KR102016257B1 - 소변 유래 줄기세포의 분리 효율 및 자가 증식을 증가시키는 방법 - Google Patents

소변 유래 줄기세포의 분리 효율 및 자가 증식을 증가시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 개체로부터 소변을 채취하는 단계; (b) 상기 소변을 원심분리하여 세포를 수집하는 단계; (c) 상기 세포를 세척한 후, 원심분리하여 세포를 제공하는 단계; 및 (d) 코팅물질이 코팅된 세포배양 접시에서 세포를 접종(seeding)하는 단계를 포함하는 소변유래줄기세포의 분리 방법에 관한 것이다.

Description

소변 유래 줄기세포의 분리 효율 및 자가 증식을 증가시키는 방법{Method for increasing separation efficiency and self-renewal of urine-derived stem cells}
본 발명은 코팅물질이 코팅된 세포배양 접시에서 세포를 접종 및 배양하는 단계를 포함하는 소변유래줄기세포의 분리 및 증식 방법에 관한 것이다.
줄기세포 연구는 인간에 대한 치료 기술을 향상 시킬 수 있는 잠재력을 가진 폭발적이고 흥미진진한 연구이다. 이러한 줄기세포 연구는 크게 만능줄기세포(Pluripotent stem cell)와 체세포 줄기세포(Somatic stem cell)에 의해 수행되고 있다. 만능줄기세포는 배아줄기세포(Embryonic stem cell)와 유도만능줄기세포(Induced pluripotent stem cell) 에 포함된다. 배아줄기세포는 초기 배아의 내세포집단(inner cell mass)에서 유래된 것이며 시험관내와 생체내에서 3종류의 배엽층 세포 유형으로 분화할 수 있다. 유도만능줄기세포는 2006년 일본 교토대의 야마나카 교수팀이 레트로바이러스 (retrovirus)를 이용하여 마우스의 체세포에 Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4 유전자를 도입하여 배아줄기세포와 유사한 리프로그래밍(Reprogramming)된 세포를 생성하였으며, 이 세포를 유도만능줄기세포라고 명명하였다. 유도만능줄기세포는 초기 배아를 파괴하여 생기는 배아줄기세포의 윤리적 문제를 우회하여 체외에서 다양한 계통의 세포 유형을 생성할 수 있다. 그러나 세포 조작의 어려움, 낮은 리프로그래밍 효율, 종양 형성, 돌연변이 등의 장애물로 인해 임상적용까지는 아직 시간이 걸릴 것으로 보인다. 한편 체세포 줄기세포는 종양 형성의 위험이 없이 많은 수의 분화된 세포 유형으로 전파될 수 있으므로 만능줄기세포에 비해 임상 적용에 한발 앞서 있으며 또한 만능줄기세포로의 리프로그래밍을 통해 여러 개통으로 분화할 수 있는 장점이 있다. 체세포 줄기세포의 경우 골수유래줄기세포(Bone marrow derived stem cell)와 지방유래줄기세포 (Adipose derived stem cell), 그리고 탯줄유래줄기세포(umbilical cord derived stem cell)가 장기간 연구 되었고 다양한 실험 연구와 전임상 시험에 적용 시도가 있었다. 또한, 자가 줄기세포는 면역 반응 및 거부 반응을 유도하지 않기 때문에 임상적으로 유용하다. 그러나, 조직과 장기에서 분리할 수 있는 줄기세포는 신체 내에서 아주 적은 세포 집단을 이루고 있고, 특별한 조직 분리 기술이 필요하기 때문에 세포를 분리하는데 어려움을 가지고 있다. 본 발명에서 사용된 소변유래줄기세포(Urine derived stem cell)는 인간의 소변에서 쉽게 분리할 수 있으며, 다른 체세포 줄기세포와 마찬가지로 여러 조직과 기관으로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있다. 최근 10년간 소변유래줄기세포는 세포 치료 및 조직 공학을 위한 유망한 세포 자원으로 등장하였으며, 이러한 응용을 기반으로 현재 줄기세포 생물학에서 중요한 역할을 수행하고 있다.
한국공개특허 제10-2017-0126564호
본 발명의 목적은 (a) 개체로부터 소변을 채취하는 단계; (b) 상기 소변을 원심분리하여 세포를 수집하는 단계; (c) 상기 세포를 세척한 후, 원심분리하여 세포를 제공하는 단계; 및 (d) 코팅물질이 코팅된 세포배양 접시에서 세포를 접종(seeding)하는 단계를 포함하는 소변유래줄기세포의 분리 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 코팅물질이 코팅된 세포배양 접시에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 소변유래줄기세포의 증식 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 개체로부터 소변을 채취하는 단계; (b) 상기 소변을 원심분리하여 세포를 수집하는 단계; (c) 상기 세포를 세척한 후, 원심분리하여 세포를 제공하는 단계; 및 (d) 코팅물질이 코팅된 세포배양 접시에서 세포를 접종(seeding)하는 단계를 포함하는 소변유래줄기세포의 분리 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 소변은 소변의 중간뇨에서 채취하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포는 개체의 소변에서 채취하여 2시간 이내에 분리된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 원심분리는 300g 내지 500g에서 5분 내지 15분 동안 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 400g 에서 10분 동안 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세척은 PBS(phosphate buffered saline)에 의하여 세척되는 것일 수 있고, 바람직하게는 Antibiotic-Antimycotic (Gibco)를 넣은 PBS에 의하여 세척되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 코팅물질은 Matrigel 인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포 배양 단계에서 Y-27632를 배지에 첨가하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 코팅물질이 코팅된 세포배양 접시에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 소변유래줄기세포의 증식 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 코팅물질은 Matrigel 인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포 배양 단계에서 Y-27632를 배지에 첨가하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 소변유래줄기세포의 분리 및 증식 방법은 개체의 소변으로부터 쉽게 획득될 수 있고 많은 수의 세포를 분리 및 증식할 수 있어 세포치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 소변유래줄기세포의 분리 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 소변유래줄기세포의 특성을 분석한 결과이다.
도 3은 Gelatin, Gelatin+Y-27632, Matrigel 및 Matrigel+Y-27632를 처리한 경우 소변유래줄기세포의 분리 효율을 나타낸 결과이다.
도 4는 Gelatin, Gelatin+Y-27632, Matrigel 및 Matrigel+Y-27632를 처리한 경우 소변유래줄기세포의 증식률을 비교한 결과이다.
도 5는 Gelatin, Gelatin+Y-27632, Matrigel 및 Matrigel+Y-27632를 처리한 경우 소변유래줄기세포의 군체 형성 능력을 비교한 결과이다.
도 6은 지방유래줄기세포, 탯줄유래줄기세포 및 소변유래줄기세포의 시간별 증식률을 비교한 결과이다.
도 7은 지방유래줄기세포, 탯줄유래줄기세포 및 소변유래줄기세포에서 얻을 수 있는 세포의 양을 비교한 결과이다.
도 8은 지방유래줄기세포, 탯줄유래줄기세포 및 소변유래줄기세포의 군체 형성 능력을 비교한 결과이다.
본 발명에서의 용어, "줄기세포"는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent)이거나 전능성(totipotent)이 있는 자가-재생산능(self-renewal)을 갖는 세포를 의미하며, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포 및 성체줄기세포를 포함한다.
상기 용어, "배아 줄기세포"는 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것으로서, 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent)이거나 전능성(totipotent)이 있는 자가-재생산능(self-renewal)을 갖는 줄기세포를 의미한다.
상기 용어, "유도만능줄기세포(iPSC: induced pluripotent stem cells)"는 분화가 끝난 체세포 또는 제한된 분화능을 가지는 세포에 세포 분화 관련 유전자를 주입하여 리프로그래밍 과정을 통해 분화 이전의 세포 단계로 되돌린 만능성을 유도한 세포를 말한다. 유도만능줄기세포는 배아줄기세포와 거의 같은 특성을 가지고 있는데, 구체적으로 비슷한 세포모양을 보여주고, 유전자 및 단백질 발현 패턴이 유사하며, 생체 내외에서 다분화능을 가지는 특성을 가지고 있다. 인간 배아줄기세포와 같이 여성의 난자 등으로부터 획득하는 것이 아니라, 이미 분화가 끝난 체세포 등에서 유도된 것이기 때문에 인간 배아줄기세포와 같은 윤리적 문제점을 수반하지 않으며, 환자의 체세포에서 줄기세포로 전환할 수 있기 때문에 면역 거부 반응의 문제도 적다. 다만, 이러한 유용성에도 불구하고 역분화 효율이 낮아 충분한 수의 유도만능줄기세포를 얻을 수 없다는 단점이 있다.
상기 용어, "리프로그래밍(reprogramming)"이란 분화된 세포를 만능성(pluripotent)을 가지는 상태로 복원 또는 전환될 수 있는 프로세스를 의미한다. 본 발명에서 상기 리프로그래밍이란 0% 내지 100% 미만의 분화능을 가지는 분화된 세포들을 미분화 상태로 되돌리는 과정이라면 모두 이에 포함하며, 바람직하게는 0%의 분화능을 가지는 분화된 세포 또는 0% 초과 내지 100% 미만의 분화능을 가지는 일정부분 분화된 세포를 100% 분화능을 가지는 세포로 복원 또는 전환시키는 것을 모두 포함한다. 이러한 리프로그래밍은 리프로그래밍 유도인자(reprogramming factor)에 의하여 수행될 수 있다.
상기 용어, "리프로그래밍 유도인자"는 분화된 세포에 처리 또는 발현되는 경우 iPSC 특이적 유전자의 발현을 가져와 만능성을 가지는 유도만능줄기세포로 유도하는 물질을 의미한다. 상기 리프로그래밍 유도인자는 분화된 세포의 리프로그래밍을 유도하는 물질이면 본 발명에 제한없이 포함될 수 있으며, 그 예로 Oct3/4, sox-2, c-Myc 및 Klf-4 등을 들 수 있으나, 적용할 세포의 종류에 따라 선택할 수 있으며, 상기 예에 제한되는 것은 아니다.
상기 용어, "성체줄기세포"는 분화된 조직에서 발생하는 줄기세포로 자가 재생산이 가능하며 유래 조직의 모든 세포 타입으로 분화될 수 있는 미분화된 세포를 의미한다. 구체적으로 상기 성체줄기세포는 제대혈(탯줄혈액), 성인의 골수, 비장, 난소, 정소, 말초혈액, 양수, 뇌, 혈관, 골격근, 피부 또는 위장관의 상피, 각막, 치아의 치수, 망막, 간 또는 췌장으로부터 추출해 낼 수 있으며, 뼈와 간, 혈액 등 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포를 의미한다. 예를 들어, 척수는 조혈모세포(Hematopoietic stem cell, HSC) 및 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell)를 가지는 것으로 보고되고 있으며 뇌로부터 유래한 줄기세포인 신경줄기세포(Neural stem cell)는 뇌실하 영역(subventricular zone), 뇌실 영역(ventricular zone) 및 CNS(central nervous system)의 해마(hippocampus)로부터 분리된다고 알려져 있다. 일반적으로 성체 줄기세포는 증식이 어려우나 쉽게 분화되는 경향이 강한 것으로 알려져 있어, 여러 종류의 성체 줄기세포를 사용하여 실제 의학에서 필요로 하는 장기 재생을 할 수 있을 뿐 아니라 이식된 후 각 장기의 특성에 맞게 분화할 수 있는 특성을 지니고 있다.
본 발명에서의 용어, 줄기세포의 "증식"은 줄기세포의 분화(differentiation)와는 구분되는 개념으로서, 줄기세포가 구체적인 세포로 분화되지 않고, 줄기세포의 특성을 그대로 유지한 채, 세포가 분열되어 세포의 전체 수가 증가되는 것을 의미한다.
본 발명에서의 용어, "분화"란 덜 특화된 세포가 특정한 세포로 발달하여 세포의 크기나 모양, 막전위, 대사활성, 신호에 대한 반응이 특정한 유형의 세포로 변화하는 현상을 의미한다. 주로 다세포 생물이 단일 접합자(zygote)에서 복잡한 조직을 형성하는 과정 중에 일어나거나, 성인이 되었을 때 손상된 조직을 복구하는 경우 성체줄기세포가 특정한 세포로 분화하게 된다.
본 발명에서의 용어, "배지"는 인 비트로(in vitro)에서 세포의 성장 및 생존을 유지하는데 필요한 영양물질을 포함하는 조성물을 의미한다.
본 발명에서의 용어, "계대 배양"이란 세포를 건강한 상태로 지속적으로 장기간 배양하기 위해 주기적으로 세포의 일부를 새로운 배양용기에 옮긴 후 배양배지를 갈아주면서 세포의 대를 계속 이어서 배양하는 방법을 의미한다. 한정된 공간을 가진 배양용기 내에서 세포의 수가 늘어나면서 일정시간이 지나면 증식 영양분이 소비되거나 오염 물질이 쌓여 세포가 자연히 죽게 되므로, 건강한 세포의 수를 늘리기 위한 방법으로 사용되며, 통상적으로 한 차례 배지(배양용기)를 교체하는 것 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 1 계대(1 passage)라고 한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 실험 재료 및 방법
1.1. 인간 소변유래줄기세포 분리 및 배양
소변유래줄기세포는 6명 이상의 다른 성별, 나이로부터 얻었으며, 소변의 중간뇨로부터 채취하여 상온에서 2시간 이내에 분리하였다. 총 100~200mL의 소변을 소변 용기에 담은 후, 50mL 튜브 4개로 나누어 담았고, 이후, 상온에서 원심분리기를 이용하여 400g에서 10분 동안 원심 분리한 후 상등액을 제거하였다. 세포를 세척하기 위해서 Antibiotic-Antimycotic (Gibco)를 넣은 PBS 15mL을 50mL 튜브에 넣고 10분 동안 400g에서 원심분리한 후 Gelatin, Matrigel이 코팅된 세포 배양 접시에 시딩하였고 Y-27632를 세포 배양 배지에 첨가하였다. 세포 분리 후 3일간 10% FBS, Antibiotic-Antimycotic (Gibco), REGM SingleQuot kit supplement (Lonza) 가 들어간 DMEM/high glucose 와 Ham’s F12 nutrient mix을 1:1로 섞은 배양 배지에서 37℃, 5% CO2 조건에서 세포배양 인큐베이터에서 배양 되었으며 3일 후부터는 REGM BulletKit (Lonza) 배양 배지로 교체하여 배양하였다.
1.2. Total RNA 분리 및 RT-PCR 분석
제조업체의 방법에 따라, Easy-Blue total RNA extraction kit (iNtRON Biotechnology, Republic of Korea)를 사용하여 Total RNA을 추출하였다. 전체 RNA의 농도는 Nanodrop (ND1000) 분광 광도계(Nanodrop Technologies Inc., Wilmington DE, USA)로 측정하였다. 2 ㎍의 총 RNA 및 M-MLV 역전사효소를 사용하여 cDNA을 합성하였고, PCR 반응이 끝난 후, 1 % 또는 1.5 % 아가로스 젤에서 분석하였다. qPCR은 SYBR Green 마스터 믹스를 사용하여 분석하였으며, mRNA 발현은 House keeping gene (GAPDH)을 기준 값으로 이용하여 계산하였다.
1.3. 웨스턴 블롯
세포 분해 완충액 [1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich), 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM NaCl, 10% glycerol (Amresco, Solon OH, USA), 50 mM sodium fluoride (Sigma-Aldrich), 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF; Sigma-Aldrich), 1 mM p-nitrophenyl phosphate (Sigma-Aldrich), and 1 mM sodiumorthovanadate (Sigma-Aldrich)]을 사용하여 용해물을 4℃에서 15분 동안 13,000 rpm으로 원심 분리 하였다. 단백질 상등액을 Bradford 단백질 시약으로 정량하였고, 단백질은 SDS-PAGE (10% 또는 12 %)를 진행하였다. 분리된 단백질은 니트로-셀률로오스 막으로 옮겨졌고, TBS(Tris-buffered saline) 용액에 녹여 있는 5% 탈지분유로 1 시간 정도 블러킹한 후, anti-OCT4, anti-SOX2, anti-NANOG 및 anti-ACTIN (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)의 1차 항체를 4℃에서 12 내지 18시간 동안 반응시켰다. 이후, HRP-tagged anti-mouse, anti-goat 또는 anti-rabbit의 2차 항체를 반응시켰으며, ECL kit(Amersham Bioscience, Piscataway NJ, USA)을 사용하여 단백질을 확인하였다.
1.4. Fibroblast colony-forming unit (CFU-F) 분석 실험
배양중인 소변유래줄기세포, 지방유래줄기세포, 탯줄줄기세포를 카운트하여 세포 배양 플레이트에 50/cm2 씩 깔아준 다음, 10-14일간 배양하여 세포의 콜로니 형성을 확인하였다. 배양 후 각 세포의 군체가 형성되면 PBS로 세포를 세척한 다음 crystal violet 시약으로 20분간 염색하고, 이후 다시 PBS로 세척한 후 콜로니를 선별하였다.
1.5. 유세포 분석
소변유래줄기세포의 유세포 분석을 위해 세포 배양 플레이트에 있는 소변유래줄기세포에 0.25% Trypsin을 3분간 처리하여 세포를 띄운 후 1,000rpm 에서 원심분리하였다. 이후, 상층액을 버리고, 1X PBS로 세척한 후 다시 원심분리하였다. 이후, Blocking Buffer (0.5% BSA, 2% FBS in PBS)를 30분 동안 얼음에서 반응시켰고, FACS Buffer (0.05% sodium azide, 0.5% BSA in PBS)가 들어간 각각의 1차 항체 (CD34, CD45, CD105, CD73, CD90)를 1시간 동안 얼음에서 반응시켰다. 세척 후, 2차 항체 (FITC, PE)를 30분 동안 얼음에서 반응시켰고, 세포들은 1X PBS로 두 차례 세척한 후, 1X PBS에 재부유하여 FACS Calibur로 분석하였다.
실시예 2. 소변유래줄기세포 분리
소변유래줄기세포를 분리하기 위하여 100~200mL의 중간뇨를 멸균된 소변통에 받은 후, 50mL conical 튜브를 이용하여 원심분리기를 이용하여 400g에서 10분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 하나의 50mL conical 튜브로 세포를 모은 후 PBS를 넣고 다시 400g에서 10분간 원심분리를 진행하였다. 분리된 소변유래줄기세포는 14일까지 배양한 후에 세포수를 측정하였고 그 다음 계대배양을 진행하였다(도 1).
본 발명자들은 분리한 소변유래줄기세포의 특성을 분석하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 소변유래줄기세포에서 Epithelial 마커인 E-cadherin, Claudin 1, Occludin의 발현을 확인하였고, Fibroblast marker인 Vimentin, Twist1, Fibronetin의 발현을 확인하였으며, Renal epithelial marker인 SLC2A1, L1CAM의 특이적인 발현을 확인하였다(도 2 위쪽 패널).
또한, 유세포분석기를 통해 소변유래줄기세포에서 성체줄기세포 양성 마커인 CD73, CD90, CD105의 발현을 확인하였고, 음성 마커인 CD34, CD45의 미발현을 확인함으로써 소변유래줄기세포가 기존에 알려진 성체줄기세포 마커와 동일한 발현 양상을 보임을 확인하였다(도 2 아래쪽 패널). 이로써, 분리된 세포가 성체줄기세포와 유사한 특성을 지닌 소변유래줄기세포임을 확인하였다.
실시예 3. 소변유래줄기세포 분리 효율 증가
소변유래줄기세포 분리를 위하여 중간뇨를 원심 분리한 후 그 세포를 세포배양 플레이트에 seeding 하였다. 세포배양 플레이트에는 Gelatin을 코팅한 그룹, Matrigel을 코팅한 그룹, 그리고 세포 배양 플레이트에 각각 Y-27632를 처리한 그룹과 처리하지 않은 그룹으로 나누어서 세포의 부착 효율을 확인하였다.
소변유래줄기세포를 분리한 후 14일 후 세포수를 확인한 결과, Gelatin 및 Y-27632를 함께 처리한 그룹(Gelatin+Y-27632)에서는 Gelatin 만을 코팅한 그룹보다 약 10배 정도의 세포 분리 효율을 보였고, Matrigel을 플레이트에 코팅한 그룹에서는 약 6배 정도의 세포 분리 효율을 보였으며, Matrigel 및 Y-27632를 함께 처리한 그룹(Matrigel+Y-27632)에서는 Gelatin 만을 코팅한 그룹보다 약 60배 정도의 세포 분리 효율을 보였다(도 3). 따라서, Matrigel을 플레이트에 코팅하고, Y-27632를 함께 처리한 경우 소변유래줄기세포의 분리 효율이 높음을 확인하였다.
실시예 4. 소변유래줄기세포의 증식률 비교
체외에서 세포를 배양하는 과정에서 종래의 상용화된 배지를 이용하여 배양하는 것보다 소변유래줄기세포의 증식률을 높인 경우 대량 배양까지의 시간을 단축할 수 있고, 이렇게 조기배양된 소변유래줄기세포를 이용하여 골 형성세포, 연골세포 및 지방세포 등의 세포로 분화하여 세포치료제로 이용할 수 있어 많은 이점이 있을 수 있다.
소변유래줄기세포의 증식률을 높이기 위하여, Gelatin 외에 Y-27632, Matrigel을 첨가하여 줄기세포를 배양하였다. 그 결과, Gelatin을 단독으로 사용한 경우보다 Y-27632를 함께 처리한 그룹에서 세포의 증식률이 증가하였고, Gelatin 보다는 Matrigel을 처리한 그룹에서 세포의 증식률이 증가하였으며, Matrigel과 Y-27632를 함께 처리한 그룹에서는 Gelatin을 단독으로 처리한 그룹보다 4배 정도의 세포의 증식률이 증가하였음을 확인하였다(도 4). 따라서, Matrigel을 플레이트에 코팅하고, Y-27632를 함께 처리한 경우 소변유래줄기세포의 증식을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 5. 소변유래줄기세포의 군체 형성 능력(colony forming capacity) 비교
본 발명자들은 성체줄기세포의 특징 중 하나인 자가 재생 능력을 비교하기 위해 CFU-F(colony-forming unit fibroblast) 분석을 수행하였다. 군체의 크기는 군체의 자가 증식력에 따라 차이를 보이는데, 즉, 크기가 작은 군체는 낮은 자가 증식력을 나타내고, 크기가 큰 군체는 높은 자가 증식력을 나타낸다.
CFU-F 분석 결과, Gelatin을 단독으로 코팅한 플레이트 보다 Y-27632를 첨가한 플레이트에서 더 많은 수의 군체 형성을 보였으며, Matrigel을 코팅한 플레이트에서도 더 많은 수의 군체 형성을 보였다. 특히, Matrigel과 Y-27632를 동시에 처리한 플레이트에서는 Gelatin을 단독으로 처리한 그룹보다 3배 정도로 많은 수의 군체 형성을 보였음을 확인하였다(도 5). 따라서, Matrigel을 플레이트에 코팅하고, Y-27632를 함께 처리한 경우 소변유래줄기세포의 증식을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 6. 지방유래줄기세포, 탯줄유래줄기세포, 소변유래줄기세포의 비교
본 발명자들은 분리한 지방유래줄기세포, 탯줄유래줄기세포 및 소변유래줄기세포에 대하여 시간별 증식률을 비교하는 실험을 수행하였다. 그 결과, 소변유래줄기세포의 경우 지방유래줄기세포 또는 탯줄유래줄기세포 보다 빠른 증식률을 보였다(도 6). 또한, 소변유래줄기세포는 지방유래줄기세포나 탯줄유래줄기세포 보다 많은 양의 세포를 확보할 수 있음을 확인하였다(도 7).
또한, 소변유래줄기세포가 지방유래줄기세포나 탯줄유래줄기세포와 마찬가지로 비슷한 수준의 군체 형성 능력이 있음을 확인하였다(도 8).

Claims (10)

  1. (a) 개체로부터 소변을 채취하는 단계;
    (b) 상기 소변을 원심분리하여 세포를 수집하는 단계;
    (c) 상기 세포를 세척한 후, 원심분리하여 세포를 제공하는 단계; 및
    (d) Matrigel이 코팅된 세포배양 접시에 세포를 접종(seeding)하고 Y-27632를 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는 소변유래줄기세포의 분리 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 소변은 소변의 중간뇨에서 채취하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포는 개체의 소변에서 채취하여 2시간 이내에 분리된 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 원심분리는 300g 내지 500g에서 5분 내지 10분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 세척은 PBS(phosphate buffered saline)에 의하여 세척되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1 항의 방법에 의해 분리된 소변유래줄기세포를 Matrigel이 코팅된 세포배양 접시에 접종(seeding)하고 Y-27632를 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는 소변유래줄기세포의 증식 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
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