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Hintergrund
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Die
Degeneration von spezifischen Arten von Neuronen im Zentralnervensystem
(ZNS) oder im enterischen Nervensystem (ENS) führt zu mehreren Haupterkrankungen.
Bei der Parkinson-Krankheit (PK) tritt ein Verlust der dopaminergen
Neuronen in der Substanz nigra des Gehirns auf, was zur Hemmung
der Skelettmuskel-Bewegungskoordination führt. Es wurde gezeigt, dass
es einen Verlust an dopaminergen Neuronen im Colon von PK-Patienten mit
Obstipation gibt. Bei der Achalasie, beim Morbus Hirschsprung und
bei der angeborenen Pylorus-Stenose
ist der Verlust der Stickstoffoxid-produzierenden Neuronen (nitrinerg)
gut dokumentiert. Dieser nitrinerge Verlust führt zum Unvermögen der
gastrointestinalen glatten (GI) Muskulatur, sich zu entspannen,
was zu schwerwiegenden Motilitätsstörungen führt.
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Eine
hochinteressante, neue Behandlungsstrategie besteht darin, diese
Verluste durch Implantieren von Neuronen in die betroffenen Bereiche
zu ersetzen. Beispielsweise führte
die Implantation von fötalen
Neuronen in das Gehirn von PK-Patienten
zur Verbesserung der motorischen Funktion. Jedoch konnten die anatomischen
und funktionalen Kontakte dieser implantierten Zellen mit striatalen
Neuronen aufgrund von Schwierigkeiten bei der Identifizierung der
implantierten Neuronen und da kein funktionaler Test für den Zusammenhang
zur Verfügung
stand, nicht deutlich gezeigt werden. Die Verwendung von fötalem Gewebe
hat schwerwiegende Einschränkungen.
Die Versorgung mit menschlichem fötalem Gewebe ist eingeschränkt, und
es besteht die Möglichkeit,
dass eine Wirt/Transplantat-Abstoßung der implantierten Neuronen
erfolgt.
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Neurodegenerative
Erkrankungen des ZNS wie PK, Alzheimer-Erkrankung, Multiple Sklerose und
Chorea Huntington sind häufige
Probleme in der klinischen Praxis. Es wird zunehmend erkannt, dass neben
den gut bekannten degenerativen Krankheiten der enterischen Nerven,
wie Achalasie, Morbus Hirschsprung und angeborener Pylorus-Stenose mehrere
andere allgemeine Gastrointestinalkrankheiten, z.B. die Reflux-Krankheit,
das Reizcolon und die intestinale Pseudoobstruktion mit gestörten enterischen
Neuronen im Zusammenhang stehen.
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Das
enterische Nervensystem (ENS) ist Teil des peripheren Nervensystems
und besteht aus neuronalen Zellkörpern,
ihren Fasern und den stützenden
Zellen, die in der Wand des GI-Traktes lokalisiert sind. Diese Zellkörper sind
in zwei Plexi des Hauptganglions angeordnet, einen peripheren myenterischen
(Auerbach-) Plexus zwischen den Ring- und Längsmuskelschichten und einen
submukosalen (Meisner-) Plexus im submukosalen Bindegewebe zwischen
der lamina muscularis mucosae und dem Ringmuskel. Meistens stellen
die myenterischen Neuronen der glatten Darmmuskulatur exzitatorische (Acetylcholin
und SP) und inhibitorische (Stickstoffoxid, VIP, CGRP und ATP) Transmitter
bereit. Der Tonus der Darmmuskulatur hängt vom aufsummierten Einfluss
der entgegengesetzten Wirkung dieser Neurotransmitter ab.
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Die
derzeitigen Behandlungsoptionen für neurodegenerative Gastrointestinalkrankheiten
sind sehr begrenzt. Daher besteht ein Bedarf an neuen Behandlungsvorschriften
für Gastrointestinalkrankheiten,
die Neuronen, Muskelgewebe oder andere Gewebe sowie andere Krankheiten
einschließen,
die mit gastrointestinalen Organen im Zusammenhang stehen.
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Zusammenfassung
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Die
vorliegende Erfindung ist auf die Verwendung von neuralen Stammzellen,
die keine menschlichen embryonalen Stammzellen sind, deren Nachkommen
oder Kombinationen davon, für
die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Subjekts,
das an einer neuro-degenerativen Gastrointestinalkrankheit leidet, gerichtet,
wobei das Arzneimittel in eine Wand eines Hohlorgans des Gastrointestinaltraktes
des Subjekts implantiert werden soll, wobei die implantierten Zellen
einen zellulären
Bestandteil neu besiedeln und/oder eine Quelle für ein biologisches Material
bereitstellen. Das Subjekt ist vorzugsweise ein Säuger und
stärker
bevorzugt ein Mensch. Die Gastrointestinalkrankheit ist angeboren
oder erworben. Sie wird ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Achalasie, Morbus Hirschsprung, Gastrophorese
und intestinaler Pseudoobstruktion. Das Spektrum der Krankheiten,
bei dem eine derartige Behandlung ebenfalls nützlich sein kann, schließt ein,
ist jedoch nicht begrenzt auf, degenerative, immunologische/inflammatorische,
neoplastische und idiopathische Zustände des Gastrointestinaltraktes, die
entweder angeboren oder erworben sein können. Daher schließen die
Krankheiten irgendeine aus einer Vielzahl von Gastrointestinalkrankheiten
ein, die beispielsweise Neuronen sowie Muskelgewebe beteiligen,
obwohl andere Gewebe ebenfalls beteiligt sein können. Andere Krankheiten, die
mit der Funktion oder Dysfunktion eines Gastrointestinalorgans im Zusammenhang
stehen, können
ebenfalls unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung behandelt
werden.
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Gastrointestinalorgane
schließen
hohle und feste Organe ein. Hohle Gastrointestinalorgane schließen diejenigen
ein, die den Verdauungskanal wie Mund, Ösophagus, Magen und Darm ausmachen.
Feste Gastrointestinalorgane schließen diejenigen ein, die in
den gastrointestinalen Verdauungskanal münden, wie die Leber, die Gallenblase
und der Pankreas.
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Wie
hier verwendet, schließt
die Behandlung einer Gastrointestinalkrankheit sowohl therapeutische
als auch prophylaktische (d.h. präventive) Behandlung ein. Der
Erfolg einer derartigen Behandlung kann durch die Bewertung des
funktionalen Status eines Organs oder eines Patienten, wie durch
das klinische Ergebnis und/oder die morphologische Analyse bestimmt,
ermittelt werden. Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung
eine Verwendung von Stammzellen (vorzugsweise multipotente oder
totipotente Stammzellen), die keine menschlichen embryonalen Stammzellen
sind, deren Nachkommen oder Kombinationen davon, für die Herstellung
eines Arzneimittels zur Behandlung eines Subjekts bereit, das an
einer neurodegenerativen Gastrointestinalkrankheit leidet, wobei
das Arzneimittel für
die Zwecke der Neubesiedelung verschiedener zellulärer Bestandteile
(wie die Neuronen, Muskeln oder andere Zelltypen) und/oder für die Bereitstellung
einer Quelle von biologischem Material (z.B. Neurotransmitter, Cytokine,
Anticytokine, Wachstumsfaktoren, Immunmodulatoren, antiinflammatorische
Agentien, antineoplastische Agentien, Analgesika etc.) für die therapeutische
Absicht in eine Wand eines Hohlorgans des Gastrointestinaltraktes
(z.B. des gastrointestinalen Verdauungskanals oder fester Organe,
die in den Verdauungskanal münden)
implantiert (z.B. transplantiert) wird. Die Quelle dieser Stammzellen
kann embryonal, außer
menschlichen embryonalen Zellen, oder neurales und nicht-neurales
Gewebe von Erwachsenen (z.B. Knochenmark oder Fettgewebe) sein.
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Die
Implantation kann über
lokale Injektion wie beispielsweise in eine Wand des Gastrointestinaltraktes
oder in ein festes Gastrointestinalorgan wie das Pankreas oder die
Leber, durch Verabreichung in den systemischen (z.B. über den
Blutkreislauf oder die Peritonealhöhle) oder den portalen Kreislauf
oder durch irgendwelche anderen geeigneten Mittel erfolgen.
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Ebenfalls
hier offenbart ist ein Verfahren zur Verwendung bei der Produktion
erhöhter
Insulinspiegel in einem Patienten. Dies beinhaltet die Implantation
von Stammzellen und/oder deren Nachkommen in das Pankreas, das als
Gastrointestinalorgan, wie hier verwendet, betrachtet wird, da es
ein festes Organ ist, das in den gastrointestinalen Verdauungskanal
mündet.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1.
Eine neurale Stammzelle (Neuronalmarker β-Tubulin-spezifisch gefärbt) in
gemeinsamer Kultur mit menschlichen glatten Darmmuskelzellen.
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2. (A) Western-Blot-Analyse des Gesamtproteinextraktes
von neuralen Ratten-Stammzellen. (B) nNOS-Immunreaktivität in neuralen
Ratten-Stammzellen.
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3. (A) Pseudofarbbilder der NO-Produktion
nach Stimulierung durch Ionomycin (1,4 μM) in gezüchteten neuralen Stammzellen
in Gegenwart von L-Arginin
(1 mM) oder L-NAME (100 μM).
NSZ wurden mit dem NO-sensitiven Fluoreszenzindikator DAF-2 beladen,
und die Zellen wurden mit einem konfokalen Laser-Rastermikroskop-System
unter Verwendung eines Argonionen-Lasers (488 nm), gekoppelt mit
einem Nikon-Diaphot-Umkehrmikroskop betrachtet. (B) Relative Fluoreszenzintensitätsänderungen,
die die NO-Produktion in 11 gezüchteten neuralen
Stammzellen widerspiegeln, gemessen in Gegenwart von L-Arginin (1
mM) oder L-NAME (100 μM).
Fehlerbalken geben die SA („SD", Standardabweichung)
an.
*p < 0,05;
**p < 0,01 (gepaarter
Student-t-Test).
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4. (A) Dil-markierte NSZ 8 Wochen nach der
Transplantation in den Pylorus von wilden C57BL/6J-Mäusen. (B)
Doppelte Immunfluoreszenzfärbung
von transplantierten Dil-markierten NSZ, die eine gemeinsame Lokalisierung
von β-Tubulin und nNOS
zeigt (Pfeile).
LM = Längsmuskel;
RM = Ringmuskel
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5. (A) Western-Blot-Analyse des Gesamtproteinextraktes
von neuralen Ratten-Stammzellen. (B) Ret-Immunreaktivität in neuralen
Ratten-Stammzellen. Die Zellkerne sind mit DAPI (4,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid)
in Blau gegengefärbt
(repräsentiert
durch die hellen Bereiche). Maßstabsbalken
= 10 μm.
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6. (A) Western-Blot-Analyse des Gesamtproteinextraktes
von neuralen Ratten-Stammzellen (NSZ) + Positivkontrolle. (B) GFRα1-Immunreaktivität in neuralen
Ratten-Stammzellen. (C) GFRα2-Immunreaktivität in neuralen
Ratten-Stammzellen.
Die Zellkerne sind mit DAPI in Blau gegengefärbt (repräsentiert durch die hellen Bereiche).
Maßstabsbalken
= 10 μm.
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7. Ret-Immunreaktivität in neuralen Ratten-Stammzellen,
die 10 Tage entweder Neurobasalmedien als Kontrolle (A) oder GDNF,
100 ng/ml, (B) ausgesetzt waren. Zellkerne sind mit DAPI in Blau gegengefärbt (repräsentiert
durch die hellen Bereiche). Man beachte die Sphäroidbildung in B. Maßstabsbalken
= 50 μm.
(C) Diagramm zeigt signifikante Erhöhung der RET+-Zellpopulation
unter der Wirkung von GDNF bei derselben Konzentration.
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Detaillierte
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine Verwendung von Stammzellen (z.B.
multipotente, totipotente oder pluripotente Stammzellen), die keine
menschlichen embryonalen Stammzellen sind oder deren Nachkommen,
für die
Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Subjekts bereit,
das an einer neurodegenerativen Gastrointestinalkrankheit leidet, wobei
das Arzneimittel für
die Zwecke der Neubesiedelung verschiedener zellulärer Bestandteile
(wie die Neuronen, Muskeln oder andere Zelltypen) und/oder für die Bereitstellung
einer Quelle von biologischem Material für die therapeutische Absicht
in eine Wand eines Hohlorgans des Gastrointestinaltraktes (vorzugsweise
des gastrointestinalen Verdauungskanals) implantiert werden soll.
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Das
Spektrum der Krankheiten, bei dem eine derartige Behandlung ebenfalls
verwendet werden kann, schließt
degenerative, immunologische/inflammatorische, neoplastische und
idiopathische Zustände
des Gastrointestinaltraktes ein, die entweder angeboren oder erworben
sein können.
Beispiele von Gastrointestinalkrankheiten, die durch die Verwendung
der vorliegenden Erfindung behandelt werden sollen, schließen ein,
sind jedoch nicht begrenzt auf, Achalasie, Gastrophorese, intestinale
Pseudoobstruktion und Morbus Hirschsprung. Vorzugsweise können die
Gastrointestinalkrankheiten irgendwelche aus einer Vielfalt von
Gastrointestinalkrankheiten sein, die beispielsweise Neuronen sowie
Muskelgewebe oder andere Zelltypen des Gastrointestinaltraktes beteiligen.
Ferner können
die hier beschriebenen Verwendungen auch verwendet werden, um eine
Therapie für
Krankheiten bereitzustellen, die herkömmlicherweise nicht als Gastrointestinalkrankheiten
betrachtet werden, die jedoch mit Organen im Zusammenhang stehen,
die als Gastrointestinalorgane (z.B. Leber, Gallenblase und Pankreas)
betrachtet werden, weil die Organe in den gastrointestinalen Verdauungskanal
münden.
Derartige Krankheiten schließen
Diabetes ein, der mittels Implantation von Stammzellen in das Pankreas
eines Patienten behandelt werden kann, um die Erhöhung der Insulinproduktion
hervorzurufen.
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Die
Quelle der Stammzellen kann embryonal – keine menschliche embryonale
Quelle – oder
neurales und nicht-neurales Gewebe von Erwachsenen sein. Im Allgemeinen
wird der Begriff „neurale Stammzelle" locker verwendet,
um Zellen zu beschreiben, die (i) neurales Gewebe erzeugen können oder
vom Nervensystem stammen; (ii) Kapazität zur Selbsterneuerung besitzen
und (iii) zu Zellen führen, die
durch asymmetrische Zellteilung nicht sie selbst sind. Ein wichtiges
Identifizierungsmerkmal einer Stammzelle ist ihre Fähigkeit,
Selbsterneuerung zu zeigen oder mehr von sich selbst zu erzeugen.
Die einfachste Definition einer Stammzelle ist eine Zelle mit der
Kapazität
zur Selbsterhaltung. Eine stringentere (aber nach wie vor vereinfachte)
Definition einer Stammzelle wird von Potten und Loeffler (Development,
110, 1001, (1990)) geliefert, die Stammzellen als „undifferenzierte
Zellen, die zur a) Proliferation, b) Selbsterhaltung, c) Produktion einer
großen
Anzahl von differenzierten funktionalen Nachkommen, d) Geweberegenerierung
nach Verletzung und e) zu einer Flexibilität bei der Verwendung dieser
Optionen in der Lage sind" definierten.
Die Funktion der Stammzellen besteht darin, Zellen zu ersetzen,
die durch natürlichen
Zelltod, Verletzung oder Krankheit verloren gehen. Das Vorhandensein
von Stammzellen in einer bestimmten Gewebeart korreliert gewöhnlich mit
Geweben, die einen hohen Zellumsatz aufweisen. Jedoch kann diese
Korrelation nicht immer aufrechterhalten werden, da man glaubt,
dass Stammzellen in Geweben (z.B. Leber) vorliegen, die keinen hohen Zellumsatz
aufweisen.
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Das
Vermögen
einer Zelle, sich grenzenlos zu teilen und Tochterzellen zu produzieren,
die sich am Ende in Neuronen und Gliazellen differenzieren, sind
Merkmale der Stammzellen. Demnach ist, wie hier verwendet, eine
Stammzelle in der Lage, sich selbst zu erhalten, was bedeutet, dass
mit jeder Zellteilung eine Tochterzelle auch eine Stammzelle sein wird.
Die Nachkommen einer Stammzelle, die keine Stammzellen sind, werden
als Vorläuferzellen
bezeichnet. Die Vorläuferzellen,
die von einer einzelnen multipotenten neuralen Stammzelle erzeugt
werden, sind in der Lage, sich in Neuronen, Astrocyten (Typ I und
Typ II) und Oligodendrocyten zu differenzieren. Einige Vorläuferzellen
können
Nachkommen produzieren, die in der Lage sind, sich in mehr als einen Zelltyp
zu differenzieren. Beispielsweise ist eine O-2A-Zelle eine Gliavorläuferzelle,
die zu Oligodendrocyten und Typ II-Astrocyten führt und daher als eine „bipotentiale" Vorläuferzelle
bezeichnet werden könnte.
Ein Unterscheidungsmerkmal einer Vorläuferzelle ist, dass sie im
Gegensatz zu einer Stammzelle eine begrenzte proliferative Fähigkeit besitzt
und daher keine Selbsterhaltung zeigt.
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Stammzellen
aus neuralen und anderen Geweben werden oft durch ihr Ursprungsgewebe
definiert. Alternativ können
sie durch ihr Potential definiert werden (Gage, Science, 287, 1433–1438 (2000)).
Das Verstehen des Potentials einer Zelle wird am besten im Zusammenhang
mit der normalen menschlichen Entwicklung beschrieben. Wie bei den Stem
Cells: A Primer, National Institutes of Health, Mai 2000, das man
im Internet unter nih.gov/news/stemcell/primer.htm finden kann,
beschrieben, beginnt die menschliche Entwicklung, wenn das Sperma
ein Ei befruchtet und eine einzelne Zelle erzeugt, die das Potential
besitzt, einen ganzen Organismus zu bilden. Dieses befruchtete Ei
ist totipotent, was bedeutet, dass sein Potential total ist. In den
ersten Stunden nach der Befruchtung teilt sich die Zelle in identische „totipotente" Zellen. Dies bedeutet,
dass jede dieser Zellen, falls sie in den Uterus einer Frau gesetzt
wird, das Potential besitzen, sich in einen Fötus zu entwickeln. Tatsächlich entwickeln sich
identische Zwillinge, wenn sich zwei totipotente Zellen trennen
und sich in zwei individuelle, genetisch identische menschliche
Wesen entwickeln. Etwa vier Tage nach der Befruchtung und nach mehreren
Zellteilungszyklen beginnen diese totipotenten Zellen, sich zu spezialisieren,
indem sie eine hohle Zellkugel bilden, die als Blastocyste bezeichnet
wird. Die Blastocyste besitzt eine äußere Zellschicht und in der
hohlen Kugel gibt es eine Anhäufung
von Zellen, die als innere Zellmasse bezeichnet wird.
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Die äußere Zellschicht
fährt damit
fort, die Plazenta und anderes unterstützendes Gewebe zu bilden, das
für die
fötale
Entwicklung im Uterus benötigt
wird. Die innere Zellmasse fährt
damit fort, praktisch alle Gewebe des menschlichen Körpers zu
bilden. Obwohl die inneren Zellmassenzellen praktisch jede Art von
Zellen bilden können,
die man im menschlichen Körper
findet, können
sie keinen Organismus bilden, weil sie zu keiner Plazenta und keinen unterstützenden
Geweben führen
können,
die für
die Entwicklung im menschlichen Uterus notwendig sind. Diese inneren
Zellmassenzellen sind „pluripotent". Das bedeutet, dass
sie zu vielen Arten von Zellen führen
können,
aber nicht zu allen Zellen, die für die fötale Entwicklung notwendig
sind. Da ihr Potential nicht total ist, sind sie nicht totipotent
und sie sind keine Embryonen. Falls man daher eine innere Zellmassenzelle
in den Uterus einer Frau einsetzen würde, würde sie sich nicht in einen
Fötus entwickeln
(Stem Cells: A Primer, National Institutes of Health, Mai 2000,
kann man im Internet unter nih.gov/news/stemcell/primer.htm finden).
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Die
pluripotenten Stammzellen unterlaufen eine weitere Spezialisierung
in Stammzellen, die darauf festgelegt werden, dass Zellen entstehen,
die eine bestimmte Funktion haben. Beispiele davon schließen Blutstammzellen,
die zu roten Blutkörperchen,
weißen
Blutkörperchen
und Thrombocyten führen,
und Hautstammzellen ein, die zu verschiedenen Arten von Hautzellen
führen.
Diese spezialisierten Stammzellen werden als „multipotent" bezeichnet. (Stem
Cells: A Primer, National Institutes of Health, Mai 2000, kann man
im Internet unter nih.gov/news/stemcell/primer.htm finden).
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Die
meisten Stammzellen fallen in die Kategorie der multipotenten Stammzellen.
Multipotente Stammzellen können
von embryonalem, postnatalem, juvenilem Gewebe oder Gewebe von Erwachsenen
erhalten werden. Das Gewebe kann von einer breiten Vielfalt von
Tieren wie Insekten, Fischen, Reptilien, Vögeln, Amphibien, Säugern und
dergleichen erhalten werden. Die bevorzugte Quelle stammt von Säugern, vorzugsweise
Nagern und Primaten, und am meisten bevorzugt von Mäusen und
Menschen. Im Falle eines heterologen Spender-Tieres kann das Tier
getötet
werden und das Gewebe (z.B. das neurale Gewebe) und der spezifische
Bereich von Interesse können
unter Verwendung eines Sterilverfahrens entfernt werden. Bereiche
von besonderem Interesse schließen
beispielsweise jeden Bereich ein, von dem die neuralen Stammzellen
erhalten werden können
(z.B. jeder Teil des Nervensystems, Knochenmarks etc.).
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Nicht-neurale
Stammzellen können
von irgendwo im Körper
sowie von embryonalen Stammzellen erhalten werden. Stammzellen können von
primitiveren Zellen stammen, die die Kapazität besitzen, neurale Stammzellen
und nicht-neurale Stammzellen (d.h. Stammzellen aus anderen Geweben)
zu erzeugen.
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Stammzellen
können
von Spendergewebe durch Dissoziation einzelner Zellen von der verbindenden
extrazellulären
Matrix des Gewebes erhalten werden. Gewebe aus einem bestimmten
Bereich wird unter Verwendung eines Sterilverfahrens entfernt, und
die Zellen werden unter Verwendung von irgendeinem im Fachgebiet
bekannten Verfahren einschließlich
der Behandlung mit Enzymen wie Trypsin, Collagenase und dergleichen
oder unter Verwendung physikalischer Dissoziationsverfahren wie
mit einem stumpfen Instrument, dissoziiert.
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Die
Stammzellen können
in Suspension oder auf einem fixierten Substrat gezüchtet werden.
Jedoch neigen Substrate dazu, die Differenzierung der Stammzellennachkommen
zu induzieren. Daher werden Suspensionskulturen bevorzugt, falls
eine große Anzahl
von Nachkommen aus undifferenzierten Stammzellen gewünscht wird.
Geeignete Kulturmedien, die in der Lage sind, das Zellwachstum zu
unterstützen,
schließen
HEM, DMEM, RPMI, F-12 und dergleichen ein, die Ergänzungen
wie Glutamin oder andere Aminosäuren,
Vitamine, Mineralien und nützliche
Proteine wie Transferin und dergleichen enthalten können, die
für den
Zellstoffwechsel erforderlich sind. Das Kulturmedium kann auch Antibiotika
wie Penicillin, Streptomycin, Gentamycin und dergleichen enthalten,
um die Kontaminierung mit Hefe, Bakterien und Pilzen zu verhindern.
Die Bedingungen für
das Züchten
sollten nahe bei den physiologischen Bedingungen (vorzugsweise ein
pH-Wert von etwa 6 bis etwa 8 und eine Temperatur von etwa 30°C bis etwa
40°C) liegen.
Das Kulturmedium kann mit mindestens einem proliferationsinduzierenden Wachstumsfaktor
wie EGF, Amphiregulin, saurem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (aFGF
oder FGF-1), basischem Fibroblasten-Wachstunsfaktor (bFGF oder FGF-2),
transformierendem Wachstumsfaktor alpha (TGF-alpha) und Kombinationen
davon supplementiert werden. Zusätzlich
zu den proliferationsinduzierenden Wachstumsfaktoren können andere Wachstumsfaktoren,
die die Proliferation und Differenzierung der Zellen beeinflussen,
einschließlich NGF,
von Thrombocyten stammender Wachstumsfaktor (PDGF), Thyrotropin
freisetzendes Hormon (TRH) und dergleichen, dem Kulturmedium hinzugefügt werden.
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Außerdem könnten die
Stammzellen, sobald sie einmal in vitro proliferiert haben, auch
genetisch in vitro unter Verwendung bekannter Verfahren modifiziert
werden. Die genetische in vitro-Modifizierung kann unter bestimmten
Umständen
wünschenswerter
sein als genetische in vivo-Modifizierungsverfahren, wenn mehr Kontrolle über die
Infektion mit dem genetischen Material erforderlich ist. Die Stammzellennachkommen
können
durch irgendein im Fachgebiet bekanntes Verfahren kryokonserviert
werden, bis sie benötigt
werden. Die Zellen können
in einer isotonischen Lösung
suspendiert werden, vorzugsweise in einem Zellkulturmedium, das
ein bestimmtes Kyrokonservierungsmittel enthält. Derartige Kyrokonservierungsmittel
schließen
Dimethylsulfoxid (DMSO), Glycerin und dergleichen ein.
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Eine
breite Vielfalt genetischer Modifizierungen der Zellen liegt im
Umfang der vorliegenden Erfindung. Beispielsweise können die
Zellen genetisch modifiziert werden, um Wachstumsfaktoren und andere
Arten neurologischer Agentien wie Neurotransmitter zu exprimieren.
Wenn die genetische Modifizierung für die Herstellung einer biologisch
aktiven Substanz bestimmt ist, ist die Substanz im Allgemeinen eine,
die für
die Behandlung einer bestimmten Gastrointestinalkrankheit nützlich ist.
Beispielsweise kann es wünschenswert
sein, Zellen genetisch zu modifizieren, so dass sie Stickstoffoxid
(für Achalasie)
produzieren. Zellen können
auch in vivo modifiziert werden, um Wachstumsfaktor-Rezeptoren, Neurotransmitter
oder deren Rezeptoren, neurotransmittersynthetisierende Gene, Neuropeptide
und dergleichen zu exprimieren.
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Die
Stammzellen und/oder deren Nachkommen können einem Wirt auf eine breite
Vielfalt von Arten verabreicht werden. Die Implantation (z.B. Transplantation)
kann über
lokale Injektion, beispielsweise in die Wand des Gastrointestinaltraktes,
durch Verabreichung in den systemischen oder portalen Kreislauf
oder durch alle anderen geeigneten Mittel erfolgen. Die Verwendung
von Stammzellen bei der Behandlung von Krankheiten wie Gastrointestinalkrankheiten
kann durch die Verwendung von Tiermodellen gezeigt werden.
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Die
vorliegende Erfindung erlaubt die Verwendung von Stammzellen und/oder
Stammzellennachkommen, die aus Spendergewebe hergestellt werden,
das zum Wirt xenogen ist. Im Allgemeinen wird jedoch bevorzugt,
dass ein Verfahren zur Verringerung oder Beseitigung der Immunreaktion
gegen das implantierte Gewebe verwendet werden soll, damit die Xenotransplante
erfolgreich sind. Daher werden Empfänger entweder durch Verwendung
von immunsuppressiven Wirkstoffen wie Cyclosporin oder durch lokale
Immunsuppressionsstrategien, bei denen lokal angewandte Immunsuppressiva
verwendet werden, häufig
immunsupprimiert.
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Als
Alternative zur Verwendung von immunsupprimierenden Techniken können Verfahren
des Genersatzes oder des Gen-Knockouts, bei denen die homologe Rekombination
in embryonalen Stammzellen (wie von Smithies et al., Nature, 317,
230–234 (1985)
vermittelt) verwendet wird und die auf den Genersatz oder das Gen-Knockout
in Zelllinien erweitert werden (H. Zheng et al., PNAS, 88, 8067–8071 (1991),
auf Stammzellen für
die Entfernung der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Gene angewandt
werden. Stammzellen, denen die MHC-Expression fehlt, würden die
Einpflanzung von angereicherten neuralen Zellpopulationen über allogene
und vielleicht sogar xenogene, Histokompatibilitätsbarrieren zulassen, ohne
dass die Immunsuppression des Rezipienten erforderlich ist.
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Zellen
können
im gesamten betroffenen Bereich verabreicht werden, insbesondere
in einer ortspezifischen Weise (d.h. lokal) oder systemisch. Zellen
können
dem bestimmten Bereich unter Verwendung jedes Verfahrens, das die
Integrität
der umgebenden Bereiche aufrechterhält, vorzugsweise durch lokale Injektion,
verabreicht werden. Zellen können
auch dem systemischen oder portalen Kreislauf verabreicht werden.
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Zusätzlich zu
den Stammzellen oder deren Nachkommen können Arzneimittel, die für die Verwendungen
der vorliegenden Erfindung nützlich
sind, Wachstumsfaktoren, um das Wachstum und die Differenzierung
der Stammzellen zu fördern,
Immunsuppressiva, antiinflamatorische Agentien etc. enthalten. Außerdem können, falls
gewünscht,
Stammzellen oder deren Nachkommen verkapselt sein, wie dem Fachmann
gut bekannt ist.
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Das Überleben
des Transplantats im lebenden Wirt kann unter Verwendung verschiedener
Verfahren einschließlich
klinischer, radiologischer, histologischer, physiologischer Verfahren
etc. untersucht werden. Nicht-invasive Scans, einschließlich computergestützter Axialtomographie
(CAT-Scan oder CT-Scan), Kernmagnetischeresonanz- oder Magnetresonanzbildgebung
(NMR oder MRI) oder Positronemmissionstomographie (PET)-Scans können verwendet
werden. Die post-mortem-Untersuchung auf Überleben von Transplantat kann
erfolgen, indem Gewebe entfernt wird und der betroffene Bereich
makroskopisch untersucht wird, oder besonders bevorzugt unter Verwendung
der Mikroskopie. Zellen können
mit allen unter licht- oder elektronenmikroskopischen Bedingungen
sichtbaren Färbungen
gefärbt werden,
genauer gesagt mit Färbungen,
die für
Neuronen und Glia spezifisch sind. Besonders nützlich sind monoclonale Antikörper, die
neuronale Zelloberflächenmarker
wie den M6-Antikörper
identifizieren, der Maus-Neuronen
nachweist. Am meisten bevorzugt sind Antikörper, die alle Neurotransmitter,
insbesondere diejenigen, identifizieren, die gegen GABA, TH, ChAT
und Substanz P, sowie gegen Enzyme gerichtet sind, die an der Synthese
von Neurotransmittern insbesondere GAD beteiligt sind. Transplantierte Zellen
können
ebenfalls durch vorherigen Einbau von Tracer-Färbungen wie Rhodamin-oder fluorescein-markierte
Mikrosphären,
Fast Blue, Bisbenzamid oder retroviral eingeführten histochemischen Markern
wie das lacZ-Gen, das beta-Galactosidase produziert, identifiziert
werden.
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Beispiele
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Die
folgenden Beispiele sind angegeben, um spezifische bevorzugte Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung zu veranschaulichen. Zahlreiche andere
Variationen sind im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten.
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Erzeugung
und in-vitro-Kultur der neuralen Stammzellen des Ratten-Vorderhirns. Neurale Stammzellen
wurden von schwangeren weiblichen Holtzman-Ratten am Embryo-Tag 17 erhalten. Die Gehirne
der Rattenembryonen wurden entfernt, und das subventrikulare Zonengewebe
(SVZ) wurde aus jeder Gehirnhemisphäre freigelegt. Aus diesem Gewebe
wurden dann Einzelzellsuspensionen unter Verwendung von Dipase/DNAse-Behandlung
und sanftem Zerreiben hergestellt. Die Fraktionen wurden vereinigt,
pelletiert und in Neurobasalmedium resuspendiert. Nach 2–4 Stunden
wurden die Zellen abzentrifugiert und das Medium wurde mit NB27 (Neurobasalmedium,
enthaltend B27 und Antibiotika) plus 20 ng pro ml (ng/ml) bFGF und
20 ng/ml EGF ersetzt. 50% des Kulturmediums wurden auf täglicher Basis
ersetzt.
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Gemeinsame
Immunpräzipitation
und Western-Blot-Analyse. Gesamtproteinextrakt wurde von neuralen
Stammzellen erhalten, indem die Zellen in einer Lösung, enthaltend
5% (Natriumdodecylsulfat) SDS, 1 Millimolar (mM) Benzamidin, 0,5
mM Phenylmethylsulphonylfluorid, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
in Tris-gepufferter Salzlösung
(TBS) (50 mM Tris-HCl [pH 7,5], 150 mM NaCl) lysiert wurden. Unlösliches
Material wurde durch 10-minütige (min)
Zentrifugation bei 13.000 × g
entfernt. Für
die gemeinsame Immunpräzipitation
wurden 500 Mikrogramm (μg)
Protein aus Ganzzelllysaten jeweils mit 2 Mikroliter (μl) eines
anti-Ret-Antikörpers
(sc-167-G, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) und 20 μl Protein
A-Agarose (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) über Nacht
bei 4°C
inkubiert. Präzipitierte Aggregate
wurden in Laemmli-Probenpuffer resuspendiert, und man ließ sie auf
7,5%-igen SDS-PAGE-Gelen laufen, dann erfolgte ein Transfer auf PVDF-Membranen
(Amersham, Amersham Place, UK). Sie wurden jeweils mit anti-RET-Tyrosinkinase-Rezeptor
(Ret)-Antikörper
bei einer Verdünnung von
1/1000 in 5% Trockenmilch, 0,05% Tween 20 in TBS 2 Stunden bei Raumtemperatur
inkubiert. Nach der Inkubation mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertem
sekundärem
Antikörper
wurde die Immunoreaktivität
durch den enzymkatalysierenden lumineszierenden (ECL-) Kit (Amersham)
nachgewiesen. Für eine
negative Kontrolle wurden die Proben auf dieselbe Weise behandelt,
wie vorstehend beschrieben, mit der Ausnahme, dass der primäre Antikörper bei der
Immunpräzipitation
weggelassen wurde.
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Immuncytochemie.
Für die
Immuncytochemie wurden neurale Stammzellen auf Polyornithin-beschichtete
Objektträger
mit Kammern (Nunc, Naperville, IL) oder auf einer Einzelschicht aus
menschlicher glatter Darmmuskulatur (erworben von ATCC) ausgesät. Die Zellen
wurden 10 Minuten bei –20°C mit 100%
Methanol fixiert. Folgende Antikörper
wurden verwendet: anti-βIII-Tubulin
(0,5 μg/ml;
Promega Corp., Madison, WI) und anti-nNOS (1:200-Verdünnung; Santa
Crux Biotechnology, Santa Cruz, KA). Vor den Inkubationen mit primären Antikörpern wurden
die Zellen mit 5% normalem Ziegenserum 1 Stunde bei Raumtemperatur
blockiert. Die Zellen wurden in Phosphatpufferlösung (PBS) gewaschen und mit
primären
Antikörpern,
verdünnt in
PBS, enthaltend 1,5% Ziegenserum, über Nacht bei 4°C inkubiert.
Die Zellen wurden dann 1 Stunde bei Raumtemperatur mit dem geeigneten
Alexa-konjugierten sekundären
Antikörper
(Alexa-488; Alexa-594: verdünnt
1:500, Molecular Probes, Eugene, OR) inkubiert. Ordnungsgemäße Kontrollen
wurden hergestellt, indem die primären Antikörper weggelassen wurden.
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Stickstoffoxidnachweis.
Neurale Stammzellen wurden auf Polyornithin-beschichtete Deckgläser aus Glas plattiert. Die
Zellen wurden in Standard-Krebslösung, enthaltend
den NO-sensitiven Fluoreszenzindikator DAF-2 DA (10 μM, Alexis
Biochemicals, San Diego, CA), 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach dem Beladen
wurden die Zellen in Krebslösung
gewaschen und in Krebslösung,
enthaltend L-Arginin oder L-NAME, gegeben. Die Zellen wurden mit
einem konfokalen Laser-Rastermikroskop-System unter Verwendung eines
Argonionen-Lasers (488
nm), gekoppelt mit einem Nikon-Diaphot-Umkehrmikroskop betrachtet.
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Markierungsverfahren
und Herstellung der Zellen für
die Transplantation. Um den Nachweis der Zellen in vivo zu ermöglichen,
wurden neurale Stammzellen mit CM-Dil (Molecular Probes, Eugene, OR)
nach den Anweisungen des Herstellers markiert. Nach dem Waschen
in PBS wurden die Zellen in PBS bei einer Konzentration von 400.000
Zellen/μl
resuspendiert und auf Eis gehalten. Für die Transplantation wurden
männliche
C57BL/6J-Wildtyp-Mäuse (Jackson
Laboratories) mit einem Gewicht von ~20 g verwendet. Der chirurgische
Eingriff wurde unter tiefer Narkose durchgeführt. Die Mäuse erhielten 2 μl Zellsuspension
bilateral in den Pylorus unter Verwendung einer auf eine 10 μl-Hamilton-Spritze
aufgesetzten 22 G-Nadel.
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Gewebeverarbeitung.
2, 4 und 8 Wochen nach der Transplantation wurden die Mäuse betäubt und
transkardial perfundiert und mit eiskaltem 4%-igem Paraformaldyhyd
(PFA) in 0,1 M PBS fixiert. Der Pylorus wurde entfernt, 1 Stunde
bei Raumtemperatur in PFA nachfixiert und in 30% Saccharose in PBS über Nacht
bei 4°C
kryogeschützt.
Das Gewebe wurde dann in optimale Verbindung zum Schneiden (OCT)
eingebettet, und 15–30 μm große, gefrorene Schnitte
wurden auf einem Kryostaten geschnitten und für die weitere Verarbeitung
gesammelt. Für
die doppelte Immunfluoreszenz wurden die Schnitte mit 50% Glycerin/50%
PBS permeabilisiert, um das Durchdringen der Antikörper zuzulassen.
Die gemeinsame Lokalisierung der fluoreszierenden lipophilen Färbung Dil
mit diesen Markern wurde mit konfokaler Mikroskopie unter Verwendung
eines konfokalen Mikroskops, Model OZ (Noran Intruments), gekoppelt
mit einem Nikon-Diaphot-Umkehrmikroskop durchgeführt.
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Ergebnisse
und Diskussion. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass neurale Stammzellen
(NSZ), die aus dem Ratten-Vorderhirn isoliert wurden, einen anatomischen
Kontakt mit der glatten Darmmuskulatur in vitro ausbilden können (1).
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Gezüchtete NSZ
exprimieren auch neuronales Stickstoffoxid (nNOS) und produzieren
Stickstoffoxid (NO) in vitro (2),
was zeigt, dass die Verwendung von NSZ ein gültiges Werkzeug ist, um nNOS
bei Versuchsbedingen dort wieder einzuführen, wo es einen funktionalen
Mangel an derartigem Enzym gibt.
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Die
Daten haben gezeigt, dass NSZ erfolgreich in die Gastrointestinalwand
von Wildtyp-Mäusen
implantiert werden können
(3) und dass sie sich 2 Wochen nach
der Transplantation in nitrinerge Neuronen (die nNOS exprimieren)
differenzieren (4). NSZ sind noch
lebensfähig,
und nNOS ist 8 Wochen nach der Transplantation immunreaktiv (Daten
nicht gezeigt).
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Das
ENS wie andere periphere neuronale Systeme stammt gänzlich vom
Neuralkamm ab. Vom Kamm stammende Vorläufer sind pluripotent und können erfolgreich
jeden Bereich des Darms innervieren; es ist die Mikroumgebung in
der Darmwand, die bei der Bestimmung der regionalen Spezialisierung
und Differenzierung dieser Zellen wichtig zu sein scheint. Die Interaktion
des RET-Tyrosin-Kinase-Rezeptors,
der von diesen Zellen exprimiert wird, mit vom Darm stammenden neurotrophen
Wachstumsfaktoren, GDNF (von Gliazelllinien stammender Wachstumsfaktor)
und Neurturin (NTN) (5), ist bei diesem
Vorgang wichtig. Diese Interaktion beinhaltet auch eine Reihe von
extrazellulären,
mit GPI verbunden Rezeptoren, die eng mit RET in Verbindung stehen:
der Rezeptor der GDNF-Familie (GFR) α1 und α2 (6).
GDNF wirkt als Mitogen für
diese Vorläufer
bis etwa E12, was zu einer Erhöhung
ihrer Anzahl führt,
die ausreicht, um den gesamten Darm zu kolonisieren (7). Später
dient er als Differenzierungsfaktor, der die Entwicklung von Neuronen auf
Kosten der Gliazellen fördert.
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NTN
ist ebenfalls ein wichtiges enterisches Neurotrophin und fördert die
Proliferation und das Überleben
von neuroglialen Vorläufern
in vitro, obwohl er nicht so wichtig wie RET ist, wie durch Mutationen
von NTN oder dessem bevorzugten Rezeptor GFRα2 gezeigt wurde. Es wird postuliert,
dass das NTN/GFRα2-System
für die
Aufrechterhaltung des reifen enterischen Nervensystems wichtig ist,
während
das GDNF/GFRα1-System
für dessen
Entwicklung wichtig ist.
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Die
vorstehenden Studien in unseren Laboren haben gezeigt, dass neurale
Stammzellen (NSZ), die aus Rattenvorderhirn isoliert wurden, das
Rezeptorsystem für
das enterische Neurotrophin GDNF und NTN exprimieren.
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Die
vorstehende detaillierte Beschreibung und die Beispiele wurden ausschließlich zur
Klarheit des Verständnisses
aufgeführt.
Es sollten keine unnötigen
Begrenzungen davon abgeleitet werden. Die Erfindung ist nicht auf
die genauen Einzelheiten begrenzt, die dargestellt und beschrieben
werden, da für
den Fachmann offensichtliche Variationen in der Erfindung eingeschlossen
sind, die durch die Ansprüche
definiert wird.