CN106148276A

CN106148276A - 间充质干细胞在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用

Info

Publication number: CN106148276A
Application number: CN201510179793.2A
Authority: CN
Inventors: 时玉舫; 曹巍; 王莹
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2015-04-16
Filing date: 2015-04-16
Publication date: 2016-11-23

Abstract

本发明涉及间充质干细胞在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用。首次揭示了利用炎症因子处理间充质干细胞后，能够显著地促进间充质干细胞对于神经退行性疾病的缓解作用，并提供了包含所述细胞的药物组合物。本发明还揭示了吲哚胺2,3-双加氧酶在间充质干细胞治疗神经退行性疾病上的核心作用。

Description

间充质干细胞在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体地，本发明涉及间充质干细胞在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用。

背景技术

帕金森病和帕金森综合征(parkinson disease，PD)是一种常见的神经系统退行性疾病，其特征性的病理改变是中脑黑质多巴胺(dopamine，DA)能神经元的进行性缺失，进而导致投射至纹状体多巴胺神经递质的减少。遗传因素、环境因素、年龄老化、氧化应激以及炎症等均参与帕金森氏病多巴胺能神经元的变性死亡过程。其中，氧化应激在各种神经变性机制中处于主导地位，对多巴胺神经元死亡起重要作用。目前该病仍无有效治疗方法，随着世界人口老龄化，其发病率日益增高，给患者、家庭甚至社会带来巨大影响。干细胞的发现和应用，将使神经元再生、神经功能恢复和神经退行性疾病的治愈成为可能。胚胎干细胞和神经干细胞虽然已在帕金森、多发性硬化等动物模型中应用，但由于其来源有限以及伦理性和安全性问题难以解决，阻碍其在临床的广泛使用。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)作为干细胞的一种，广泛存在于机体的大部分组织中，可以从骨髓、脂肪、肌肉等组织中分离获得，具有跨胚层分化的特性，可以分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞、神经细胞等，参与组织的再生修复和机体内环境稳态的维持。与胚胎干细胞和诱导性多能干细胞(inducible pluripotent cells，iPS)不同的是，它兼具了组织修复和免疫调节的双重特性，为实现帕金森氏病病人的神经细胞再生和免疫紊乱回调带来曙光。

已有研究证实，MSCs对神经退行性疾病具有明显疗效。例如，Lee JK将小鼠骨髓来源的MSCs脑室注射于阿尔兹海默的小鼠模型中发现疾病小鼠的病理改变和认知功能得到明显改善。

虽然MSCs在神经退行性疾病模型中已证实有疗效，但其具体机制尚无定论。利用体外细胞实验及体内观察推测出MSCs可能具有的作用机制包含以下几种：(1)分泌神经营养因子促进神经修复，大量研究表明MSCs可分泌多种神经营养因子，并可促进中枢神经系统内源性神经生长因子的分泌。Crigler证明人源MSCs的特定亚群细胞表达BDNF和NGF，他们利用体外共培养体系证明，MSCs促进SH-Sy5y细胞的存活和神经突触生长是部分依赖于BDNF的。(2)促进内源性神经干细胞的迁移分化MSCs迁移至中枢神经系统的损伤部位后，可以改变其微环境，促进神经干细胞的迁移分化。MunozJR发现将人源骨髓干细胞移植入SCID小鼠的海马区后能够促进临近内源性的神经干细胞增殖、迁移和分化。(3)免疫调节作用研究发现，MSCs分泌的PGE2在MSCs缓解多发性硬化的小鼠疾病模型中起到了关键的作用。

MSCs的发现和成功分离为PD疾病的治疗带来了新的希望。虽然，MSCs移植在PD上取得了明显的治疗效果，但其具体的作用机制还需进一步研究。

发明内容

本发明的目的在于提供间充质干细胞在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用。

在本发明的第一方面，提供一种间充质干细胞或细胞培养物，所述的间充质干细胞是炎症因子预处理的间充质干细胞，所述的炎症因子是IFN-γ和TNF-α。

在一个优选例中，所述的预处理包括：将炎症因子加入间充质干细胞的培养体系中，使得炎症因子IFN-γ的终浓度为：1ng/ml～1000μg/ml(较佳地为2ng/ml～200μg/ml；更佳地为3ng/ml～50μg/ml；更佳地为5ng/ml～10μg/ml，如10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，500ng/ml，1μg/ml)；炎症因子TNF-α的终浓度为1ng/ml～1000μg/ml(较佳地为2ng/ml～200μg/ml；更佳地为3ng/ml～50μg/ml；更佳地为5ng/ml～10μg/ml，如10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，500ng/ml，1μg/ml)。

在另一优选例中，预处理的时间是30分钟～96小时。

在另一优选例中，所述的间充质干细胞还过(高)表达吲哚胺2,3-双加氧酶。

在本发明的另一方面，提供所述的间充质干细胞或细胞培养物的用途，用于制备预防、缓解或治疗神经退行性疾病或保护神经细胞的药物。

在一个优选例中，所述的神经退行性疾病是：帕金森病、帕金森综合征。

在另一优选例中，所述的药物还用于：提高神经细胞的抗氧化应激能力；降低脑纹状体区的氧化应激反应，或提高脑组织病灶部位抗氧化应激能力；或提高脑纹状体区犬尿氨酸(Kynurenine，KYN)或犬尿喹啉酸(Kynurenic acid，KYNA)的水平。

在本发明的另一方面，提供一种用于预防、缓解或治疗神经退行性疾病或保护神经细胞的药物组合物，所述的药物组合物中包含所述的间充质干细胞或细胞培养物。

在本发明的另一方面，提供一种制备所述的间充质干细胞(或细胞培养物)的方法，所述的方法包括：将炎症因子加入间充质干细胞的培养体系中，使得炎症因子IFN-γ的终浓度为：1ng/ml～1000μg/ml(较佳地为2ng/ml～200μg/ml；更佳地为3ng/ml～50μg/ml；更佳地为5ng/ml～10μg/ml，如10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，500ng/ml，1μg/ml)；炎症因子TNF-α的终浓度为1ng/ml～1000μg/ml(较佳地为2ng/ml～200μg/ml；更佳地为3ng/ml～50μg/ml；更佳地为5ng/ml～10μg/ml，如10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，500ng/ml，1μg/ml)，预处理细胞30分钟-96小时。

在本发明的另一方面，提供炎症因子的用途，用于制备间充质干细胞或细胞培养物，该间充质干细胞或细胞培养物能用于预防、缓解或治疗神经退行性疾病或保护神经细胞，所述的炎症因子是IFN-γ和TNF-α。

在本发明的另一方面，提供一种提高间充质干细胞的预防、缓解或治疗神经退行性疾病功能的方法，用炎症因子处理间充质干细胞；所述的炎症因子是IFN-γ和TNF-α。在一个优选例中，所述的方法还包括：在所述的间充质干细胞中过表达吲哚胺2,3-双加氧酶或提高吲哚胺2,3-双加氧酶活性。

在本发明的另一方面，提供一种吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)或其上调剂(包括激动剂、促进剂等)的用途，用于制备提高间充质干细胞在预防、缓解或治疗神经退行性疾病或保护神经细胞中的功效的组合物。

在另一优选例中，所述的吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的上调剂包括(但不限于)：过表达吲哚胺2,3-双加氧酶的重组质粒、炎症因子。

在本发明的另一方面，提供吲哚胺2,3-双加氧酶的代谢产物的用途，用于制备预防、缓解或治疗神经退行性疾病或保护神经细胞的药物，所述的代谢产物是犬尿喹啉酸(Kynurenic acid，KYNA)。

在本发明的另一方面，提供一种筛选提高间充质细胞在预防、缓解或治疗神经退行性疾病或保护神经细胞中的功效的潜在物质的方法，包括：

(1)将候选物质与表达吲哚胺2,3-双加氧酶的体系接触；

(2)检测候选物质对吲哚胺2,3-双加氧酶的影响；

若所述候选物质可提高吲哚胺2,3-双加氧酶的表达、活性或分泌，则表明该候选物质是可用于提高间充质细胞在预防、缓解或治疗神经退行性疾病或保护神经细胞中的功效的潜在物质。

在一个优选例中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达吲哚胺2,3-双加氧酶的体系中；和/或步骤(2)包括：检测测试组的体系中吲哚胺2,3-双加氧酶的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达吲哚胺2,3-双加氧酶的体系；如果测试组中吲哚胺2,3-双加氧酶的表达、活性或分泌在统计学上高于(优选显著高于，如高20％以上，较佳的高50％以上；更佳的高80％以上)对照组，就表明该候选物质是可用于提高间充质细胞在预防、缓解或治疗神经退行性疾病或保护神经细胞中的功效的潜在物质。

在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在另一优选例中，所述方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于抑制炎症性疾病有用的组合物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、细胞移植前后阿朴吗啡诱导的帕金森病小鼠旋转行为变化。

a、干细胞移植PD小鼠的实验流程图。

b、细胞移植后阿朴吗啡诱导的PD小鼠的旋转次数。

c、免疫组化方法检测酪氨酸羟基化酶(TH)在纹状体(STR)和黑质区(SN)内的表达水平。

图2、促炎因子预处理的MSCs及其细胞上清对SH-Sy5y人神经元细胞系的神经保护作用。利用Transwell，将促炎因子预处理的MSCs与SH-Sy5y共培养过夜后，加入6-OHDA孵育8h，再进行检测。

a，b，CCK8检测SH-Sy5y细胞的存活率。

c，采用Annexin V和7-AAD检测SH-Sy5y的细胞调亡。

图3、GFP标记的MSCs在小鼠脑内的追踪。DAPI用来标记脑组织内的细胞核。

图4、促炎因子预处理的MSCs(pMSCs)移植降低PD小鼠脑组织纹状体区的氧自由基(a)和一氧化氮的水平(b)。

图5、pMSCs对PD小鼠抗氧化应激反应的影响，以超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性，谷胱甘肽(GSH)含量为指标。

图6、pMSCs对神经细胞SH-sy5y的氧化应激反应的影响。将神经细胞与MSCs共培养过夜后，加入6-OHDA孵育18小时后，利用CellROX^TM染料检测细胞内活性氧的累积(a)，利用试剂盒检测神经细胞SOD的酶活以及GSH的含量(b)。

图7、色氨酸代谢通路。

图8、色氨酸代谢通路关键酶在人源MSCs中的表达及代谢产物的水平。

a.realtime-PCR检测炎症因子IFN-γ和TNF-α刺激后，色氨酸代谢通路中关键酶在MSCs中的表达水平。

b.炎症因子刺激后色氨酸通路的代谢产物在MSCs培养上清中的浓度。

图9、pMSCs移植后PD小鼠脑组织病损部位色氨酸代谢产物水平的变化。提取PD小鼠脑黑质和纹状体的组织样品，利用高效液相色谱-质谱联用检测色氨酸代谢产物KYN的水平。通过脑右侧与左侧的数值比例来比较治疗组与对照组的变化。

图10、pMSCs与神经细胞SH-sy5y共培养后色氨酸代谢产物(KYN、KYNA、AA、3HAA、3HK)水平的变化。

图11、IDO敲低逆转pMSCs对PD小鼠及神经细胞SH-Sy5y(Sh-sy5y)的神经保护作用。

a.MSCs转染了IDO1siRNA后显著降低IDO1的表达。

b.IDO敲低的MSCs(hMSC IDO KD)在炎症因子刺激后色氨酸代谢产物KYN、KYNA的分泌水平显著降低。

c.IDO敲低的MSCs逆转了pMSCs对PD小鼠疾病的缓解作用。

d，e.IDO敲低使MSCs对神经细胞的抗凋亡及抗氧化应激作用显著减弱。

图12、iNOS-/-鼠源MSCs过表达人源IDO后能够显著缓解小鼠帕金森疾病。

a.MSC-IDO受到炎症因子IFN-γ和TNF-α刺激后可以表达人的IDO；CM表示未用炎症因子刺激的本底水平。

b.高效液相色谱-质谱分析表明，MSC-IDO在炎症因子刺激下能够产生大量代谢产物KYN和KYNA。

c.过表达IDO后mMSC-IDO细胞能够显著缓解小鼠PD疾病。

图13、KYN(a)和KYNA(b)对小鼠PD疾病的缓解作用。

图14、KYNA对神经细胞系SH-sy5y的保护作用。

具体实施方式

本发明人利用动物模型及细胞模型，首次揭示了利用炎症因子处理间充质干细胞后，能够显著地促进间充质干细胞对于神经退行性疾病的缓解作用。本发明还揭示了吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)在间充质干细胞治疗神经退行性疾病上的核心作用。

炎症因子处理的间充质干细胞及其用途及药物组合物

基于本发明人的新发现，本发明提供了一种MSCs，其是炎症因子预处理的MSCs，其制备方法简单，无需转基因操作，不涉及外源基因的插入，给药时不会存在安全性问题。

作为本发明的优选方式，所述的MSCs是经炎症因子预处理的MSCs，所述的炎症因子是IFN-γ和TNF-α；较佳地，所述的预处理包括：将IFN-γ和TNF-α加入MSCs的培养体系中，使得IFN-γ的终浓度可以为1ng/ml～1000μg/ml；使得TNF-α的终浓度可以为1ng/ml～1000μg/ml。

所述的炎症因子作为本领域已知的蛋白质(多肽)，其可以是重组多肽、合成多肽。

作为本发明的优选方式，所述的炎症因子是IFN-γ，其可以具有GenBank登录号NG_015840.1所示的氨基酸序列。

作为本发明的优选方式，所述的炎症因子是TNF-α，其可以具有GenBank登录号AB103618.1所示的氨基酸序列。

经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的、但保留了本发明实施例中所用炎症因子相同功能的炎症因子变体或生物活性片段也包括在本发明中。炎症因子变体或生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，TheBenjamin/Cummings Pub.Co.P224。

任何一种炎症因子的生物活性片段都可以被应用到本发明中。在这里，炎症因子的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的炎症因子的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长炎症因子的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长的炎症因子的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

本发明也可采用经修饰或改良的炎症因子，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的炎症因子。也就是说，任何不影响炎症因子的生物活性的变化形式都可用于本发明中。

基于本发明的新发现，还提供了一种炎症因子预处理的MSCs的用途，用于制备预防、缓解或治疗神经退行性疾病的药物。所述的神经退行性疾病例如是帕金森氏症。其还用于：保护神经细胞，或提高神经细胞的抗氧化应激能力；降低脑纹状体区的氧化应激反应，或提高脑组织病灶部位抗氧化应激能力；或提高脑纹状体区犬尿氨酸(Kynurenine，KYN)或犬尿喹啉酸(Kynurenic acid，KYNA)的水平。

基于本发明的新发现，还提供了炎症因子的用途，用于制备MSCs(或细胞培养物)，该MSCs能用于制备预防、缓解或治疗神经退行性疾病。较佳地，所述的炎症因子是IFN-γ和TNF-α。

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的所述的炎症因子预处理的MSCs，以及药学上可接受的载体。

通常，可将所述细胞配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

如本文所用，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)在间充质干细胞治疗中的作用

本发明人在研究中还发现，IDO在MSCs缓解或治疗神经退行性疾病中发挥了核心作用，能够上调IDO表达的激动剂、因子可以缓解或治疗神经退行性疾病的方法。

同时，IDO表达的升高可以作为筛选治疗效果更强的MSCs的一种方法；IDO代谢物Kynurenic Acid也能够治疗帕金森。

所述的IDO包括全长的IDO或其生物活性片段。优选的，所述的IDO的氨基酸序列可以与GenBank登录号：NG_028155所示的序列基本上相同。

经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的IDO的氨基酸序列也包括在本发明中。IDO或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，TheBenjamin/Cummings Pub.Co.P224。

任何一种IDO的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，IDO的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的IDO的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长IDO的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长IDO的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

本发明也可采用经修饰或改良的IDO，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的IDO。

本发明还提供了一种吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)或其上调剂的用途，用于制备提高间充质细胞在预防、缓解或治疗神经退行性疾病或保护神经细胞中的功效的组合物。

如本文所用，所述的IDO的激动剂包括了促进剂、上调剂等。任何可提高IDO蛋白的活性、维持IDO蛋白的稳定性、促进IDO蛋白的表达、促进IDO蛋白的分泌、延长IDO蛋白有效作用时间、或促进IDO的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于上调IDO的有效物质。

作为本发明的优选方式，所述的IDO蛋白的上调剂包括(但不限于)：在转入细胞后可表达(优选过表达)IDO的表达载体或表达构建物。通常，所述表达载体包含一基因盒，所述的基因盒含有编码IDO的基因及与之操作性相连的表达调控序列。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

试剂

实验动物

C57BL/6品系小鼠，雄性，12～16周，购自中国科学院上海实验动物中心。

实验细胞

人神经母细胞瘤细胞SH-Sy5y：购自中国科学院细胞库。

人脐带来源的MSCs的制备：脐带取自足月健康孕妇，无菌条件下采集脐带后置于冰上保存并立即送于实验室制备。采取组织块贴壁培养法，将新鲜脐带放入大培养皿中，去除羊膜及血管。将分离好的脐带用眼科剪剪成约1mm³大小的组织块，取适量放入无菌培养皿中，覆盖70％培养皿的底面积，加入培养基培养9-11天，可见有长梭形细胞从组织块边缘长出，每2天更换一次培养液，连续换液2次。待贴壁细胞长到瓶底的90％时进行消化传代并进行细胞鉴定。

MSCs培养方法：细胞培养液为低糖DMEM加入10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、10ng/ml bFGF。待细胞长到瓶底的90％时按1：3进行传代，每2天换一次液。

用6-OHDA构建帕金森病单侧损毁小鼠模型

100μl生理盐水溶解6-OHDA，制备50μg/μl 6-OHDA，避光分装-20℃储存。使用前用0.2％维生素C/生理盐水稀释到4μg/μl，并避光置冰上备用。通过6-OHDA立体定向损毁纹状体(STR)来构建PD小鼠模型。通过腹腔注射3％戊巴比妥钠(1.5ml/kg)将小鼠麻醉后，固定于脑立体定向仪上，调节齿杆至合适高度，常规备皮、消毒后，剪开头皮，剥离骨膜，暴露前囟。确定右侧STR损毁坐标：前囟前1.0mm，矢状缝右侧2.0mm，颅骨骨膜下3.0mm。采用小型磨钻在坐标点钻颅，用10μl的微量注射器注射2μl的6-OHDA(4μg/μl浓度)，注射速度1μl/min，留针5min，缓慢退针，缝合手术创口。

阿朴吗啡诱导旋转实验

6-OHDA立体定向注射小鼠右侧STR三周后，腹腔注射阿朴吗啡(0.5mg/kgapomorphine/生理盐水)，2分钟后开始观察并记录小鼠的旋转行为，表现为以左侧后肢为支撑点，向左侧旋转，头尾相接，身体弯曲成环状的快速旋转行为。共记录10分钟。

小鼠帕金森疾病的治疗

人脐带来源的MSCs以2×10⁴/μl密度用PBS重悬，在疾病诱导后第7天每只小鼠注射2.5μl细胞悬液于小鼠纹状体区。同样，在疾病诱导后第7天每只小鼠注射50nmol/5μl的kynurenic acid(KYNA)于纹状体区。纹状体注射坐标：前囟前1.0mm，矢状缝右侧2.0mm，颅骨骨膜下3.0mm。注射速度1μl/min，留针5min，缓慢退针，缝合手术创口。

将kynurenine(KYN)和anthranilic acid(AA)溶解于1N NaOH溶液中，并将pH回调至10，在疾病诱导后第7天开始以75mg/kg分别腹腔注射于帕金森小鼠体内，每天注射一次，连续两周。

小鼠灌注固定取脑及脑组织冰冻切片制备

小鼠经戊巴比妥麻醉后，剪开胸廓，暴露搏动的心脏，将圆润的灌注针头从心尖处插入，稍斜行向右上方插入升主动脉，血管夹将灌注针头固定在升主动脉，剪开右心耳，开放静脉血流出道。首先注入50ml生理盐水，待小鼠肝脏及四肢末端变白后，再注入4％多聚甲醛(PFA)/磷酸盐缓冲液(Phosphatebuffer，PB)50ml，此时可观察到小鼠在多聚甲醛刺激下全身肌肉抽搐，待抽搐停止并肢体及尾巴僵硬后即可取脑。切除小脑，再将大脑的头端及尾端各切除约2mm，从剩余大脑的前后中点处冠状位垂直切开，前半部分包含双侧纹状体区，后半部分则包含中脑黑质部，分别置于4％PFA/PB中4℃固定过夜。次日取出，用PBS冲洗后，重新浸入30％蔗糖/PBS中脱水24小时，待组织块完全沉底后即可取出进行冰冻切片检查。

冰冻切片免疫荧光染色

采用悬浮法染色。切片悬浮在PBS中清洗2次×3min后，悬浮于0.15％TritonX-100/3％BSA/PBS稀释的合适浓度的一抗，4℃过夜。第二天PBS中悬浮洗去一抗，3次×5min，然后悬浮于PBS稀释的合适浓度的荧光标记二抗中，室温避光孵育1小时，PBS 3次×5min洗去二抗。小心将切片吸附到APES涂胶玻片上，室温放置干燥，封片剂封片，荧光显微镜下观察拍照，置于4℃保存。

冰冻切片免疫组化染色

同免疫荧光染色，采用切片悬浮法染色，一抗4℃孵育过夜后，PBS 3次×5min清洗，加入生物素标记的二抗，37℃孵育1h，PBS 3次×5min清洗后再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的生物素卵白素复合物37℃孵育1h，PBS 3次×5min清洗，加入DAB显色室温1～5min。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察。

荧光定量PCR检测基因的表达情况

抽提细胞中的RNA使用Qiagen公司Rneasy Mini Kit。cDNA的合成使用Qiagen公司的Sensiscript RT Kit。获得逆转录产物-cDNA之后，进行荧光定量PCR检测基因的表达情况。引物序列如表1。

表1、Real-time PCR引物序列

hu-IDO1-FW912	ATTTGTCTGGCTGGAAAGGCA	SEQ ID NO:1
			hu-IDO1-RV914	CAAAGCACTGAAAGACGCTGC	SEQ ID NO:2
hu-KAT1-FW595	GTCGTCCTGTGTTTGTGTCCCT	SEQ ID NO:3
			hu-KAT1-RV696	GCTTTGGTGCGTGATGTGAA	SEQ ID NO:4
hu-KAT2-FW469	TGGCAGCCAACAAGGTCTTT	SEQ ID NO:5
			hu-KAT2-RV599	CCCACTTTCATCACTGGCAAC	SEQ ID NO:6
hu-KYNase-FW870	TTGGCTTTGATCTAGCACATGC	SEQ ID NO:7
			hu-KYNase-RV985	CATGAATGAAGGCACCAGCA	SEQ ID NO:8
hu-KYNOHase-FW1165	TGCGAGCACATGTCAACTCAA	SEQ ID NO:9
			hu-KYNOHase-RV1303	TTTGCCAATGCCAACGCT	SEQ ID NO:10
hu-3HAO-FW200	CCAGGAAGGACTATCACATCGA	SEQ ID NO:11
			hu-3HAO-RV301	TATCTCTCCCTGCCGAATGAC	SEQ ID NO:12
hu-QPRTase-FW950	CTCCAGTGCCCAAAATCCACT	SEQ ID NO:13
			hu-QPRTase-RV1061	AGTGCCAAATGTGCCCCAT	SEQ ID NO:14

高效液相色谱/质谱仪联用检测犬尿氨酸途径代谢产物

流动相：A：0.1％甲酸-水；

B：0.1％甲酸-乙腈；

梯度：10min；

t(min)	流速(ml/min)	％B
			0.00	0.2	5
5.00	0.2	50
			6.00	0.2	90
7.00	0.2	90
			8.00	0.2	5
10.00	0.2	5

柱温：25℃。

质谱仪参数：

Sheath gas flow(arb)：30；

Auxiliary gas flow(arb)：10；

Spray voltage：3.9kV；

Ion transfer tube tempatature：320℃；

Vaporizer tempatature：300℃。

采取一级质谱全扫描，FT质量分析器，正离子模式，分辨率15000，提取离子流mass tolerance：10ppm。

Transwell体系检测MSCs对6-OHDA诱导的SH-Sy5y细胞凋亡的影响

使用96孔的Transwell(膜孔径为4μM)培养技术，下层培养SH-Sy5y，待细胞长到孔底的80％左右，将用炎症因子(10ng/ml的IFN-γ+10ng/ml的TNF-α)预处理过夜的MSCs加入Transwell的上层培养孔中。共培养6小时，加入终浓度为50μM的6-OHDA，培养18小时。弃去上层细胞后，向下层细胞中加入CCK8进行细胞活力的检测。同时收集细胞，利用AnnexinV和PI进行细胞凋亡的检测。

过表达人源IDO的iNOS-/-鼠源MSCs(mMSC-IDO)的制备

将小鼠iNOS启动子(ATG上游5,050bp基因序列)和人源IDO基因序列(GenBank登录号NG_028155)克隆到去除CMV启动子序列的pCMS-EGFP载体中，使人IDO基因的表达受到小鼠iNOS启动子的调控(图4)，然后将质粒稳定转染到iNOS基因缺失的小鼠MSC细胞内，从而得到“人源化”的MSCs(以下称为IDO-MSCs)(参见Cancer Research，2014；74:1576-1587)。其中用于扩增人源IDO的cDNA全长的引物序列如下：

Forward：5’-AATTTCTCACTGCCCCTGTG-3’(SEQ ID NO:15)；

Reverse：5’-AATGGGTAATGACAGGAATGC-3’(SEQ ID NO:16)。

统计学数据分析

两组之间的基因表达差异以Mann-Whitney U检验分析。各组之间的差异以Student’s T检验，两组间的关联采用线性回归分析。P<0.05被认为有统计学意义。

实施例1、炎症因子预处理的MSCs(Cytokine-primed MSCs，pMSCs)能够显著缓解小鼠帕金森疾病(PD)

1、pMSCs细胞移植对小鼠PD疾病的缓解作用

促炎因子(IFN-γ+TNF-α)预处理的MSCs制备：以10ng/ml终浓度的IFN-γ和10ng/ml终浓度的TNF-α加入到MSCs培养基中，处理12-24小时，获得促炎因子预处理的MSCs，即pMSCs。

为模拟体内免疫环境对MSCs的影响，拟采用促炎因子体外预处理细胞的方法，在接近体内治疗的实际情况的情形进行实验。PD小鼠经过6-OHDA纹状体注射后1周，同侧纹状体注射人脐带来源的MSCs(注射量为5×10⁴个细胞/只)，以PBS作为对照，两周后腹腔注射阿朴吗啡进行旋转检测。结果如图1b所示，与正常培养的MSCs比较，促炎因子(IFN-γ+TNF-α)预处理的MSCs(pMSCs)能够有效降低PD小鼠的旋转次数，显著缓解疾病。

采用免疫组化技术检测酪氨酸羟基化酶(TH)在纹状体和黑质区内的表达水平，结果表明pMSCs能够显著提高黑质区和纹状体内多巴胺能神经元的存活，如图1c。

同时，免疫组织化学染色发现，pMSCs治疗后小鼠脑黑质和纹状体区的酪氨酸羟化酶的表达水平有一定程度的回复(图2)。

这些结果表明，促炎因子(IFN-γ+TNF-α)预处理的人源MSCs能够显著缓解小鼠PD疾病。

2、pMSCs对神经细胞SH-Sy5y的神经保护作用

SH-Sy5y是人神经瘤母细胞系，采用6-OHDA刺激可以作为PD体外细胞模型。实验中，利用Transwell体系，检测MSCs是否对6-OHDA诱导的SH-Sy5y细胞凋亡具有保护作用。

结果表明，促炎因子(IFN-γ+TNF-α，终浓度分别为10ng/ml)预处理的MSCs能够显著提高SH-Sy5y细胞存活率，其培养上清也具有相似的作用效果。

同时发现，促炎因子(IFN-γ+TNF-α，终浓度分别为10ng/ml)预处理的MSCs可以缓解6-OHDA诱导的SH-Sy5y细胞调亡。

3、MSCs在PD小鼠脑组织内的存活率低下

本发明人采用病毒转染的方法使MSCs过表达GFP蛋白，从而可以利用GFP进行MSCs的标记。随后将GFP标记的MSCs注射入小鼠的脑纹状体区，在不同时间点观察MSCs在PD小鼠脑内的迁移和存活情况。

结果发现，MSCs大量聚集在注射部位即纹状体区，在注射后7天，仍能观察到一定数量的细胞，但数量已明显减少，注射后14天在脑组织内几乎很难找到MSCs细胞，表明植入的人源MSCs能够在小鼠脑内短期存活，不具有明显的迁移能力。这提示，MSCs在小鼠脑内有限的迁移和存活能力有可能不足以分化成神经元修复受损的神经(图3)。

该实验排除了移植的MSCs在脑内分化为神经元进而修复受损神经的可能性，可以间接支持本发明中的MSCs的旁分泌的治疗效果。

实施例2、炎症因子预处理的MSCs对PD小鼠氧化应激的影响

1、pMSCs移植显著降低PD小鼠脑组织纹状体区的氧化应激反应

为了检测pMSCs(制备方法同实施例1)对PD小鼠脑组织区氧化应激水平的影响，本发明人提取了对照组和治疗组PD小鼠的脑纹状体的组织样品，检测样品中总自由基包括ROS、RNS等的水平。

结果发现，注射6-OHDA后，小鼠脑纹状体区的ROS/RNS水平显著提高，当移植入pMSCs后，ROS/RNS的水平恢复到正常小鼠水平(图4a)。同样，本发明人也检测了各组样品中的一氧化氮(NO)的含量，结果与ROS/RNS的变化趋势相似(图4b)。这些结果表明，pMSCs移植显著降低PD小鼠脑纹状体区的氧化应激反应。

2、pMSCs移植显著提高PD小鼠抗氧化应激能力

为了检测pMSCs对PD小鼠脑组织区抗氧化应激能力的影响，本发明人提取了对照组和治疗组PD小鼠的脑纹状体的组织样品，检测抗氧化应激相关分子的含量或酶活。

结果发现，与对照组比较，治疗后小鼠病灶部位的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的酶活力显著提高，谷胱甘肽(GSH)的含量也明显增加(图5)。

这些结果表明，pMSCs能够显著提高PD小鼠脑组织病灶部位的抗氧化应激能力。

3、pMSCs提高神经细胞系SH-sy5y的抗氧化应激能力

体外实验中，本发明人利用transwell培养体系，将SH-Sy5y与MSCs或pMSCs进行共培养，在细胞共培养6小时后加入终浓度为50uM的6-OHDA培养18小时后，检测SH-Sy5y的细胞活性以及胞内活性氧(ROS)的水平。

结果显示，pMSCs能够显著降低6-OHDA引起的SH-Sy5y胞内活性氧(ROS)的累积(图6a)，同时能够显著提高SH-sy5y细胞的SOD酶活，并且提高谷胱甘肽的含量(图6b)。

上述结果表明，pMSCs能够提高神经细胞SH-sy5y的抗氧化应激能力。

实施例3、炎症因子预处理的MSCs通过IDO发挥神经保护作用

1、人源MSCs的Kynurenine pathway(KP)的鉴定

有证据表明，犬尿酸途径(kynurenine pathway，KP)是色氨酸代谢的主要路径，其中，吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)是色氨酸分解代谢(犬尿氨酸途径)中催化起始反应的酶，并且是该过程的限速酶，将色氨酸转化为N-formylkynurenine，随后分解为一系列统称为kynurenines的代谢产物，如图7所示，主要包括犬尿酸(kynurenine，KYN)，犬尿喹啉酸(kynurenic acid，KYNA)，邻氨基苯甲酸(anthranilic acid，AA)，3羟犬尿氨酸(3-hydroxykynurenine，3HK)，3羟邻氨苯甲酸(3-hydroxyanthranilic acid，3HAA)，喹啉酸(quinolinic acid，QUIN)以及2-吡啶甲酸picolinic acid(PIC)。其中，KYNA和QUIN在神经系统内可作为神经递质发挥作用，KYNA作为NMDA受体的拮抗剂，具有神经保护的作用。相反，QUIN是NMDA受体的激动剂，具有神经毒性。有研究发现，3HK和3HAA能够产生大量的氧自由基(ROS)，从而导致神经细胞的凋亡和坏死。QUIN是3-HK与3-HAA的下游代谢产物，这一分支的过度活化与很多神经退行性疾病如帕金森，阿尔兹海默等的发生密切相关。已有研究人员在神经退行性病患脑组织内发现了KP代谢途径的异常，尤其是KP代谢产物中KYNA和QUIN间的失衡。另有研究证明，将KYN注射入小鼠体内，能够缓解PD症状，这被认为是KYN转化为KYNA后发挥的神经保护作用导致的。通常，KP途径主要存在于巨噬细胞和小胶质细胞内，在炎症因子或LPS的刺激下，IDO表达显著上调，KP代谢产物大量产生，进而发挥免疫调节等生理作用。但对于MSCs，这一代谢途径尚未被完全鉴定。

本发明人首先利用realtime-PCR的分析方法检测了MSCs的KP途径中关键酶的表达情况，以人原代巨噬细胞作为阳性对照。结果如图8a所示，在炎症因子IFN-γ(终浓度10ng/ml)和TNF-α(终浓度10ng/ml)的刺激下，IDO1和KYNase表达明显上调，KATI和KATII在有无因子刺激下均有一定程度的表达。相较于巨噬细胞，MSCs表达极低水平的KYNOHase和HAO，这提示人源MSCs很有可能缺失产生3HK和3HAA的代谢分支。

接下来，本发明人利用高效液相色谱-质谱技术检测细胞培养上清中各代谢产物的水平。结果如图8b所示，MSCs在炎症因子刺激下，产生大量的KYN，KYNA和AA，而相应的3HAA和3HK则检测不到。这表明，人源MSCs的KP途径缺失产生神经毒性的QUIN的代谢分支，相反，会产生大量具有神经保护作用的代谢产物KYNA。提示介导了MSCs在小鼠PD上的缓解作用。

2、pMSCs移植后PD小鼠脑组织病损部位KP代谢产物水平的变化

如实施例1相同的方法对6-OHDA诱导的PD模型小鼠移植pMSCs或MSCs细胞。

提取对照组和治疗组PD小鼠的脑黑质和纹状体的组织样品，利用高效液相色谱-质谱检测KP的相关代谢产物水平。

结果发现，移植pMSCs后，小鼠脑纹状体内KYN的水平明显提高，如图9。

3、pMSCs与神经细胞SH-sy5y共培养后KP代谢产物水平的变化

SH-sy5y与MSCs共培养体系及培养方法见实施例1(2)的方法。

本发明人检测了SH-sy5y与MSCs共培养体系中KP代谢产物的水平，与体内实验结果相似，加入pMSCs后，共培养体系内的KYN，KYNA的水平显著提高。

而加入6-OHDA后，却检测不到AA。这有可能6-OHDA对负责产生AA的酶KYNase有抑制作用。另外，与之前结果相似，在细胞共培养上清中仍然检测不到3HAA和3HK(图10)。

KYN和KYNA水平的显著升高提示，pMSCs通过这两个代谢产物发挥神经保护作用。

4、IDO敲除逆转pMSCs对PD小鼠及神经细胞SH-Sy5y的神经保护作用

为了验证炎症因子(IFN-γ+TNF-α)预处理的MSCs是否通过高表达的IDO发挥神经保护作用，本发明人采用病毒转染的方法将特异性针对IDO的siRNA(sc-45939-c，Santa Cruz biotechnology)以及对照siRNA(sc-108080，SantaCruz biotechnology)转入MSCs细胞中。

结果如图11所示，特异性针对IDO的siRNA可以显著下调IDO的表达水平(图11a)。高压液相色谱-质谱分析表明，转入IDO特异siRNA的MSCs细胞(IDO KD)在炎症因子的刺激下，与对照细胞相比，KYN、KYNA的水平显著降低(图11b)。

将细胞移植入PD小鼠脑内，通过动物行为学检测发现，IDO基因敲低使MSCs细胞失去了缓解小鼠PD疾病的能力(图11c)。

将MSCs与神经细胞Sh-sy5y共培养，结果发现，IDO基因敲低的MSCs丧失了清除6-OHDA引起的氧自由基以及保护神经细胞抵抗凋亡的作用(图11d，e)。

5、iNOS-/-鼠源MSCs过表达人源IDO后能够显著缓解小鼠帕金森疾病

本发明人将鼠源MSCs细胞的iNOS基因置换成人的IDO基因，从而模拟人的MSCs，即将小鼠iNOS启动子和人源IDO基因序列克隆到质粒，使人IDO基因的表达受到小鼠iNOS启动子的调控，然后将质粒稳定转染到iNOS基因缺失的小鼠MSCs细胞内，从而得到“人源化”的MSCs(以下称为mMSC-IDO)。在该细胞中，人IDO基因的表达受到小鼠iNOS基因启动子的调控，从而达到模拟人MSCs的目的。

当mMSC-IDO受到炎症因子IFN-γ(10ng/ml)和TNF-α(10ng/ml)刺激后可以表达人的IDO(图12a)。

高效液相色谱-质谱分析表明，在炎症因子刺激下能够产生大量代谢产物KYN和KYNA(图12b)。

将mMSC-IDO细胞及对照细胞移植入PD小鼠脑纹状体区，通过动物行为学检测发现，与对照细胞相比，过表达IDO后mMSC-IDO细胞能够显著缓解小鼠PD疾病(图12c)。

上述结果证明，IDO及其代谢产物在介导MSCs的神经保护中的关键作用。

实施例4、KP代谢产物对小鼠PD疾病及神经细胞的作用

1、KYNA和KYN能够显著缓解小鼠PD疾病

由上述实验结果，本发明人发现人源MSCs由于KYN-OHase和3HAO表达量极低而导致其KP代谢途径中缺失产生神经毒性的QUIN的代谢分支。由于体内的KYN在酶KATI和KATII的作用下会转化为KYNA，因此，MSCs产生的KYN和KYNA会赋予其显著的神经保护作用。事实上，本发明人对IDO的基因敲低以及过表达实验已经证实了这一点。那么对于MSCs分泌出来的KYN、KYNA以及AA，哪个代谢产物介导了MSCs的体内作用。

为了解决上述问题，本发明人将代谢产物分别注入PD小鼠体内，检测其对PD疾病的影响。KYN及AA采取腹腔注射的方式，而KYNA由于不能穿越血脑屏障，本发明人采取脑纹状体原位注射的方式。在疾病诱导第7天开始腹腔注射KYN及AA，结果如图13a所示，KYN能够显著降低阿朴吗啡诱导的PD小鼠的旋转圈数，AA没有明显效果。同样在疾病诱导第7天脑纹状体注射KYNA，结果发现，KYNA同样能显著缓解PD疾病，如图13b。

2、KYNA对神经细胞系SH-sy5y的保护作用

为了验证KYNA的神经保护作用，本发明人将不同剂量的KYNA加入SH-sy5y培养液中，随后加入6-OHDA(终浓度50μM)，利用CCK8检测细胞活性。

结果如图14所示，KYNA能够显著缓解6-OHDA对SH-sy5y的毒性作用，对其具有神经保护作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种间充质干细胞或细胞培养物，其特征在于，所述的间充质干细胞是炎症因子预处理的间充质干细胞，所述的炎症因子是IFN-γ和TNF-α。

2.如权利要求1所述的间充质干细胞或细胞培养物，其特征在于，所述的预处理包括：

将炎症因子加入间充质干细胞的培养体系中，使得炎症因子IFN-γ的终浓度为：1ng/ml～1000μg/ml；炎症因子TNF-α的终浓度为1ng/ml～1000μg/ml。

3.如权利要求1所述的间充质干细胞或细胞培养物，其特征在于，所述的间充质干细胞还高表达吲哚胺2,3-双加氧酶。

4.权利要求1～3任一所述的间充质干细胞或细胞培养物的用途，用于制备预防、缓解或治疗神经退行性疾病或保护神经细胞的药物。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的神经退行性疾病是：帕金森病、帕金森综合征。

6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的药物还用于：

提高神经细胞的抗氧化应激能力；

降低脑纹状体区的氧化应激反应，或提高脑组织病灶部位抗氧化应激能力；或

提高脑纹状体区犬尿氨酸或犬尿喹啉酸的水平。

7.一种用于预防、缓解或治疗神经退行性疾病或保护神经细胞的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物中包含权利要求1～3任一所述的间充质干细胞或细胞培养物。

8.一种制备权利要求1所述的间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的方法包括：将炎症因子加入间充质干细胞的培养体系中，使得炎症因子IFN-γ的终浓度为：1ng/ml～1000μg/ml；炎症因子TNF-α的终浓度为1ng/ml～1000μg/ml，预处理细胞30分钟-96小时。

9.炎症因子的用途，用于制备间充质干细胞或细胞培养物，该间充质干细胞或细胞培养物能用于预防、缓解或治疗神经退行性疾病或保护神经细胞，所述的炎症因子是IFN-γ和TNF-α。

10.一种提高间充质干细胞的预防、缓解或治疗神经退行性疾病功能的方法，其特征在于，用炎症因子处理间充质干细胞；所述的炎症因子是IFN-γ和TNF-α。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，还包括：在所述的间充质干细胞中过表达吲哚胺2,3-双加氧酶或提高吲哚胺2,3-双加氧酶活性。

12.一种吲哚胺2,3-双加氧酶或其上调剂的用途，用于制备提高间充质干细胞在预防、缓解或治疗神经退行性疾病或保护神经细胞中的功效的组合物。

13.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的神经退行性疾病是：帕金森病、帕金森综合征。

14.如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的吲哚胺2,3-双加氧酶的上调剂包括：过表达吲哚胺2,3-双加氧酶的重组质粒、炎症因子。

15.吲哚胺2,3-双加氧酶的代谢产物的用途，用于制备预防、缓解或治疗神经退行性疾病或保护神经细胞的药物，所述的代谢产物是犬尿喹啉酸。

16.一种筛选提高间充质细胞在预防、缓解或治疗神经退行性疾病或保护神经细胞中的功效的潜在物质的方法，其特征在于，所述的方法包括：

(1)将候选物质与表达吲哚胺2,3-双加氧酶的体系接触；

(2)检测候选物质对吲哚胺2,3-双加氧酶的影响；

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到表达吲哚胺2,3-双加氧酶的体系中；和/或

步骤(2)包括：检测测试组的体系中吲哚胺2,3-双加氧酶的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达吲哚胺2,3-双加氧酶的体系；

如果测试组中吲哚胺2,3-双加氧酶的表达、活性或分泌在统计学上高于对照组，就表明该候选物质是可用于提高间充质细胞在预防、缓解或治疗神经退行性疾病或保护神经细胞中的功效的潜在物质。