CN111214645A - Ghrh-a在制备防治缺血性脑梗塞药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物医学领域，主要涉及生长激素释放激素受体激动剂MR‑409在制备防治缺血性脑梗塞药物中的应用。MR‑409为新型的GHRH受体激动剂，前期研究证明其能够通过增加多种骨髓性干细胞在缺血病灶中的存活进而缓解糖尿病、心肌缺血等难治性疾病的病理损伤。在本发明中，研究发现MR‑409能够显著地改善脑缺血模型小鼠的缺血性脑损伤、生存率和神经行为学表现，其机制可能通过增加内源性神经干细胞的增殖、迁移和存活。本研究为脑缺血的治疗提供新的策略，具有重要的临床治疗意义。为将来以促进神经元再生作为脑缺血治疗靶点的药物研发提供科学理论依据。
Description
技术领域
本发明属生物医学领域，具体涉及生长激素释放激素受体激动剂（GHRH-A）在制备防治缺血性脑梗塞药物中的应用，主要涉及应用人工合成的生长激素受体激动剂MR-409在防治缺血性脑梗塞（tMCAO）中的神经细胞保护效应和降低脑梗塞后遗症。
背景技术
缺血性脑梗塞（又称脑卒中）是世界范围内导致死亡和永久性致残的主要元凶之一。目前，缺血脑梗塞的治疗以溶栓治疗和神经保护治疗为主。溶栓治疗虽然能够实现血管的再通，但溶栓治疗最佳时机为脑梗塞6小时内，临床上大多数患者到达医院后已失去最佳溶栓治疗时机，在脑缺血过程中常有不可逆性的神经元缺失，患者即使经积极抢救后仍然伴有严重程度不同的后遗症，如感觉、运动及认知功能障碍。神经保护剂通过改善脑代谢对缺血半暗带的神经细胞提供一些保护效应，但其治疗效果十分局限；因此，目前临床上对缺血性脑梗塞仍无有效地治疗方法。通过有效地促进神经元再生来修复缺血引起的脑神经元损失被认为是治疗缺血性脑梗塞以及减少脑梗塞后遗症最有希望的治疗方法。众所周知在所有细胞系中，神经细胞再生能力最低，过去认为神经细胞缺乏再生能力，由于发现SGZ和SVZ等脑区富有内源性神经干细胞的存在，目前认为SGZ和SVZ等脑区中的内源性神经干细胞在适当条件下可能再生成新的神经元再生发挥修复作用。然而到目前为止尚未找到一种可行的方法能够通过有效地刺激神经干分化新的细胞神经元，促进新的神经元再生而治疗缺血性脑梗塞。因此，找到一种促进神经元再生的新疗法治疗缺血脑梗塞并降低脑梗塞后遗症对脑梗塞的治疗和预后具有重要的临床意义。
MR-409为Andrew V. Schally团队近期研发的一种新型生长激素释放激素类似物（Growth Hormone Releasing Hormone Analogue, GHRH-A），目前还未上市。Andrew V.Schally因为发现下丘脑生长激素释放激素等多肽及其阐明其生理功能而获得1977年诺贝尔医学生理学奖。生长激素和生长激素释放激素具有重要的生理功能，其中一个重要的生理功能是能促进组织和细胞的合成代谢，特别是蛋白质的合成代谢，促进细胞生长发育，抑制细胞凋亡。 基于这些生理作用，Andrew V. Schally教授认为部分的肿瘤可能可以通过阻断一些细胞GHRH信号通路达到阻断肿瘤生长的目的，而一些老年性疾病比如心血管疾病，神经退行性疾病，可能通过刺激GHRH信号通路促进细胞再生，提振这些细胞功能从而达到治疗这些疾病的目的。 天然的GHRH由于在体内容易被酶降解，作用不稳定，半衰期短，并刺激垂体生长素分泌可能促发激肿瘤生长等付作用，不适应于在临床应。 Andrew V.Schally团队通过对GHRH肽链中的许多编码氨基酸被人工合成的非编码氨基酸所替代，因而更难被蛋白酶所降解，因此具有更长的体内半衰期和更高的受体亲和力；此外，GHRH-A能够通过竞争性的抑制内源性的GHRH与受体的结合因而避免了内源性GHRH的诸多副反应，如肿瘤的发生。Andrew V. Schally合成一系列的GHRH受体激动剂，经过实验研究目前有7种GHRH-A产品在不同的动物实验疾病模型中显示有治疗效应，包括一型糖尿病胰岛细胞修复，心肌梗塞，下肢缺血，血管钙化和糖尿病视网膜病变等。
目前，缺血脑梗塞的治疗仍然以溶栓治疗和神经保护治疗为主，但是都具有各自的局限性，而且患者在渡过急性期后常常遗有语言或肢体功能障碍等后遗症，有些患者引起永久性致残，其后遗症的发生主要是由于脑梗塞缺血期不可逆性神经元的损失有关。为此，寻找一种新型，有效的治疗药物，特别是能促进神经元再生取代脑缺血损失的神经元以减少脑梗塞后遗已刻不容缓。 GHRH-A具有促进细胞增殖，抑制细胞凋亡的特性，前期实验结果已经证实MR-409能够改善多种难治性疾病包括心肌缺血和一型糖尿病胰岛细胞的病理损伤，其部分机制可能与其促进骨髓源干细胞向损伤病灶入住以及增加存活相关。然而，由于神经细胞再生的特殊性，神经细胞再生率低，神经细胞再生来源于脑内内源性神经干细胞，而非骨髓干细胞。 因此，MR-409在缺血性脑梗塞中能否与心肌梗塞一样发挥治疗效应为不可预测性，丞待通过新的不同的研究方案进行解决。
发明内容
本发明的目的是提供一种含有MR-409的用于治疗防治缺血性脑卒中的组合物，为脑缺血治疗，特别是减少缺血性脑梗塞后的后遗症提供新的治疗策略，具有重要的临床治疗意义。本研究也为日后通过促进神经原再生作为缺血性脑梗塞调控靶点的药物研发提供重要的科学理论依据。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一方面，本发明提供了GHRH-A在制备防治缺血性脑梗塞药物中的应用，其技术要点是：所述GHRH-A为MR409。
进一步的，该药物主要以注射剂作为给药剂型。
另一方面，本发明提供了一种含有GHRH-A的用于防治缺血性脑梗塞的组合物，其技术要点是：所述GHRH-A为MR409。
MR409的氨基酸序列为：NMeTyr-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Orn-Val-Leu-Abu-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Orn-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asp-Arg-NHCH。
有效成分MR409的剂量为5μg或10μg。
进一步的，该组合物主要以注射剂作为给药剂型。
有效成分MR409的浓度为0.5μM或1μM。
本发明的有益效果：本发明公开了生长激素释放激素受体激动剂MR-409在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用。实验证实：1）MR-409能够显著地缓解短暂性脑缺血再灌注（Transient middle cerebral artery occlusion, tMCAO）模型小鼠4周的脑萎缩；2）MR-409能够显著地增加tMCAO模型小鼠的脑重量；3）MR-409能够显著地逆转tMCAO模型小鼠4周海马的神经元缺失；4）MR-409能够显著地改善tMCAO模型小鼠的神经行为学表现。5）MR-409能够显著地增加tMCAO模型小鼠2周SGZ和SVZ脑区的GFAP+/Nestin+/MCM2+细胞数；6）MR-409能够显著地增加tMCAO模型小鼠2周SGZ脑区的Tbr2+/MCM2+细胞数；7）MR-409能够显著地增加tMCAO模型小鼠2周的海马SGZ脑区的BrdU+/DCX+以及海马SGZ和SVZ脑区的MCM2+/DCX+细胞数及DCX+细胞向海马分子层和纹状体迁移的数量；8）MR-409能够显著地增加tMCAO模型小鼠4周的海马SGZ和SVZ脑区的BrdU+/NeuN+细胞数；9）MR-409能够显著地增加氧糖剥夺/复氧（Oxygen glucose deprivation/ re-oxygenation, OGD/R）后NSCs的增殖和存活并抑制其凋亡，其机制可能与其增加脑缺血后p-AKT和p-ERK蛋白的表达有关。 其中MR-409的优选剂量为5 ug和10 ug。优选给药方式为造模后每天皮下注射给药。以上实验结果表明MR-409能够显著地改善缺血性脑梗塞小鼠的脑损伤，提高生存率并改善缺血脑梗塞小鼠的神经行为学表现，降低缺血后脑梗塞后遗症的发生率，其机制可能与增加脑缺血后内源性神经元发生相关。以上MR-409的新用途为脑缺血的治疗提供新的策略，具有重要的临床治疗意义。为将来以促进神经元再生作为脑缺血治疗靶点的药物研发提供科学理论依据。
相比内源性的GHRH，人工合成的GHRH-A 具有副作用低，半衰期长，作用稳定的优势。而在这些GHRH-A产品中，MR-409在治疗血管钙化和心肌梗塞中具有更良好的效应。尽管Dr. Schally团队已报道MR-409在治疗实验血管钙化和心肌梗塞动物模型方面获得了一定的效应。与神经细胞比较，心肌细胞再生能力较好，心肌梗塞后可通过刺激心肌细胞再生和骨髓性干细胞分化成内皮祖细胞而促进血管新生，实现部分的自我修复。 与脑梗塞相比，心肌梗塞在度过急性危险期后遗留的后遗症少，致残率低，MR-409通过加速心肌细胞这一修复过程而促进梗塞后心肌的愈合。 与心肌细胞比较，神经细胞再生能力低，而且骨髓干细胞不能分化成神经干细胞和神经元，神经细胞的再生主要靠脑内内源性神经干细胞向病灶区移行和修复。 缺血性脑梗塞常规治疗由于难予修复损伤的神经元而常遗有神经和肢体功能障碍的后遗症。因此，治疗心肌梗塞比较，MR-409是否能治疗脑梗塞存在着更多的不确定性。此外，MR-409需透过血脑屏障，达到脑部药物浓度较低，MR-409治疗脑梗塞的给药方案尚需要进一步确定。因此，我们的结果显示MR-409通过刺激内源性神经干细胞增生促进神经元再生修复治疗缺血脑梗塞，减少脑梗塞后遗症，这些结果将为脑梗塞开辟一条新的治疗途径。
应用GHRH受体激动剂MR-409治疗能有效地降低由大脑中动脉阻塞引起缺血性脑梗塞模型小鼠的死亡率，增加小鼠生存率（见图三）。因此该治疗方案有可能降低脑梗塞患者的死亡率。
MR-409能够增加缺血性脑梗塞模型小鼠的脑重量（图1-2），改善模型小鼠海马空洞（图4），降低缺血性脑梗塞模型小鼠的脑萎缩（图1-3）。因此，该新型治疗方案实施有可能有效地保护缺血性脑梗塞患者的脑组织损伤。
MR-409能够改善模型小鼠的神经行为，包括改善缺血性脑梗塞后的学习记忆功能（图6）以及肢体的运动功能（图5）。因此，该新型治疗方案实施有可能有效地降低缺血性脑梗塞患者的后遗症。
MR-409能够增加模型小鼠神经干细胞的增殖（图7-8）、神经前体细胞（图9）、神经母细胞的增殖和迁移以（图10-12）及新生神经元的存活（图13-14）。
MR-409能够增加体外培养的缺血神经干细胞的存活和增殖（图15-16），其机制可能与其增加脑缺血后p-AKT和p-ERK蛋白的表达相关（图17）。
我们的结果显示MR-409通过刺激内源性神经干细胞增生促进神经元再生修复治疗缺血脑梗塞，减少脑梗塞后遗症，这些结果将为脑梗塞开辟一条新的治疗途径。
附图说明
图1为MR-409治疗（28天）降低tMCAO（大脑中动脉结扎）小鼠所致缺血性脑梗塞脑萎缩。
图2为MR-409治疗（28天）增加tMCAO缺血性脑梗塞小鼠的脑重量。
图3为MR-409治疗（28天）增加tMCAO缺血性脑梗塞小鼠生存率。
图4为MR-409治疗（28天）减少tMCAO缺血性脑梗塞所致的脑部海马空洞。
图5为MR-409治疗（28天）改善tMCAO模型小鼠不同时间点感觉运动功能。
图5中，A图为小鼠神经功能评分测定；B图为小鼠同侧转身次数测定；C图为小鼠转棒停留时间测定；D图为小鼠前肢拉力测定。
图6为MR-409改善tMCAO模型小鼠缺血不同时间点学习记忆功能。
图6中，A图为小鼠水迷宫游泳距离测定；B图为小鼠逃避潜伏期测定；C图为小鼠在目标象限停留时间测定；D图为小鼠穿越平台次数。
图7为MR-409治疗促进tMCAO小鼠海马SGZ脑区神经干细胞增殖。
图7中，绿色荧光代表神经干细胞标记物GFAP，红色荧光代表神经干细胞标记物Nestin，灰色荧光代表内源性增殖细胞标记物MCM2。
图8为MR-409治疗促进tMCAO小鼠SVZ脑区神经干细胞增殖。
图8中，绿色荧光代表神经干细胞标记物GFAP，红色荧光代表神经干细胞标记物Nestin，灰色荧光代表内源性增殖细胞标记物MCM2。
图9为MR-409治疗促进tMCAO小鼠海马SGZ脑区神经前体细胞增殖。
图9中，红色荧光代表神经前体细胞标记物Tbr2，绿色荧光代表内源性增殖细胞标记物MCM2。
图10为 MR-409治疗促进tMCAO小鼠海马SGZ脑区神经母细胞瞬时增殖和迁移。
图10中，红色荧光代表神经母细胞标记物DCX，绿色荧光代表外源性增殖细胞标记物BrdU。
图11为MR-409治疗促进tMCAO小鼠海马SGZ脑区神经母细胞增殖和迁移。
图11中，红色荧光代表神经母细胞胞标记物DCX，绿色荧光代表内源性增殖细胞标记物MCM2。
图12为MR-409治疗促进tMCAO小鼠SVZ脑区神经母细胞增殖和迁移。
图12中，红色荧光代表神经母细胞胞标记物DCX，绿色荧光代表内源性增殖细胞标记物MCM2。
图13为MR-409治疗增加tMCAO小鼠海马SGZ脑区神经元存活。
图13中，绿色荧光代表外源性增殖细胞标记物BrdU，蓝色荧光代表成熟神经元标记物NeuN。
图14为MR-409增加tMCAO小鼠脑区新生神经元存活。
图14中，绿色荧光代表外源性增殖细胞标记物BrdU，蓝色荧光代表成熟神经元标记物NeuN。
图15为MR-409对tMCAO小鼠突触可塑性的影响
图15中，A图和B图为电镜检测小鼠海马CA1区突触结构的示意图；C图为高尔基染色神经元的示意图；D图和E图为高尔基染色树突棘示意图；F图和G图为树突棘半定量结果的示意图。
图16为MR-409抑制体外培养的氧糖剥夺的神经干细胞凋亡，绿色荧光为TUNEL标记的阳性细胞。
图17为 MR-409促进体外培养的氧糖剥夺的神经干细胞增殖，红色荧光为BrdU标记的阳性细胞。
图18为 MR-409增加体外培养的氧糖剥夺的神经干细胞存活率。
图19为MR-409增加体外培养的氧糖剥夺的神经干细胞AKT和ERK蛋白表达影响。
图20为GHRH受体在小鼠神经发生特定脑区SVZ和SGZ及体外培养的神经干细胞中的表达。
图20中，A图为GHRH受体在小鼠神经发生的特定脑区表达的示意图；B图为GHRH受体在体外培养的神经干细胞中的表达示意图。
具体实施方式
以下结合图1~20，通过具体实施例详细说明本发明的内容。
本发明涉及生长激素释放激素受体激动剂MR-409在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用：
1、实验材料：
C57BL/6小鼠，雄性，体重22-25g，动物合格证号：购于沈阳医学院实验动物中心。成年SD大鼠，海马脑区的神经干细胞。MR-409由美国迈阿密大学（University of Miami,Miami， FL， USA）Andrew Schally（1977年医学诺贝尔奖得主）教授实验室所提供，纯度，由10%的1,2-丙二醇配置成所需浓度备用。
、实验方法：
2.1 实验分组及给药
1）实验动物选用C57BL/6小鼠，体重在22-25 g，分为假手术组、模型组、MR-409低剂量组（5 μg每次）和MR-409高剂量组（10 μg每次）。
2）给药剂量：MR-409低剂量组每只单次给予受试药物5 μg [将MR-409溶于DMSO溶液中，制备储备液浓度为100 mg/ml的储备液。临用前用10%的聚乙二醇稀释至工作浓度为0.1 mg/ml （DMSO的终浓度<1%）]；MR-409高剂量组每只单次给予受试药物10 μg；假手术组及模型组给予等体积的生理盐水。
3）给药方式：皮下注射给药。
4）给药时间：MR-409组在脑缺血造模即刻给药，之后每天在相同时间给药一次，治疗时间为14-18天。
模型的制备
1）动物实验：脑缺血再灌注模型
MCAO 手术前小鼠禁食不禁水12 h，异氟烷麻醉（4%诱导，2%维持），仰卧固定，颈部中线切口1 cm，暴露右侧颈CCA、颈外动脉ECA 和颈内动脉ICA。用缝合线将ECA 和CCA 的近心端结扎，并用微型动脉夹将ICA 暂时夹闭。结扎并分离ECA 及其分支，动脉夹夹闭CCA，于ECA残端起始部剪一小口，由此口轻轻插入制备好的线栓，至略感阻力停止，备线固定线栓，线栓插入的深度以ECA 分叉处开始计算约8 mm。术毕，打开CCA 动脉夹，缝合皮肤，外留线栓。缺血1小时后再灌注，小时鼠经由异氟烷麻醉，打开颈部缝合切口，逐渐拔出线栓至完全离开ECA，结扎ECA 残端，再次缝合颈部切口，碘伏涂抹消毒。术后以电热灯照射4 h 以维持动物体温，24 h 内禁食不禁水，单笼饲养。假手术组线栓头部仅推进至分叉处上方ICA 方向3mm，其余手术过程同上。
2）体外实验：细胞氧糖剥夺/再灌注模型
（1）海马分离及神经球培养
1) 取新生24 h内的SD大鼠，75%乙醇浸泡消毒5 min，无菌条件下将脑组织完整取出，迅速置于预冷的盛有Dissection solution的平皿中。分离出海马，并剔除脑膜和血管。用显微镊尽量剪碎约1 mm3大小，将双侧海马组织合并转移至含预冷Dissection solution的离心管中，做好标记。
2) 250×g离心5 min。
3) 弃上清，加入500 μL/tube Accutase于37℃培养箱孵育3 min，目的为消化组织。
4) 吸去上清Accutase，加入200 μL SFM，满量程吹打30~40次。吹打时，枪头抵住管底，以获得最大剪切力。动作要果断，每次吸入要满量程，同时尽量避免气泡产生。
5) 吹打适度之后，加入SFM完全培养基，70 μm细胞过滤器过滤。
6) 250×g离心3~5 min。
7) 弃上清，加入200 μL SFM完全培养基，吹打重悬组织，使细胞分离成单细胞。
8) 补加SFM完全培养基，充分混匀细胞悬液，将悬液接种至6孔板，3~4 mL/孔，双测海马的细胞悬液置于一个孔。
9) 十字形轻晃培养板，使细胞分布均匀。镜下观察细胞形态。
10)5% CO2，37℃培养箱中培养7~10天。在此期间，分化的细胞将死亡，而NSCs和一些祖细胞将开始增殖并形成神经球。
（2）神经球传代培养
1) 将含有神经球的培养液转移至15 mL离心管（可用完全培养基将孔板底部冲洗一遍，以获得尽可能多的细胞）。
2) 根据整体神经球的大小和数量，250×g离心5 min。
3) 小心吸去上清，加入200 μL Accutase，重悬细胞沉淀，37℃孵育3 min。
4) 加入800 μL完全培养基稀释，500×g离心5 min。
5) 小心吸去上清，加入200 μL SFM完全培养基，充分吹打成单细胞悬液。
6) 根据细胞密度按照1:2~1:5的比例传代，接种至6孔板。
7) 5% CO2，37℃培养箱中培养。5~7 d之后新的神经球可再传代。
（3）神经干细胞贴壁培养及诱导分化
1) 传至3代以上的细胞可贴壁培养。预先用含有100 μg/mL PDL/PLL和5 μg/mLLaminin的混合溶液包被24孔爬片。
2) 其余步骤同2.2.2（2）传代。
3) 培养至3~5 d时，可用于免疫荧光鉴定或药物实验。
4) 诱导分化的细胞培养步骤如下：贴壁培养第1~2 d仍采用完全培养基，视细胞密度延长该培养时间；之后更换去除EGF，添加1% FBS且FGF减半的SFM完全培养基。第2次换液时，采用FGF全部去除的上述培养基。每三天半量换液一次。分化培养14 d，可用于免疫细胞化学实验或药物实验。
将传至3代以上的NSCs贴壁培养至培养板/皿中，培养3~5 d后，将培养基换作无糖DMEM，置于37℃缺氧小室中，通入含95% N2和5% CO2的混合气体，即为OGD模型，转移到正常氧浓度和SFM完全培养基条件下继续培养，可以模拟细胞缺血再灌注损伤模型。
2.3. 脑缺血神经功能检测
1）神经功能评分
选择改良神经损伤评分（Modified Neurological Severity Score, mNss）对术后不同时间点动物进行神经功能检测
2）转棒测试
检测前一周开始对小鼠进行训练，转速为4~20 rpm，转速至最大时持续60 s，每只小鼠每日训练三次，第7天记录基础值。检测时，每只小鼠检测三次，取最长滞留时间；当小鼠持续滞留时间超过60 s时，检测终止，以60 s作为最终成绩，对转棒滞留时间及进行统计分析
3）拉力测试
将小鼠两前肢置于拉力计拉杆上，保持小鼠身体与桌面水平，缓慢匀速向后拉拽小鼠，直至两前肢离开拉力计拉杆，重复记录三次，取最大值纳入统计计算
4）转角测试
实验中的转角是由30度角的平板组成，并且在两板的结合处有一条小缝，以此吸引小鼠进入转角。实验时小鼠被放在两板间，并正对转角，当小鼠进入转角时，它的两侧触须会同时感受到障碍物的存在，然后会前肢抬起，并转身面向进入端。每只小鼠重复进行10次测试，每次间隔一分钟。记录小鼠向左或者向右偏转的次数。
5）Morris水迷宫检测
Morris水迷宫系统包括一个黑色不锈钢圆形水池（直径1.5 m，高45 cm，水温20°C）、一个直径为10 cm的圆柱形黑色平台、摄像头系统及Etho Vision XT 8.0软件分析系统。在水池上缘等距离的设置东、西、南、北四个标记点，以这四个标记点和水池底部的投影点将水池分成均等的四个象限，圆柱形黑色平台位于目标象限水平面以下1.5~2 cm，实验时用二氧化钛将水池的水染白。实验持续5天，包括定位航行实验和空间探索实验。前3天为训练阶段，每只小鼠每天进行3次训练，每次训练间隔120 s。实验中轻柔地将小鼠从不同的象限面向池壁放入水中，记录120 s内大鼠从入水至找到平台的时间，即逃避潜伏期（latency），当大鼠找到平台后使其在平台上停留10 s；如果90 s内大鼠未找到平台，可将其诱导至平台上并停留10 s，记录逃避潜伏期为90 s。第4天为定位航行实验检测阶段，检测90 s内大鼠的逃避潜伏期。第5天为空间探索实验，撤掉平台，记录90 s内大鼠在平台所在象限的游泳时间、穿越平台位置的次数。
2.4. 免疫荧光检测：
小鼠经PFA心脏灌流后取脑，再经PFA后固定与梯度沉糖后进行OTC冰冻切片。将脑切片用PBS洗片缓冲液清洗3次，每次5 min，小心擦干载玻片上的水迹，在脑片周围用组化笔划线，在脑片上孵育血清工作液，37℃孵育1 h。之后弃去血清工作液，小心擦干脑切片边缘液体，按适当比例4℃孵育一抗过夜。次日将孵育好的脑切片用PBS洗片缓冲液清洗3次，小心擦干载玻片上的水迹，在脑片周围用组化笔补线。适当比例在室温孵育荧光二抗工作液1 h后，将孵育好的脑切片用PBS洗片缓冲液清洗3次后小心擦干载玻片上的水迹，用放淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察荧光。
2.5蛋白质免疫印迹检测：
（1）细胞总蛋白的提取
贴壁细胞加入RIPA裂解液，在冰上超声破碎1分钟，4℃，12000×g，离心15分钟，取上清液，用BCA法测蛋白浓度，提取出来的上清液用5X上样缓冲液进行稀释，在95℃金属浴中热变性10分钟。
（2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及染色
分别配制12%的分离胶和5%的浓缩胶，灌制SDS-PAGE（6×8×0.1 cm）。装好电泳槽后，加入电泳缓冲液，上样，组织总蛋白30 μg/孔，marker 5 μg/孔。恒压电泳，样品在浓缩胶中以60 V电泳，待溴酚蓝迁移至分离胶界面后，样品在分离胶以120 V电泳至溴酚蓝迁移至凝胶底部，关闭电源。取下凝胶，进行电转印。
（3）免疫印迹
1）PVDF膜在甲醇中活化15秒，之后将膜、湿转滤纸和海绵在转移缓冲液中充分浸泡15分钟；
2）将SDS聚丙稀胺凝胶取出后，将凝胶按叠成“三明治”状，插入转移池中，凝胶一面接阴极，4℃下260 mA恒流转印相应时间；
3）转移后的PVDF膜在TBST中漂洗，加入5%的脱脂奶粉封闭，室温1小时；
4）将一抗用5%脱脂奶粉稀释至适当浓度，4℃孵育过夜；
5）用TBST漂洗膜4次，每次5分钟；
6）将二抗用5%脱脂奶粉稀释至适当浓度，室温孵育1小时；
7）用TBST漂洗膜3次，每次10分钟；
8）暗室中将ECL试剂加到膜蛋白面上，反应1分钟后，置于曝光暗盒中，盖X-光胶片，曝光一定时间；
9）取出胶片放入显影液中，待出现条带后，以自来水漂洗，置于定影液中，最后用自来水冲洗，晾干，扫描图片保存。
2.6 高尔基染色
小鼠脱颈处死后直接取完整脑组织在细胞培养皿使用PBS缓冲液冲洗血液，并将之浸泡于高尔基染色液（Fdneurotech, PK401，A：B=1：1）中避光常温放置2-3周。而后，以震荡切片机在C液中进行100 μm厚的海马区冠状连续切片，并使用毛刷将脑片贴附于明胶包被的防脱载玻片中避光风干48 h。切片分别经超纯水漂洗，高尔基染色液（D：E：超纯水=1：1：2）浸泡，超纯水再次漂洗，50%、75%、95%及100%乙醇溶液（各3次/5 min）依次脱水后，以二甲苯透化，中性树胶封片后，使用光学显微镜采片。而后，采用ImageJ软件进行图片处理分析，选取海马CA1区各部分神经树突，分析神经元发育情况，并统计树突棘密度。
2.7 投射电镜检测
小鼠以4%水合氯醛（0.1 ml/10 g）麻醉后开胸，经预冷的生理盐水及2%PFA-2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液灌流后迅速取脑，分离海马组织后切成1 mm3组织块并置于预冷的2.5%戊二醛溶液中后固定。而后，使用磷酸缓冲液漂洗后经1%锇酸溶液再固定80 min，经超纯水漂洗，梯度丙酮脱水，环氧树脂渗透包埋制成组织块。使用超薄切片机制备70 nm厚的超薄切片后将之捞至铜网，并使用3%醋酸双氧铀及柠檬酸铅进行组织染色。切片最后经超纯水冲洗后使用透射电镜进行采片。
3、实验结果：
1）MR-409对tMCAO小鼠28天后脑萎缩、脑重量、生存率和海马形态的影响
C57BL/6小鼠经tMCAO造模（缺血1小时后再灌注28天），同时，在造模当天给予MR-409（5, 10 μg/day/mouse, s.c.）连续给予4周，在造模后的第28天进行断头取脑观察各组动物的脑萎缩情况。结果如图1-4所示，在tMCAO手术造模后，右侧半球出现了明显萎缩，脑重量显著下降，海马出现空洞。给予低剂量和高剂量的MR-409后，能够明显缓解模型造成的右侧半球萎缩，增加脑重量、提高模型小鼠的生存率并改善海马空洞现象。提示MR-409能够显著改善tMCAO模型小鼠的脑缺血损伤。##p<0.01, ###p<0.001 vs. sham组；*p<0.5, **p<0.01 vs. Vehicle组。标尺为200 μm。
2）MR-409对tMCAO小鼠神经功能和学习记忆功能的影响
C57BL/6小鼠经tMCAO造模（缺血1小时后再灌注28天），同时，在造模当天给予MR-409（5, 10 μg/day/mouse, s.c.）连续给予4周，在造模后的第3天、第7天、第14天、第21天、第28天进行神经功能相关行为学检测。结果如图5-6所示，在神经功能评分实验中，MR-409能能够显著降低tMCAO后不同时间点的神经功能评分；在转角实验中，MR-409能够显著降低缺血小鼠向缺血同侧偏转次数；在转棒测试实验中，MR-409显著增加模型小鼠的转棒停留时间，在拉力测试实验中，MR-409显著增加模型小鼠的前肢拉力；在Morris水迷宫实验中，显著降低模型小鼠的游泳距离，显著降低模型小鼠的逃避潜伏期，显著增加模型小鼠在目标象限的停留时间，显著增加模型小鼠的穿越平台次数。以上结果提示，MR-409能够显著地改善tMCAO模型小鼠的神经功能和学习记忆能力。#p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001 vs.sham组；*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. Vehicle组。
3）MR-409对tMCAO模型小鼠神经干细胞增殖的影响
C57BL/6小鼠经tMCAO造模（缺血1小时后再灌注14天），同时，在造模当天给予MR-409（5, 10 μg/day/mouse, s.c.）连续给予14天，在造模后的第14天进行断头取脑，之后用共聚焦荧光显微镜考察海马SGZ脑区和SVZ脑区的GFAP、Nestin和MCM2共染。实验结果如图7-8所示，绿色荧光为GFAP+细胞、红色荧光为Nestin+细胞，灰色荧光为MCM+细胞。MR-409低剂量组和高剂量组组能够明显增加模型小鼠海马SGZ脑区和SVZ脑区的GFAP+/Nestin+/MCM2+细胞数量。提示MR-409能够增加tMCAO模型小鼠神经干细胞的增殖。标尺为40 μm。
4）MR-409对tMCAO模型小鼠神经母细胞增殖的影响
C57BL/6小鼠经tMCAO造模（缺血1小时后再灌注14天），同时，在造模当天给予MR-409（5, 10 μg/day/mouse, s.c.）连续给予14天，在造模后的第14天进行断头取脑，之后用共聚焦荧光显微镜考察海马SGZ脑区Tbr2和MCM2共染。实验结果如图9所示，红色荧光为Tbr2标记的神经母细胞，绿色荧光为内源性增殖细胞标记物MCM2，蓝色荧光为细胞核染料DAPI。MR-409低剂量组和高剂量组能够明显增加模型小鼠海马SGZ脑区的Tbr2+/MCM2+的细胞。提示MR-409能够增加tMCAO模型小鼠神经母细胞的增殖。标尺为40 μm。
5）MR-409对tMCAO模型小鼠神经母细胞增殖和迁移的影响
C57BL/6小鼠经tMCAO造模（缺血1 h后再灌注14天），同时，在造模当天给予MR-409（5,10 μg/day/mouse, s.c.）连续给予2周，在造模后的第14天断头取脑，在断头前2小时给予小鼠腹腔注射BrdU（300 mg/kg），之后用共聚焦荧光显微镜考察海马SGZ脑区BrdU和DCX共染以及海马SGZ和SVZ脑区的MCM2和DCX共染。实验结果如图10-12所示，红色荧光标记的细胞为DCX+的细胞，绿色荧光分别为外源性和内源性标记的增殖细胞标记物BrdU+和MCM2+的细胞，蓝色荧光为细胞核染料DAPI。在tMCAO造模14天后，tMCAO组SGZ脑区的BrdU+/DCX+以及MCM2+/DCX+细胞数明显增加，且DCX+的细胞向海马分子层迁移；SVZ脑区的MCM2+/DCX+细胞数明显增加，且DCX+的细胞向纹状体迁移。而与tMCAO组相比，给予低剂量和高剂量的MR-409能够进一步增加BrdU+/DCX+及MCM2+/DCX+细胞数，并进一步增加DCX+细胞向海马分子层和纹状体迁移的细胞数量。提示MR-409能够促进tMCAO模型14天小鼠海马SGZ脑区的神经干细胞的增殖和迁移。标尺为40 μm。
6）MR-409对tMCAO模型小鼠突触可塑性的影响
C57BL/6小鼠经tMCAO造模（缺血1 h后再灌注28天），同时，在造模当天给予MR-409（5,10 μg/day/mouse, s.c.）连续给予4周，在造模后的第28天断头取脑。取缺血测海马CA1区脑组织分别进行电镜和高尔基染色检测。实验结果如图所示，A图和B图为海马CA1区的突触结构，结果显示在假手术组中，突触结构完整，突触后致密带深染，突触间隙清晰。在tMCAO组中，突触后致密带变宽，突触间隙变窄，突触小泡消失，突触曲度变平，而在给予MR-409后能够明显改善tMCAO所导致的突触可塑性改变。C图为高尔基染色的实验结果，如图所示，假手术组中海马结构完整，神经元形态正常，轴突和树突分支清楚。在tMCAO组中，海马CA1区和CA3区神经元缺失，树突分支减少。D图和E图为树突放大的结果，图片显示，tMCAO组中，树突棘的密度显著降低，给予MR-409后能够显著地逆转模型所导致的树突棘缺失。F图和G图为树突棘半定量的结果。***p<0.01 vs. sham组；##p<0.01, ###p<0.001 vs. tMCAO组
7）MR-409对tMCAO模型小鼠神经元存活的影响
C57BL/6小鼠经tMCAO造模（缺血1 h后再灌注28天），同时，在造模当天给予MR-409（5,10 μg/day/mouse, s.c.）连续治疗4周，在造模后的第一天给予BrdU（50 mg/kg, i.p.），每天2次，连续5天。在造模后的第28天断头取脑，之后用共聚焦荧光显微镜进行缺血同侧海马SGZ脑区和SVZ脑区的BrdU和NeuN共染。实验结果如图13、14所示，绿色荧光标记的细胞为BrdU+的细胞，蓝色荧光标记的细胞为NeuN+的细胞。在tMCAO造模28天后，tMCAO组SGZ脑区和SVZ脑区BrdU+/NeuN+的细胞数明显增加，总的NeuN+的细胞数量明显降低；与tMCAO组相比，给予低剂量和高剂量的MR-409能够进一步增加BrdU+/NeuN+的细胞数和总的NeuN+的细胞数。提示MR-409能够促进tMCAO后28天海马SGZ脑区和SVZ脑区新生神经元的存活。标尺为40μm。
8）MR-409对OGD/R的神经干细胞增殖、存活和凋亡的影响
传至3代以上的NSCs贴壁培养3天，经OGD处理4 h后复氧，同时加入MR-409（0.5 μM, 1μM）作用72小时，细胞经PFA固定，后经蛋白酶K处理，经BrdU染色。实验结果如图15-18所示，红色荧光为BrdU标记的神经干细胞，绿色荧光为TUNEL标记的神经干细胞。在OGD/R后，BrdU+细胞数以及总的NSCs的数量都明显降低，TUNEL+细胞数量明显增加，在给予MR-409后能够明显地增加BrdU+细胞数以及总的NSCs数量。同时，用MTT法检测NSCs的存活率情况。结果显示，在OGD/R后，细胞的存活率较空白组相比显著降低，在给予MR-409后能够剂量依赖性地增加NSCs的存活率。Western blot实验结果表明，MR-409能够剂量依赖性的增加p-AKT/AKT和p-ERK/ERK蛋白的表达。以上结果提示，MR-409能够增加OGD/R的神经干细胞的增殖、存活并抑制其凋亡，其机制可能与其增加脑缺血后p-AKT及p-ERK蛋白的表达相关。**p<0.01vs. con组；##p<0.01, ###p<0.001 vs. mod组。标尺为20 μm。
9）GHRH受体在神经发生的特定脑区及体外培养的神经干细胞中的表达
C57BL/6小鼠取海马SVZ及SGZ脑区、阳性对照下丘脑脑组织及阴性对照骨骼肌。通过Western blot进行检测，结果如A图所示，在下丘脑组织中，有高表达的GHRH受体，在骨骼肌组织中，几乎没有GHRH受体的表达，而在神经发生的特定脑区SVZ和SGZ中，也存在高表达的GHRH受体。同时，通过Western blot检测，考察GHRH受体在体外培养的神经干细胞中的表达，选用Hela细胞为阳性对照，MCF7细胞为阴性对照。实验结果如图B显示，在Hela细胞中存在高表达的GHRH受体，而在MCF7细胞中几乎没有GHRH受体的表达，而在神经干细胞中也存在高表达的GHRH受体。
通过上述实施例可知，MR-409能够改善tMCAO模型小鼠的脑缺血损伤、增加模型小鼠的存活率并改善海马空洞；MR-409能够改善tMCAO模型小鼠的神经行为学表现；MR-409能够增加tMCAO模型小鼠的神经干细胞增殖；MR-409能够增加tMCAO模型小鼠的神经母细胞增殖；MR-409能够增加tMCAO模型小鼠的神经母细胞增殖和迁移；MR-409能够增加tMCAO模型小鼠的新生神经元存活；MR-409能够改善tMCAO模型小鼠的海马突触可塑性；MR-409能够增加OGD/R处理的神经干细胞的增殖、存活并抑制其凋亡；其机制可能与其增加脑缺血p-AKT和p-ERK蛋白的表达相关，在神经发生的特定脑区和体外培养的神经干细胞中存在高表达的GHRH受体。
Claims (7)
1.一种GHRH-A在制备防治缺血性脑梗塞药物中的应用，其特征在于：所述GHRH-A为MR409。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物为注射剂。
3.一种含有GHRH-A的用于防治缺血性脑梗塞的组合物，其特征在于：所述GHRH-A为MR409。
4.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于:MR409的氨基酸序列为：NMeTyr-D-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Orn-Val-Leu-Abu-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Orn-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Nle-Asp-Arg-NHCH。
5.根据权利要求3或4所述的组合物，其特征在于：有效成分MR409的剂量为5μg或10μg。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于：所述组合物为注射剂。
7.根据权利要求3或4所述的组合物，其特征在于：有效成分MR409的浓度为0.5μM或1μM。
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