CN111773244B - 一种纳米硫化铁混合物作为制备乙醇急性中毒恢复药物的应用 - Google Patents
一种纳米硫化铁混合物作为制备乙醇急性中毒恢复药物的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于醇中毒恢复药物领域,具体涉及纳米硫化铁混合物作为制备乙醇急性中毒恢复药物的应用。其有益效果在于:提供了制备醇醛中毒恢复药物的新思路;材料获取容易,成本低,易于制备;与现有药物相比,可以同时恢复受损的神经细胞、肝脏细胞;同时可以缓解中毒诱发的脑中炎症。
Description
技术领域
本发明属于醇中毒恢复药物领域,涉及纳米硫化铁混合物作为制备乙醇急性中毒恢复药物的应用。
背景技术
如今,酒精饮料消费量呈上升趋势。很多人喜欢通过喝酒来调节自己的情绪。一方面,增强放松、高兴,激动等积极情绪。另一方面,减弱焦虑、紧张、压力等消极情绪(Kasselet al.Neurosurg Clin N Am,2000,21:43–51)。然而,过量的饮酒会导致肝脏、胃、大脑、肾脏和肺等多种器官的结构和功能发生改变,甚至会导致癌症的发生。而且长期饮酒的人,会产生酒精耐受和酒精依赖性,而这又进一步促进了酒精的过度消费。除此以外,酗酒者更容易患上神经系统性疾病(HarperC.&MatsumotoI.Curr Opin Pharmacol,2005,5:73–78)。
酒精中毒和大脑酒精中毒已经成为国际关注的话题。酒精对中枢神经系统有多种作用,这取决于饮酒量和持续饮酒时间。酒精的急性效应包括欣快感、神志不清、抑制解除、不协调和昏迷;酒精的慢性效应包括酒精依赖、精神障碍、免疫系统障碍,多发炎症。酒精的戒断效应包括酒精性震颤、酒精性幻觉症、戒断性惊厥发作、震颤谵妄、自主神经过度兴奋(Sripada et al.Neuroimage,2011,55:371–380)。此外,长期过量饮酒会导致大脑神经系统发生选择性地结构、生理和功能的改变,导致认知和运动能力受损,如注意力分散不集中、记忆缺失、共济失调,执行功能障碍、视觉空间障碍、社交退缩、动机减弱和冲动控制缺陷(Sullivan&Pfefferbaum.Psychopharmacology(Berl),2005,180:583–594)。
目前纳米颗粒通常被用作高效抗菌剂。没有资料公开纳米硫化铁混合物作为醇醛中毒恢复药物方面的应用。
本发明是提供一种纳米硫化铁混合物的新用途,给出了治疗相关疾病的新思路,以解决现有技术中的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种纳米硫化铁混合物的新用途,给出了治疗神经损伤的思路。
本发明公开了一种纳米硫化铁混合物作为制备乙醇急性中毒恢复药物的应用。
优选地,所述纳米硫化铁混合物采用包括如下步骤的方法制备:
步骤1,将铁源与水或非水溶剂按比例溶解,得反应液A;
步骤2,向反应液A中加入碱性溶液,搅拌使其溶解,得反应液B;
步骤3,向反应液B中加入硫源,搅拌使其溶解,得反应液C;
步骤4,将反应液C加热制备得到纳米硫化铁混合物。
进一步地,所述步骤4包括将反应液加热、烘干的步骤。
进一步地,所述步骤4加热的温度为100-500℃,优选为200-400℃;加热时间为1-48h,优选为12-24h。
进一步地,所述铁源选自二价铁和/或三价铁,优选氯化铁、硫酸亚铁、硝酸铁、溴化铁中的至少一种。
进一步地,所述非水溶剂为醇类溶剂、醚类溶剂、酮类溶剂、烃类溶剂、酯类溶剂中的至少一种;优选的,所述非水溶剂为醇类溶剂;更优选的,所述醇类溶剂为乙二醇、丙三醇、乙醇、聚乙二醇中的至少一种。
进一步地,所述碱性溶液选自醋酸钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、NH4 +中的至少一种,优选的,选用醋酸钠、柠檬酸钠和/或碳酸氢钠的溶液。
进一步地,所述硫源选自含硫化合物;含硫化合物分为有机含硫化合物和无机含硫化合物。优选的,所述含硫化合物选自含硫氨基酸、硫醚类化合物中的一种或多种;更优选的,所述含硫氨基酸选自L-半胱氨酸、胱氨酸、GSH(谷胱甘肽)中的一种或多种,所述硫醚类化合物可为不饱和硫醚化合物,尤其为烯丙基甲基硫醚、二烯丙基硫醚、烯丙基甲基二硫醚、二烯丙基二硫醚、烯丙基甲基三硫醚、二烯丙基三硫醚、烯丙基乙硫醚中的至少一种。
进一步地,所述铁源与水或非水溶剂的摩尔比为1:1-1000;所述碱性溶液的终浓度为0.01-1mol/L;所述硫源添加的终浓度为0.01-10mol/L。
进一步地,所述铁源与所述硫源的摩尔比为1:0.02-5,优选1:0.05-2,更优选1:0.06-1,更优选1:0.1-0.8,更优选1:0.2-0.6,更优选1:0.3-0.5。
进一步地,所述铁源:硫源的重量比例为1:0.1-10;所述铁源:水或非水溶剂:碱性溶液:硫源的重量比例为0.1-1:10-100:0.1-1:0.1-1,优选,0.5-1:20-80:0.5-1:0.5-1,更优选,0.5-1:30-60:0.5-1:0.5-1。
本发明的有益效果在于:
1、提供了制备醇醛中毒恢复药物的新思路;
2、材料获取容易,成本低,易于制备;
3、与现有药物相比,可以同时恢复受损的神经细胞、肝脏细胞;
4、同时可以缓解中毒诱发的脑中炎症。
附图说明
图1应用例1体外受损神经元的保护效果测试结果图;
图2应用例1对体内Tuj1蛋白表达的影响测试结果图;
图3应用例1对体内GFAP蛋白表达的影响测试结果图;
图4应用例1共济失调调节测试转棒试验测试结果图;
图5应用例1共济失调调节测试翻转试验测试结果图;
图6采用Fluoro Jade B染色技术对应用例1脑片中退行性神经细胞染色测试结构图;
图7采用HE染色技术对应用例1对肝功能保护作用测试结构图;
图8采用TUNEL染色技术对应用例1对肝功能保护作用测试结构图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述,以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术实施例,而不能以此来限制本发明的保护范围。
本发明实施例及应用例材料及仪器选取如下:
实验动物:
C57BL6/J(SPF级、雄性、8-10月龄、体重22±3g)购于斯贝福动物有限公司。
试剂:
MTT粉末购于索莱宝公司;
Fluoro Jade B染料购于Merck;
Tuj1、GFAP一抗购于CST;
无水乙醇购于安利隆;ECL发光液购于Millipore;
一抗稀释液购于碧云天;
Goat Anti-Mouse IgG(H&L)-HRP Conjugated购于柏奥易杰;
OCT包埋剂购于樱花;
伊红、苏木素染色液购于索莱宝;
TUNEL染色液购于碧云天;
设备:
CO2培养箱型号:Thermo-BB15;
酶标仪型号:MR-96A;
倒置荧光显微镜型号:Leica DMiL;
转棒仪型号:智鼠多宝DB024;
冰冻切片机型号:Leica 1950;
化学发光成像系统型号:Tonon 4800;
数据处理软件:GraphPad Prism6。
实施例1
所述纳米硫化铁混合物采用包括如下步骤的方法制备:
步骤1,将氯化铁与乙二醇按摩尔比为1:237溶解,得反应液A;
步骤2,向反应液A中加入醋酸钠,搅拌使其溶解,得反应液B,反应液B中醋酸钠浓度为0.7mol/L;
步骤3,向反应液B中加入L-半胱氨酸,搅拌使其溶解,得反应液C,反应液C中L-半胱氨酸浓度为0.04mol/L;
步骤4,将反应液C加热200℃,反应12h制备得到纳米硫化铁混合物。
实施例2-6
实施例2-6与实施例1相比较,仅仅是纳米硫化铁混合物的合成反应参数不同,以铁源的加入量为1mol计,具体参数见表1-2:
表1纳米硫化铁混合物合成参数选择-1
表2纳米硫化铁混合物合成参数选择-2
应用例1
将实施例1制备的纳米硫化铁混合物用于制备乙醇急性中毒恢复药物。为了说明其有益效果,特做出如下检测:
纳米硫化铁混合物对体外受乙醇损伤的神经细胞的保护
采用MTT法检测体外细胞存活率。将SH-SY5Y神经母瘤细胞按5E6的细胞密度均匀铺在96孔板中,每孔100μL。放置到含5%CO2,37℃培养箱中培养4h后吸掉原有的培养基,加入含500mM乙醇的新鲜培养基对SH-SY5Y神经母瘤造成损伤,同时加入0、7、9、11、13、15μg/mL六个浓度的纳米硫化铁混合物,将细胞板放回培养箱中继续培养24h。第二天吸出培养基,加入100μL,1mg/mL的MTT溶液,放入培养箱中继续培养4h,吸出MTT,加入150μL DMSO溶解甲瓒,用酶标仪检测490nm波长下的吸光值。
实验结果如附图1:加入500mM乙醇会造成神经母瘤细胞40%以上的死亡,而给予纳米硫化铁混合物后,神经母瘤细胞存活率与纳米硫化物混合物浓度呈现出剂量依赖性关系,神经母瘤细胞存活率提高了10%以上,说明纳米硫化铁混合物能提高体外受损神经细胞的存活率。
纳米硫化铁混合物对急性乙醇中毒后的受损神经细胞的保护
采用Fluoro Jade B染色技术对脑片中退行性神经细胞染色,退行性神经元呈亮绿色。本次动物实验选用SPF级的9~10周龄的C57BL/6J小鼠。采用灌胃方法将浓度为0.5mg/mL纳米硫化铁混合物按2.5mg/kg的剂量给到小鼠体内,10min后采用腹腔注射法将25%乙醇按2.2g/kg的剂量给到小鼠体内。3h后进行心脏灌注。将灌流后的鼠脑取出,一定要小心,避免伤到脑组织。4%PFA浸泡过夜,20%、30%蔗糖溶液分别浸泡一天,40%蔗糖溶液浸泡2-3d。采用冰冻切片切取厚度为15μm的脑片。FJB染色:将切片浸入其中无水乙醇5min,然后在70%乙醇中漂洗2min,在30%乙醇中再漂洗2min,最后在蒸馏水中保持2min。然后将切片放入0.06%高锰酸钾溶液孵育30min。流水冲洗2min,将切片转移到一个以0.1%乙酸溶解的0.0004%的Fluoro Jade B Chemicon)溶液中。用蒸馏水洗3次,每次1min。在二甲苯中澄清2min,盖上DPX非荧光安装介质。在Nikon Eclipse E600荧光显微镜下可视化使用520nm荧光素滤光片组。
实验结果如附图2:scare bar为100μm。从附图2中可可看出急性乙醇组的退行性神经元最多,而给予纳米硫化铁混合物的治疗组,退行性神经元的数量减少,说明纳米硫化铁混合物能保护由急性乙醇中毒造成的脑中神经元的损伤。
采用Western Blot技术检测成熟神经元细胞标志物Tuj1蛋白的表达。本次动物实验选用SPF级的9~10周龄的C57BL/6J小鼠。采用灌胃方法将浓度为0.5mg/mL纳米硫化铁混合物按2.5mg/kg的剂量给到小鼠体内,10min后采用腹腔注射法将25%乙醇按2.2g/kg的剂量给到小鼠体内。3h后进行心脏灌注,按常规方法提取总蛋白。配制12%的SDS-PAGE胶,分离蛋白样品。采用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上,5%脱脂牛奶封闭1h,Tuj1一抗孵育1h,TBST洗膜3次,每次5min,加入二抗孵育1h,TBST洗膜3次,每次5min,滴加显影液,用化学发光成像系统曝光成像。
实验结果如附图3:急性乙醇组Tuj1表达明显低于正常组,给予纳米硫化铁混合物的治疗组Tuj1表达相较于急性乙醇对比例2增多。
纳米硫化铁混合物对急性乙醇中毒诱发的脑中炎症的缓解作用
脑内发生炎症时,星形胶质细胞会被过度活化,产生一系列的促炎因子,从而诱发炎症。采用Western Blot技术检测星形胶质细胞活化标志物GFAP蛋白的表达。本次动物实验选用SPF级的9~10周龄的C57BL/6J小鼠。采用灌胃方法将浓度为0.5mg/mL纳米硫化铁混合物按2.5mg/kg的剂量给到小鼠体内,10min后采用腹腔注射法将25%乙醇按2.2g/kg的剂量给到小鼠体内。3h后进行心脏灌注,按常规方法提取总蛋白。配制12%的SDS-PAGE胶,分离蛋白样品。采用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上,5%脱脂牛奶封闭1h,GFAP一抗孵育1h,TBST洗膜3次,每次5min,加入二抗孵育1h,TBST洗膜3次,每次5min,滴加显影液,用化学发光成像系统曝光成像。
实验结果如附图4:急性乙醇对比例2的GFAP表达高于正常组,给予纳米硫化铁混合物的治疗组GFAP表达相较于急性乙醇对比例2降低,说明纳米硫化铁混合物对急性乙醇中毒诱发的脑中炎症具有缓解作用。
纳米硫化铁混合物对急性乙醇中毒后的小脑共济失调的改善
采用翻转实验和平衡实验对纳米硫化铁混合物对小脑共济失调的改善作用进行试验。本实验采用的小鼠为8~10周龄的C57BL/6J。采用灌胃方法将浓度为0.5mg/mL纳米硫化铁混合物按2.5mg/kg的剂量给到乙醇中毒小鼠体内,30min后相继进行翻转实验和平衡实验进行测试。
翻转实验:将小鼠置于25×30cm的铁网中心,铁网距离地面50cm高,迅速将铁网翻转,测量小鼠爬到顶部的时间。
实验结果如附图5:乙醇中毒的鼠在翻转试验中,很难从铁网中心爬往顶端,容易从铁网掉落,在悬空垂直的铁网上的时间降低,而给予纳米硫化铁混合物的鼠在铁网上的时间相较于只给予乙醇组的鼠有所提高,说明纳米硫化铁混合物能提高乙醇中毒鼠的平衡能力。
转棒实验:加速旋转杆装置(直径:3cm)的悬杆上评估旋转杆的性能,旋转杆装置以1至23rpm的恒定速率加速300秒。小鼠连续训练5天,并将它们放在棒上进行3次试验。记录每次试验的时间。当鼠标从旋转杆上脱落或时间达到300秒后,试验结束。每次试验之间允许休息180秒。
实验结果如附图6:乙醇中毒的鼠在转棒试验中运动时间相较于正常组的鼠降低了一倍,而给予纳米硫化铁混合物的鼠运动时间相较于只给乙醇组的鼠的运动时间显著提高,说明纳米硫化铁混合物能提高乙醇中毒鼠的运动能力。
纳米硫化铁混合物对乙醇中毒后的肝组织的保护
采用HE染色技术对纳米硫化铁混合物肝功能保护作用进行试验。本实验采用的小鼠为8~10周龄的C57BL/6J。采用灌胃方法将浓度为0.5mg/mL纳米硫化铁混合物按2.5mg/kg的剂量给到乙醇中毒小鼠体内,3h后进行心脏灌注。将灌流后的肝组织取出,4%PFA浸泡过夜,20%、30%蔗糖溶液分别浸泡一天,40%蔗糖溶液浸泡2-3d。采用冰冻切片切取厚度为15μm的肝片。染色步骤:将切片置于水中洗5min,然后苏木素染色3min,再用水洗3次,每次1min,将玻片置于1%的盐酸酒精中分化1min,再置于0.5%氨水中10min,水洗3次,每次1min,放于伊红中染色3min,水洗3次,每次1min,梯度乙醇中各脱水1min(75%、85%、95%、100%、100%),最后放于二甲苯中澄清5min,50%甘油封片,用正置显微镜进行成像。
实验结果如附图7(scare bar为100μm):正常肝组织致密,很少有核的破碎,而乙醇对比例2的肝脏组织被破坏,组织间隙增大,核增大,破碎,而给予纳米硫化铁混合物治疗组的肝脏组织间隙减少,破碎核的数量减少,说明纳米硫化铁混合物对肝组织具有保护作用。
采用TUNEL染色技术对纳米硫化铁混合物肝功能保护作用进行试验。TUNEL染色是对断裂DNA进行荧光标记,当细胞发生损伤时,DNA会断裂,标记上绿色荧光。本实验采用的小鼠为8~10周龄的C57BL/6J。采用灌胃方法将浓度为0.5mg/mL纳米硫化铁混合物按2.5mg/kg的剂量给到乙醇中毒小鼠体内,3h后进行心脏灌注。将灌流后的肝组织取出,4%PFA浸泡过夜,20%、30%蔗糖溶液分别浸泡一天,40%蔗糖溶液浸泡2-3d。采用冰冻切片切取厚度为15μm的肝片。染色步骤:将切片置于水中洗5min,4%PFA固定30min,PBS洗2次,每次10min,用含0.5%Triton X-100的PBS溶液细胞打孔5min,用先配制的染色液(5μL TdT+45μL荧光标记液+50μL检测液),37℃避光孵育1h,PBS洗3次,用含DAPI的甘油封片,倒置荧光显微镜进行成像,实验结果如图8,scare bar为100μm。
实验结果如附图8:可以看出正常组绿色荧光点很少,乙醇组相较于正常组绿色荧光点数大量增加,说明乙醇造成了肝组织的损伤,而给予纳米硫化铁混合物的治疗组,绿色荧光数相比于乙醇对比例2大量减少,说明纳米硫化铁混合物对乙醇中毒后的肝损伤具有保护作用。
应用例2-6
应用例2-6与应用例1相比较,仅仅是纳米硫化铁混合物的选择不同,具体见表3:
表3纳米硫化铁的选择
组别 | 纳米硫化铁混合物选择 |
应用例2 | 实施例2 |
应用例3 | 实施例3 |
应用例4 | 实施例4 |
应用例5 | 实施例5 |
应用例6 | 实施例6 |
为了进一步说明本发明的有益效果,探究不同材料选择对效果的影响,特设置对比例1-2,对比例1为相同类别的正常细胞和小鼠(正常组)。对比例2与对比例1相比,仅仅是不加入纳米硫化铁混合物(中毒对照组)。
将对比例1-2及应用例2-6重复应用例1的测试实验,测试结果如表4-5:
表4测试结果汇总表-1
表5测试结果汇总表-2
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (9)
1.一种纳米硫化铁混合物作为制备乙醇急性中毒恢复药物的应用,其特征在于,所述纳米硫化铁混合物采用包括如下步骤的方法制备:
步骤1,将铁源与水或非水溶剂按比例溶解,得反应液A;
步骤2,向反应液A中加入碱性溶液,搅拌使其溶解,得反应液B;
步骤3,向反应液B中加入硫源,搅拌使其溶解,得反应液C;
步骤4,将反应液C加热制备得到纳米硫化铁混合物;
所述铁源选自二价铁和/或三价铁;所述非水溶剂为醇类溶剂、醚类溶剂、酮类溶剂、烃类溶剂、酯类溶剂中的至少一种;所述碱性溶液选自醋酸钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、NH4 +中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的纳米硫化铁混合物作为制备乙醇急性中毒恢复药物的应用,其特征在于,所述步骤4加热的温度为100-500℃。
3.根据权利要求2所述的纳米硫化铁混合物作为制备乙醇急性中毒恢复药物的应用,其特征在于,所述步骤4加热的温度为200-400℃。
4.根据权利要求3所述的纳米硫化铁混合物作为制备乙醇急性中毒恢复药物的应用,其特征在于,所述铁源选自氯化铁、硫酸亚铁、硝酸铁、溴化铁中的至少一种;所述醇类溶剂为乙二醇、丙三醇、乙醇、聚乙二醇中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的纳米硫化铁混合物作为制备乙醇急性中毒恢复药物的应用,其特征在于,所述硫源选自含硫化合物;含硫化合物分为有机含硫化合物和无机含硫化合物。
6.根据权利要求5所述的纳米硫化铁混合物作为制备乙醇急性中毒恢复药物的应用,其特征在于,所述含硫化合物选自含硫氨基酸、硫醚类化合物中的一种或多种;所述硫醚类化合物为不饱和硫醚化合物。
7.根据权利要求6所述的纳米硫化铁混合物作为制备乙醇急性中毒恢复药物的应用,其特征在于,所述含硫氨基酸选自L-半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽中的一种或多种;所述硫醚类化合物为烯丙基甲基硫醚、二烯丙基硫醚、烯丙基甲基二硫醚、二烯丙基二硫醚、烯丙基甲基三硫醚、二烯丙基三硫醚、烯丙基乙硫醚中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的纳米硫化铁混合物作为制备乙醇急性中毒恢复药物的应用,其特征在于,所述铁源与水或非水溶剂的摩尔比为1:1-1000;所述碱性溶液的终浓度为0.01-1mol/L;所述硫源添加的终浓度为0.01-10mol/L;所述铁源与所述硫源的摩尔比为1:0.02-5。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的纳米硫化铁混合物作为制备乙醇急性中毒恢复药物的应用,其特征在于,所述纳米硫化铁混合物采用包括如下步骤的方法制备步骤,还包括步骤5,烘干。
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