CN104755610A - 脂肪组织细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及源自成体干细胞或祖细胞、源自成体白色脂肪组织(WAT)的褐色脂肪组织(BAT)细胞，以及涉及衍生这种细胞的方法。

Description

脂肪组织细胞
技术领域
本发明涉及褐色脂肪组织(BAT)细胞，以及它们的生产方法。尤其是，本发明涉及源自人类成体干细胞，例如脂肪来源干细胞，的BAT细胞。
背景技术
肥胖症正成为全球人口日益关注的问题，因为更加意识到肥胖症对健康的负面影响。重度肥胖症，其中一个人超出理想体重50公斤或更多，尤其引起严重健康问题的显著风险。因此，大量的注意力被聚焦到肥胖症患者的治疗上。
食欲抑制通路已经成为抗肥胖症药物开发的焦点，因为肥胖症被认为是由于过多的能量摄入超过了能量消耗。然而限制热量摄入却诱导了抵抗体重减轻的代偿性适应。由于营养感应神经元与认知和行为成分之间有交叉作用(cross talk)，抑制食欲往往产生不能接受的精神副作用。然而，由于调节脂肪生成的复杂性，较少有其它通路被得以探索。
糖尿病是一种代谢疾病，其特征是血糖水平高且结合有相对的胰岛素缺乏和胰岛素抵抗。大多数糖尿病患者患有2型糖尿病，这也称为迟发性糖尿病，并且这种类型糖尿病的发病率在过去的几年中呈螺旋上升，这和肥胖症的增加相一致。
BAT的功能是将食物中的能量转化为热量；生理学上而言，产生热量以及最终在代谢效率上的降低是有重要意义的。当有机体需要额外的热量时，例如出生后、进入发热状态期间、以及从休眠状态清醒期间，便激活褐色脂肪组织来产生热量，并且通过下丘脑起始的通路来中枢控制产热率。
BAT丰富存在于啮齿动物和人类新生儿中，但成体人类具有很少的BAT并且量随年龄而减少。BAT在啮齿动物和人类中的量与肥胖症呈负相关，从而促进BAT形成和功能的基因存在缺陷的啮齿动物易于肥胖，并且在人类中在更年轻更瘦的个体中比更年长超重受试者中观察到更大量的BAT。因此，预期在肥胖症个体中激活BAT组织或增加BAT质量的方法对减重和肥胖症相关发病率的易感性有积极的作用。因此，已提出将BAT引入成体人类来对抗肥胖症的一些提议。例如，美国专利No.6,645,229指出“褐色脂肪组织(BAT)在调节能量消耗中发挥作用并且刺激BAT可导致患者变瘦。BAT激活受到交感神经系统和其它生理影响例如激素和代谢的调节。当被激活时，BAT从血液供应中去除游离脂肪酸(FFA)和氧用于产生热量”。新生儿BAT和成体人类的BAT在某些特性方面表现出差异。例如，新生儿或经典BAT源自表达Myf5的肌样细胞谱系。所谓的米色或白棕色(brite)脂肪来自不同的谱系，来自白色脂肪组织(WAT)。最近，已经提出所有成体人类的BAT是米色/白棕色，而不是经典的BAT(Wu等人，2012 Cell 150：1-11)。
激活或增加BAT的质量对BAT相关疾病也有积极的作用-特别是糖尿病(Vegiopoulos等人,2010,Science 328(1158-61)；Seale等人2001,JCI 121(96-105)；Bostrom等人2012 Nature 481(463-68))。在最简单的场景中，BAT可以通过减少肥胖症因而减少WAT囤积(depots)，从而减少其诱导的胰岛素抵抗来改善II型糖尿病。然而BAT也能改善代谢功能障碍，这超出了仅仅通过减少肥胖症所预期的。这已得到事实证明，即甚至当小鼠没有减重时，增加的BAT仍改善超重小鼠的胰岛素敏感性。已显示BAT也能够直接影响胰岛细胞响应葡萄糖时的胰岛素分泌，改善葡萄糖动态平衡(Guerra等人,JCI,2001,108(1205-1213))。
此外，最近显示小鼠中的BAT移植强烈改善肥胖的、胰岛素抵抗小鼠的代谢条件(Liu等人(2013).Cell research,1–4；Stanford等人(2013)The Journal of clinical investigation,123(1),215–223)，并在链脲霉素诱导的糖尿病小鼠中恢复正常血糖及糖耐量(Gunawardana&Piston,2012Diabetes,61(3),674–82)。除了充当葡萄糖和能量消耗器(sink)外，褐色脂肪细胞也很可能(在局部和/或在循环中)分泌对葡萄糖代谢/胰岛素敏感性和总能量平衡具有有益效果的因子，如IL-6(Stanford等人2013)。
WO2009137613描述了一种用于产生BAT的方法，这种方法基于这样的发现，即用一种或更骨形态发生蛋白(BMP)处理的干细胞抗原-1阳性(Sca-1+)的祖细胞分化成BAT细胞或者向着BAT细胞分化。这些BAT细胞被描述为真正的BAT细胞，其具有响应打开BAT细胞产热程序的儿茶酚胺刺激的完整能力。
Nishio等人Cell Metabolism 16:394,2012描述了从人多能干细胞产生BAT细胞。产生的BAT是经典的，而不是白棕色谱系。
最近，WO2013/123214描述通过将乳内动脉源细胞(internalmammary artery-derived cells)(iMAC)暴露于指导脂肪生成的介质中从动脉源细胞产生人类BAT。
发明内容
由于设计用于治疗性目的的BAT旨在被引入到患者中，因而能够从患者自身组织产生BAT将是有利的-即开发自体治疗。因此，不适合使用ES细胞或胚胎/胎儿干细胞，尽管它们具有潜在的产生BAT的潜能，理由是BAT在婴儿中丰富但在成体中较少。由于常规上通过吸脂除去成体脂肪组织，能够从源自WAT的细胞产生BAT将是有利的。最后，由于BAT旨在被重新引入到人体中，应避免使用转基因。
因此，在本发明的第一方面，提供了一种分化的褐色脂肪组织(BAT)细胞，其产生自脂肪来源成体干细胞。我们已经开发出一种从存在于WAT中的脂肪来源干细胞(ADSC)开始，从成体WAT产生BAT细胞的规程。所述成体干细胞不是转基因的。
在一个实施方式中，所述成体干细胞是脂肪来源干细胞(ADSC)或祖细胞，例如前脂肪细胞或adMSC(脂肪组织来源的间充质干细胞)。
在一个实施方式中，基础UCP1的表达水平是白色脂肪组织(WAT)表达水平的至少10倍。UCP1的表达是BAT表型的一般标记物。在一个实施方式中，基础UCP1的表达是WAT中基础UCP1表达的至少20倍。UCP1的表达能够被cAMP及其类似物进一步诱导。
一般情况下，在根据本发明源自成体干细胞的细胞培养物中测量基因表达水平。优选地，该数字是相对于总细胞数进行标准化的，并且因此是等量(equivalent)总细胞数的培养物之间做出的相对比较。例如，通过将结果相对于培养物中的细胞数进行平均，能够计算每100个细胞或者每个细胞的表达水平。通过培养物中管家基因的表达水平推断细胞数。管家基因在所有的细胞中以相同水平表达。因此，每个培养物中基因表达水平相对于管家基因表达水平进行标准化，允许在不同的培养物中进行比较。
在一个实施方式中，BAT培养物以基础水平表达PDRM16，所述基础水平相较于WAT是提高的。在一些实例中，以比WAT中的基础水平高约2倍的水平表达PDRM16。
在一个实施方式中，BAT培养物以基础水平表达PPARGC1a，所述基础水平相较于WAT中的基础表达水平是提高的。例如，以比WAT中的水平高约20倍的水平表达PPARGC1a；在一些实例中，以比WAT中的水平高约40倍的水平表达PPARGC1a。
在一个实施方式中，当和白色脂肪组织(WAT)相比时，BAT培养物不以提高的水平表达CIDEA。经典BAT基因(Eva1、FBXO31、EBF3、ZIC1)和米色特异性基因(TMEM26、Tbx15、Shox2、HoxC9)的比较表明米色而非经典BAT谱系用于本发明的BAT细胞。在一个实施方式中，在米色脂肪中以更高水平表达的CD137，在本发明的细胞中没有检测到。
在其它实施方式中，相较于WAT而言，观察到一个或更多如下基因的提高的基础表达：TBX15、FBXO31、EBF3、SHOX2和TMEM26。
根据本发明的第二方面，提供了一种用于从成体脂肪来源干细胞衍生BAT细胞的方法，包括在间充质干细胞生长介质中培养干细胞，以及将细胞转移至包含Dex、IBMX和BMP-7的介质中。
在一个实施方式中，细胞未转染有转基因。
根据本发明的方法是非常有效的。在一种实施方式中，如通过细胞培养物的针对BAT相关基因(如UCP-1)表达的抗体染色所评估的，20％或更多的干细胞分化成BAT细胞。优选地，25％、30％、40％、50％或更多的干细胞分化为BAT。
在实施方式中的方法，包括将所述干细胞暴露于如下介质组合：
(i)StemPro MSC SFM(invitrogen)和BMP-7；
(ii)DMEM/F12(w Glutamax)、胰岛素、转铁蛋白、BMP-7、三碘甲状腺原氨酸(T3)、地塞米松、罗格列酮和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)；以及
(iii)DMEM/F12(w Glutamax)、胰岛素、转铁蛋白、BMP-7、T3、地塞米松和罗格列酮。
通过更新介质来重复上述步骤(iii)。
有利的，细胞以三天的间隔先后暴露于介质。然而，通过经验分析，针对特定的条件能够确定不同的时间规划。
在一个实施方式中，组分能够以单一的混合物(cocktail)形式进行混合，并用来在单一步骤程序中区分ADSC。此处，这被称为“混合”规程。
在另一实施方式中，该规程包括三个介质组合，如下：
(i)StemPro MSC SFM(invitrogen)；
(ii)DMEM/F12、胰岛素、转铁蛋白、BMP-7、T3、地塞米松、罗格列酮和IBMX；以及
(iii)DMEM/F12、胰岛素、转铁蛋白、T3、地塞米松和罗格列酮。
在所有的介质中，抗生素和/或抗真菌剂能够被用于防止感染。例如，能够使用1％青霉素/链霉素。
在第三方面，本发明提供一种分化的BAT细胞，其是通过根据本发明第二方面的方法所衍生的。在实施方式中，BAT细胞可以是根据本发明第一方面的BAT细胞。
在第四实施方式中，提供根据第一实施方式的分化的BAT细胞，用于治疗患者，其中所述患者患有特征在于过度脂肪组织积累的疾病，其中将所述细胞植入所述患者。
在第五实施方式中，提供一种用于治疗患者的方法，所述患者患有特征在于过度脂肪组织积累的疾病，方法包括将根据第一实施方式的一个或更多细胞植入需要所述治疗的患者中。
附图说明
图1分化17天的脂肪来源干细胞(Lonza)中UCP-1和PRDM16表达的实施例。A)亮视野，b)用抗PDMR16抗体(绿)R&D 1：20染色；c)抗UCP1抗体(红)，SantaCruz；1：100；d)合并PDRM16(绿)、UCP-1(红)和Hoescht(蓝)。×20的放大率。
图2：分化17天的脂肪来源干细胞(Lonza)中UCP-1和PRDM16表达的第二实施例。A)亮视野，b)用抗PDMR16抗体(绿)R&D 1：20染色；c)抗UCP1抗体(红)，SantaCruz；1：100；d)合并PDRM16(绿)、UCP-1(红)和Hoescht(蓝)。×20的放大率。
图3：分化17天的脂肪来源干细胞(Lonza)中UCP-1和细胞色素C氧化酶表达的实施例。A)亮视野，b)用抗UCP-1抗体(绿)；SantaCruz；1：100染色；c)抗Cyt C抗体(红)，Invitrogen；1：100)。×10的放大率。
图4：分化17天的脂肪来源干细胞(Invitrogen)中基因表达的qPCR分析。ADSC和分化的BAT细胞中的表达水平是相对于白色脂肪组织中的表达，将白色脂肪组织中针对每个基因的表达被设定为1。
图5：通过实施例2、3和4的规程所获得的细胞的UCP1蛋白表达的Western印迹分析。
图6：图表表示按照实施例2、3和4所述所衍生的BAT细胞中的qPCR基因表达分析。
图7：按照实施例2、3和4所述所衍生的BAT细胞中的qPCR UCP1基因表达分析，经过肾上腺素信号级联的第二信使cAMP处理。肾上腺素激活(儿茶酚胺)增加BAT活性。肾上腺素激动剂或第二信使(cAMP)强效激活UCP1表达。
图8：用XF Cell Mito Stress测试试剂盒(Seahorse Bioscience)测量耗氧分析，这表明与采用已发表的WAT规程所分化的细胞相比，采用BAT规程所分化的细胞表现出更高的呼吸能力。
具体实施方式
除非另有指明，本发明采用分子生物学、微生物学和重组DNA的常规技术，这属于本领域普通技术人员的能力之内。这种技术在文献中有解释。参见，例如J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版，Books 1-3,ColdSpring Harbor Laboratory Press；Ausubel,F.M.等人(1995和定期的增刊；Current Protocols in Molecular Biology,ch.9,13和16,John Wiley&Sons,New York,N.Y.)；B.Roe,J.Crabtree和A.Kahn,1996,DNAIsolation and Sequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons；M.J.Gait(编),1984,Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IrIPress；以及D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg,1992,Methods ofEnzymology:DNA Structure Part A:Synthesis and Physical Analysis ofDNA Methods in Enzymology,Academic Press。
术语
分化的。根据本发明分化的组织或细胞是一种源自单能、多能(multipotent)、多潜能(pluripotent)或全能细胞成为明确组织类型细胞的细胞，在本发明的情况下是褐色脂肪组织或BAT。
BAT。褐色脂肪组织是具有褐色脂肪优选人褐色脂肪特征的组织，如此处所述褐色脂肪相关基因表达谱所代表的，或者例如Svensson等人Int J Mol Med.2011 Feb；27(2):227-32中代表的，并且其具有褐色脂肪的能量利用谱。BAT通常以高于白色脂肪组织和ADSC BAT前体细胞的水平表达UCP1基因。BAT可能是经典的或白棕色(米色)谱系。经典谱系源自表达Myf5的细胞，其是肌样谱系，而白棕色或米色谱系源自WAT中的细胞。在实施方式中，本发明的BAT细胞是白棕色/米色谱系。
WAT。白色脂肪组织是具有成体白色脂肪特征的组织。优选是人类WAT。
细胞。如此处所指，细胞被定义为能够独立发挥作用的有机体最小结构单元；或者是单细胞有机体，其由一个或更多的核、细胞质和各种细胞器组成，核、细胞质和各种细胞器都被半透的细胞膜或细胞壁所包围。
根据本发明的BAT细胞所来源的起始细胞源自成体人干细胞或祖细胞，优选源自脂肪组织的干细胞或祖细胞。在本发明的一个实施方式中，细胞未进行遗传操作。在一个实施方式中，它们是间充质干细胞。干细胞如下详细定义，并且其是能够产生一种以上的分化细胞类型的全能、多潜能或多能细胞。干细胞可体外分化而产生分化的细胞，其本身可以是多能的或者是分化终末的细胞。体外分化的细胞是通过将干细胞暴露于一种或更多促进细胞分化的试剂而人工产生的细胞。
成体。在本发明的上下文中，胚胎、新生儿和新生期后(post-neonatal)的组织之间显示出差异。新生期后的组织被称为成体。例如，新生期后是指出生1个月后的(人类)婴儿。
转基因。如此处所指，转基因细胞是已经转染或转化有外源基因的细胞。
全能。全能细胞是具有分化为有机体和胚外组织中发现的任何类型体细胞或生殖细胞潜力的细胞。因此，通过一些手段可以从全能细胞衍生任何所需的细胞。
多潜能。多潜能细胞是能够分化成发育中的胚胎和成体有机体中所有细胞类型，但不能分化为胚外组织的细胞。
体的(somatic)。如此处所用，术语“体细胞”具有和本领域所理解的相同含义，即形成有机体身体的任何细胞，而非种系细胞。哺乳动物中，种系细胞(也称为配子)是精子和卵子，两者在受精过程中融合以产生称为合子的细胞，合子发育成整个哺乳动物胚胎。
培养介质。在特定试剂的存在下，通过在培养介质中培养脂肪来源干细胞能够衍生根据本发明的BAT细胞。所述介质可以是用于细胞的扩增和/或传代的培养介质。在某些情况下，培养介质的组成是未知的，因为其包含通常是未知组成的血清。然而，在优选的实施方式中，培养介质的各组分就其量或浓度方面而言是已知的。在一个实施方式中，培养介质可以是适于培养干细胞的无血清介质，例如SFM(Invitrogen)或DMEM/F12。
脂肪来源干细胞(ADSC)。如此处所称，脂肪来源干细胞或ADSC是源自脂肪组织的干细胞。这样的细胞包括脂肪来源的间充质干细胞(adMSC)，以及通常来说脂肪来源的其它多能细胞。ADSC是从Lonza(目录号PT-5006)和Invitrogen(StemPro ADSC试剂盒)可商购获得。adMSC可从PromoCell(目录号C-12978)获得。例如如此处所述，ADSC可分离自WAT。
成体干细胞。如此处所定义的，源自成体的任何干细胞。优选地，成体干细胞是ADSC。
试剂。术语“试剂”指的是被添加(例如外源添加或补充)到包含细胞如adMSC的介质中的实体。试剂通常不存在于细胞或包含细胞的介质中。试剂可以是单一试剂或试剂的组合-如两种或更多不同试剂的组合。
本公开提供一种用于从成体细胞衍生BAT细胞的方法，以及能够通过这种方法获得的BAT细胞。本发明的BAT细胞具有特定的特征，所述特征在此处所述的本申请中是有利的。这些方法包括促进干细胞或祖细胞分化为BAT细胞谱系。更具体的，本公开基于，至少部分基于这样一种发现，即采用限定的条件来自WAT的干细胞或祖细胞能够分化以产生BAT。
细胞
干细胞
在Stem Cells:Scientific Progress and Future Research Directions.Department of Health and Human Services.2001年六月http://www.nih.govlnews/stemcell/scireport.htm中详细描述了干细胞。干细胞是能够分化以形成至少一种有时多种特定(specialised)细胞类型的细胞。
迄今，已经分离出三种类型的哺乳动物多潜能干细胞，或者如果将诱导的多潜能干细胞(iPS细胞)包括在内的话，则四种类型。这些细胞能够产生通常源自胚胎所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞类型。三种干细胞类型是：源自睾丸肿瘤的胚胎癌(EC)细胞；源自植入前胚胎(通常为胚泡)的胚胎干(ES)细胞；和源自植入后胚胎(通常为注定成为性腺一部分的胎儿细胞)的胚胎生殖(EG)细胞。因为这些细胞是多潜能的，因此在指导分化的努力当中它们得到了特别的关注。然而，它们不是本发明的重点。
干细胞也存在于成体有机体中。成体干细胞是存在于分化的(特定)组织中自我更新并能够分化产生更加特定细胞的未分化细胞。因为它们能够从患者的组织获得并用于产生BAT，因此在本发明中使用它们非常理想。除了成体干细胞，有多种类型的祖细胞或前体细胞。这些是其分化潜能被部分受到限制的细胞，并且可能存在于身体的所有组织中-它们能够进行分化，但区别于干细胞的是它们的分化方向(repertoire)并不广泛，并且根据定义，它们不能够自我更新。这些细胞在本发明的上下文中也是有用的。
用于从各种组织获得样本的方法和建立原代细胞系的方法是本领域公知的(见例如，Jones GE,Wise CJ.,"Establishment,maintenance,andcloning of human dermal fibroblasts."Methods Mol Biol.1997；75:13-21)。体细胞系可购自许多供应商如，例如美国组织培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)或PromoCellGmbH、Sickingenstr.63/65，D-69126海德堡。
半分化的细胞
所述细胞可以是祖细胞-例如多能祖细胞-即能够产生功能性BAT细胞。像干细胞一样，祖细胞有分化成特定类型细胞类型的能力。然而，与干细胞不同的是，它们已经更特定了：它们被推进到分化成它们的“靶”细胞。干细胞和祖细胞之间最重要的区别是干细胞能够无限复制，而祖细胞只能够分裂有限次数。大多数祖细胞被描述为单能或多能。这个角度来看，它们可以和成体干细胞相比。但祖细胞被认为处于细胞分化的更远阶段。它们处在干细胞和完全分化的细胞之间的“中心”。它们具有的潜能的类型，取决于它们“亲本”干细胞的类型，也取决于它们的位置(niche)。像干细胞一样，大多数情况它们形成并发展成集落，采用适当的条件它们生长并分化为它们的靶组织。祖细胞发现于成体有机体中，它们作为身体的修复系统发挥作用。它们补充特定的细胞，但也维持血液、皮肤和肠组织。也能够在发育中的胚胎胰腺组织中发现它们。
例如，通过Li等人Experimental Biology and Medicine 2012,237:845-852以及US2012208274中所述的程序，能够从脂肪组织中分离人类脂肪来源干细胞。
细胞培养技术
能够通过任何合适的技术进行细胞培养。此处公开的能被用来从成体干细胞或祖细胞(包括ADSC或adMSC)分化BAT的试剂，可以按顺序或同时添加。
我们此前公开了用于细胞在各种介质中进行先后培养的技术和工具，例如在EP1917349、WO2004031369、EP2491386和EP2464720中。在本发明的上下文中可以使用这种技术，但不是必要的；然后本申请提供前脂肪细胞前体分化成BAT所要求的条件。
因此，能够使用标准培养技术将细胞暴露于此处所述的试剂中，在标准细胞培养板上进行细胞培养。
一种或更多试剂的量(例如，浓度或剂量)以及在细胞培养中的暴露时间足以增加前脂肪细胞前体群中BAT细胞或具有成熟BAT细胞特征的细胞的数目。根据经验技术人员能够确定浓度和暴露时间。
典型地，将细胞暴露于试剂中维持多达三天，例如1天、两天或三天的时间。也可以使用更长的孵育时间。
能够通过测量一个或更多BAT特异性标记物如解偶联蛋白1(UCP1)、细胞死亡诱导DFF45样效应因子A(CIDEA)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ、共激活因子1α(PGC)-1α、和/或PPARγ共激活因子(camp)-1β和/或PRDM-16，来鉴定BAT。用于鉴定BAT的替代方法包括BAT形态学(例如，使用视觉，例如显微镜检查细胞)；或BAT热动力学，如细胞色素氧化酶的活性、测量Na+-K+-ATP酶的酶单位，或者参与BAT生热作用(thermogenesis)的其它酶的分析以及动物移植后的功能分析。
试剂
用在本发明细胞培养中的试剂可以按照任何常规方式(例如在载体系统中)进行配制，以便施用至细胞群。载体可以是胶体系统如脂质体。载体也可以是聚合物，例如生物可降解的、生物相容的聚合物基质。在一些实施方式中，蛋白可被嵌入聚合物基质中仍然保持蛋白完整性。聚合物可以是天然的比如多肽、蛋白质或多糖，或者是合成的比如聚(α-羟基)酸。实例包括例如胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、醋酸纤维素、硝酸纤维素、多糖、纤维蛋白、明胶及其组合制成的载体。在一些实施方式中，聚合物是聚乳酸(PLA)或共聚乳酸/乙醇酸(PGLA)。可以以各种形式和大小制备并分离聚合物基质，包括微球和纳米球。聚合物制剂能够导致治疗性效果的持续时间延长。
然而，通常可将试剂直接加入到细胞培养介质中，并且被吸收到细胞中。
在一些实施方式中，试剂可包括BMP、胰岛素、转铁蛋白、BMP-7、T3、地塞米松、罗格列酮和IBMX中的一种或更多。
BAT的衍生
根据此处所述方法BAT细胞可源自脂肪组织干细胞或祖细胞。例如，如上所述所分离的ADSC能够通过在适于MSC培养的基础介质中进行培养而暴露于试剂。
通过试剂、或一个或更多试剂的组合和/或先后，脂肪来源的干细胞或祖细胞包括adMSC，可能分化成BAT。如上述，所述试剂可以包括胰岛素、转铁蛋白、T3、地塞米松、BMP-7、IBMX和罗格列酮中的一个或更多。在细胞培养介质中使用的T3浓度范围从0.1至2nM；地塞米松的浓度范围从1uM至500nM；IBMX的浓度范围从100uM至1mM；BMP-7的浓度范围从10ng/ml至200ng/ml；罗格列酮的浓度能够在10nM和1mM之间的范围。培养介质可以是任何适于细胞培养物的介质。培养介质的实例包括LDMEM(低葡萄糖DMEM)、HDMEM(高葡萄糖DMEM)和DMEM/F12。培养介质可补充有血清或血清蛋白。或者，细胞可以在不添加血清或血清蛋白的培养介质中生长。合适的介质实例包括SFM(Invitrogen)无血清介质、来自Stem cell Technologies的干细胞基础介质、以及用于细胞培养的其它可市售获得的介质。为了最佳的分化，可每三天更换介质。通过本领域中已知的各种方法监测分化。干细胞和分化处理的细胞之间的参数变化表明经处理的细胞是分化了的。分化期间可使用显微镜直接监测细胞的形态学。作为一个实例，分化中的脂肪细胞可具有BAT脂肪细胞典型的多腔细胞构象，其中脂肪滴分散在整个细胞质中。细胞通常还具有多角的形状。使用本领域熟知的方法对细胞进行免疫染色。尤其是，UCP1是BAT标记物。例如，特异于UCP1的一级抗体可标记有荧光团或发色团以便直接检测。或者，用标记有荧光团或发色团、或连接至酶的二级抗体检测一级抗体。荧光团可以是荧光素、FITC、罗丹明、德克萨斯红、Cy-3、Cy-5、Cy-5.5、Alexa488、Alexa594、QuantumDot525、QuantumDot565、或者QuantumDot653。连接至二级抗体的酶可以是HRP、B-半乳糖苷酶、或荧光素酶。在光学显微镜、荧光显微镜、或共聚焦显微镜下检查标记的细胞。在荧光计或分光光度计中测量细胞或细胞介质的荧光或吸光度。也可以使用RT-PCR或定量实时PCR在信使RNA(mRNA)的水平监测基因表达的变化。可以使用任何BAT标记物。例如，可监测UCP1表达。采用本领域中已知的方法从细胞中分离RNA，并且使用本领域熟知的PCR条件和参数来扩增所需基因产物。可扩增的基因产物包括解偶联蛋白(UCP1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ、共激活因子1α(PGC)-1α、和/或PPARγ共激活因子(PGC)-1β和/或PRDM-16。
BAT增殖
使用市售可获得的介质，如来自Cosmo Bio有限公司的褐色脂肪细胞维持介质，BAT细胞能够在培养中得以增殖。或者，通常可用的培养介质如DMEM，可用于增殖脂肪细胞。
试剂盒
本发明提供用于从脂肪组织来源的干细胞或祖细胞产生BAT细胞的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒可包括脂肪来源的干细胞或祖细胞；能够促进一个或更多干细胞或祖细胞分化成BAT细胞谱系的一种或更多试剂；任选，用于将细胞施用至受试者的装置和/或施用说明书。试剂盒的不同组分可以包装在分开的容器中，并在使用前立即混合。当一个具体试剂盒中包含一个以上试剂时，可以分开包装所述试剂并在使用前分别混合，或包装在一起，如果组合时所得到的混合物的各组分是稳定的。在一个实施方式中，根据本发明的试剂盒包含Dex、IBMX和BMP-7中的两个或更多。在一个实施方式中，试剂盒可包含如上所述的试剂、BMP、胰岛素、转铁蛋白、BMP-7、T3、地塞米松、罗格列酮和IBMX中的两个、三个、四个、五个或六个或更多。
试剂盒还可以包含基础介质，如StemPro SFM、DMEM/F12和/或DMEM。
任选地，试剂盒可以包含从其中可以衍生出BAT细胞的细胞，如前脂肪细胞、或adMSC，以及可以包含用于提取脂肪组织以及从中衍生干细胞的仪器、说明书和试剂。
治疗性的应用
通过本发明的手段衍生的BAT可用于治疗性的应用，用于引入或重新引入到患者以增加个体中褐色脂肪的含量。
用于递送脂肪组织的方法是现有技术已知的。方法可包括向待治疗的受试者中植入BAT细胞。这样的方法可用于治疗患者的肥胖症和胰岛素抵抗，或用于治疗与肥胖症相关的疾病，例如糖尿病、癌症、神经变性和老化。用于植入BAT细胞的方法是本领域中已知的，并包括使用递送系统，其经过配置以允许将细胞引入受试者，如，例如注射器或配备有针的其他递送装置。典型地，BAT细胞在可具有或不具有支架的药用介质或载体、基质或细胞可附着其上的其它可植入装置中(实例包括例如胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、醋酸纤维素、硝酸纤维素、多糖、纤维蛋白、明胶及其组合制成的载体)。
各种施用途径和各种施用位点是本领域技术人员显而易见的，并且包括存在脂肪细胞的任何位点，包括肾包膜下、皮下、中枢神经系统(包括鞘内)、血管内、肝内、内脏内(intrasplanchnic)、腹膜内(包括网模内)和肌内位点。例如，BAT细胞能够植入患者皮下。
本发明优点是植入的细胞能够源自患者自身的细胞，并因此免疫学上是相容的。当使用非免疫学上相容的细胞时，可以施用免疫抑制化合物。
实施例
实施例1
分离人类adMSC
经过择期手术程序，从获自年轻供体的皮下脂肪组织中分离人类adMSC。用磷酸缓冲盐(PBS)洗涤约1.5g的脂肪组织并切碎，然后用0.15％I型胶原酶(Sigma，圣路易斯，MO，美国)在37℃下在水浴摇床(200rpm)中消化30分钟。加入补充有10％胎牛血清、青霉素(50U/mL)和链霉素(50mg/mL)的Dulbecco改良Eagle介质(DMEM)，将胶原酶灭活。含有adMSC的细胞悬液以600g离心5分钟。以2.5×104个细胞的密度将分离的细胞铺板于25cm2细胞培养烧瓶中，并在标准培养介质中于378C以5％CO2进行培养。48小时后，用PBS洗涤培养物除去未附着的细胞，并重新加入新鲜介质。adMSC得以扩增，并具有脂肪生成分化的特征。培养14天后，使用脂肪生成试剂盒(Cyagen Biosciences)通过油红O(Sigma)对脂滴进行染色来确认ADMSC的脂肪生成分化(图1c)。通过向DMEM中添加适量无菌HCl(1mol/L)和NaOH(1mol/L)，并使用市售pH微电极(Lazarlab，洛杉矶，CA，USA)(敏感到0.01个pH单位)进行监测，来制备具有不同pH水平的培养介质。获得具有四种pH水平的介质，包括7.4(标准状态)、7.1(正常IVD)、6.8(轻度退化IVD)和6.5(严重退化IVD)。培养介质在37℃5％CO2保持三天以使pH平衡(CO2依赖性)。世代2的adMSC培养在24孔板中用于细胞增殖分析，或者在25cm2细胞培养烧瓶中用于细胞活力以及基因和蛋白表达的分析。在第3天给细胞重新加入新鲜介质，并在第6天收获用于分析。
实施例2
BAT分化
在标准生长介质(StemPro SFM，Invitrogen)中以30,000个细胞/cm2(第0天)接种脂肪来源干细胞。三天后，并在下述随后的日子里将下列介质制剂加入到细胞中。细胞培养组分是可商购的。BMP7是骨形态发生蛋白7b。培养介质包含青霉素和链霉素(1％)以防止感染。
表1
在第17天固定细胞并分析其BAT基因表达和形态。
结果
图1和2显示在源自ADSC(Lonza)的细胞中的UCP1和PRMD1表达。细胞显示所有的BAT特征。
图3显示在上述所衍生的细胞上UCP1和细胞色素C氧化酶染色结果。同样，细胞显示BAT特征。
图4显示来自上述所衍生的BAT细胞的qPCR基因表达分析的结果。这些结果证实BAT表型的存在。有趣的是，相较于WAT，CIDEA没有过度表达。根据本发明所衍生的BAT细胞中表达的基因、及其相关谱系列于下表2：
基因 组织
UCP1 所有BAT
PRDM16 所有BAT
TBX15 米色
CIDEA 所有BAT
PPARGC1a 所有BAT
TCF21 白色
FBXO31 经典BAT
EBF3 经典BAT
ZIC1* 经典BAT
SHOX2 米色
HOXC9 米色
CPT1B 经典BAT
TMEM26 米色
MPZL2(EVA1) 经典BAT
TNFRSF9(CD137) 米色
实施例3
单步规程
重复实施例1中所述的规程，用单步(“混合”)规程代替系列培养规程。在这个实验中，ADSC在MSC SFM介质中孵育，然后直接转移到分化介质中用于持续进行分化时期(15至16天)。
ITSE是含有转铁蛋白和胰岛素的市售可获得的细胞的细胞培养介质补充物；其余组分和实施例2中所用试剂相同。
结果显示于图5至图9中，这在实施例4中进一步进行描述。
实施例4
使用第二规程的BAT分化
在StemPro SFM(Invitrogen)中以50,000个细胞/cm2(第0天)接种脂肪来源干细胞，2天后介质替换为根据如下配方的分化介质，同样含有1％青霉素和链霉素。6天后，每2-3天更新介质直至分化的第14或15天。
为了监测BAT的生成，分析细胞中与BAT细胞类型相关的各种基因的表达。图5显示通过实施例2、3和4的规程所分离的组织中UCP-1表达的Western印迹分析。本实施例4的规程被称为“MR”。
图6显示通过qPCR评估的采用三个规程所获得的基因表达的变化。在每一种情况下，随着细胞分化成BAT，UCP-1的表达显著增加。其它标记物表达的增加，随着所使用的规程而变化。
BAT中UCP-1的表达通常是cAMP诱导的。因此，分析了当用cAMP诱导时三个规程所获细胞中UCP-1的诱导。结果显示于图7。所有三个规程导致显示出cAMP所诱导的基因表达的细胞的产生，其中MR规程给出最大程度的诱导。
BAT细胞特征的最终分析涉及与天然所得BAT比较的细胞氧气消耗分析。褐色脂肪细胞比白色脂肪细胞有更高的线粒体含量并表达更高水平的UCP1。UCP1蛋白通过允许H+跨过线粒体内膜解偶联从氧化磷酸化中产生的ATP而产生热，因此BAT细胞比白色脂肪细胞显示更高的呼吸率。评估呼吸能力的最佳途径之一是通过直接测量完整细胞中的氧气消耗。由于这个原因，使用Seahorse技术。来自SeahorseBiosciences(North Billerica，MA)的XF Cell Mito Stress测试试剂盒用于测量微孔板中线粒体功能的四个关键参数：基础呼吸、ATP周转率、质子泄漏和最大呼吸。当和WAT细胞比较时，所有这些参数通常在BAT细胞中更高，如前所提及的，是由于更高的线粒体数目和更高的UCP1蛋白表达Ahfeldt等人(2012),Nat Cell Biol,14(2),209–219)。结果示于图8。
除非另有说明，此处使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域中普通技术人员所通常理解的具有相同的含义。和此处所述那些相似或等同的任何方法和材料可用于实施或测试本发明。适用于这种用途的方法、装置以及材料如上所述。此处引用的所有出版物其全部并入此处作为参考，目的在于描述和公开可能与本发明结合使用的公开中所报道的方法、试剂和工具。

Claims (31)

1.一种分化的褐色脂肪组织(BAT)细胞，其源自成体干细胞。
2.根据权利要求1所述的分化的BAT细胞，其中所述成体干细胞不是转基因的。
3.一种如权利要求1或权利要求2所述的分化的BAT细胞的培养物，所述培养物源自成体干细胞。
4.根据权利要求3所述的分化的BAT细胞的培养物，其中基础UCP1的表达水平是白色脂肪组织(WAT)表达水平的至少10倍。
5.根据权利要求4所述的分化的BAT细胞的培养物，其中基础UCP1的表达是WAT中基础UCP1表达的至少20倍。
6.根据权利要求3所述的分化的BAT细胞的培养物，其以基础水平表达PDRM16，所述基础水平相较于WAT是提高的。
7.根据权利要求6所述的分化的BAT细胞的培养物，其中以比WAT中的基础水平高2倍的水平表达PDRM16。
8.根据权利要求3所述的分化的BAT细胞的培养物，其以基础水平表达PPRCG1a，所述基础水平相较于WAT中的基础表达水平是提高的。
9.根据权利要求8所述的分化的BAT细胞的培养物，其中以比在WAT中高至少20倍的水平表达PPRCG1a。
10.根据权利要求3所述的分化的BAT细胞的培养物，当和白色脂肪组织(WAT)相比时，其不以提高的水平表达CIDEA。
11.根据任一前述权利要求所述的分化的BAT细胞或者分化的BAT细胞的培养物，其中相较于WAT而言，观察到一个或更多如下基因的提高的基础表达：TBX15、FBXO31、EBF3、SHOX2和TMEM26。
12.根据任一前述权利要求所述的分化的BAT细胞或者分化的BAT细胞的培养物，其显示出白棕色细胞谱系的特征。
13.根据任一前述权利要求所述的分化的BAT细胞或者分化的BAT细胞的培养物，其中成体干细胞是脂肪来源干细胞(ADSC)。
14.根据权利要求13所述的分化的BAT细胞或者分化的BAT细胞的培养物，其中成体脂肪来源干细胞是adMSC和/或前脂肪细胞。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的分化的BAT细胞或者分化的BAT细胞的培养物，其中成体脂肪来源干细胞源自WAT。
16.一种用于从成体干细胞衍生BAT细胞的方法，其包括在间充质干细胞生长介质中培养干细胞，以及将细胞转移至包含地塞米松、IBMX和BMP-7的介质中。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞未转染有转基因。
18.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中20％或更多的成体干细胞分化成BAT细胞。
19.根据权利要求18所述的方法，其中50％或更多的成体干细胞分化成BAT细胞。
20.根据权利要求16至19任一项所述的方法，其包括将所述干细胞暴露于如下介质组合：
(i)MSC SFM和BMP-7；
(ii)DMEM/F12、胰岛素、转铁蛋白、BMP-7、T3、地塞米松、罗格列酮和IBMX；以及
(iii)DMEM/F12、胰岛素、转铁蛋白、BMP-7、T3、地塞米松和罗格列酮。
21.根据权利要求20所述的方法，其中通过更新所述介质来重复步骤(iii)。
22.根据权利要求16至21任一项所述的方法，其中所述细胞以三天的间隔先后暴露于所述介质。
23.根据权利要求16至21任一项所述的方法，其中所述细胞同时暴露于所述介质。
24.根据权利要求16至19任一项所述的方法，其包括将所述干细胞暴露于如下介质组合：
(i)MSC SFM；
(ii)DMEM/F12、胰岛素、转铁蛋白、BMP-7、T3、地塞米松、罗格列酮和IBMX；以及
(iii)DMEM/F12、胰岛素、转铁蛋白、T3、地塞米松和罗格列酮。
25.根据权利要求24所述的方法，其中通过更新所述介质来重复步骤(ii)和(iii)。
26.一种分化的BAT细胞或者细胞培养物，其是通过权利要求16至25任一项所述的方法所衍生的。
27.根据权利要求1至15任一项所述的分化的BAT细胞或者细胞培养物，其是通过权利要求16至25任一项所述的方法所衍生的。
28.权利要求1至15任一项所述的分化的BAT细胞或者细胞培养物，用于治疗患者，其中所述患者患有特征在于过度脂肪组织积累的疾病，其中将所述细胞植入所述患者。
29.一种用于治疗患者的方法，所述患者患有特征在于过度脂肪组织积累的疾病，所述方法包括将权利要求1至15任一项所述的一个或更多细胞植入需要所述治疗的患者中。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述疾病是糖尿病。
31.一种用于从成体干细胞中衍生BAT细胞的试剂盒，其包含两种或更多权利要求20或权利要求23中所述的试剂。
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