidad de proliferación y generan una población precursora de la amplificación del tránsito

Estudios previos, basados en la falta de incorporación de nucleótidos marcados después de una sola inyección o de unas cuantas, han indicado que las células ependimales no proliferan en mamíferos adultos. Un rasgo característico de las células madre es que proliferan lenta o raramente y se ha usado la administración de nucleótidos marcados a lo largo de prolongados períodos de tiempo para identificar células madre de ciclos lentos en otros tejidos. Es, pues, probable que se pase por alto una lenta velocidad de proliferación de las células ependimales, que se esperaría si fueran células madre, si se analizara por una sola inyección o por unas cuantas de nucleótidos marcados.

Para caracterizar la proliferación de las células ependimales, suministramos el análogo de timidina 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU, Sigma) continuamente a lo largo de prolongados períodos de tiempo. Más que hacer inyecciones repetidas, administramos BrdU a ratones adultos en el agua de bebida a lo largo de un período de dos a seis semanas antes del análisis. Para conseguir el marcaje a largo plazo del cerebro de los ratones, añadimos 1 mg/ml de BrdU al agua de bebida de los ratones. Se cambió el agua dos veces por semana y se protegió de la luz con una hoja de aluminio. La BrdU fue eficientemente captada a través del intestino y dio lugar al marcaje de las células ependimales que revisten las paredes laterales de los ventrículos laterales. Las células ependimales que revisten el techo y la pared medial de los ventrículos laterales quedaron raramente marcadas, lo que corresponde a que la pared lateral era la región neurogénica más activa. Estaban presentes números muy grandes de células marcadas con BrdU en la zona subventricular (Fig. 4). Las células marcadas en la zona subventricular se agrupaban frecuentemente en estrechos grupos celulares, dando la impresión de ser un clon de células (Fig. 4). Sorprendentemente, en muchos casos dicho grupo célula se localizaba en estrecha proximidad a una célula ependimal marcada (Fig. 4). Las células precursoras proliferantes migraban muy juntas en la zona subventricular hacia la punta anterolateral del ventrículo lateral, donde entran en la corriente migratoria rostral. La relación espacial entre una célula ependimal marcada y un grupo de células de la zona subventricular era en la inmensa mayoría de los casos tal que las células ependimales se desviaban hacia la corriente migratoria rostral en relación a la célula ependimal marcada (Fig. 4).

El hecho de que las células madre tengan una lenta velocidad de proliferación ha sido utilizado para localizar células madre en otros tejidos. Cuando se administran nucleótidos marcados a lo largo de prolongados períodos de tiempo, se marcarán las células de proliferación tanto rápida como lenta. Dejando que los animales sobrevivan durante un período después de la administración del nucleótido marcado, se dará tiempo a las células de rápida proliferación para diluir el marcaje por divisiones continuadas o por migración. Por lo tanto, sólo las células lentamente proliferantes conservarán el marcaje con el tiempo. Analizamos animales que habían recibido BrdU continuamente a lo largo de un período de dos a seis semanas, seguido de dos semanas sin BrdU. En estos animales, se vieron muy pocas células marcadas en la zona subventricular, lo que indica que la inmensa mayoría de las células habían diluido el marcaje por divisiones repetidas o habían migrado (Fig. 4). Sin embargo, un número substancial de células ependimales estaban aún marcadas (Fig. 4).

A continuación, estudiamos la proliferación de células ependimales de la médula espinal. Un número substancial de células ependimales que revisten el canal central fueron marcadas tras administración prolongada de BrdU a través del agua de bebida (Fig. 5). Contrariamente a la zona subventricular del ventrículo lateral, se vieron unas cuantas células marcadas justo por fuera del epéndimo del canal central (Fig. 5). Sin embargo, las pocas células marcadas que fueron vistas próximas al canal central residían con frecuencia en estrecha proximidad a una célula ependimal marcada, lo que sugiere que esta célula puede derivar del epéndimo (Fig. 5).

10. Cultivo de células madre del SNC neural ependimal de cerebro humano adulto

Se extirpó el tejido de la pared del ventrículo lateral de dos pacientes adultos durante la cirugía para eliminar focos epilépticos. Se disoció el tejido enzimáticamente como se describe con detalle para el tejido de roedores, se procesó y se cultivó exactamente del mismo modo. Después de aproximadamente una semana, aparecieron neuroesferas típicas en las placas de cultivo. Al inducir su diferenciación plaqueando las neuroesferas en poli-L-ornitina o añadiendo suero, se diferenciaron neuronas, astrocitos y oligodendrocitos (estudiados con los mismos marcadores específicos de células que en los experimentos con roedores) a partir de neuroesferas simples.

11. Un método cuantitativo que analiza la neurogénesis in vivo en una región cerebral definida, tal como la pars compacta de la substantia nigra en el cerebro medio

Varios datos no publicados de los presentes inventores les han llevado a postular que la región del cerebro en donde mueren las neuronas dopaminérgicas en la enfermedad de Parkinson, es decir, la substantia nigra (Date, Brain Res. Bull. 40: 1) representa una nueva región en la que está presente una renovación continua de neuronas. Se han utilizado técnicas de recuento de células estereológicas del "estado de la técnica" in situ y se han desarrollado aún más (Gundersen y col., APMIS 96: 857; Janson y col., Neuroscience 57: 931) y se ha analizado el número total de neuronas nigrales en ratones jóvenes y viejos, así como el número total de neuronas apoptósicas en la misma región. Resumiendo, los resultados no publicados del presente inventor (Janson y col.) indican que los ratones jóvenes y viejos tienen el mismo número de neuronas dopaminérgicas nigrales, aunque un bajo número de neuronas mueren espontáneamente por apoptosis. Al mismo tiempo, los presentes inventores han visto que la nestina, un marcador para las células progenitoras neuronales como se ha descrito antes, está presente en una subpoblación de neuronas nigrales (datos no publicados, Janson y col.). Tomados conjuntamente, estos datos indican la posibilidad de una neurogénesis continua en equilibrio con la apoptosis neuronal, es decir, una renovación neuronal, que se describe a continuación. El método cuantitativo permite el rastreo in vivo de substancias que aumentan la neurogénesis y/o la migración neuronal.

Se dio Dil a ratas y ratones adultos por inyecciones intraventriculares según se ha descrito en el ejemplo anterior. A varios intervalos de tiempo después de la inyección (horas - meses), los animales fueron perfundidos transcardialmente con 15 ml de solución salina al 0,9%, seguido de 50 ml de paraformaldehído al 4% (p/v) a +4ºC y ácido pícrico al 0,4% (v/v) en solución salina tamponada con fosfatos 0,1 M, pH 6,9, durante 5 min. Tras la extirpación del cerebro, se fijó el tejido durante 90 minutos más en el mismo fijador y se crioprotegió en sacarosa tamponada (10% durante 24 h, 30% durante 2 días) a +4ºC. Se cortó la totalidad del cerebro medio con un criostato usando un diseño de toma de muestras aleatorio, uniforme y sistemático, donde se tomaron secciones frontales de 40 \mum de grosor en seis series rostrocaudales paralelas. Se mantuvo una serie de secciones en PBS 0,1 M y se convirtió inmediatamente la señal fluorescente en una señal permanente de diaminobenzidina (DAB) usando un protocolo previamente descrito modificado (Singleton y col., J. Neurosci. Meth. 64: 47). Así, se sumergieron las secciones de las muestras recién cortadas y de libre flotación durante 10 min. en H_{2}O_{2} al 1% en Tris 0,1 M (pH 8,2) y se lavaron después en tampón solo. Se preincubó entonces el tejido en obscuridad durante 60 min. a +4ºC con DAB filtrada (1,5 mg/ml de tampón Tris, pH 8,2), se lavó en tampón Tris y se montó luego en un portaobjetos de vidrio y se cubrió con solución fresca de DAB, que fue reemplazada por solución fresca cada 30 min. durante el proceso de fotoconversión. Se identificó la substantia nigra en cada portaobjetos de muestra y se irradió la sección con luz ultravioleta utilizando un objetivo 10x y un filtro de rodamina en un microscopio de epifluorescencia (Nikon). Se evaluó cuidadosamente el proceso de fotoconversión y, cuando se visualizó una señal fluorescente en la substantia nigra con el producto DAB marrón, se marcaron inmunohistoquímicamente las secciones con un marcador (Vector SG, Vector) para neuronas dopaminérgicas (tirosina hidroxilasa) utilizando el sistema avidina-biotina-inmunoperoxidasa (Vector) (Janson y col., Neuroscience 57: 931). Se guardaron en lugar de ello las cinco series paralelas de secciones en sacarosa al 30% en PBS 0,1 M a -20ºC hasta su procesamiento para la inmunohistoquímica y se analizaron con un microscopio de barrido por láser confocal utilizando varios marcadores para glía y neuronas (con controles apropiados) para determinar el fenotipo neuronal de las células marcadas con Dil en la pars compacta de la substantia nigra (Fig. 8). Se hicieron estimaciones cuantitativas del número total de cuerpos celulares inmunorreactivos con TH contrateñidos con violeta de cresilo (TH/CV + neuronas), así como de cuerpos celulares inmunorreactivos con TH que también contenían marcaje Dil, en el SNC bilateral. Se determinaron los recuentos neuronales usando secciones codificadas y una técnica estereológica, el fraccionador óptico (Janson y col., Neuroscience 57: 931). Resumiendo, se analizaron las secciones tomadas como muestras sin predisposición en orden rostrocaudal con un sistema CAST-Grid (Computer Assisted Stereological Toolbox, Olympus, Albertslund, Dinamarca), que consiste en una cámara de vídeo sobre un microscopio Olympus BH2 con una platina de muestras motorizada y un "microcator" para monitorizar los movimientos en el eje z (Heidenhain, Traunreut, Alemania); ambos están unidos a un PC con programa GRID y un monitor de alta resolución. Después de cercar el área del SNC en cada sección de muestra a bajo aumento, se realizó el análisis a gran aumento (inmersión en aceite 100x, apertura numérica 1.4). Esto permitió una clara visualización de células individuales en el área cercada densamente poblada a medida que el foco se movía a través del tejido, que fue ópticamente diseccionado en finos cortes y valorado por el microcator con una resolución de 0,5 \mum. Se realizó una toma de muestras aleatoria, sistemática, uniforme y computerizada de pequeños volúmenes (que se extendían 6-9 \mum a lo largo del grosor de la sección); se contaron las neuronas con los nucleolos dentro del volumen de muestreo que satisfacían los criterios estereológicos en una fracción conocida de la totalidad del volumen nigral. Como se ha descrito antes (Chan y col., J. Pharmacol. Exp. Ther. 280: 439), se contaron las neuronas nigrales si mostraban perinúcleos teñidos con Nissl e inmunorreactividad con TH en el cuerpo celular y/o sus dendritas. En la serie de secciones en las que se fotoconvirtió la señal Dil, se contaron las neuronas TH+ que contenían Dil (evaluación a 3.600x). Se determinó el coeficiente de error para cada estimación del número total de neuronas marcadas en diferentes categorías. Los recuentos obtenidos son independientes de cualquier cambio dimensional en el tejido durante el procesado, tal como encogimiento, que se determinó a lo largo del eje z. Se representó el número total de neuronas dopaminérgicas nigrales en varios puntos de tiempo (de varias horas a 60 días) frente al tiempo y, por la curva de regresión (r^{2} = 0,97), se vio que 175 nuevas neuronas se generaban cada semana en esta región del cerebro, que es alrededor de un uno por ciento del número total de neuronas dopaminérgicas nigrales en el ratón.

Se caracterizaron varias corrientes migratorias de células marcadas con Dil al alcanzar diferentes partes de la pars compacta de la substantia nigra (no conocido o descrito con anterioridad, Fig. 9). Con la aplicación de un protocolo modificado para el recuento celular usando un microscopio fluorescente, se determina el número total de células en cada una de las corrientes migratorias definidas. La interpretación de que las neuronas marcadas con Dil eran ciertamente de nueva generación fue confirmada con marcaje con BrdU en animales que recibieron administración crónica en el agua de bebida (1 mg/ml, véase el ejemplo anterior, o por inyecciones intraperitoneales repetidas de BrdU). Más aún, la evidencia de que las "nuevas" neuronas eran funcionales y desarrollaban procesos neuronales apropiados para la proyección se basaba en el descubrimiento de Dil y/o BrdU en algunas de las neuronas nigrales TH+, que también demostraron un marcaje de cuerpos celulares retrógradamente transportado desde la región terminal del nervio en el estriado (FluoroGold).

12. La progenie de células madre ependimales marcadas incluye neuronas en diversas regiones del cerebro y de diversos fenotipos

Utilizando el protocolo de marcaje fluorescente in vivo antes descrito, identificamos varias regiones del cerebro en las que se identificaron células marcadas con Dil como neuronas. Estas regiones incluyen varias partes del hipocampo, incluyendo la capa granular del giro dentado (Fig. 10), capas corticales y estructuras subcorticales, tales como las neuronas que presumiblemente contienen ácido gamma-aminobutírico (GABA) en las regiones subtalámica y de la pars reticulata de la substantia nigra, así como las neuronas serotoninérgicas de los núcleos cerebrales del rafe y las neuronas noradrenérgicas del locus coeruleus.

13. Generación de células madre genéticamente modificadas in vitro

Se generaron células madre sometidas a ingeniería genética cultivando las células madre como antes y transfectándolas luego con plásmidos de expresión o vectores víricos. Para cada transfección, se añadieron 4 \mug de ADN (se estableció el método usando el plásmido CMV-GFP de Clontech, codificante de la proteína fluorescente verde ("GFP") como informador) a 200 \mul de medio de cultivo (definido anteriormente) en un tubo cónico de 12 x 75 mm (15 ml) y se mezclaron suavemente. En un segundo tubo cónico, se añadieron 15 \mul de reactivo Lipofectamine a 200 \mul de medio de cultivo y se agitó vorticialmente con suavidad. Se combinaron entonces las dos soluciones añadiendo la segunda a la primera y se incubó a temperatura ambiente durante 45 min. para permitir la formación de complejos de ADN-liposomas. Se añadieron entonces 1,6 ml de medio de cultivo al tubo con los complejos de ADN-liposomas y se depositó esta solución sobre las células (a las que se había quitado cuidadosamente la mayoría del medio). Se incubaron las células durante 12 horas y se substituyó luego el medio con el medio de cultivo regular sin ADN. Se realizó la detección de GFP en un microscopio de fluorescencia 48-72 horas después de la transfección. Estas células madre pudieron ser expandidas clonalmente para generar esferas de células madre genéticamente modificadas indiferenciadas.

14. Expresión génica alterada en células madre in vivo

Se vio la viabilidad de alterar la expresión génica en células madre in vivo inyectando un adenovirus deficiente en replicación portador del gen informador LacZ bajo el control del promotor RSV en los ventrículos laterales como se ha descrito anteriormente. La tinción con X-gal (antes descrita) demostró la expresión de un gen informador en células madre ependimales y, por lo tanto, la viabilidad de alterar la expresión génica en células madre. Se generan células madre que llevan genes que dirigen la expresión del factor del crecimiento de los nervios, del factor neurotrófico derivado de la línea de células de la glía (factor de supervivencia neuronal), bc1-2 (un gen que promoverá la supervivencia de las células madre) y nurr1 (que puede promover la generación de neuronas dopaminérgicas a partir de las células madre).

15. Uso de células madre de animales transgénicos

Hemos visto que es posible cultivar células madre de animales transgénicos. Para estos estudios, hemos utilizado ratones portadores del gen LacZ en su genoma (Zambrowicz y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 3789). Estos ratones expresan el transgén de forma ubicua en todos los tejidos (Zambrowicz y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 3789). Se purificaron células madre de estos ratones y se cultivaron como antes. Se reveló una fuerte expresión del transgén por tinción con X-gal como se ha descrito antes.

16. Manipulación de la proliferación y diferenciación de las células madre por lesión traumática

En ratas adultas, se realizó una laminectomía a nivel torácico medio para exponer la médula espinal y se cortó transversalmente el funículo dorsal con tijeras de microcirugía y se prolongó a continuación la lesión rostralmente mediante una incisión longitudinal superficial en el funículo dorsal. En otros animales, se practicó un orificio en el cráneo y se insertó una aguja en el tejido cerebral para inducir una lesión. En algunos animales, se habían marcado las células ependimales 1-10 días antes de la lesión mediante una inyección de Dil como se ha descrito antes. La cuantificación de la proporción de células ependimales que proliferan a distintos puntos temporales tras una incisión en el funículo dorsal reveló un aumento de casi 50 veces 1 día después de la lesión en comparación con animales no lesionados (Fig. 5). Después de este primer día, la proliferación declinó gradualmente hacia lo normal en un mes (Fig. 5). Igualmente, la proliferación de las células ependimales aumentó mucho en la pared del ventrículo lateral después de la lesión cerebral.

En animales en los que las células ependimales fueron marcadas mediante una inyección de Dil antes de la lesión de la médula espinal o del cerebro, se vio progresivamente un número creciente de células marcadas con Dil más hacia fuera de la capa ependimal a lo largo de las primeras cuatro semanas tras la lesión (Fig. 6). Las células marcadas con Dil eran abundantes en el tejido cicatricial en formación en el plazo de una semana después de la lesión y persistieron en él durante al menos un año. En el tejido cicatricial que se formaba en la lesión, la inmensa mayoría de las células marcadas con Dil mostraban inmunorreactividad a la proteína ácida fibrilar de la glía, un marcador de astrocitos, lo que indica que la mayoría de la progenie de las células ependimales se habían diferenciado en astrocitos (Fig. 6). Sin embargo, no se encontraron marcadores neuronales en las células marcadas con Dil, lo que indica que las señales requeridas para la transformación neuronal de las células madre no estaban presentes en este modelo animal.

17. Productos químicos que aumentan la neurogénesis en la pars compacta de la substantia nigra en el cerebro medio

Se dio a ratones por separado 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina ("MPTP", RBI, Natick, MA, EE.UU.) (40 mg/kg diluidos en suero fisiológico, s.c.). Esta substancia es conocida por sus acciones neurotóxicas selectivas sobre las neuronas dopaminérgicas en el cerebro medio que causan parkinsonismo en humanos y animales experimentales (Langston y col., Science 219: 979; Heikkila y col., Science 224: 1451). Sin embargo, la molécula tiene también estructuras en común con compuestos que se sabe actúan como agentes neuroprotectores en modelos animales de la enfermedad de Parkinson, por ejemplo, nicotina (Janson y col., Neuroscience 57: 931).

En nuestros experimentos, se dio a los animales MPTP o vehículo y se analizó el curso temporal de los cambios en el número de células dopaminérgicas nigrales Dil+ o en el patrón de tinción de las corrientes migratorias de células Dil+ que se mueven hacia esta región del cerebro (véase lo anterior, método cuantitativo para estudiar la neurogénesis en la pars compacta de la substantia nigra en el cerebro medio después de marcar las células ependimales). El tratamiento dio lugar a números superiores de neuronas nigrales TH+/Dil+, así como TH+/BrdU+, lo que indica un aumento en la neurogénesis. Además, las corrientes migratorias de células Dil+ en el cerebro medio aparecían más pronunciadas en animales tratados con MPTP, que pueden ser analizadas cuantitativamente usando el método estereológico modificado antes descrito.

18. Trasplante de células madre ependimales

Se purificaron células madre ependimales del cerebro o de la médula espinal de ratones transgénicos Rosa26 y se cultivaron como antes. Se trasplantaron esferas de células madre indiferenciadas de estos ratones al estriado de ratas adultas por inyección estereotáxica de esferas en 15 \mul de su medio de cultivo (descrito anteriormente). Se sacrificaron los animales 2 días después y se seccionaron los cerebros y se analizaron en cuanto a la presencia de células que expresan LacZ derivadas de los ratones Rosa26 por tinción con X-gal como se ha descrito antes. Las células injertadas estaban dispersas en el tejido cerca del canal de inserción. Estas células tenían con frecuencia varios procesos
(Figura 7).

19. Desarrollo de ensayos para el rastreo de alto rendimiento de substancias que influyen en la diferenciación de las células madre neurales

Se desarrollan sistemas de ensayo para estudiar eficientemente la capacidad de substancias para promover la diferenciación de las células madre neurales ependimales en un fenotipo particular glial o neuronal. Dichas substancias podrían ser entonces estudiadas in vivo como se ha señalado anteriormente.

20. Potencial amplio de las células madre neurales del cerebro adulto para generar tejidos de todas las capas germinales 20 a. Cultivo de CMN

Se disoció enzimáticamente la pared lateral de los ventrículos laterales como se ha descrito antes (Johansson y col., Cell, 96: 25). El medio de cultivo consistía en 20 ng/ml de EGF (Collaborative Biomedical Products), suplemento B27 (Life Technologies), glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina en medio DMEM-F12 (Life Technologies). Se añadió EGF (20 ng/ml) al medio cada 48 horas después del plaqueo inicial de las células.

20 b. Análisis de ARN

Se extrajeron ARN de los tejidos usando RNeasy (Qiagen) y se hizo una transcripción inversa de 500 ng del ARN total a ADNc usando Superscript II (Life Technologies) y hexámeros aleatorios (Pharmacia) en un volumen de reacción de 50 \mul en las condiciones recomendadas por el fabricante. Se llevaron a cabo las reacciones de PCR en presencia de MgCl_{2} 2,5 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,8 a 25ºC), KCl 50 mM, Nonidet P40 al 0,08%, 0,2 mM de cada dNTP, 5 U de ADN polimerasa Taq (Fermentas), 0,1 mg/ml de BSA y 30 pmoles de cada cebador oligonucleotídico y en presencia de alfa[^{32}P]dCTP. Para normalizar los rendimientos de ADNc, se llevó a cabo una reacción de PCR semicuantitativa usando cebadores específicos para ADNc codificante de \beta-galactosidasa en combinación con cebadores específicos para la proteína ribosomal L19. Se usaron 40 ciclos de 94ºC (1 minuto), 64ºC (1 minuto) y 72ºC (1 minuto) para amplificar la \beta-galactosidasa con el siguiente par de cebadores oligonucleotídicos: oligonucleótido sentido 5'-TTG GAG TGA CGG CAG TTA TCT GGA-3' (SEC. ID. Nº 1) y oligonucleótido antisentido 5'-TCA ACC ACC GCA CGA TAG AGA TTC-3' (SEC ID. Nº 2). Después de 25 ciclos, se suplementó la reacción con 5 U de ADN polimerasa Taq y se añadieron cebadores oligonucleotídicos específicos para L19 como control interno: oligonucleótido sentido 5'-CCT TGG ACA GAG TCT TGA TGA TCT CCT-3' (SEC. ID. Nº 3) y oligonucleótido antisentido 5'-CTT CTC AGG AGA TAC CGG GAA TCT AAG-3' (SEC. ID. Nº 4).

20 c. Inmunohistoquímica

Se incubaron secciones del criostato y células cultivadas con anticuerpos primarios durante 1 h a 37ºC o durante la noche a 4ºC, se lavaronen PBS y se incubaron con antisuero secundario durante 45 min. a temperatura ambiente.

20 d. Agregación de las mórulas e inyección de blastocistos

Se tripsinizaron las esferas de células proliferantes en los 4 a 6 días siguientes a su aislamiento inicial y se resuspendieron en PBS 1X para agregación o microinyección.

Se agregaron las células madre neurales con mórulas CD-I o se inyectaron en blastocistos derivados de ratones C57BL y se implantaron en madres adoptivas usando técnicas y procedimientos estándar.

20 e. Integración de las células madre neurales en la masa celular interior del blastocisto

Con objeto de analizar el potencial de diferenciación de las células madre neurales del adulto, estudiamos la capacidad de estas células para contribuir a la formación de diferentes tejidos introduciendo células madre neurales adultas en un ambiente embrionario precoz y seguimos el destino de su progenie.

Se pueden propagar células madre neurales pluripotentes a partir de tejido de cerebro y médula espinal de adulto disociado en ciertas condiciones de cultivo. En estas condiciones, las células simples proliferan y la progenie forma un grupo de células agregadas. Dichos clones de células se desprenden de la placa de cultivo después de unos cuantos días in vitro. En presencia de mitógenos, tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) o el factor de crecimiento de los fibroblastos (FGF), las células continúan proliferando y forman un agregado celular esferoide característico, al que se hace referencia como neuroesfera, de células estrechamente agrupadas, todas ellas derivadas de una sola célula (Reynolds y col., Science 233: 1707).

Para estudiar inicialmente si las células madre neurales derivadas de adultos pueden sobrevivir en el microambiente de la embriogénesis muy precoz, se agregaron inicialmente esferas simples de células madre neurales o numerosas células simples enzimáticamente disociadas con mórulas compactadas de 8 células y se dejó que continuaran desarrollándose in vitro hasta el estadío de blastocisto precoz. Como las células madre neurales fueron cultivadas a partir de ratones Rosa26 que expresan de forma ubicua \beta-galactosidasa derivada de Escherichia coli, estas células y su progenie pudieron ser fácilmente identificadas después de fijar y de teñir. En los blastocistos precoces, muchas de las células madre neurales parecían unirse y proliferar sobre el trofectodermo externo (Fig. 11A). Sin embargo, unas pocas células pudieron intermezclarse con las células de las mórulas y se las encontró en la masa celular interna del blastocisto en desarrollo (Fig. 11B). Como estas células madre neurales podían agregarse con éxito con mórulas en el estadío de 8 células y sobrevivir en la masa celular interna al estadío de blastocisto precoz del desarrollo, era plausible suponer que estas células pueden ser capaces de contribuir, al menos en parte, a la formación del sistema nervioso central embrionario o posiblemente a otros tejidos embrionarios. Una contribución más eficiente de las células madre neurales a la masa celular interna fue adquirida microinyectando las células directamente en los blastocistos precoces.

20 f. Las células madre neurales del adulto pueden contribuir a la generación de embriones de ratón quiméricos

Para estudiar la capacidad de las células madre neurales del adulto para contribuir a la generación de diferentes tejidos, se transfirieron blastocistos de C57BL/6 inyectados con 10 a 20 células madre neurales simples a madres adoptivas y se dejó que se desarrollaran hasta el día embrionario 11. Se fijaron los embriones en paraformaldehído y se estudió la expresión de lacZ por histoquímica X-gal e inmunohistoquímica con anticuerpos contra la \beta-galactosidasa. Se usaron otros embriones para detectar la presencia de ARNm de \beta-galactosidasa usando RT-PCR.

El examen de embriones totalmente montados E11 teñidos para detectar la presencia de \beta-galactosidasa derivada de las células madre neurales de adulto de los ratones Rosa26, reveló grados variables de quimerismo en los embriones analizados. Dentro de las camadas, había un gran grado de variación en el grado de quimerismo y en todas las camadas siempre había varios embriones que carecían por completo de células que expresaran lacZ. Los embriones quiméricos eran de un tamaño similar a los embriones no quiméricos y no mostraban ninguna anormalidad anatómica evidente. Se muestra un embrión que exhibía un alto grado de quimerismo en la figura 11, junto con un control no inyectado C57BL/6 de tipo salvaje. El examen superficial del embrión derivado de un blastocisto inyectado revela una amplia contribución de las células madre neurales derivadas de Rosa26 a la médula espinal ventral, al cerebro medio, a los ojos, al corazón y a muchos otros órganos y tejidos internos. Los embriones que exhibían menos contribución de las células madre neurales derivadas de Rosa26, exhibían primariamente tinción en el área de la unión del intestino medio al intestino posterior o en corazón. Frecuentemente, se observó un nivel relativamente bajo de tinción endógena en el embrión de tipo salvaje en el área de las vesículas óticas y en las venas umbilicales. Sin embargo, no se vio actividad endógena adicional en otras áreas de los embriones de tipo salvaje examinados. Se confirmó la especificidad de la tinción X-gal en embriones quiméricos solapando el marcaje inmunohistoquímico con antisueros contra la \beta-galactosidasa. Las áreas que mostraron actividad de tipo \beta-galactosidasa endógena en embriones de tipo salvaje no se marcaron con antisueros contra la \beta-galactosidasa.

Más aún, para estudiar la contribución de las células derivadas de Rosa26 en aún una forma independiente, se usó RT-PCR para estudiar la presencia de ARNm de \beta-galactosidasa en el ARN total aislado de los embriones E11 inyectados con células madre neurales de adulto o de controles de tipo salvaje no inyectados. Los embriones usados en este análisis fueron disecados transversalmente en tres secciones: cabeza (incluyendo los arcos branquiales), área torácica (por debajo de los arcos branquiales y por encima del cordón umbilical) y la región caudal del embrión (incluyendo el área umbilical, los miembros posteriores y la cola). Se usaron cebadores oligonucleotídicos específicos para el gen de la \beta-galactosidasa para amplificar el ADNc obtenido de cada una de las secciones embrionarias. Se añadieron también dos cebadores oligonucleotídicos adicionales específicos para la detección de ARNm de L19, una proteína ribosomal, a la reacción de PCR para que sirvieran como control interno. No se detectó ARNm de \beta-galactosidasa en las muestras tomadas de embriones no inyectados, mientras que se observó una señal moderada predominantemente en la cabeza y en la región torácica de los embriones que contenían el corazón y el intestino medio. Esta distribución de la expresión de lacZ era consistente con el patrón observado en la tinción de montaje total de otros embriones para detectar el patrón de expresión del producto del gen de la \beta-galactosidasa.

20 g. Las células madre neurales de adulto pueden participar en la generación de tejidos en todas las capas germinales

En las Figs. 12 y 13, respectivamente, se muestran ejemplos de las secciones de embriones quiméricos que exhiben niveles máximos de contribución quimérica observados en tejidos de embriones inyectados con las células madre neurales de adulto. Las células madre neurales de adulto contribuyen significativamente a algunos tejidos de origen ectodérmico en el embrión de ratón E11. En la región craneal, la contribución era más aparente en las regiones ventral y medial de la médula espinal, la lámina terminal del telencéfalo, el infundíbulo del diencéfalo, el tallo óptico, la capa retiniana y la lente del ojo, la cóclea del oído interno y las placodas nasales. En la región torácica, sin embargo, se puede observar comparativamente poca contribución de las células madre neurales de adultos en tejido derivado del ectodermo, más notablemente a la epidermis.

También se puede observar una alta contribución quimérica de las células madre neurales derivadas de adultos en tejidos derivados del endodermo embrionario definitivo. Esto es predominantemente observado en la región faríngea, que incluye el intestino anterior, la lengua, la cavidad oral, las bolsas faríngeas y la glándula tiroides. En la región torácica, la contribución a tejidos de origen endodérmico era también significativa en el esófago, la tráquea, los brotes pulmonares, el estómago, el intestino, el páncreas y el hígado.

Diversos tejidos de origen mesodérmico también exhiben un alto nivel de contribución de las células madre neurales del adulto. Estos tejidos incluían el notocordio, el miocardio que comprende las paredes atriales y ventriculares del corazón, la aorta dorsal y el primordio del reborde genital y los túbulos mesonéfricos. Aquí, sin embargo, es también importante observar la contribución comparativamente reducida de las células madre neurales derivadas del adulto al músculo esquelético y el hueso en desarrollo.

20 h. Diferenciación a tipos celulares específicos de tejidos

Para analizar si las células que expresan lacZ derivadas de células madre neurales de adultos encontradas en los embriones quiméricos se habían diferenciado en tipos celulares típicos del tejido en el que se habían integrado, estudiamos la expresión de marcadores celulares distintos expresados por las células que normalmente constituyen algunos de estos tejidos. Usamos una doble tinción inmunohistoquímica para demostrar la expresión solapante de \beta-galactosidasa con anticuerpos monoclonales específicos para Tuj1, HB9, tirosina hidroxilasa (TH), erizo sónico (Shh), actina del músculo liso y desmina (Figs. 12 y 13). Estos anticuerpos detectan la \beta-tubulina III (específica para los microtúbulos axonales), las neuronas motoras, las neuronas dopaminérgicas, las productoras de Shh que se encuentran en la médula espinal ventral, el músculo liso que reviste muchas arterias y venas y un filamento intermedio que se encuentra en el músculo cardíaco y esquelético, respectivamente. Se usan anticuerpos adicionales para detectar la co-localización de las células secretoras de insulina o glucagón del páncreas con la de la \beta-galactosidasa.

Discusión

La pérdida de células es un factor común en muchos tipos de trastornos del sistema nervioso. Tipos distintos de células están afectados en diferentes enfermedades, por ejemplo, las neuronas dopaminérgicas en la enfermedad de Parkinson, las neuronas motoras en la esclerosis lateral amiotrófica y los oligodendrocitos en la esclerosis múltiple. Varios tipos de células diferentes en una determinada área pueden estar afectados en otras situaciones, tales como el accidente cerebrovascular o la lesión traumática. Actualmente, no se dispone de métodos en la práctica clínica para estimular la generación de nuevas células en el sistema nervioso. El trasplante de células de embriones humanos o de animales ha sido estudiado clínicamente con algunos resultados esperanzadores. Sin embargo, estos métodos presentan varios problemas, principalmente éticos e inmunológicos, lo que hace muy improbable que se utilicen en ningún número mayor de pacientes. La reciente constatación de que existe una población de células madre pluripotentes en el sistema nervioso central del adulto ha dado esperanzas de que pueda ser posible estimular la generación de nuevas células en el sistema nervioso central del adulto a partir de las propias células madre del paciente. Unas cuantas cuestiones clave han quedado, no obstante, sin contestar y han hecho difícil proceder en este campo. La presente identificación de las células madre ha hecho ahora posible desarrollar métodos para purificar estas células, estudiarlas cuantitativamente in vivo, modificarlas genéticamente y estimularlas con diversos compuestos farmacéuticos in vitro e in vivo. Más aún, la presente invención proporciona evidencia de que las células madre siguen nuevas rutas migratorias a varios grupos de células neuroanatómicos en el SNC y que son capaces de transformarse en neuronas in vivo. La invención también incluye un método cuantitativo sin predisposición para valorar la neurogénesis en diversas regiones del cerebro, así como técnicas para analizar el número total de células madre y su progenie que migra a diversas regiones del cerebro. En conjunto, los desarrollos aportados por la presente invención aumentan mucho las posibilidades de desarrollar estrategias para estimular la generación de nuevas células en el sistema nervioso
central.

La alteración de la expresión de genes en células puede hacer que estas células produzcan una proteína dada de elección o puede evitar la producción de una proteína no deseada. La manipulación de los genes de las células in vitro o in vivo según la presente invención puede ser beneficiosa en una amplia variedad de situaciones. Por ejemplo, se pueden trasplantar células sometidas a ingeniería para expresar un factor de crecimiento, citokina, hormona o cualquier otra proteína a individuos que pueden necesitar la administración continua de dicha proteína para estimular, por ejemplo, la señalización celular o la supervivencia celular. Las células servirán así como administradores continuos de una substancia farmacéutica. Las células para tal uso pueden ser amoldadas genéticamente, por ejemplo, por transfección con vectores plasmídicos o víricos, o se pueden tomar las células de organismos transgénicos. Los organismos transgénicos que contienen células según la presente invención entran también dentro del alcance de la presente invención. Más aún, la expresión génica puede ser alterada in situ en un organismo induciendo la expresión génica ectópica con vectores plasmídicos o víricos, así como fragmentos de ADN o ARN antisentido. En determinadas circunstancias, puede ser valioso usar células que carezcan de un cierto gen o que produzcan niveles menores del producto génico. Por ejemplo, el trasplante de células o tejidos entre diferentes individuos está limitado por la expresión de ciertas proteínas sobre las superficies de las células que induce al sistema inmune del huésped a rechazar el injerto. Este es un problema importante, especialmente si los dos individuos son de especies diferentes. Una forma de soslayar este problema es generar células o animales genéticamente modificados que carezcan de genes que inducen el rechazo por el sistema inmune de un huésped. Otras implicaciones importantes para manipular la expresión génica en células in vitro o in vivo incluyen la inducción de la diferenciación de una célula indiferenciada hacia un determinado destino celular o la estimulación de la supervivencia de la célula suprimiendo las señales de muerte celular intrínsecas o extrínsecas. Más aún, introduciendo ciertos genes, es posible inmortalizar células y generar líneas celulares clónicas con características especiales. Como la identidad y la localización de las células madre neurales en el sistema nervioso central del adulto han resultado desconocidas, ha sido previamente difícil modificar estas células genéticamente, especialmente in vivo. La invención de métodos par purificar células madre en cultivo celular permite todo tipo de manipulación genética, por ejemplo, la transfección de estas células con vectores de expresión plasmídicos o víricos o la purificación de células de organismos transgénicos o la supresión de la expresión génica con, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN antisentido. La localización de la célula madre in vivo permite la alteración de la expresión génica en estas células in situ con, por ejemplo, vectores
víricos.

Se ha demostrado también anteriormente que las células madre del cerebro adulto pueden contribuir a la formación de múltiples tejidos derivados de todas las capas germinales en embriones de ratón quiméricos. La progenie de las células madre neurales expresa marcadores específicos de tejidos adecuados para los tejidos en los que se integran y que no se expresan en el sistema nervioso. Se integran y diferencian de un modo funcional. Quizá, el ejemplo más chocante de esto es la gran contribución frecuente de la progenie de las células madre neurales al corazón; la funcionalidad de las células era aquí obvia por un corazón latiente de anatomía normal aparente.

Control epigenético de la diferenciación celular

El destino celular de las progenitoras que surgen de estas células madre en tejidos específicos puede no estar determinado autónomamente, sino determinado por la exposición de la célula a un grupo reproducible de señales extrínsecas. Ciertamente, al caracterizar la progenie de las células madre neurales, hay una creciente evidencia de que los factores de crecimiento extrínsecos pueden modificar directamente el destino de las células madre neurales, condicionando la posterior diferenciación. Si se exponen transitoriamente poblaciones de células madre clónicas derivadas del hipocampo de roedores al factor neurotrófico ciliar ("CNTF"), producen astrocitos a expensas de las neuronas; si se exponen transitoriamente a la hormona tiroidea (T3), producen oligodendrocitos a expensas de las neuronas. Se observan los mismos resultados con células madre neurales embrionarias o de adultos (Johe y col., Genes Dev. 10: 3129). Estos datos sugieren que los factores de crecimiento afectan directamente al destino de las células madre, dando lugar a la producción de células progenitoras destinadas a generar neuronas, astrocitos u oligodendrocitos. Se han observado resultados similares usando células de las crestas neurales cultivadas de forma clónica; BMP2 induce a las neuronas autónomas, el factor de crecimiento de la glía induce el destino de las células de Schwann y el factor de crecimiento transformante \beta ("TGF-\beta") induce la diferenciación de músculo liso (Shah y col., Cell 77: 349; Shah y col., Cell 85: 331). Estos datos sugieren que las diferencias regionales en la expresión génica pueden no conducir a poblaciones molecularmente diferentes de células madre y que las diferencias inherentes en el destino de las células madre pueden modificarse por exposición a señales extrínsecas.

¿Carecen las células madre neurales del adulto de restricción de linaje o se desdiferencian?

Los experimentos de trasplantes en embriones precoces han definido puntos temporales cuando se restringen las células a determinados linajes. La obligación a sufrir un determinado destino es impuesta por la expresión de combinaciones específicas de genes. Experimentos in vitro han demostrado el potencial de las células madre neurales del adulto para generar neuronas y células de la glía. En una primera consideración, es, por lo tanto, natural suponer que una célula madre neural de adulto necesita experimentar una desdiferenciación para generar células de un linaje diferente. Sin embargo, es notorio que muchos de los genes implicados en dar a una célula una determinada identidad y restricción de linaje se expresan transitoriamente durante el desarrollo embrionario. La expresión de genes determinantes del linaje puede no ser necesaria después del desarrollo de un tejido, ya que una población de células madre puede estar físicamente restringida a ese tejido particular y el ambiente molecular puede impulsar destinos específicos de tejidos sobre las nuevas células. Así, es posible que las células madre del sistema nervioso central del adulto hayan perdido su destino neural. Definir la pluripotencialidad de las células madre que residen en el sistema nervioso central del adulto puede ayudarnos a empezar a entender los fenómenos moleculares complejos necesarios para que las células madre neurales de adultos, o las células madre en general, abandonen su estado quiescente y entren en una fase proliferativa para producir progenitoras con un destino celular determinado.

Hay indicaciones de que otras poblaciones de células madre pueden tener un potencial de diferenciación más amplio en el adulto que en el embrión. Por ejemplo, las células madre hematopoyéticas trasplantadas al cerebro pueden generar astrocitos. Esto abre la posibilidad de que las células madre en diferentes tejidos de adultos puedan ser muy similares y tener un potencial próximo al de las células madre embrionarias. Ciertamente, es posible que haya sólo una población de células madre fundamental que exista en el organismo adulto.

Para acordar más directamente la potencia celular de las células madre neurales derivadas de la pared ventricular lateral del cerebro adulto, hemos puesto estas células en el microambiente de blastocistos precoces y hemos visto que estas células contribuyen a numerosos órganos y tejidos que originalmente derivan de las tres capas germinales durante el desarrollo embrionario.

En resumen, la presente invención hará posible desarrollar nuevas estrategias de tratamiento en diversas enfermedades del SNC, no sólo en enfermedades con una lenta progresión de la neurodegeneración (incluyendo la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica y la esclerosis múltiple), sino también en situaciones clínicas de trauma agudo en la cabeza o en la médula espinal, así como en enfermedades cerebrovasculares. Nuestro descubrimiento de que las células madre pueden transformarse en varios fenotipos neuronales diferentes (neuronas dopaminérgicas, neuronas GABA, neuronas serotoninérgicas), así como en tipos de tejidos completamente diferentes, abre la puerta a posibles aplicaciones más allá de las enfermedades mencionadas, donde la pérdida celular es fundamental para el desarrollo de la enfermedad, en nuevas áreas posibles, incluyendo la depresión y otros trastornos mentales, así como la cirugía cardíaca.

<110> Neuronova AB

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<120> Un método de purificación de células

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<130> neuronovapct

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<140> 9802264-3

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<141> 24-06-1999

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<160> 4

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: cebadores de PCR para el gen de la beta-galacto-sidasa de E. coli.

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<400> 1

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ttggagtgac ggcagttatc tgga

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tcaaccaccg cacgatagag attc

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cttctcagga gataccggga atctaag

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Claims

1. Una célula madre del SNC neural ependimal no embrionaria aislada, cuya célula expresa la proteína de superficie Notch 1 junto con al menos una proteína de superficie seleccionada entre el grupo de Notch 2, Notch 3, CAR (adenovirus que se une a proteínas de transmembrana) y CFTF (regulador de la conductancia de transmembrana en la fibrosis quística) y cuya célula tiene también al menos un cilio.

2. Una célula madre del SNC neural ependimal aislada según la reivindicación 1, que se origina de un mamífero, tal como un roedor o un humano.

3. Un método de aislamiento de células madre del SNC neural ependimal a partir de tejido del SNC post-natal, cuyo método consiste en aislar selectivamente células ependimales de dicho tejido del SNC.

4. Un método de aislamiento de células madre del SNC neural ependimal según la reivindicación 3, caracterizado por disociar el tejido ependimal y recuperar las células madre del SNC neural ependimal de ese tejido.

5. Un método según la reivindicación 4, caracterizado por disociar enzimáticamente el tejido ependimal mediante enzimas hidrolizantes, tales como la colagenasa, la tripsina o la hialuronidasa, o por disociarlo con ácido quinurénico.

6. Un método según la reivindicación 4 ó la reivindicación 5, caracterizado por mantener las células liberadas disociando el tejido ependimal en un medio de cultivo que contiene EGF y/o FGF.

7. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 3-6, caracterizado por conseguir la recuperación de las células madre del SNC neural ependimal rastreando células simples en cuanto al menos una característica de una célula madre del SNC neural ependimal.

8. Un método según la reivindicación 7, caracterizado por rastrear las células simples en cuanto a la presencia de Notch 1, al menos un cilio y la expresión de al menos una proteína de superficie seleccionada entre el grupo de Notch 2, Notch 3, CAR y CFTR.

9. Un método según la reivindicación 7, caracterizado por el hecho de que dicha característica de una célula madre del SNC neural ependimal es un marcaje previamente preparado in vivo de la célula ependimal.

10. Una preparación celular consistente en células madre del SNC neural ependimal según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, cuya preparación contiene al menos un 10%, preferiblemente al menos un 50%, especialmente al menos un 80% y más preferiblemente al menos un 90% de células madre del SNC neurales ependimales.

11. Una preparación celular según la reivindicación 10, caracterizada por ser al menos un 4% de las células madre células madre activas, es decir, que no son quiescentes.

12. Una preparación celular según la reivindicación 10 ó la reivindicación 11, caracterizada por haber sido preparada pro un método según cualquiera de las reivindicaciones 3-9.

13. Una preparación celular según cualquiera de las reivindicaciones 10-12, que contiene células madre del SNC neural ependimal genéticamente manipuladas.

14. Una célula madre del SNC neural ependimal según cualquiera de la reivindicación 1 ó de la reivindicación 2 para uso médico.

15. Una composición farmacéutica consistente en una célula madre del SNC neural ependimal según cualquiera de la reivindicación 1 ó de la reivindicación 2 junto con un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

16. Uso de una célula madre del SNC neural ependimal según la reivindicación 1 ó la reivindicación 2 para fabricar una composición farmacéutica para generar tejido neural.

17. Uso de una célula madre del SNC neural ependimal según la reivindicación 1 ó la reivindicación 2 para fabricar una composición farmacéutica para generar tejido no neural, tal como tejido del corazón, del ojo, del oído interno, del hígado, del riñón, del páncreas y de otros órganos endocrinos.

18. Uso de una célula madre del SNC neural ependimal según la reivindicación 1 ó la reivindicación 2 para fabricar una composición farmacéutica para tratar la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica, la esclerosis múltiple, el trauma agudo de la cabeza o de la médula espinal, enfermedades cerebrovasculares, enfermedades musculares, enfermedades cardiológicas o enfermedades del ojo, del oído, del hígado, del riñón, del páncreas y de otros órganos endocrinos.