CN105073978B - 利用植物干细胞或植物去分化干细胞的提取物诱导定制亚全能干细胞的方法以及利用该方法的方式制得的亚全能干细胞 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用植物干细胞和植物去分化干细胞(愈伤组织)的提取物通过重新编程分化的成人细胞来诱导定制亚全能干细胞的方法；利用该方法制得的亚全能干细胞以及包含所述亚全能干细胞的细胞治疗剂。根据本发明，可克服伦理问题，因为没有使用卵来制备具有与胚胎干细胞类似功能的亚全能干细胞，并且可制备确保安全性的亚全能干细胞，因为利用尤其已经证实对身体无害的植物干细胞提取物，并且还可利用本发明来开发适合不同个体的免疫相兼容的细胞治疗剂。此外，预计本发明可在阐明病因以及研究通过诱导亚全能干细胞治疗疾病个体的医学病症的方法时具有很大优势。

Description

利用植物干细胞或植物去分化干细胞的提取物诱导定制亚全 能干细胞的方法以及利用该方法的方式制得的亚全能干细胞

本发明是在如下支持下完成的：由科学部资助的国家研究基金会(NRF)的生物医学技术开发项目拨款NRF-2015M3A9B4051041；由卫生和福利部资助的ICT和未来规划革新研究所用于细胞治疗的拨款No.A062260；由卫生和福利部资助的韩国卫生技术研发项目拨款No.HI14C1277以及由卫生和福利部资助的在韩国卫生业开发研究所(KHIDI)范围内的先进医学技术开发项目拨款No.HI14C1541。

技术领域

本发明涉及利用植物干细胞和/或植物去分化干细胞的提取物通过重新编程分化的成人细胞和/或使分化的成人细胞去分化来诱导定制亚全能干细胞的方法、利用该方法制得的亚全能干细胞以及包含所述亚全能干细胞的细胞治疗剂。

背景技术

干细胞是存在于胚胎、胎儿和成人组织中的未分化的细胞类型的总称，其特点在于分化成多种特定细胞类型的能力。在各种分类的干细胞中，亚全能干细胞是指这样的细胞，其可分化成衍生自构成生物体的三个胚层中的任何一层的细胞。

在分类中，干细胞可以根据解剖区域、细胞功能、细胞表面上表达的抗原类型、转录因子、细胞产生的蛋白质以及可由干细胞生成的特定细胞的类型来进行分类。

其中最常用的标准之一是干细胞所衍生的来源。干细胞可以被分类为从胚胎中分离的胚胎干细胞(ES细胞)和从成人分离的成体干细胞。

根据另一个常用的分类法对由干细胞分化的细胞类型的数量进行分类，干细胞可被分类为亚全能(pluripotency)干细胞、多能(multipotency)干细胞和单能(unipotent)干细胞。一般情况下，胚胎干细胞是代表性的亚全能干细胞，成体干细胞被分为多能干细胞和单能干细胞。

在受精后于哺乳动物的早期发育形成的胚泡的内细胞团是随后形成胚胎的一部分，并且由内细胞团形成的胚胎干细胞可被称为亚全能干细胞，具有分化成构成个体的所有组织的细胞的潜能。也就是说，与成体干细胞相比较而言，胚胎干细胞是未分化的细胞，其能够增殖但不限于分化成所有类型的细胞，还形成生殖细胞，并且因此可以遗传给下一代。

然而，这些胚胎干细胞即亚全能干细胞的制备导致人类胚胎被破坏，这引起了宗教和伦理问题。此外，由于胚胎干细胞衍生自有限的胚胎，因此每个个体之间缺乏免疫相容性，并且因此在胚胎干细胞用作细胞治疗剂的开发中可能存在移植排斥。为了解决这些问题，已经通过利用成人来源细胞进行多种尝试以人为制备模拟胚胎干细胞的亚全能干细胞。

代表性方法的实例包括体细胞核转移(SCNT)，ES细胞融合物，由所限定的因子重新编程等等。SCNT需要大量的卵母细胞，由于其效率非常低。ES细胞融合物具有稳定性问题，因为由此诱导的亚全能干细胞包含两个额外的基因对。通过所限定的因子重新编程，这是最近的技术，其采用含有致癌基因的病毒，并因此可能引起致癌性。

为了确保定制亚全能干细胞用于细胞疗法的开发，需要开发制备亚全能干细胞的方法，其安全并且可解决伦理问题。根据这一需求，本发明的发明人已经利用衍生自动物的诱导亚全能干细胞(iPS)的提取物开发了去分化干细胞，但也有一些限制。

首先，需要约20mg或更多的iPS提取物实施上述方法。因此，其中提取物是从人去分化干细胞中分离出的去分化诱导需要大量的成本和劳动，尚未成功。例如，所属领域的技术人员必须耗时3个月或以上来制备人去分化干细胞以获得20mg提取物，这需要很高的成本。

其次，动物干细胞或与其对应的去分化干细胞没有完全粉碎并残留在分离提取物的过程中，当利用所述提取物处理待诱导去分化的体细胞时，难以将诱导去分化的细胞和提取物中残留的去分化干细胞区分开来，并且因此可能无法立即确定实验成功与否，而可以在分析其基因组DNA后确定。因此，可能浪费大量的时间和成本。

再次，由于很少利用蛋白质制得的人去分化干细胞，所以使用了利用病毒产生的人去分化干细胞的提取物。然而，该提取物可能含有由所述病毒引起的致癌物质，这可能是临床应用的一个障碍。

发明内容

技术问题

开发本发明以解决如上所述的常规技术的问题，并提供了制备定制亚全能干细胞的方法，确保安全性并没有伦理问题。此外，提供了诱导人去分化干细胞的方法，这是难以利用现有技术来实现的。

本发明的发明人已开发了通过利用成人来源细胞诱导具有与从其中分离细胞的成人的遗传背景相同的亚全能干细胞的方法。因此，本发明将提议本发明实施方案的方法适用于通过提供与具有不同遗传背景的成人来源细胞相同的结果来制备亚全能干细胞。

技术解决方案

为了解决上述技术主题，本发明提供了通过利用植物来源干细胞的提取物诱导亚全能干细胞的方法。

更具体地，本发明提供了制备定制亚全能干细胞的方法，包括：制备任何植物干细胞或者诱导的亚全能植物干细胞的提取物；将所述提取物导入到成人来源细胞中；以及培养所述成人来源细胞以制备具有与胚胎干细胞的多能性相同的亚全能干细胞。

所述提取物包括从植物细胞获得的蛋白质、脂质、糖和酸。

所述提取物包括愈伤组织粉末。

根据本发明的实施方案，本发明进一步包括在将提取物引进到成人来源细胞中之前利用培养基处理步骤a)的提取物。

根据本发明的另一个实施方案，本发明可进一步包括在将提取物导入到成人来源细胞中之前利用膜渗透促进组分处理成人来源细胞。所述膜渗透促进组分可以是蛋白质或化合物，包括链球菌溶血素O和毛地黄皂苷。

根据本发明的又一个实施方案，本发明还可进一步包括将其中导入所述提取物的成人来源细胞转移到饲养细胞层上并进行培养。饲养细胞可包括STO细胞。

此外，本发明提供了制备定制亚全能干细胞的方法，包括：制备任何植物干细胞或者诱导的亚全能植物干细胞的提取物；将所述提取物导入到成人来源细胞中；以及在普通细胞培养基中培养所述成人来源细胞；将所述成人来源细胞转移到饲养细胞层上，并在胚胎干细胞培养基中培养成人来源细胞。

此外，本发明提供利用上述方法制备的亚全能干细胞，其与胚胎干细胞非常相似。

此外，本发明提供一种包含所述亚全能干细胞的细胞治疗剂。

此外，本发明提供了治疗疾病的方法，其包括施用药学上有效量的细胞治疗剂。

此外，本发明提供了所述亚全能干细胞作为细胞治疗剂的有效成分的用途。

有利效果

根据本发明的实施方案，植物干细胞或诱导的亚全能植物干细胞的提取物可用作制备定制干细胞的最有效的方法。此外，这种方法将是可广泛应用的制备方法，覆盖所有类型的细胞，包括具有不同遗传背景的人。此外，本发明实施方案的方法利用植物来源干细胞的提取物，从而允许制备定制亚全能干细胞，不会引起伦理问题并确保安全性。

附图说明

图1是举例说明根据本发明的方法诱导定制亚全能干细胞的整体过程的示意图。

图2是举例说明利用植物干细胞提取物处理后第5天诱导的亚全能干细胞的图。

图3是举例说明利用植物干细胞提取物处理后第8天以及被转移到饲养细胞层上后第2天诱导的亚全能干细胞的图。

图4A是利用植物干细胞提取物处理后第32天以及被转移到饲养细胞层上并传代4次后诱导的亚全能干细胞和的图。图4B是举例说明典型的胚胎干细胞的图。

图5是举例说明利用植物干细胞提取物处理后第32天以及被转移到饲养细胞层上并传代4次后诱导的亚全能干细胞的碱性磷酸酶试验结果的图。

图6A是举例说明利用植物干细胞提取物处理后第50天以及被转移到饲养细胞层上并传代7次后诱导的亚全能干细胞的图(左)以及举例说明其碱性磷酸酶试验结果的图(右)。图6B是举例说明通过病毒递送四种Yamanaka因子诱导的人亚全能干细胞的图(左)以及举例说明其碱性磷酸酶试验结果的图(右)。

图7是举例说明根据本发明的方法诱导的亚全能干细胞的基因表达的图。

发明方式

为了实现本发明的目的，本发明提供了一种制备定制亚全能干细胞的方法，包括：a)制备任何植物干细胞或诱导的亚全能植物干细胞的提取物；b)将所述提取物导入到成人来源细胞内；以及c)培养所述成人来源细胞以制备具有与胚胎干细胞的多能性相同的亚全能干细胞。

所述提取物可包括由植物细胞获得的蛋白质、脂质、糖类、酸和有机化合物，但不限于此。

所述提取物可包括愈伤组织粉末，并且所述愈伤组织粉末优选溶解在水中使用，但本发明不限于此。

本文所用的术语“干细胞”是指可无限复制以至于形成组织和器官的特定细胞的主细胞。干细胞是指可被开发的亚全能或多能性细胞。干细胞可以分化成两种子干细胞或者一种子干细胞和一种衍生(过渡)细胞，随后增殖成组织的成熟的和完整形式的细胞。

本文所用的术语“胚胎干细胞”是指具有多能性的细胞，其是通过从胚泡的内细胞团分离并培养而制得，所述内细胞团是在受精后哺乳动物的早期发育时形成的。

本文所用的术语“去分化干细胞或诱导的亚全能干细胞(induced PluripotentStem cells，iPS)的提取物”是指通过将去分化干细胞或通过物理化学方法利用多种体外方法进行诱导和培养的诱导的亚全能干细胞(iPS)进行研磨，并且通过离心将其分离等等而获得的材料。

本文所用的术语“植物干细胞”是来源于形成层的植物干细胞。特别是，植物干细胞包括形成层分生组织细胞(CMC)，其在插到植物的木质部和韧皮部之间的边界的形成层中不会被物理损坏。

本文所用的术语“愈伤组织”(愈伤组织、创伤组织或伤口愈合组织)是指未分化的无定形细胞团，并且主要是指当植物受伤时由伤口周围的分生组织形成的肿瘤组织。植物主要由其中细胞进行分裂的分生组织和不进行细胞分裂的永久组织组成。当初始分生组织的细胞是在营养培养基中培养时形成愈伤组织。然后，形成胚状体并分化成植物。通常将愈伤组织称为“植物干细胞”。本发明中使用的愈伤组织的类型不限。

本文所用的术语“亚全能干细胞”是指具有多能(多能性)并能分化成三种胚层(即内胚层、中胚层和外胚层)中任何一层的干细胞。通常，胚胎干细胞是具有代表性的亚全能干细胞。

本文使用的术语“定制亚全能干细胞”是指与用于制备亚全能干细胞的供体细胞基因一致的亚全能干细胞，这意味着该亚全能干细胞是由供体细胞衍生的。

本文使用的术语“成人来源细胞”是指与胚胎细胞相反的术语，并且是指来源于出生后活到成人的细胞。

本文所用的术语“分化”是指通过一种方式，在细胞的分裂、增殖和生长的过程中，细胞在结构和功能上特定化，也就是说细胞的形态或功能发生变化以便执行给定的任务。一般情况下，分化表示一种其中一个相对简单的系统被分成两个或更多个性质不同的部分系统的现象。例如，“分化”是指最初同质的生物系统的部分出现性质的差异，例如卵的部分，其在个体发育最初同质，具有区别例如头、身体等等，或者细胞分为肌细胞、神经元等等，或者是指一种状态，其中部分被随后划分成可通过性质来区分的区域或部分系统。

本发明实施方案的方法包括培养植物干细胞或使用各种方法诱导的所有类型的诱导亚全能干细胞，并由此制备提取物，其可使用相关领域中公知的一般方法进行。例如，由每种细胞衍生的蛋白质可通过以下步骤提取：培养植物干细胞或使用各种方法诱导的所有类型的诱导亚全能干细胞，利用蛋白酶进行处理，并收集悬浮液或使植物来源的干细胞在65℃下反应2小时，过滤。愈伤组织粉末可用在本发明的实施方案中。

关于提取物的制备，本领域的技术人员可以容易理解的是，高浓度的提取物可以利用现有的提取方法来制备。提取物的浓度优选为100μg/ml至1mg/ml，更优选为500μg/ml。当提取物的浓度超出上述范围时，诱导定制亚全能干细胞的效果下降，或者所提取的细胞可能是死的。

本发明实施方案的方法包括将从植物干细胞或利用各种方法诱导的所有类型的诱导亚全能干细胞分离的提取物导入到成人来源细胞中。

成人来源细胞包括人真皮成纤维细胞。

就导入而言，利用膜渗透促进组分(例如链球菌溶血素O或毛地黄皂苷)处理细胞以形成可逆的小孔(透化)，使得该提取物可流入细胞内。透化后，从植物干细胞或诱导的亚全能干细胞分离的的提取物通过将成人来源细胞与该提取物一起孵育的方法被导入到成人来源细胞内。

本发明包括通过孵育其中导入所述提取物的所述细胞的方法来制备与胚胎干细胞非常类似的细胞，即具有与那些胚胎干细胞的遗传背景和多能性相同的细胞。

本发明可进一步包括在导入所述提取物之后于普通细胞培养基中培养成人来源细胞，然后转移至饲养细胞层上并培养成人来源细胞。

更具体地，将导入所述提取物的成人来源细胞在常用的细胞培养基(DMEM，10％FBS，50U/ml青霉素，50mg/ml链霉素)中培养，直到在导入所述提取物的方法之后形成一个集落。形成集落后，将成人来源细胞转移到饲养细胞层上并培养，同时将成人来源细胞每七天传代培养并每天更换新鲜的培养基。本发明实施方案的饲养细胞包括STO细胞。

导入所述提取物的亚全能干细胞可在添加了Dulbecco’s改良的Eagle培养基(DMEM)/F12、20％敲除血清替代品(KSR)、2mM的L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.1mM的β巯基乙醇、50U/ml青霉素、50mg/ml链霉素和10μg/ml的bFGF的培养液中培养。本领域的技术人员将容易理解的是，加入到DMEM中的化合物的浓度可在可实现本发明效果的范围内变动。

此外，本发明提供诱导定制亚全能干细胞的方法，包括：a)制备任何植物干细胞或诱导的亚全能植物干细胞的提取物；b)将提取物导入到成人来源细胞内；以及c)在普通细胞培养基中培养所述成人来源细胞，将所述成人来源细胞转移到饲养细胞层上，并在胚胎干细胞培养基中培养成人来源细胞。

当利用本发明实施方案的方法时，与胚胎干细胞非常相似的细胞可利用植物干细胞或诱导的亚全能植物干细胞从成人来源细胞来制备。

本发明的发明人确定，利用本发明实施方案的方法诱导定制的亚全能植物干细胞。

更具体地，可确定的是，根据本发明诱导的亚全能干细胞在形态上与胚胎干细胞无法区分(参照图4)。此外，对根据本发明诱导的亚全能干细胞进行测定以表达基因Nanog和Oct4，其是胚胎干细胞的标志(参照图7)。另外，本发明提供利用本发明实施方案的方法诱导的定制亚全能干细胞。

本发明的发明人连续进行传代10次，并由此确定了亚全能干细胞的自我更新，这是干细胞的特征之一(参照图6)。

此外，本发明提供包含本发明实施方案的定制亚全能干细胞的细胞治疗剂。更具体地，所述细胞疗法剂可用于形成肝细胞、脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞、心肌细胞、血管内皮细胞等等。

本文所用的术语“细胞治疗剂”是指药物，通过从人分离、培养并特异性操控人的细胞或组织而制得，用于疾病的治疗、诊断和预防(美国FDA法规)，也就是说，药物是通过一系列的对自体、同源或异源的细胞的体外增殖和筛选或者改变细胞的生物学特性来修复细胞或组织的功能而制得的，用于疾病的治疗、诊断和预防。根据细胞的分化程度，细胞治疗剂被分类为成人体细胞治疗剂和干细胞治疗剂，并且本发明涉及一种干细胞治疗剂。

下文将结合下述实施例对本发明进行详细地描述。但是，下述实施例仅仅是举例说明本发明，并且本发明并不限于下述实施例。

实施例1.将植物干细胞导入到成人来源细胞中

本发明的发明人利用愈伤组织粉末作为植物来源干细胞的提取物。可用于本发明的愈伤组织粉末的种类不受限制。Amorepacific Corporation提供的红杉愈伤组织粉末用于下述实施例中。

更具体地，用胰蛋白酶-EDTA收获人皮肤成纤维细胞，并用冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗。将由此得到的细胞团块再悬浮于冷的不含Ca²⁺和Mg²⁺的Hank’s平衡盐溶液(HBSS)(浓度为100,000个细胞/100μl)中并转移到1.5ml离心管中。以水平转子在120g于4℃下离心5分钟后，弃去上清液，并将所得的细胞团块再悬浮于97.7μl冷的HBSS中并在37℃下于水浴中孵育2分钟。将2.3μl链球菌溶血素O(SLO；稀释(1:10)在冷的HBSS中至浓度为100g/mL)加入到该反应溶液中(最终SLO浓度：230ng/mL)。此外，可在上述过程中加入毛地黄皂苷(20μg/ml)和200μl的输送溶液(110mM乙酸钾、5mM乙酸钠、2mM乙酸镁、1mM的EGTA、2mM的DTT、蛋白酶抑制剂混合物、20mM的HEPES，pH7.3)来代替SLO。将样品在37℃水浴中孵育50分钟，在此过程中每十分钟上下翻转1次。将孵育的样品置于冰上并向其中加入200μl冷的HBSS溶液，随后以水平转子在120g于4℃下离心5分钟。透化后，将细胞团块以1000个细胞/μl的密度再悬浮在200μl植物干细胞提取物中。愈伤组织粉末用作植物干细胞的提取物(500μg/ml)。此后，将ATP再生系统(10mM磷酸肌酸和25g/ml肌酸激酶)和1mM各三磷酸核苷酸加入到悬浮液中，随后在37℃水浴中孵育1小时，同时每10分钟上下翻转1次。孵育后，将1ml含有2mM氯化钙的ES细胞培养基加入到悬浮液中，并将悬浮液在37℃的培养箱中孵育2小时以重新密封胞质膜。将细胞用PBS清洗，再悬浮在胚胎干细胞培养基中，并接种在涂有0.1％的明胶的培养皿上。

实施例2.通过培养提取物诱导的细胞制备类似胚胎干细胞的细胞

将细胞在37℃下于普通细胞培养基中在5％CO₂培养箱中培养，在所述普通细胞培养基中向Dulbecco’s改良的Eagle培养基(DMEM)中加入10％FBS、50U/ml青霉素、50mg/ml链霉素。将在涂有0.1％明胶的培养皿上的导入植物干细胞(愈伤组织粉末)的成人来源细胞(人真皮成纤维细胞)在上述培养基中培养，孵育最初两天后更换新鲜的培养基。在培养基每天用新鲜的培养基更换后，将细胞培养10天，将每一个培养皿中的细胞以1:2的比率分为两组并在丝裂霉素C(MMC)处理的饲养细胞层上培养。然后，将细胞在培养基中培养，其中所述培养基中向Dulbecco’s改良的Eagle培养基(DMEM)/F12加入20％敲除血清替代品(KSR)、2mM的L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.1mM的β-巯基乙醇、50U/ml青霉素、50mg/ml链霉素和10μg/ml的bFGF，同时每天更换新鲜的培养基，并且以7天的规律间隔将细胞转移到新的饲养细胞层上。平均来说，分析所需的定制干细胞可以培养至培养后大约第21天。

图1是举例说明根据本发明的方法诱导定制的亚全能干细胞的整体过程的示意图。图2至4分别显示第5天、第10天以及第32天时诱导的亚全能干细胞。图5至6分别显示培养的第32天以及第50天时亚全能干细胞的碱性磷酸酶染色。利用一般的染色试剂盒观察了碱性磷酸酶染色。

如图6所示，观察到根据本发明的方法诱导的亚全能干细胞的碱性磷酸酶染色是阳性的(呈紫色)，与胚胎干细胞相似。

实施例3.定制亚全能干细胞的特征分析(基因表达分析)

收获培养的细胞后，利用TRIzol试剂(Invitrogen)分离出总RNA。反转录聚合酶链反应(RT-PCR)后进行cDNA合成，PCR是相比于Nanog、Oct-3/4特异性引物和对照基因GAPDH而实施的。通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，结果示于图 7。

如图7所示，可确定的是，Nanog和Oct-3/4(它们是胚胎干细胞(hES)的标志基因)在根据本发明的方法诱导的亚全能干细胞(HiPS)中表达。

关于本发明的上述描述仅仅是为了举例说明，应当理解的是，本领域技术人员可以容易地对这些实施方案进行改动或修改，而不背离本发明的范围和精神。因此，应该理解的是，提供上述实施方案仅用于举例说明的目的并且不以任何方式限制本发明。

工业应用性

根据本发明的实施方案，可制备不会引起伦理问题并且确保安全性的定制亚全能干细胞。

Claims (14)

1.一种制备表达Nanog和Oct-3/4的定制亚全能干细胞的方法，包括：

a)从红杉愈伤组织制备提取物；

b)将所述提取物导入人皮肤成纤维细胞中；以及

c)培养所述人皮肤成纤维细胞以制备具有与胚胎干细胞的多能性相同的亚全能干细胞，

其中所述提取物的浓度范围为100μg/ml至1mg/ml。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述提取物包括从植物细胞获得的蛋白质、脂质、糖和酸。

3.根据权利要求1所述的方法，其中还包括在将所述提取物导入到人皮肤成纤维细胞内之前利用培养基处理步骤a)的所述提取物。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中步骤a)的所述提取物包括在将所述提取物导入到人皮肤成纤维细胞内之前通过利用培养基处理来产生的材料。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述提取物的浓度为500μg/ml。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述提取物是愈伤组织粉末。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述愈伤组织粉末是通过溶解在水中来使用的。

8.根据权利要求1所述的方法，其中还包括在将所述提取物导入到人皮肤成纤维细胞内之前利用膜渗透促进组分对人皮肤成纤维细胞进行处理。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述膜渗透促进组分包括蛋白质或化合物。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述蛋白质包括链球菌溶血素O。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述化合物包括毛地黄皂苷。

12.根据权利要求1所述的方法，其中还包括将其中导入所述提取物的人皮肤成纤维细胞转移并在饲养细胞层上培养。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述饲养细胞包括STO细胞。

14.一种制备表达Nanog和Oct-3/4的定制亚全能干细胞的方法，包括：

a)从红杉愈伤组织制备提取物；

b)将所述提取物导入到人皮肤成纤维细胞内；以及

c)在普通细胞培养基中培养所述人皮肤成纤维细胞，将所述人皮肤成纤维细胞转移到饲养细胞层上，并在胚胎干细胞培养基中培养所述人皮肤成纤维细胞，

其中所述提取物的浓度范围为100μg/ml至1mg/ml。

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