KR20160125440A - 자기 조직화용 세포 집합체의 제작 방법 - Google Patents
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Abstract
in vitro 에 있어서 다수의 세포 (수만 ∼ 수백만 개) 로부터 세포 집합체의 제작에 필요한 요건을 발견함과 함께, 간장이나 신장 등의 복잡한 고차 구조나, 다른 장기와의 상호 작용을 실현하는 것이 가능한 자기 조직화용 세포 집합체의 형성 방법을 제공한다. 총 세포 수로서 40 만 개 이상의 임의의 종류의 세포 및/또는 조직과 10 만 ∼ 40 만 개의 간엽계 세포의 혼합물을 배양하여, 크기가 1 ㎜ 이상인 세포 집합체를 형성시키는 것을 포함하는, 세포 집합체를 in vitro 에서 제작하는 방법. 상기 방법으로 제작된 세포 집합체. 상기 방법으로 제작된 세포 집합체를 자기 조직화시켜, 고차 구조가 부가된 삼차원 조직 구조를 형성시키는 것을 포함하는, 삼차원 조직 구조의 제작 방법. 배양하는 측의 단면이 U 또는 V 자의 형상인 겔상 배양 지지체.
Description
본 발명은, 자기 조직화용 세포 집합체의 제작 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 목적으로 하는 조직·장기에 대한 자기 조직화를 유도하기 위해서 필요한 세포 집합체의 제작 방법에 관한 것이다.
최근, 복잡한 구조를 갖는 조직·장기를 형성하는 방법으로서, 세포가 본래 갖는 자기 조직화능 (Self-Organization) 을 이용하는 방법이 주목 받고 있다 (비특허문헌 1, 2). 자기 조직화란, 1 종류 혹은 소수의 종류의 요소가, 외부로부터 특별한 「지시」 가 되는 정보를 받지 않고, 스스로의 내재적인 특성을 발휘하여 복잡한 고차의 구조를 조합해 가는 것이다. 예를 들어, 눈의 결정 형성 등과 같이, 패턴이 없는 집합체 중에서, 자발적인 질서가 생성되어 패턴이 형성되어 가는 자연 현상이 관찰되는 것 외에, 나노 테크놀로지나 광학 결정의 제작 등에서 공학적으로도 이용되고 있다.
자기 조직화를 유도하기 위한 요건으로는, 고밀도 환경에서 균일한 세포로 이루어지는 집합체 (Aggregate) 를 형성할 필요가 있게 된다. 배양을 실시한 ES·iPS 세포로부터 Aggregate 를 제작하여, 뇌, 안배, 하수체, 치아 등을 제작하는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 3 - 6). 이와 같은, Aggregate 를 제작하기 위한 수법으로는, 저면이 U 나 V 상의 구조를 가지는 96 well 등과 같이 저면에 모이는 것과 같은 기재를 사용함으로써, 소수의 세포 (수천 개 정도) 의 세포 집합체로부터 수백 ㎛ 레벨의 조직을 형성하는 방법이 주로 이용되고 있다. 그러나, 다수의 세포 (수만 ∼ 수백만 개) 로부터 보다 대형 (200 ㎛ 이상 ∼ ) 의 세포 집합체를 형성하는 것은 달성 곤란하였다. 이 때문에, 다양한 종류의 세포로 이루어지는 Aggregate 를 제작하기 위해서는 종래의 방법을 적용하는 것은 곤란하였다.
따라서, 마우스 등의 소형 동물의 조직·장기와 비교하여, 자기 조직화를 이용하여 인간 등과 같이 대형의 복잡한 조직·장기를 제작하기 위한 집합체를 제작하는 수법의 개발이 요망되고 있었다.
Camazine, S., Deneubourg, J.-L., Franks, N. R., Sneyd, J., Theraulaz, G. ＆ Bonabeau, E. Self-Organization in Biological Systems (Princeton Univ. Press, 2001).
Takeichi, M. Self-organization of animal tissues : cadherin-mediated processes. Dev. Cell 21, 24 - 26 (2011).)
Eiraku, E. et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature 472, 51 - 56 (2011).
Eiraku, M. et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell 3, 519 - 532 (2008).
Suga, H. et al. Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture. Nature 480, 57 - 62 (2011).
Sato, T. et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature 459, 262 - 265 (2009).
발명자들은, 3 종류의 상이한 세포 계보의 시공간적인 상호 작용을 활용함으로써, 「장기의 재구성에 기초하는 장기 세포의 분화 유도」 를 실현화한 혁신적인 삼차원 배양 기술을 확립하고 있다. 즉, 장기 발생의 초기 프로세스에 필수인 장기 세포와 혈관 세포와 간엽계 세포의 세포간 상호 작용을 재현화함으로써 입체적인 장기의 원기 (장기의 종) 를 유도하여, 혈관망을 갖는 기능적인 장기의 창출을 가능하게 하는 기반 기술을 확립하고 있다 (Nature, 499 (7459), 481 - 484, PCT/JP2012/074840 : 조직 및 장기의 제작 방법).
한편, 신장이나 간장·폐장 등의 질환에 대한 의약품 개발이나 재생 의료의 실현을 목표로 하기 위해서는, 혈관 구조뿐만 아니라, 예를 들어, 요관 구조나, 담관 구조, 기관 구조 등과 같이, 추가적인 고차 구조가 부가된 3 차원적인 복잡한 구조나 세포 극성을 재현하는 것이 필수이다. 추가로 서술하면, 다른 장기와의 상호 작용을 거침으로써 목적 장기의 유도가 달성된다.
따라서, 다능성 간세포 (幹細胞) 로부터 유도된 조직이나 개체로부터 분리된 조직의 기능을 최대화하기 위해서는, 다양한 고차 구조나 타장기와의 연속성의 재구축을 가능하게 하는 삼차원 조직체의 형성이 필요하다. 그러나, 종래 고안되어 있는 방법에 있어서는, 3 종류의 세포나 조직으로부터 혈관 구조만을 갖는 조직체를 제작할 뿐이고, 보다 복잡한 고차 구조 (요관 구조나, 담관 구조, 기관 구조) 를 제작하기 위한 수법은 고안되어 있지 않았다.
본 발명에서는, in vitro 에 있어서 다수의 세포 (수만 ∼ 수백만 개) 로부터 세포 집합체의 제작에 필요한 요건을 발견함과 함께, 간장이나 신장 등의 복잡한 고차 구조나, 다른 장기와의 상호 작용을 실현하는 것이 가능한 자기 조직화용 세포 집합체의 형성 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 하기 1 ∼ 4 의 조작에 의해, 단리된 복수 종류의 세포나 조직으로부터 복잡한 고차 구조를 갖는 삼차원 조직·장기를 제작하는 것에 성공하여, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
1. 필요한 세포·조직의 조제
A) 복잡한 구조를 갖는 조직에 대한 자기 조직화에 필요한 임의의 종류의 세포나 조직을 조제한다. 종류나 조합하는 수는, 상관없다.
B) 총 세포 수로서 200 만 개 정도의, 임의의 종류의 세포나 조직으로 이루어지는 혼합액에 대하여, 단리한 간엽계 세포를 10 ∼ 40 만 개 정도 혼합한다.
2. 지지체의 제작
A) 세포 배양용의 배양 접시에, 적정한 경도의 지지체를 형성하고, 고층화한다. 이 때, 지지체의 재료로는, 하이드로 겔 (폴리아크릴아미드 겔 등) 을 사용하는 것이 바람직하지만, 그에 한정되는 것은 아니다.
B) 제작한 지지체 상에, 화학적·물리적으로 수식을 실시한다. 이 때, 지지체에 대한 수식의 부여는 필수 요건은 아니다. 화학 인자로는, 마트리겔이나 라미닌을 사용하는 것이 바람직하지만 그에 한정되는 것은 아니다.
C) 또한, 목적으로 하는 집합체의 형태·사이즈·양에 따라, 지지체의 경도는 균일할 필연성은 없고, 경도에 공간적·시간적인 구배를 설정하는 것이나 패턴화하는 것에 의해, 이후의 실험에 사용하는 것이 가능하다.
3. 세포 집합체의 제작·배양
1. 에서 제작한 세포·조직의 혼합액을, 2. 에서 제작한 지지체 상에 파종하고, 집합체를 형성한다. 형성된 집합체는, 배양 기간을 연장함으로써, 시험관 내에 있어서 목적으로 하는 장기의 자기 조직화에 사용하는 것이 가능하다.
또한, 저면에 세포가 모이는 것과 같은 배양 기재와 간엽계 세포를 조합하는 것에 의해서도, 소수의 세포로부터라면 집합체를 제작하는 것이 가능하다.
4. 세포 집합체의 이식
3. 에서 제작한 집합체를 장기 배양이나 생체 내에 이식함으로써, 혈액 관류를 유도하고, 복잡한 구조를 갖는 고차 조직으로의 자기 조직화시킴으로써, 성체 조직과 동등한 고도로 질서 있는 조직 구조를 갖는 조직·장기를 제작하는 것이 가능해진다.
이와 같이 간엽계 세포와 지지체의 물리·화학 특성을 조합함으로써, 임의의 종류의 세포로 이루어지는 복잡한 세포 집합체를 제작하는 수법은 과거에는 존재하지 않아, 신규성이 매우 높은 방법인 것으로 생각된다.
본 발명의 요지는 이하와 같다.
(1) 임의의 종류의 세포 및/또는 조직과 간엽계 세포의 혼합물을 배양하여, 세포 집합체를 형성시키는 것을 포함하는, 세포 집합체를 in vitro 에서 제작하는 방법.
(2) 세포 집합체가, 자기 조직화에 의해, 고차 구조가 부가된 삼차원 조직 구조를 형성할 수 있는 것인 (1) 에 기재된 방법.
(3) 임의의 종류의 세포 및/또는 조직과 간엽계 세포의 혼합물을 간엽계 세포가 수축 가능한 겔상 지지체 상에서 배양하는 (1) 또는 (2) 에 기재된 방법.
(4) 배양이 이차원 배양인 (3) 에 기재된 방법.
(5) 겔상 지지체가 평면이거나, 혹은, 겔상 지지체의 배양하는 측의 단면이 U 또는 V 자의 형상인 (3) 또는 (4) 에 기재된 방법.
(6) 겔상 지지체의 중심부의 경도가 주변부의 경도보다 단단한 (3) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(7) 겔상 지지체의 주변부의 경도가 중심부의 경도보다 단단한 (3) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(8) 겔상 지지체가 패턴화되어 있고, 중심부의 경도가 주변부의 경도보다 단단하다고 하는 패턴을 1 개 이상 갖는 (3) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(9) 겔상 지지체가 패턴화되어 있고, 주변부의 경도가 중심부의 경도보다 단단하다고 하는 패턴을 1 개 이상 갖는 (3) ∼ (5) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(10) 임의의 종류의 세포 및/또는 조직이 총 세포 수로서 40 만 개 이상이고, 간엽계 세포가 10 만 ∼ 40 만 개인 (1) ∼ (9) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(11) 세포 집합체의 크기가 1 ㎜ 이상인 (1) ∼ (10) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(12) 세포 집합체의 형성이 자율적인 것인 (1) ∼ (11) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(13) 족장 재료를 사용하지 않고, 임의의 종류의 세포 및/또는 조직과 간엽계 세포의 혼합물을 배양하는 (1) ∼ (12) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(14) 간엽계 세포와 혼합하는 세포 및/또는 조직이, 간장, 췌장, 장, 폐, 신장, 심장, 뇌 또는 암에서 유래하는 (1) ∼ (13) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(15) 간엽계 세포와 혼합하는 세포가, 다능성 세포인 (1) ∼ (13) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(16) 간엽계 세포와 혼합하는 조직이, 다능성 세포로부터 유도된 조직인 (1) ∼ (13) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(17) 다능성 세포가, 생체로부터 얻어진 다능성 세포, 재프로그램으로부터 유도되어 얻어진 다능성 세포, 또는 그들의 조합인 (15) 또는 (16) 에 기재된 방법.
(18) (1) ∼ (17) 중 어느 하나에 기재된 방법으로 제작된 세포 집합체.
(19) (1) ∼ (17) 중 어느 하나에 기재된 방법으로 제작된 세포 집합체를 자기 조직화시켜, 고차 구조가 부가된 삼차원 조직 구조를 형성시키는 것을 포함하는, 삼차원 조직 구조의 제작 방법.
(20) 배양하는 측의 단면이 U 또는 V 자의 형상인 겔상 배양 지지체.
(21) 중심부의 경도가 주변부의 경도보다 단단한 겔상 배양 지지체.
(22) 주변부의 경도가 중심부의 경도보다 단단한 겔상 배양 지지체.
(23) 중심부의 경도가 주변부의 경도보다 단단하다고 하는 패턴을 1 개 이상 갖는 겔상 배양 지지체.
(24) 주변부의 경도가 중심부의 경도보다 단단하다고 하는 패턴을 1 개 이상 갖는 겔상 배양 지지체.
(25) (20) ∼ (24) 중 어느 하나에 기재된 겔상 배양 지지체 상에서, 임의의 종류의 세포 및/또는 조직과 간엽계 세포의 혼합물을 배양하여, 세포 집합체를 형성시키는 것을 포함하는, 세포 집합체를 in vitro 에서 제작하는 방법.
본 발명에 의하면, 간엽계 간세포와 지지체, 내지, 저면에 모이는 것과 같은 기재를 조합함으로써, 이론상 어떤 복잡한 조성의 집합체도 형성하는 것이 가능해진다. 본 발명에 의해, 족장 재료 (스캐폴드) 를 사용하지 않고, 조직·장기의 구축이 가능해진다.
제 1 로, 보다 복잡한 조직·장기의 인위적 구성계로서의 활용이 기대된다. 예를 들어, 혈관망 이외에도 요관 구조나, 담관 구조, 기관 구조 등과 같이, 추가적인 고차 구조가 부가된 3 차원적인 복잡한 구조를 제작할 수 있을 가능성이 있다. 또한, 간장 등과 같이, 그 기능 발현을 위해서는, 간장뿐만 아니라, 담관이나 췌관과의 합류, 십이지장으로의 연결 등 타장기와의 연관의 재구성이 필수가 되는 장기가 다수 존재한다. 본 발명에 의해, 다른 장기와의 상호 작용을 재현하는 집합체를 제작함으로써, 체내에 존재하는 복잡한 장기의 자기 조직화 유도계로서의 활용이 기대된다.
제 2 로, 저렴하고, 비교적 용이하게 가공하는 것이 가능한 지지체를 사용하고 있기 때문에, 대량의 조직 창출을 목표로 하는 산업 응용상의 유용성이 높다. 지지체의 멀티 패턴화 등의 수법을 조합함으로써, 저비용으로, 임의의 형태·사이즈·수의 대량 조직 제작이 가능해진다.
iPS 세포 등의 간세포로부터 제조한 세포 응집체로부터 자기 조직화한 입체적인 조직체를 구축함으로써, 지금까지 달성이 곤란했던 인간 기능 세포의 창출, 조직·장기 이식, 창약 스크리닝, 약제의 효과 발현과 지지 조직 (혈관, 신경, 간질 등), 의 관련성 등을 평가하는 새로운 해석계 등에 대한 응용이 가능하다.
본 명세서는, 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원, 특원 2014-037341 의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
도 1 은 간엽계 세포의 수축에 의한 세포 집합체의 제작이다. (A) 세포 집합체 형성 과정의 시간 경과적 변화. (녹색) iPSC-간 내배엽 세포, (엷은 적색) 인간 혈관 내피 세포, (무색) 간엽계 세포. (B) 자기 조직화한 iPSC 또는 iPS 세포 유래 간아의 형성. (C) 세포 집합체 형성의 시간 발전 다이나믹스. (적색) 집합체 투영 면적의 평방근. 집합체 외주부의 위치를 나타내는 지표로서 사용할 수 있다. 약 13 h 이후에는 지수 함수 (흑색 점선) 로 잘 근사할 수 있다. (청색) 집합체의 원형도. 집합체의 투영 면적과 외주 길이로부터 계산하였다. (D) 세포 집합체 형성에 있어서의 간엽계 세포의 필요성. (E) 각종 화학 물질을 사용한 세포 집합체 형성 과정의 저해 실험. (F) 활성화형 미오신 함유율의 시간 변화와 그 저해.
도 2 는 세포 집합체 형성에 있어서의 경도 환경의 지적화이다. (A, B) 다양한 경도 조건하에 있어서의 세포 집합체 형성 실험. (A) 는 배양 48 시간 후의 육안 관찰 사진. (B) 는 공초점 레이저 현미경에 의한 세포 이동의 시간 변화를 나타낸다. (C-G) 세포 집합체 중의 MSCs 의 궤적 (C), 이동 속도 및 운동 배향성의 시간 의존성 (D, E) 과 기판 경도 의존성 (F, G).
도 3 은 다양한 조직에서 유래하는 세포를 사용한 자기 조직화용 집합체 형성 실험이다. (A, B) 췌장 β 세포를 사용한 세포 집합체 형성 (A) 와 자기 조직화 (B) (C, D) 다른 장기의 세포·조직을 사용한 세포 집합체 형성 실험
도 4 는 다양한 조직에서 유래하는 세포 집합체의 in vivo 자기 조직화와 기능 발현이다. (A) 이식에 의해 2 - 3 일 동안 기능적인 혈관화가 발생한다. (B) 종래법과 비교하여, 혈액 관류에 필요로 하는 시간의 비교. (C) 마우스 혈관과 인간 혈관의 직접 문합 (吻合). (D) 태아 신장 세포로부터 형성한 집합체가 형성된 사구체·요세관. (E) β 세포로부터 형성된 집합체가 형성된 췌도 (膵島) 유사 조직. (F) β 세포로부터 형성된 집합체의 치료 효과 판정 모델. (G) β 세포로부터 형성한 집합체를 이식한 당뇨병 모델 마우스에 있어서의 혈당치의 시간 경과적 변화.
도 5 는 각 경도 조건에 있어서의 세포 집합체 중의 MSCs 의 궤적, 이동 속도 및 운동 배향성의 시간 변화이다.
도 6 은 각종 저해 물질을 사용한 세포 집합체 형성 과정의 시간 경과적 관찰이다.
도 7 은 성체 신장 조직을 사용한 세포 집합체의 in vivo 자기 조직화이다.
도 8 은 태아 폐 조직을 사용한 세포 집합체의 in vivo 자기 조직화이다.
도 9 는 β 세포를 사용한 세포 집합체의 in vivo 혈관 도입 과정의 추적이다.
도 10 은 β 세포를 사용한 세포 집합체의 in vivo 호스트 혈관과의 접속 부위의 관찰이다.
도 11 은 β 세포를 사용한 세포 집합체로부터 형성된 조직의 조직학적 해석이다.
도 12 는 U 보텀 겔의 단면도이다.
도 13 은 (A) 혈관 내피 세포를 포함하지 않는 세포 집합체의 형성이다. (B) 인간 또는 마우스 간엽계 세포를 사용한 세포 집합체의 형성이다.
도 14 는 U 보텀 겔을 사용한 세포 집합체의 형성이다.
도 15 는 지지체 상에서 제작한 신장 원기 이식에 의한 기능적인 혈관망의 재구성이다.
도 16 은 이식을 실시한 신장 원기의 성숙화이다.
도 17 은 이식 후 성숙한 신장 원기의 구조학적 해석이다.
도 18 은 이식을 실시한 신장 원기의 원뇨 생성 기능의 라이브 관찰이다.
도 19 는 생화학 물질 코팅 전후의 지지체의 경도 특성의 계측이다.
도 20 은 경도의 멀티 패턴을 가진 지지체의 제작이다.
도 21 은 경도의 멀티 패턴을 가진 지지체 상에서의 세포 집합체의 제작이다.
도 22 는 복잡한 멀티 패턴을 가진 지지체 상의 제작이다.
도 2 는 세포 집합체 형성에 있어서의 경도 환경의 지적화이다. (A, B) 다양한 경도 조건하에 있어서의 세포 집합체 형성 실험. (A) 는 배양 48 시간 후의 육안 관찰 사진. (B) 는 공초점 레이저 현미경에 의한 세포 이동의 시간 변화를 나타낸다. (C-G) 세포 집합체 중의 MSCs 의 궤적 (C), 이동 속도 및 운동 배향성의 시간 의존성 (D, E) 과 기판 경도 의존성 (F, G).
도 3 은 다양한 조직에서 유래하는 세포를 사용한 자기 조직화용 집합체 형성 실험이다. (A, B) 췌장 β 세포를 사용한 세포 집합체 형성 (A) 와 자기 조직화 (B) (C, D) 다른 장기의 세포·조직을 사용한 세포 집합체 형성 실험
도 4 는 다양한 조직에서 유래하는 세포 집합체의 in vivo 자기 조직화와 기능 발현이다. (A) 이식에 의해 2 - 3 일 동안 기능적인 혈관화가 발생한다. (B) 종래법과 비교하여, 혈액 관류에 필요로 하는 시간의 비교. (C) 마우스 혈관과 인간 혈관의 직접 문합 (吻合). (D) 태아 신장 세포로부터 형성한 집합체가 형성된 사구체·요세관. (E) β 세포로부터 형성된 집합체가 형성된 췌도 (膵島) 유사 조직. (F) β 세포로부터 형성된 집합체의 치료 효과 판정 모델. (G) β 세포로부터 형성한 집합체를 이식한 당뇨병 모델 마우스에 있어서의 혈당치의 시간 경과적 변화.
도 5 는 각 경도 조건에 있어서의 세포 집합체 중의 MSCs 의 궤적, 이동 속도 및 운동 배향성의 시간 변화이다.
도 6 은 각종 저해 물질을 사용한 세포 집합체 형성 과정의 시간 경과적 관찰이다.
도 7 은 성체 신장 조직을 사용한 세포 집합체의 in vivo 자기 조직화이다.
도 8 은 태아 폐 조직을 사용한 세포 집합체의 in vivo 자기 조직화이다.
도 9 는 β 세포를 사용한 세포 집합체의 in vivo 혈관 도입 과정의 추적이다.
도 10 은 β 세포를 사용한 세포 집합체의 in vivo 호스트 혈관과의 접속 부위의 관찰이다.
도 11 은 β 세포를 사용한 세포 집합체로부터 형성된 조직의 조직학적 해석이다.
도 12 는 U 보텀 겔의 단면도이다.
도 13 은 (A) 혈관 내피 세포를 포함하지 않는 세포 집합체의 형성이다. (B) 인간 또는 마우스 간엽계 세포를 사용한 세포 집합체의 형성이다.
도 14 는 U 보텀 겔을 사용한 세포 집합체의 형성이다.
도 15 는 지지체 상에서 제작한 신장 원기 이식에 의한 기능적인 혈관망의 재구성이다.
도 16 은 이식을 실시한 신장 원기의 성숙화이다.
도 17 은 이식 후 성숙한 신장 원기의 구조학적 해석이다.
도 18 은 이식을 실시한 신장 원기의 원뇨 생성 기능의 라이브 관찰이다.
도 19 는 생화학 물질 코팅 전후의 지지체의 경도 특성의 계측이다.
도 20 은 경도의 멀티 패턴을 가진 지지체의 제작이다.
도 21 은 경도의 멀티 패턴을 가진 지지체 상에서의 세포 집합체의 제작이다.
도 22 는 복잡한 멀티 패턴을 가진 지지체 상의 제작이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은, 임의의 종류의 세포 및/또는 조직과 간엽계 세포의 혼합물을 배양하여, 세포 집합체를 형성시키는 것을 포함하는, 세포 집합체를 in vitro 에서 제작하는 방법을 제공한다.
간엽계 세포는, 주로 중배엽에서 유래하는 결합 조직에 존재하고, 조직에서 기능하는 세포의 지지 구조를 형성하는 결합 조직 세포이지만, 본 명세서에 있어서, 「간엽계 세포」 란, 간엽계 세포에 대한 분화 운명이 결정되어 있지만, 아직 간엽계 세포로 분화되어 있지 않은 세포도 포함하는 개념이다. 본 발명에 사용하는 간엽계 세포는, 분화한 것이어도 되고, 미분화인 것이어도 되지만, 미분화 간엽계 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 어느 세포가 미분화 간엽계 세포인지 여부는, 마커 단백질, 예를 들어, Stro-1, CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD133, CD271, Nestin 이 발현하고 있는지 여부를 조사하는 것에 의해 확인할 수 있다 (상기 마커 단백질의 어느 하나 혹은 복수가 발현하고 있으면 미분화 간엽계 세포라고 판단할 수 있다). 또한, 전항의 마커 모두가 발현하고 있지 않은 간엽계 세포는 분화 간엽계 세포라고 판단할 수 있다. 당업자 사이에서 사용되고 있는 용어 중, mesenchymal stem cells, mesenchymal progenitor cells, mesenchymal cells (R. Peters, et al. PLoS One. 30 ; 5 (12) : e15689. (2010)) 등은 간엽계 세포에 포함된다. 간엽계 세포는, 주로 인간 유래의 것을 사용하지만, 인간 이외의 동물 (예를 들어, 실험 동물, 애완 동물, 사역 동물, 경주마, 투견 등에 이용되는 동물, 구체적으로는, 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 개, 원숭이, 소, 말, 양, 닭, 상어, 가오리, 은상어, 연어, 새우, 게 등) 유래의 간엽계 세포를 사용해도 된다.
간엽계 세포와 혼합하는 임의의 종류의 세포 및/또는 조직은, 종류나 조합하는 수를 불문하고, 어떠한 세포 및/또는 조직이어도 된다. 또한, 세포 및/또는 조직의 유래도 상관없고, 간장, 췌장, 장, 폐, 신장, 심장, 뇌 등의 어떠한 장기 또는 조직에서 유래하는 것이어도 되고, 혹은 또한, 암에서 유래하는 것이어도 된다. 간엽계 세포와 혼합하는 세포는, 장기나 조직을 구성하는 기능 세포, 또는 기능 세포로 분화하는 미분화 세포나 다능성 세포인 것이 바람직하다. 또한, 간엽계 세포와 혼합하는 조직은, 개체로부터 분리된 조직이어도 되고, 장기나 조직을 구성하는 기능 세포, 또는 기능 세포로 분화하는 미분화 세포나 다능성 세포로부터 유도된 조직이어도 된다.
미분화 세포로는, 예를 들어, 신장, 심장, 폐, 비장, 식도, 위, 갑상선, 부갑상선, 흉선, 생식선, 뇌, 척수 등의 기관으로 분화 가능한 세포 등이어도 되고, 뇌, 척수, 부신속질, 표피, 모발·손톱·피부선, 감각기, 말초 신경, 수정체 등의 외배엽성 기관으로 분화 가능한 세포, 신장, 요관, 심장, 혈액, 생식선, 부신피질, 근육, 골격, 진피, 결합 조직, 중피 등의 중배엽성 기관으로 분화 가능한 세포, 간장, 췌장, 장관, 폐, 갑상선, 부갑상선, 요로 등의 내배엽성 기관으로 분화 가능한 세포 등을 들 수 있다. 어느 세포가 외배엽성 기관, 중배엽성 기관 또는 내배엽성 기관으로 분화 가능한 세포인지 여부는, 마커가 되는 단백질의 발현을 조사함으로써 확인할 수 있다 (마커 단백질의 어느 하나 혹은 복수가 발현하고 있으면 내배엽성 기관으로 분화 가능한 세포인 것으로 판단할 수 있다). 예를 들어, 간장으로 분화 가능한 세포에서는, HHEX, SOX2, HNF4A, AFP, ALB 등이 마커가 되고, 췌장으로 분화 가능한 세포에서는, PDX1, SOX17, SOX9 등이 마커가 되고, 장관으로 분화 가능한 세포에서는, CDX2, SOX9 등이 마커가 되고, 신장으로 분화 가능한 세포에서는, SIX2, SALL1, 심장으로 분화 가능한 세포에서는, NKX2-5 MYH6, ACTN2, MYL7, HPPA, 혈액으로 분화 가능한 세포에서는, C-KIT, SCA1, TER119, HOXB4, 뇌나 척수로 분화 가능한 세포에서는, HNK1, AP2, NESTIN 등이 마커가 된다. 당업자 사이에서 사용되고 있는 용어 중, hepatoblast, hepatic progenitor cells, pancreatoblast, hepatic precursor cells, pancreatic progenitors, pancreatic progenitor cells, pancreatic precursor cells, endocrine precursors, intestinal progenitor cells, intestinal precursor cells, intermediate mesoderm, metanephric mesenchymal precursor cells, multipotent nephron progenitor, renal progenitor cells, cardiac mesoderm, cardiovascular progenitor cells, cardiac progenitor cells, (JR. Spence, et al. Nature. ; 470 (7332) : 105 - 9. (2011), Self, et al. EMBO J. ; 25 (21) : 5214 - 5228. (2006), J. Zhang, et al. Circulation Research. ; 104 : e30-e41 (2009), G. Lee, et al. Nature Biotechnology 25, 1468 - 1475 (2007)) 등은 본 발명에 있어서의 미분화 세포에 포함된다. 다능성 세포로는, 생체로부터 얻어진 다능성 세포 (예를 들어, ES 세포, 재프로그램으로부터 유도하여 얻어진 다능성 세포 (예를 들어, iPS 세포, STAP 세포 (Stimulus-triggered fate conversion of somatic cells into pluripotency. Nature, 2014), MUSE 세포 (Multilineage-differentiating stress-enduring (Muse) cells are a primary source of induced pluripotent stem cells in human fibroblasts. PNAS, 2011), iMPC 세포 (induced multipotent progenitor cell ; Mouse liver repopulation with hepatocytes generated from human fibroblasts. Nature, 2014)), 그들의 조합 등을 예시할 수 있다. 미분화 세포는, 인공 다능성 간세포 (iPS 세포), 배성 간세포 (ES 세포) 등의 다능성 간세포로부터 공지된 방법에 따라 제작할 수 있다. 예를 들어, 간장으로 분화 가능한 세포는, K. Si-Taiyeb, et al. Hepatology, 51 (1) : 297 - 305 (2010), T. Touboul, et al. Hepatology. 51 (5) : 1754 - 65. (2010) 에 따라 제작할 수 있고, 췌장으로 분화 가능한 세포는, D. Zhang, et al. Cell Res. ; 19 (4) : 429 - 38. (2009) 에 따라 제작할 수 있고, 장관으로 분화 가능한 세포는, J. Cai, et al. J Mol Cell Biol. ; 2 (1) : 50 - 60 (2010), R. Spence, et al. Nature. ; 470 (7332) : 105-9. (2011) 에 따라 제작할 수 있고, 심장으로 분화 가능한 세포는, J. Zhang, et al. Circulation Research. ; 104 : e30-e41 (2009) 에 따라 제작할 수 있고, 뇌나 척수로 분화 가능한 세포에서는, G. Lee, et al. Nature Biotechnology 25, 1468 - 1475 (2007) 에 따라 제작할 수 있다. 장기나 조직을 구성하는 기능 세포로는, 췌장의 내분비 세포, 췌장의 췌관 상피 세포, 간장의 간 세포 (肝細胞), 장관의 상피 세포, 신장의 요세관 상피 세포, 신장의 사구체 상피 세포, 심장의 심근 세포, 혈액의 림프구나 과립구, 적혈구, 뇌의 신경 세포나 글리얼 세포, 척수의 신경 세포나 슈반 세포 등을 예시할 수 있다. 세포는, 주로 인간 유래의 것을 사용하지만, 인간 이외의 동물 (예를 들어, 실험 동물, 애완 동물, 사역 동물, 경주마, 투견 등에 이용되는 동물, 구체적으로는, 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 개, 원숭이, 소, 말, 양, 닭, 상어, 가오리, 은상어, 연어, 새우, 게 등) 유래의 세포를 사용해도 된다.
세포 집합체에 혈관계를 부여하고자 하는 경우에는, 임의의 종류의 세포 및/또는 조직과 간엽계 세포의 혼합물에, 추가로 혈관 세포를 첨가하면 된다. 혈관 세포는, 혈관 조직으로부터 분리할 수 있지만, 혈관 조직으로부터 분리된 세포에 한정되는 것은 아니고, iPS 세포나 ES 세포 등의 전능성 혹은 다능성을 갖는 세포로부터 분화 유도된 것이어도 된다. 혈관 세포로는, 혈관 내피 세포가 바람직하고, 본 명세서에 있어서, 「혈관 내피 세포」 란, 혈관 내피를 구성하는 세포, 또는 그러한 세포로 분화할 수 있는 세포 (예를 들어, 혈관 내피 전구 세포, 혈관 내피 간세포 등) 를 말한다. 어느 세포가 혈관 내피 세포인지 여부는, 마커 단백질, 예를 들어, TIE2, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, VE-cadherin, CD31 이 발현하고 있는지 여부를 조사함으로써 확인할 수 있다 (상기 마커 단백질의 어느 하나 혹은 복수가 발현하고 있으면 혈관 내피 세포인 것으로 판단할 수 있다). 또한, 혈관 내피 전구 세포의 마커로는, c-kit, Sca-1 등이 보고되어 있고, 이들 마커의 발현에 의해, 혈관 내피 전구 세포인 것을 확인할 수 있다 (S Fang, et al. PLOS Biology. 2012 ; 10(10) : e1001407.). 당업자 사이에서 사용되고 있는 용어 중, endothelial cells, umbilical vein endothelial cells, endothelial progenitor cells, endothelial precursor cells, vasculogenic progenitors, hemangioblast (HJ. Joo, et al.Blood. 25 ; 118 (8) : 2094-104. (2011)) 등은 본 발명에 있어서의 혈관 내피 세포에 포함된다. 혈관 세포는, 주로 인간 유래의 것을 사용하지만, 인간 이외의 동물 (예를 들어, 실험 동물, 애완 동물, 사역 동물, 경주마, 투견 등에 이용되는 동물, 구체적으로는, 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 개, 원숭이, 소, 말, 양, 닭, 상어, 가오리, 은상어, 연어, 새우, 게 등) 등의 동물 유래의 혈관 세포를 사용해도 된다. 혈관 세포는, 제대혈, 제대혈관, 신생아 조직, 간장, 대동맥, 뇌, 골수, 지방 조직 등으로부터 얻어진다.
본 명세서에 있어서, 「혈관계」 란, 혈관 내피 세포 및 그 지지 세포로 이루어지는 구조를 말하며, 혈관계는, 조직을 유지할 뿐만 아니라, 그 성숙화 과정에 있어서도 중요한 역할을 담당하고 있다. 혈관 구조는, 이식한 후에, 조직이 생존하기 위해서 필요한 산소 및 영양소 등을 조직 내부에 송달하는 역할을 가지고 있을 뿐만 아니라, (내부에 혈액이 유입되기 이전에도, ) 혈관을 수반하는 삼차원적인 조직 구조나 세포 극성을 재현하는 것이 세포의 분화·증식·유지에 중요한 것으로 생각되고 있다. 따라서, 혈관을 갖지 않는 조직은, 단순히, 이식 후에 정착하지 않고 내부가 괴사하는 것 뿐만 아니라, 혈관화에 수반하는 조직의 성숙화가 달성되지 않아, 충분한 기능을 발휘하는 것이 곤란하였다.
본 명세서에 있어서, 「혈관계를 부여한다」 및 「혈관화」 란, 혈관 내피 세포 및 지지 세포로 이루어지는 혈관계가, 대상으로 하는 조직과 직접 통합하는 것을 말하고, 혈관계가 부여된 생물학적 조직을 생체에 이식하면, 혈관의 성숙화가 관찰되고, 호스트 혈관과 접속하여, 혈관 관류가 개시되고, 혈관망을 갖는 기능적인 조직·장기로의 유도가 가능해진다.
본 발명에 있어서, 예를 들어, 총 세포 수로서 40 만 개 이상 (바람직하게는, 40 만 개 ∼ 440 만 개, 보다 바람직하게는, 200 만 개 정도) 의 임의의 종류의 세포 및/또는 조직과 4 만 개 이상 (바람직하게는, 5 만 ∼ 100 만 개, 보다 바람직하게는, 10 만 ∼ 40 만 개) 의 간엽계 세포의 혼합물을 배양하는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법에 의해, 세포 집합체가 자율적으로 형성되어, 다양한 크기, 예를 들어, 크기가 1 ㎜ 이상 (바람직하게는, 1 ∼ 20 ㎜, 보다 바람직하게는, 1 ∼ 8 ㎜) 인 세포 집합체를 형성시킬 수 있다. 임의의 종류의 세포 및/또는 조직과 간엽계 세포의 비는, 원하는 크기의 세포 집합체를 형성할 수 있는 범위이면, 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 세포의 수비는, 임의의 종류의 세포 및/또는 조직 : 간엽계 세포 = 10 : 0.5 ∼ 3 이다.
혈관 세포를 첨가하는 경우에는, 총 세포 수로서 40 만 개 이상 (바람직하게는, 40 만 개 ∼ 440 만 개, 보다 바람직하게는, 200 만 개 정도) 의 임의의 종류의 세포 및/또는 조직과 4 만 개 이상 (바람직하게는, 5 만 ∼ 100 만 개, 보다 바람직하게는, 10 만 ∼ 40 만 개) 의 간엽계 세포에, 4000 개 이상 (바람직하게는, 2 만 ∼ 40 만 개, 보다 바람직하게는, 4 만 ∼ 28 만 개) 의 혈관 세포를 첨가하는 것이 바람직하다. 임의의 종류의 세포 및/또는 조직과 간엽계 세포와 혈관 세포의 비는, 원하는 크기의 세포 집합체를 형성할 수 있는 범위이면, 특별히 한정되지 않지만, 바람직한 세포의 수비는, 임의의 종류의 세포 및/또는 조직 : 간엽계 세포 : 혈관 세포 = 10 : 1 ∼ 3 : 0.1 ∼ 7 이다.
임의의 종류의 세포 및/또는 조직과 간엽계 세포의 혼합물은, 이차원 배양으로, 세포 집합체를 형성할 수 있다. 배양시에 사용하는 배지는, 세포 집합체가 형성되는 것이면, 어떠한 배지여도 되지만, 목적으로 하는 조직의 자기 조직화 유도를 촉진시키는 조성이 바람직하다. 예를 들어, 생체 내로의 이식으로부터 자기 조직화를 유도하는 경우에는, 혈관 내피 세포용의 배지와 목적으로 하는 장기 세포의 배지를 1 : 1 로 혼합한 것을 사용하는 것이 바람직하다. 혈관 내피 세포용의 배지로는, EGM (등록상표) BulletKit (등록상표) (Lonza CC-4133) 나 EGM-2 (등록상표) BulletKit (Lonza CC-3162), EGM-2 (등록상표) MV (Lonza CC-3156) 등의 어느 것을 사용하는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 장기 세포용 배지의 예로는, 성체의 신장 세포이면, RPMI1640 (Wako) 중에, 20 ％ fetal bovine serum (BWT Lot.S-1560), 100 ㎍/㎖ penicillin/streptomycin (Gibco), Insulin-Transferrin-SeleniumX (GIBCO) 를 첨가한 것을 사용하는 것이 바람직하다. 태아의 신장 세포이면, D-MEM High-Glucose (Wako 043-30085), 10 ％ fetal bovine serum (BWT Lot.S-1560), 100 ㎍/㎖ penicillin/streptomycin (Gibco) 등을 사용하는 것이 바람직하다.
임의의 종류의 세포 및/또는 조직과 간엽계 세포의 혼합물은, 간엽계 세포가 수축 가능한 겔상 지지체 상에서 배양하는 것이 바람직하다.
간엽계 세포의 수축은, (현미경, 내지 육안으로) 형태학적으로 입체 조직 형성을 확인하는 것이나, 약수저 등에 의한 회수에 수반하여 조직의 형상이 유지되는 강도를 갖는 것을 나타내는 등 (Takebe et al. Nature 499 (7459), 481-484, 2013)) 과 같이 하여 확인할 수 있다.
지지체는, 적정한 경도 (예를 들어, 영률 200 ㎪ 이하 (마트리겔을 코트한 형상이 평탄한 겔인 경우 등) 이지만, 지지체의 적정한 경도는 코팅과 형상에 따라 변화할 수 있다) 를 갖는 겔상 기재이면 되고, 그러한 기재로는, 하이드로 겔 (예를 들어, 아크릴아미드 겔, 젤라틴, 마트리겔 등) 등을 예시할 수 있지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 목적으로 하는 집합체의 형태·사이즈·양에 따라, 지지체의 경도는 균일할 필연성은 없고, 경도에 공간적·시간적인 구배를 설정하는 것 (예를 들어, 후술하는 실시예 6) 이나 패턴화하는 (예를 들어, 후술하는 실시예 7) 것이 가능하다. 지지체의 경도가 균일한 경우에는, 지지체의 경도는, 바람직하게는, 100 ㎪ 이하, 보다 바람직하게는 1 ∼ 50 ㎪ 이다. 겔상 지지체는, 평면이어도 되고, 혹은, 겔상 지지체의 배양하는 측의 단면이 U 또는 V 자의 형상이어도 된다. 겔상 지지체의 배양하는 측의 단면이 U 또는 V 자의 형상임으로써, 지지체의 배양면에 세포가 모이게 되고, 보다 적은 수의 세포 및/또는 조직으로 세포 집합체가 형성되기 때문에 유리하다. 또한, 지지체에, 화학적·물리적인 수식을 실시해도 된다. 수식 물질로는, 마트리겔, 라미닌, 엔탁틴, 콜라겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴 등을 예시할 수 있다.
겔상 배양 지지체의 경도에 공간적인 구배를 설정한 일례는, 중심부의 경도가 주변부의 경도보다 단단한 겔상 배양 지지체 (후술하는 실시예 6, 도 20 및 21) 이다. 중심부의 경도는, 200 ㎪ 이하가 적정하고, 주변부의 경도는, 중심부보다 부드러우면 되지만, 지지체의 중심부와 주변부의 적정한 경도는 코팅과 형상에 따라 변화할 수 있다. 겔상 배양 지지체의 경도에 공간적인 구배를 설정한 다른 일례는, 주변부의 경도가 중심부의 경도보다 단단한 겔상 배양 지지체이다.
패턴화한 겔상 배양 지지체의 일례는, 중심부의 경도가 주변부의 경도보다 단단하다고 하는 패턴을 1 개 이상 갖는 겔상 배양 지지체 (후술하는 실시예 7, 도 22 왼쪽, 포지티브 패턴) 이다. 중심부의 경도는, 200 ㎪ 이하가 적정하고, 주변부의 경도는, 중심부보다 부드러우면 되지만, 지지체의 중심부와 주변부의 적정한 경도는 코팅과 형상에 따라 변화할 수 있다. 패턴화한 겔상 배양 지지체의 다른 일례는, 주변부의 경도가 중심부의 경도보다 단단하다고 하는 패턴을 1 개 이상 갖는 겔상 배양 지지체 (후술하는 실시예 7, 도 22 오른쪽, 네거티브 패턴) 이다. 주변부의 경도는, 200 ㎪ 이하가 적정하고, 중심부의 경도는, 주변부보다 부드러우면 되지만, 지지체의 중심부와 주변부의 적정한 경도는 코팅과 형상에 따라 변화할 수 있다.
배양시의 온도는 특별히 한정되지 않지만, 30 ∼ 40 ℃ 로 하는 것이 바람직하고, 37 ℃ 로 하는 것이 더욱 바람직하다. 조직이 대형화할 때에는, 배양기 내의 산소 공급량을 높이는 것이 바람직하다. 산소 공급량은, 4 ％ ∼ 50 ％ 가 적당하고, 10 ％ ∼ 30 ％ 가 바람직하고, 18 ％ ∼ 25 ％ 가 보다 바람직하다.
배양 기간은 특별히 한정되지 않지만, 12 ∼ 144 시간으로 하는 것이 바람직하고, 예를 들어, 간장으로부터 분리한 세포 및/또는 조직으로부터 0.4 ∼ 10 ㎜ 의 크기의 세포 집합체를 형성시키려면, 12 ∼ 48 시간으로 하는 것이 바람직하고, 췌장으로부터 분리한 세포 및/또는 조직으로부터 0.4 ∼ 10 ㎜ 의 크기의 세포 집합체를 형성시키려면, 12 ∼ 144 시간으로 하는 것이 바람직하고, 장으로부터 분리한 세포 및/또는 조직으로부터 0.4 ∼ 3 ㎜ 의 크기의 세포 집합체를 형성시키려면, 12 ∼ 96 시간으로 하는 것이 바람직하고, 폐로부터 분리한 세포 및/또는 조직으로부터 0.4 ∼ 1 ㎜ 의 크기의 세포 집합체를 형성시키려면, 12 ∼ 96 시간으로 하는 것이 바람직하고, 심장으로부터 분리한 세포 및/또는 조직으로부터 0.4 ∼ 10 ㎜ 의 크기의 세포 집합체를 형성시키려면, 12 ∼ 96 시간으로 하는 것이 바람직하고, 신장으로부터 분리한 세포 및/또는 조직으로부터 0.4 ∼ 5 ㎜ 의 크기의 세포 집합체를 형성시키려면, 12 ∼ 144 시간으로 하는 것이 바람직하고, 뇌로부터 분리한 세포 및/또는 조직으로부터 0.4 ∼ 10 ㎜ 의 크기의 세포 집합체를 형성시키려면, 12 ∼ 144 시간으로 하는 것이 바람직하고, 암으로부터 분리한 세포 및/또는 조직으로부터 0.4 ∼ 10 ㎜ 의 크기의 세포 집합체를 형성시키려면, 12 ∼ 144 시간으로 하는 것이 바람직하다. 또한, iPS 세포 등의 다능성 세포로부터 0.4 ∼ 10 ㎜ 의 크기의 세포 집합체를 형성시키려면, 48 ∼ 144 시간으로 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 의해 제작되는 세포 집합체는, 세포간의 상호 작용이 긴밀하게 실시되기 때문에, 태 내에서 발생하는 것과 같은 생물학적인 환경이 재현된다. 이에 의해 장기의 전구 세포에 대한 초기 분화 유도가 효율적으로 발생하기 때문에, 그 존재 빈도·수가 향상되는 것으로 생각된다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 제작되는 세포 집합체는, 세포끼리가 강하게 접착되어 있어, 비파괴적으로 회수가 가능하다.
본원에 기재된 세포 집합체는, 기관아나 오르가노이드 (기관아 (WO2013/047639), liver bud, liver diverticula, liver organoid, pancreatic (dorsal or ventral) buds, pancreatic diverticula, pancreatic organoid, intestinal bud, intestinal diverticula, intestinal organoid (K. Matsumoto, et al. Science. 19 ; 294 (5542) : 559-63. (2001)) 등을 포함하는 개념이며, 세포 집합체는, 구성하는 세포의 종류나 종류의 수는 상관없지만, 기관아는, 기관 발생 초기에 형성되는 것에 상등하고, 구성하는 세포의 종류는, 원칙, 장기나 조직을 구성하는 기능 세포 (또는 기능 세포로 분화하는 미분화 세포), 혈관 세포 및 간엽계 세포의 3 종류이며, 오르가노이드는, 상피성 조직을 구성하는 세포로부터만 성립되고, 기본적으로는 소형 (1 ㎜ 이하) 이다.
세포 집합체는, 자기 조직화에 의해, 고차 구조가 부가된 삼차원 조직 구조를 형성하고, 이에 의해 전구 세포의 종말 분화 유도를 실현하는 것이 가능하다. 자기 조직화는, in vivo, in vitro 의 어느 것으로 실시되어도 된다. 예를 들어, 본 발명의 방법으로 조제한 세포 집합체를 생체 내로 이식함으로써, 혈관망이 형성되어, 혈액 관류가 유도되고, 복잡한 구조를 갖는 고차 조직으로의 자기 조직화가 일어나, 성체 조직과 동등한 고도로 질서 있는 조직 구조를 갖는 조직이나 장기를 제작하는 것이 가능해진다. 혈관망 이외에도, 요관 구조, 담관 구조, 기관 구조 등의 추가적인 고차 구조가 부가된 고차 조직을 형성할 수 있을 가능성이 있다. 또한, 간장 등과 같이, 그 기능 발현을 위해서는, 간장뿐만 아니라, 담관이나 췌관과의 합류, 십이지장으로의 연결 등 타장기와의 연관의 재구성이 필수가 되는 장기가 다수 존재한다. 본 발명에 의해, 다른 장기와의 상호 작용을 재현하는 집합체를 제작함으로써, 체내에 존재하는 복잡한 장기의 자기 조직화 유도계로서의 활용이 기대된다.
본 발명은, 상기의 방법으로 제작된 세포 집합체도 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은, 상기의 방법으로 제작된 세포 집합체를 자기 조직화시켜, 고차 구조가 부가된 삼차원 조직 구조를 형성시키는 것을 포함하는, 삼차원 조직 구조의 제작 방법도 제공한다.
추가로 또한, 본 발명은, 배양하는 측의 단면이 U 또는 V 자의 형상인 겔상 배양 지지체를 제공한다. 본 발명의 배양 지지체는, 겔상 지지체의 배양하는 측의 단면이 U 또는 V 자의 형상임으로써, 지지체의 배양면에 세포가 모이게 되어, 보다 적은 수의 세포 및/또는 조직으로 세포 집합체가 형성되기 때문에 유리하다. 배양하는 측의 단면이 U 또는 V 자의 형상인 겔상 배양 지지체는 상기 서술한 바와 같다.
본 발명은, 중심부의 경도가 주변부의 경도보다 단단한 겔상 배양 지지체도 제공한다. 그 일 실시양태를 후술하는 실시예 6 (도 20 및 21) 에 나타낸다. 중심부의 경도는, 200 ㎪ 이하가 적정하고, 주변부의 경도는, 중심부보다 부드러우면 되지만, 지지체의 중심부와 주변부의 적정한 경도는 코팅과 형상에 따라 변화할 수 있다.
또한, 본 발명은, 반대로, 주변부의 경도가 중심부의 경도보다 단단한 겔상 배양 지지체도 제공한다.
본 발명은, 중심부의 경도가 주변부의 경도보다 단단하다고 하는 패턴을 1 개 이상 갖는 겔상 배양 지지체도 제공한다. 그 일 실시양태를 후술하는 실시예 7 (도 22 왼쪽, 포지티브 패턴) 에 나타낸다. 중심부의 경도는, 200 ㎪ 이하가 적정하고, 주변부의 경도는, 중심부보다 부드러우면 되지만, 지지체의 중심부와 주변부의 적정한 경도는 코팅과 형상에 따라 변화할 수 있다.
본 발명은, 주변부의 경도가 중심부의 경도보다 단단하다고 하는 패턴을 1 개 이상 갖는 겔상 배양 지지체도 제공한다. 그 일 실시양태를 후술하는 실시예 7 (도 22 오른쪽, 네거티브 패턴) 에 나타낸다. 주변부의 경도는, 200 ㎪ 이하가 적정하고, 중심부의 경도는, 주변부보다 부드러우면 되지만, 지지체의 중심부와 주변부의 적정한 경도는 코팅과 형상에 따라 변화할 수 있다.
또한 본 발명은, 상기의 겔상 배양 지지체 상에서, 임의의 종류의 세포 및/또는 조직과 간엽계 세포의 혼합물을 배양하여, 세포 집합체를 형성시키는 것을 포함하는, 세포 집합체를 in vitro 에서 제작하는 방법도 제공한다. 임의의 종류의 세포 및/또는 조직과 간엽계 세포의 혼합물의 배양에 대해서는, 상기 서술한 바와 같다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
〔실시예 1〕
세포 집합 덩어리 형성은, 단리된 미숙한 세포가 자기 조직화를 거쳐 삼차원으로 복잡한 장기를 형성하는 데에 중요한 원칙인 것으로 이전부터 생각되고 있다. 우리는, 기관 형성기에 발생하는 세포간 상호 작용을 재현함으로써 in vitro 에 있어서, 단리된 인간 간 전구 세포로부터 ㎜ 단위의 간 원기가 자립적으로 형성되는 것을 알아냈다. 그러나, 이와 같은 다이나믹한 삼차원 조직화의 배후에 있는 메커니즘은 완전히 불명하였다. 우리는 이 입체 조직 형성은 복수종의 세포 유닛의 자기 집합 반응으로부터 시작되고, 그 진행에는 간엽계 간세포에 있어서 발생하는 미오신 II 의 세포 골격의 수축력의 존재가 필요한 것을 분명히 하였다. 이 동적인 세포 집합 반응은, 기판 매트릭스의 강성 (경도) 조건에 의해 지배되고 있다. 더욱 최적화된 기판의 조건하에서는, 간장, 췌장, 장, 폐, 심장, 신장, 뇌, 나아가 암을 포함하는 다양한 장기로부터 분리한 세포/조직으로부터 3 차원의 장기 원기를 만드는 것에 성공하였다. 제작된 3 차원 원기는, 혈관 내피 세포를 삽입함으로써 이식시에 곧바로 혈관화되고, 또한, 치료 효과를 가지는 자기 조직화한 삼차원 조직 구조를 자율적으로 형성하였다. 장래의 재생 의료를 목표로 하는 데에 있어서, 이 원칙은, 동적인 세포 집합과 그에 이어지는 자기 조직화를 통해서, 간세포로부터 복수의 혈관화된 복잡한 기관계를 재구축하기 위한 범용성이 높은 플랫폼을 설립하는 것으로 이어질 것이다.
생리 기관 형성 동안에, 간장은 인간의 임신 5 - 8 주째에 간아라고 불리는 조직 덩어리가 모인 것으로부터 형성되는 것이 알려져 있다. 간엽계 간세포, 미분화된 혈관 내피 세포와 전장측 내배엽 세포의 세포간 상호 작용이, 전장 내의 기본적인 간장의 출아라고 불리는 (간아라고도 불린다) 간 재생의 개시에 필요하다 (1). 기관 형성에 있어서의 이들 기본적인 이해와 병행하여, 재생 의학의 최근의 진보는, 이 동적인 삼차원 (3-D) 의 전위를, 다능성 간세포 (PSC) 를 사용한 배양에 있어서 기관 형성기의 세포 상호 작용을 재현함으로써 모방할 수 있는 것도 실증하였다. 고화한 연질 매트릭스 겔 상에 파종하면, 단체의 PSC-유래 간 세포 (肝細胞) 가 내피 세포 및 간엽 세포와의 공배양으로 자율적으로 3 차원의 집합체를 형성한다 (2). 일단 집합체가 확립되면, 수 일 후 완전한 in vitro 의 조건하에서 태 내에 존재하는 장기와 유사한 구조를 가지는 간아 조직으로의 자기 조직화가 진행된다 (3). in vitro 에서 성장한 장기의 아 (芽) 의 이식은, 생체 내에서 추가로 자기 조직화 (성숙) 되고 결과적으로 혈관화되어 기능을 가진 간장이 된다. 이 방법은, 혈관화된 기관계의 인공적인 재구성을 위한 새로운 길을 여는 것이다 (4). 이와 같은 이전의 관찰에서 가장 매력적인 것은, 평탄한 2 차원 배양 플레이트하의 배양에도 불구하고 공배양한 세포에 매우 큰 형태 형성의 변화가 보여진 것이다. 자기 조직화의 선행 연구에서는, 일반적으로 급준한 바닥의 96 웰 플레이트로 미크론 스케일의 집합체를 생산하고 있었지만, 이 시스템에서는 밀리미터 혹은 센티미터 스케일로까지 성장할 수 있다 (5, 6). 그래서, 본 연구의 주목적은, 이 놀랄 만한 정도의 다이나믹한 동적인 집합 반응의 중심이 되는 메커니즘을 분석하고, 현상을 재현하기 위해서 불가결한 요인을 분명히 하는 것이었다. 그리고 최적화된 조건하에서, 우리는 최종적으로 다른 기관계를 재구성하는 것을 향한 이 어프로치의 확장성을 평가하였다.
우리는 먼저, 타임 랩스 이미징 해석에 의해 오르가노이드 형성 중의 세포의 움직임을 추적하였다. 인간 유도 다능성 간세포 (iPSC) 유래의 간 내배엽 세포, 제대 유래의 내피 세포 (HUVEC) 및 간엽계 간세포 (MSC) 를 개별적인 형광으로 표지하고, 전술한 응고한 매트릭스 겔 상에서 공배양하였다. 라이브 셀 추적은, 혈관화된 오르가노이드의 형성이, 내피와 같은 네트워크의 형성 (도 1) 에 의해 나타내는 것과 같은 자기 조직화를 통한 공간의 재구성에 앞서, 신속한 세포 집합 반응으로부터 시작되는 것이 판명되었다. 즉, 초기 자기 집합상에서는, 세포가 그룹으로서 거동하는, 이른바 다세포 집합 유닛으로서 행동하고, 곧바로 집합 중심에 수속 (收束) 하는 것이 분명해졌다 (도 1). 이와 같은 집합체 형성 다이나믹스를 보다 상세하게 해석하기 위해서, 화상 해석에 의해 집합체 외주부의 위치 (square root of cell area) 와 원형도 (Circularity) 의 시간 발전을 구하였다 (도 1b). 그 결과, 집합체는 세포 파종 후 약 7 시간까지는 10 ㎛/h 이하로 완만하게 수축하고, 그 후 수시간 동안 최대 ∼ 500 ㎛/h 에 이를 정도로 가속한 후 지수 함수적으로 감소하여 수속하였다. 한편, Circularity 는 세포 파종 후부터 대략 단조 감소하고, 10 ∼ 13 시간 후에는 약 0.5 의 최소치를 나타냈다. 그 후에는 증가로 전환하여, 20 시간 후에는 대략 일정치 (0.85) 로 수속하였다.
이상의 결과는, 본 연구에 있어서의 집합체의 형성이, 세포의 유주가 아니고, 세포 조직의 수축에 의한 것임을 시사하고 있다. 먼저 집합체 외주부의 최대 속도는, 세포 파종 후 10 ∼ 15 시간 동안 약 500 ㎛/h 에 달하고, 이것은 일반적인 세포 유주 속도를 훨씬 능가하고 있다. 또한 이동 속도는 최종적으로 지수 함수적으로 감소했지만, 이것은 집합체가 Kelvin-Voigt model 이라고 하는 지수 함수로 나타내는 역학 모델을 따라 수축하고 있는 것을 암시하고 있다. 실제로 지금까지, 다양한 세포 조직이나 스트레스 파이버 수축이 Kelvin-Voigt model 로 근사할 수 있는 것이 나타나 있다. 또한, 이와 같은 집합체의 큰 수축의 개시에는 약 10 시간 필요했는데, 이것은 세포-세포 간의 접착이나, 수축에 필요한 스트레스 파이버의 형성이 진행되는 시간으로는 타당한 범위인 것으로 생각된다. 실제 circularity 의 결과는, 초기의 10 시간에서는 집합체가 진원으로부터 벗어나, 변형된 형태로 수축되어 있는 것을 나타내고 있었다. 이것은 집합체 형성 초기에는, 그 수축력이, 세포-외장 (세포-기판 간, 세포-용기 벽면) 간의 접착력과 동일한 정도 혹은 하회하고 있는 것을 시사하고 있는 것으로 생각된다.
in vitro 에서, 이와 같은 동적이고 지향성이 있는 세포 집합 현상을 야기하기 위해서 중요한 세포의 종류를 동정하기 위해서, 우리는 공배양에 있어서 3 계통의 모든 가능한 조합을 검토하였다. 그 결과, 간엽계 간세포가 결여되면 집합체 형성이 불능인 것이 판명되었다 (도면 중의, iPSC ＋ EC, EC, iPSC). 한편, 세포 집합체 형성에는, MSC 와 조합하는 것이 충분 조건이고, 혈관 내피 세포의 존재는 필수가 아니다. 예를 들어, iPSC 유래의 간 내배엽 세포와 MSC 의 공배양 (iPSC ＋ MSC), 혈관 내피 세포와 MSC (EC ＋ MSC), 에 의해서도, 세포 집합체 형성은 가능하였다 (도 1). MSC 단독으로도 집합체는 형성되었지만, MSC 비존재하에서의 배양군은, EC 단독, iPSC 단독, iPSC ＋ EC 의 어느 것에 있어서도, 시트상의 무른 조직을 형성할 뿐으로, 비파괴적으로 회수하는 것은 불능이었던 것으로부터 집합체는 형성되지 않았다. 또한 지지체 상에서 배양하지 않는 경우에도 (2-D iPSC ＋ EC ＋ MSC), 집합체 형성은 확인되지 않았다. 상기 서술한 관찰에 의해 시사되는, '수축 기구' 를 분명히 하기 위해서, 우리는 그 후, 그들의 기체와 주위의 세포에 대한 MSC 의 수축력의 기여를 분자 레벨로 평가하였다. 생리 초기 발생 과정에 있어서의 배의 원장 함입에 있어서는, 어느 세포의 군은 수축을 받아, 미오신 II (MII) 활성에 의해 구동되는 세포-세포간 결합이 급격한 내측으로의 변위는, 배의 원장 형성기에 세포가 함입하는 것을 초래하는 것이 알려져 있다. 그래서, 우리는, 인산 특이적 항체 (7) 와 세포 내 플로우 사이트메트리에 의한 근필라멘트의 분해를 통해서 MIIA 를 불활성화하는 S1943 (pS1943) 에서의 MIIA 의 인산화의 시간 경과 의존성의 변화를 측정하는 것에 의해, MII 의 활성을 평가하였다. MIIA 활성을 추정하기 위한 보고된 식 (8) 에 기초하여, 우리는 집합체 형성 중의 간질 세포 내에서 액티브 MIIA 가 현저하게 업 레귤레이트되어 6 시간에 피크를 맞이하고, 그것은 세포가 최대 속도로 이동하고 있는 타이밍에 대응하는 것을 나타냈다 (1). 한편, iPSC 유래 간 세포 (肝細胞) 에 있어서 활성화 MIIA 는 집합체 형성을 통하여 대략 일정한 것을 알 수 있다. 이것은 MSC 에 의한 MIIA 의 활성화가 이 강고한 3 차원 전위의 책임을 담당하고 있는 것을 시사하고 있다. 또한, 이 활성화 MIIA 감소의 직접적인 증거를 지시하는 데이터로서, 우리는, 이 집합체 형성이, 블레비스타틴 (미오신 II (MII) ATP 아제 저해제) 에 의해 완전하게 대항할 수 있는 것을 나타냈다 (9). 동일하게, 공배양 중의 Rho 키나아제 저해제 Y-27632 의 첨가는, 부분적으로 집합체 형성 (도 1) 을 지연시키는 것이 판명되었다. 한편, 최근의 보고와 같은, 기관 형성 (도 1) 동안에 자율적으로 생성되는 케모카인 구배에 의한 세포 집합 메커니즘에 관해서는, AMD3100 의 첨가에 의한 케모카인 수용체 경로의 약리학적 저해에 의해 (10) 세포 집합체의 형성을 방해할 수 없었기 때문에 적응하기 어려운 것으로 생각되었다. 액토미오신 세포 골격에 의한 수축력은, 세포 집합의 지향성과 대폭적인 이동을 위해서 중요한 역할을 하고 있는 것이 이 결과로부터 밝혀졌다.
이와 같은 배양 중의 세포 내 골격 수축은, 매트릭스 앵커에 대한 결합도로 조절되는 것이 단일 세포 레벨에서는 시사되어 있다 (11). 요컨대, 단일 세포의 견인력을 측정하는 최근의 연구에 있어서, 세포 골격의 장력은, 기판의 생화학적 및 생물 물리학적 파라미터에 의해 조절되는 것이 나타나 있다 (12). 그래서 우리는, 세포 집합에 있어서의 수축 메커니즘에 있어서도 이 프로세스를 적용할 수 있으면, 기판 조건의 경도 조절에 의해 집합 반응을 변화시킬 수 있는 것으로 가정하였다. 우리의 선행 연구에 있어서 하이드로 겔, 콜라겐, 라미닌, entactins 및 그들의 조합 등 다양한 생화학의 조건하에서 테스트를 실시하여, 마트리겔 등의 기저막 복합체가 가장 효율적인 매트릭스인 것을 나타냈다. 또한 중요한 요인을 명확하게 하기 위해서, 우리는 여기서, 기판의 생물 물리학적 강성 상태의 영향을 평가하였다. 구체적으로는, 외부 환경이 세포 응답에 미치는 평가를 위해서, 생화학·역학적 조건을 자유롭게 조정 가능한 특성을 갖는 하이드로 겔을 제작하였다 (도 2) (13). 본 법에 의해 제작한 다양한 경도 조건의 기판 상에 세포를 파종한 결과, 24 시간 정도의 배양 후에 분명한 세포 집합 거동에 차이가 확인되는 것이 분명해졌다. 요컨대, 집합체 형성 중의 MSCs 의 운동을 트레이스하고, 속도 (velocity) 와 운동 배향성 (order parameter) 을 해석한 결과, 양파라미터 모두 E = 17 ㎪ 일 때에 극대를 나타내는 것이 분명해졌다. 이 결과는, 세포 외 환경의 경도가 집합체 형성의 중요 파라미터의 하나인 것을 명확하게 나타내고 있다. 실제, 본 계에서의 집합체 형성의 키 세포인 MSCs 는, 분화나 접착을 비롯하여 다양한 프로세스로 mechano-response 를 나타내는 것이 알려져 있다. 일반적으로 스페로이드 등의 집합체의 형성에는, 세포-세포 간의 상호 작용이, 세포-외장 간의 상호 작용을 상회할 필요가 있기 때문에, 본 계에서도 E = 17 ㎪ 의 외장 경도 환경이 이와 같은 조건을 실현한 것으로 생각된다. MSC (도 1) 의 필요성을 고려함으로써, 우리는 보다 부드러운 기판에 대한 간엽계 세포의 수축이 공배양 시스템으로 이들 집합 반응을 일으키고 있을 가능성이 있는 것으로 결론지었다.
MSC 유래의 수축력이 이 자기 집합 거동의 중심인 것을 고려하면, 이 원리는, 장래의 재생 의료를 목적으로 하는 데에 있어서의 배엽의 유래에 관계없이, 다른 장기의 자기 조직화계로 확장할 수 있는 것으로 생각된다. 그 중에서도, 췌장은, 간장에 비교적 가까운 발생 프로그램에 따르는 것이 밝혀지고 있기 때문에, 이 가설을 검증하기 위해서, 우리는 먼저 췌장 세포를 선택하여 공배양용으로 사용하였다. 단리된 마우스의 췌장 β 세포 (MIN6) 를, HUVEC 와 MSC 와 공배양한 결과, 동일하게 세포 집합체의 형성을 확인하였다 (도 3). 생성된 오르가노이드의 내부 구조를 가시화하기 위해서, 공초점 현미경 분석은 형광 표지된 세포를 사용하여 실시하였다. 삼차원 z 스택 투영 화상으로 kusabira 오렌지 (KO) 표지 MIN6 이 이식 후 72 시간 동안 췌도 (膵島) 유사 조직을 형성하기 위해서 자기 조직화되는 것을 분명히 하였다. 그에 대하여, 녹색 형광 단백질 (EGFP) 표지한 HUVEC 는 오르가노이드 내부의 MIN6 유래의 췌도를 덮는 네트워크 구조를 형성하였다. 이상으로부터, 간장에 있어서 알아낸 동작 원리가, 췌장에 있어서도 확장될 수 있을 가능성이 나타났다.
다음으로, 우리는, 이 어프로치의 추가적인 범용성을 평가하기 위해서, 배 또는 성체 마우스로부터의 (최대 200 ㎛ 의) 복수의 세포 또는 조직 단편을 단리하였다. 놀랄 만한 일로, 세포 집단의 지향성이 있는 자율적 집합 현상은 췌장, 간장, 장, 폐, 심장, 신장, 뇌, 나아가 암 (도 3) 을 포함하는 테스트한 모든 세포/조직 타입에서 유지되고 있었다. 타임 랩스 이미징은, 배 및 성체의 양방의 세포/조직이 잘 이식 수술을 포함한 추가의 조작에 견디고, 자율적으로 단일의 3D 오르가노이드를 형성한 것을 나타냈다 (도 3). 집합체는, 배양 내피 세포 (HUVEC) 를 포함하도록 설계되면, 신뢰성이 있는 종래의 조직 공학적 어프로치 (평균 관류 시간 ; ∼ 192 시간) 와 비교하여, 이식되고 난 후 훨씬 짧은 시간 동안 레시피언트의 순환으로 혈액 관류되는 것이 분명해졌다 (평균 관류 시간 ; ∼ 72 시간). 이것은, 혈관 신생을 위해서는 족장이 없는 자기 집합 어프로치가 우위인 것을 시사하고 있다 (도 4). 내피 세포의 존재는 집합체를 생성하기 위해서는 불필요하지만, HUVEC 없이는 이식 후의 결과는 매우 나쁘다. 왜냐하면, 기능적 혈관 형성의 징조가 in vivo 에서 관찰되지 않기 때문이다 (도 4).
흥미로운 것은, 기능적 혈관 신생이 유지되고 있음에도 불구하고, 성체 기관 유래의 세포는 대부분이 이식 시에 원래의 것과 유사한 조직을 재구성하지 않는다 (도 7). 그러나, 배세포 유래의 집합체는 효율적으로 기능적인 조직 유닛을 자기 조직화에 의해 재구성하였다. 예를 들어, 태아 신장 유래의 오르가노이드의 이식은, 혈액 여과의 징조가 있는 사구체와 같은 마이크로 조직을 재구성 (도 4D) 했지만, 성체의 신장이나 폐에서 유래하는 오르가노이드는 그러한 조직 (도 7, 8) 을 생성하는데 실패하였다. 이 결과는, PSC 로부터 직접 분화한 세포를 이용하는 성숙한 세포 이식은 장기 부전을 치료하는데 유효할지도 모른다는 우세한 재생 의학의 패러다임의 의문을 제기한다. 왜냐하면, 최종 분화한 세포는 자주 혈관 신생된 조건하에서도, 이식에 있어서 기능적인 조직을 재구축하는 능력이 부족하기 때문이다.
또한, 췌장 세포를 대상으로 하여, 상세한 해석을 실시하였다. 3 차원 췌장 오르가노이드의 이식은 신속 ( ∼ 48 시간) 한 재관류와 β 세포의 생착이 발생하고, 이들은 생체 이미징 해석에 의해 확인되었다. 14 일째에 이식편은 레시피언트의 순환계 (도 4, C) 에 접속한, 기능적 미소 혈관 네트워크를 가지는 췌도 유사 구조 (도 4, E) 를 형성하였다. 이와 같은 혈액 관류는, 혈관 내피 세포를 포함하지 않는 집합체를 이식한 경우에는 확인되지 않았다 (도 9). 재구성된 췌도는, 주변부의 마우스 혈관과 직접 접속하고, 모세 혈관의 조밀한 네트워크에 의해 고도로 혈관화되어 있었다 (도 10). 생체에 있어서의 췌도 모세 혈관망은, 외분비 조직을 둘러싸는 혈관망보다 약 5 배의 밀도가 높은 것이 알려져 있는데, 이것과 일치하여, 생체 내의 기능적 혈관 밀도의 정량화로, 재구성된 췌도 유사 조직에 있어서 정상 조직 (도 4, 도 9) 의 주위에 비하여 모세 혈관망이 훨씬 치밀 (4.2 배) 한 것이 나타났다. 조직학적인 해석으로부터도 성체 췌도와 유사한 구조를 가지고 있어, 자기 조직화에 의해 성숙 조직을 재구성하고 있는 것으로 생각되었다 (도 11). 또한, 치료 상의 유효성을 평가하기 위해서, in vitro 유래의 β 세포 오르가노이드를 I 형 극증 당뇨병 모델 마우스의 신장 피막하에 이식하였다. 당뇨병 모델로서, 우리는, 인슐린 프로모터에 디프테리아 독소 수용체 cDNA 도입 유전자를 가지는, 독소 수용체를 개재한 세포 녹아웃 (트렉)-Tg 마우스를 채용하였다. 비이식군의 마우스는 디프테리아 독소 (DT) 투여를 통한 당뇨병 유도 후 6 일째에 사망한 데에 반하여, β 세포 오르가노이드가 이식된 마우스는 혈당치를 정상적으로 유지하여 살아남았다 (도 4, G). 이상으로부터, 우리는 실험적으로 in vivo 에서 혈관 신생화 및 기능적 삼차원 조직을 재구성함으로써, 이 원리가 다른 기관계에도 적용 가능한 것을 실증하였다.
1960 년대에는, 단리한 배세포의 집합체는, 자기 조직화를 통해서, 원래의 장기와 유사한 구조를 갖는 조직을 재구성하는 것이 나타나 있다. 일단, 필요한 다양한 소수의 세포가 조밀하게 상호 작용할 수 있도록 모아지면, 개개의 세포는, in vitro 에서 기능적 조직을 자기 형성할 수 있다 (14). 자기 조직화에 대한 이 고전적인 지식은, 이 분야의 하나의 본질적인 도전인 PSC 로부터 장기를 성장시키기 위한 원칙을 설계하는 재생 의학의 분야에 있어서 기술 혁신을 가져올 수 있다. 이 원칙은 현재는, PSC 유래 세포 집합체로부터의 뇌, 안배, 신장 및 간장을 포함하는 우리나 그 밖의 연구자의 관찰에 의해 강화되어 있다 (15). 이 흐름에 있어서, 우리는 여기서 하나의 유망한 원칙을 나타내고 있다. 요컨대, 종래와 같은 모두 소형인 집합체만 형성할 수 있었던 방법과 비교하여, 희망하는 복수의 다수의 세포/조직으로부터 집합을 통해서, 그 자기 조직화한 오르가노이드를 설계할 수 있다. 집합체는, in vitro 및 in vivo 의 양방으로 그 후의 자기 조직화 능력을 조사하기 위해서 사용할 수 있다. 이 연구에서는 실험적으로 내피 세포를 삽입함으로써, 신속한 혈관 신생과 그에 이어지는 기능화를 평가하는 것을 실시했지만, 보다 정확한 조직 재구축을 위해서, 신경 세포 등의 미개척의 지원 세포의 공헌을 평가하는 것도, 우리나 다른 그룹에 있어서 흥미로운 부분이다. 표적이 되는 조직의 자기 조직화를 위한 최적의 조건을 결정하기 위해서 추가적인 개량이 필요하지만, 우리는 이 배양 원리가, 다능성 간세포를 사용한 인간 생물학 및 병리학을 연구하기 위한 강력한 툴일 뿐만 아니라, in vitro 에서 성장한 복잡한 조직 구조를 사용함으로써, 현재 치료 불가능한 환자를 위한 다음 세기의 재생 의료의 실현을 가능하게 하는 것으로 생각한다.
참고 문헌
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재료와 방법
· 간엽계 세포 (MC) 의 조제
MC 에 대해서는, 인간 골수로부터 분리한 세포, 인간 제대간질 (와튼초) 로부터 분리한 세포, 인간 귓바퀴로부터 분리한 세포, 마우스 골수로부터 분리한 세포, 인간 선유 아세포 등의 어느 것을 사용하였다. 본 실험에서 주로 사용한, 인간 골수로부터 분리한 간엽계 간세포 (Mesenchymal Stem Cell : hMSC) 는, hMSC 배양으로 조제된 전용의 배지 (MSCGMTM BulletKit (등록상표)) (Lonza PT-3001) 를 사용하여 배양하였다.
· 각종 세포의 조제
디에틸에테르 (Wako) 를 사용하여 마취한 C57BL/6-Tg (CAG-EGFP) 마우스 (니혼 SLC) 임신 12 - 17 일째의 복부를 70 ％ 에탄올로 소독한 후, 개복하여, 태아를 적출하였다. 태아로부터 뇌, 심장, 폐, 간장, 후신, 또는 장관을 적출하였다. 또한, 6 주령 이상의 C57BL/6-BALB/c RFP hairy mouse (Anticancer Inc. 로부터 구입) 의 뇌, 심장, 폐, 간장, 신장, 또는 장관을 적출하였다. 적출한 조직으로부터 단리한 세포를 사용하는 경우에는, 0.05 ％ Trypsin-EDTA (GIBCO) 200 ㎕ 중에 넣고, 37 ℃ 에서 20 분간 인큐베이트하였다. 그 후, 피펫으로 조직을 붕괴시켜, 4.8 ㎖ 의 배지에 첨가하였다. 원심하고, 배지를 첨가하여 세포 수를 센 후, 단일 세포까지 효소 처리한 세포를 공배양에 사용하였다. 또한 적출한 조직을 소조직의 상태로 사용하는 경우에는, 적출한 태아 조직을 가위로 잘게 썰고, 0.05 ％ Trypsin-EDTA 10 ㎖ 중에 넣고, 37 ℃ 에서 20 분간 진탕하였다. 그 후, 배지를 첨가하고 100 ㎛ 의 셀 스트레이너를 통하여, 원심을 실시하였다. 원심 후, 배지를 첨가하고, 세포 배양에 사용하였다. 또한, 성체 마우스의 뇌, 심장, 폐, 간장을 가위로 잘게 썰고, 100 ㎛ 의 셀 스트레이너를 사용하여 여과하고, 플로우 스루를 40 ㎛ 의 셀 스트레이너를 사용하여 여과하고, 40 ㎛ 의 셀 스트레이너에 남은 세포 덩어리를 배지로 회수하여 세포의 공배양에 사용하였다. 또한, 성체 마우스의 소장에 있어서는, 내용물을 생리 식염수로 세정하였다. 세정한 소장을 세로로 잘라, 4 ㎝ 간격으로 자른 것을, 2 mM EDTA, 0.5 mM DTT in PBS 에 넣고 37 ℃ 에서 20 분간 진탕하였다. 그 후, 100 ㎛ 의 셀 스트레이너를 사용하여 여과하고, PBS 를 첨가하였다. 원심을 실시하여, 상청을 빨아들인 후 PBS 를 첨가하여 세정하였다. 그 후, 원심을 실시하고, 배지를 첨가하여 세포 배양에 사용하였다.
정상 제대 정맥 내피 세포 (Normal Umbilical Vein Endothelial Cells : HUVEC) 는, 설명과 동일한 의미를 취득한 임산부의 분만시에 제공 받은 제대로부터 분리한 세포, 내지 구입한 세포를 EGM (등록상표) BulletKit (등록상표) (Lonza CC-4133) 를 사용하여, 5 회 이내의 계대 횟수로 배양하였다. 또한, 모든 세포에서 필요에 따라 레트로바이러스 벡터에 의한 형광 표지를 실시하였다. 또한, HepG2 는 DMEM 에 10 ％ FBS 를 첨가한 것으로 배양하였다. 각각의 세포는 37 ℃, 5 ％ CO2 의 인큐베이터 내에서 배양하였다.
· 자기 조직화용 세포 집합체의 제작
PA 겔 평면 기판을 정치 (靜置) 하거나, 또는, 마트리겔 코팅 (마트리겔 (BD) 의 원액, 내지 마트리겔과 배지를 1 : 1 의 비율로 혼합한 용액을 1 웰 마다 300 ㎕ 씩 넣고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 인큐베이터 내에 10 분 이상 정치하여 굳혔다) 을 실시한, 24 웰 플레이트의 1 웰에 세포 수로서 2 × 106 cells 이상 상당의 임의의 조합의 종류의 세포 (태아·성체로부터 분리한 조직 또는, KO-HepG2, HUVEC 등) 와, 2 × 105 cells 의 MSC 와 혼합하고, 세포를 파종하였다. 또한 소형의 세포 집합체를 형성하기 위해서는, 4 × 103 cells 이상 상당의 임의의 조합의 종류의 세포 (태아·성체로부터 분리한 조직 또는, KO-HepG2, HUVEC) 에, 5 × 103 cells 이상의 MSC 와 혼합하고, 파종하였다. 그 후, 37 ℃ 의 인큐베이터로 1 일간 배양하였다. 파종 후, 실체 현미경 또는 공초점 현미경을 사용한 세포 공배양의 시간 경과적 관찰을 실시하였다. 임의의 조합에는 종류의 한정은 없고, 예를 들어, 췌장·간장·장관·신경 등의 상이한 조직에서 유래하는 세포를 혼합한 것을 사용해도 되고, 그 후에 목적으로 하는 장기의 자기 조직화에 최적인 조성을 사용할 수 있었다.
또한, 세포의 화상 해석을 실시한 PA 겔 평면 기판을 정치한 플레이트를 사용한 실험에서는, HUVEC 를 2 ∼ 4 × 106 cells, hMSC 를 2 ∼ 4 × 105 cells 의 2 종류의 세포를 파종하는 것에 의해 얻어진 집합체 형성 과정의 동영상을 기초로 평가를 실시하였다.
· PA 겔 평면 기판의 제작 (면 내의 경도 균일)
겔의 반응 용액으로서, 아크릴아미드 수용액 (40 ％ w/v, A4058, Sigma), 비스아크릴아미드 수용액 (2 ％ w/v, M1533, Sigma), 증류수를 혼합하여 제작한 용액 10 ㎖ 를 제작하였다. 이 때 각각의 용액의 혼합 비율을 바꿈으로써, 겔의 영률을 조절하였다. 이 반응 용액을 진공 챔버를 사용하여 돌비시킨 후, 100 ㎕ 의 APS (5 g/DW50 ㎖, 01307-00, KANTO, 0.20 ㎜ filtered) 와 10 ㎕ TEMED (T9281, Sigma) 를 순서대로 첨가하였다. 그 후, 본 반응액 25 ㎕ 를 Dimethyldichlorosilane (DCDMS, D0358, TCI) 로 표면 소수화된 슬라이드 유리 (S2112, MATSUNAMI) 상에 적하한 후, 위로부터 Allytricholorosilane (ATCS, 107778-5 g, Sigma) 처리한 환형 커버 유리 (φ = 12 ∼ 25 ㎜, MATSUNAMI) 를 겹쳐 샌드위치 구조로 하여, 30 분간 정치하였다. 그 후 증류수를 첨가하고, 하룻밤 정치한 후, 슬라이드 유리 기판으로부터 박리하여, 겔이 코트된 커버 유리 기판을 얻었다. 그 후 인산 완충액을 첨가하여 하루 정치하고, 미반응의 모노머를 제거하였다. 표 1 에 대표적인 반응 용액의 배합비와 겔의 영률을 나타낸다. 겔의 영률은 원자간력 현미경 (Nanowizard 3, JPK Instruments, Germany) 의 나노인덴테이션 측정에 의해 결정하였다.
PA 겔 표면에 대한 접착 분자 (마트리겔 또는 라미닌) 의 코팅은 이하의 순서로 실시하였다. 먼저, 0.2 ㎎/㎖ 의 N-Sulfosuccinimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoate (Sulfo-SANPAH, 22589, Pierce) 의 20 mM HEPES (pH 8.5) 용액을 PA 겔 기판 상에 적하하고, UV 램프 (Z169633-1EA, Sigma) 를 20 분간 조사하였다. 그 후, 4.4 ㎎/㎖ 의 마트리겔 용액 (원액을 20 mM HEPES (pH 8.5) 용액으로 227 배로 희석, 354234, BD), 또는 10.0 ㎎/㎖ 의 라미닌 용액 (원액을 20 mM HEPES (pH 8.5) 용액으로 227 배로 희석, 354232, BD) 을 수 ㎖ 적하하고, 16 시간 37 ℃ 인큐베이터에 정치하였다. 그 후 PA 겔을 인산 완충액으로 잘 린스하고, 미가교의 마트리겔이나 라미닌을 제거하였다.
〔실시예 2〕
마트리겔 코팅 (마트리겔 (BD) 의 원액, 내지 마트리겔과 배지를 1 : 1 의 비율로 혼합한 용액을 1 웰 마다 300 ㎕ 씩 넣고, 37 ℃, 5 ％ CO2 의 인큐베이터 내에 10 분 이상 정치하여 굳혔다) 을 실시한, 24 웰 플레이트의 1 웰에 세포 수로서 2 × 106 cells 의 iPS 세포 유래 간 내배엽 세포, 내지 인간 성체 간 세포 (肝細胞) 와, 5 × 105 cells 의 인간 또는, 마우스 MSC 와 혼합하여, 파종하였다. 그 후, 37 ℃ 의 인큐베이터로 1 일간 배양하였다. 파종 후, 실체 현미경 또는 공초점 현미경을 사용한 세포 공배양의 시간 경과적 관찰을 실시하였다. 도 13 에 나타내는 바와 같이 혈관 내피 세포가 없어도, 간엽계 세포가 있으면, 세포 집합체가 형성되는 것이 나타난다.
〔실시예 3〕
· U 보텀 PA 겔의 조제
겔의 반응 용액으로서, 아크릴아미드 용액 (40 ％ w/v, A4058, Sigma), 비스아크릴아미드 용액 (2 ％ w/v, M1533, Sigma), 증류수를 혼합하여 제작한 용액 10 ㎖ 를 제작하였다. 이 때 각각의 용액의 혼합 비율을 바꿈으로써, 겔의 영률을 조절하였다. 24-well tissue culture plate (353047, BD) 에 반응 용액을 500 ㎕ 첨가한 후, 0.5 ㎕ TEMED (T9281, Sigma) 와 5 ㎕ 의 APS (5 g/DW50 ㎖, 01307-00, KANTO, 0.20 ㎜ filtered) 를 이 순서로 첨가하고, 곧바로 잘 혼합하였다. 그 후 50 ℃ 의 핫 플레이트 상에서 15 분 정치하였다. 그 후 인산 완충액을 첨가하여 하루 정치하고, 미반응의 모노머를 제거하였다. U 보텀 겔의 단면도를 도 12 에 나타낸다.
본 겔 (깊이 3 미크론 이후의 경도는, 약 30 ㎪ 로 일정하였다) 을 사용한 세포 집합체의 형성 실험에는, 24 웰 플레이트의 1 웰에 세포 수로서 2 × 106 cells 의 iPS 세포 유래 간 내배엽 세포와, 7 × 105 cells 의 HUVEC, 2 × 105 cells 의 인간 MSC 와 혼합하여, 파종하였다. 그 후, 37 ℃ 의 인큐베이터로 1 일간 배양하였다. 파종 후, 실체 현미경 또는 공초점 현미경을 사용한 세포 공배양의 시간 경과적 관찰을 실시한 결과, 세포 집합체가 형성되는 것이 나타났다 (도 14).
〔실시예 4〕
(방법과 결과)
디에틸에테르 (Wako) 를 사용하여 마취한 C57BL/6-Tg (CAG-EGFP) 마우스 (니혼 SLC) 임신 12.5 및 13.5 일째의 복부를 70 ％ 에탄올로 소독한 후, 개복하여, 태아를 적출하였다. 태아로부터 후신을 적출한 후, 0.05 ％ Trypsin-EDTA (GIBCO) 200 ㎕ 중에 넣고, 37 ℃ 에서 20 분간 인큐베이트하였다. 그 후, 피펫으로 조직을 붕괴시켜, 4.8 ㎖ 의 배지에 첨가하였다. 원심하고, 배지를 첨가하여 세포 수를 센 후, 단일 세포까지 효소 처리한 세포를 공배양에 사용하였다. 그 후, 인간 골수로부터 분리한 간엽계 간세포 (Mesenchymal Stem Cell : hMSC) 및, 정상 제대 정맥 내피 세포 (Normal Umbilical Vein Endothelial Cells : HUVEC) 와 혼합하고, 마트리겔 (실시예 2 의 마트리겔 (BD) 의 원액) 과 혈관 내피 세포용 배지 (EGM BulletKit (등록상표), Lonza CC-4133) 를 1 : 1 의 비율로 혼합한 용액을 굳힌 웰 상에 파종을 실시하였다. 24 웰 플레이트의 1 웰상 등의 경우에는, 총 세포 수로서 약 2 × 106 cells 의 임의의 조합의 종류의 세포를 파종하였다. 또한, 태아 신장 세포, MSC 와 HUVEC 의 비율은, 차례로, 10 : 2 : 0.1 ∼ 1 로 했지만 그에 한정되는 것은 아니다. 그 후, 37 ℃ 의 인큐베이터로 1 일간 배양하여, 3 차원 조직을 자율적으로 형성하였다. 도 16 하단에 기재된 결과에 대해서는, 펠릿 배양을 실시한 조직을 사용하였다. 펠릿 조직의 제작법에 대해서는, Christodoulos Xinaris, et al. (In Vivo Maturation of Functional Renal Organoids Formed from Embryonic Cell Suspensions. J Am Soc Nephrol. 2012 Nov ; 23(11) : 1857-1868.) 에 기재된 방법에 준하고 있고, 일제 회수한 단리된 세포를 원심력에 의해 튜브 저면에 집합시켜 이식용 조직을 형성하는 수법을 취하였다.
형성한 신장 원기를 면역 부전 마우스 태 내에 이식을 실시한 후, 육안 관찰을 실시한 결과, 이식 2 - 3 일에서 혈액 유입이 확인되었다 (도 15 의 상단). 도 15 중의 백색 점선은, 이식 영역을 나타낸다. 분산되어 있던 세포가, 이식 8 일째에는, 구상의 사구체 조직을 형성하였다 (도 15 의 하단). 도 16 왼쪽에 나타내는 형광 관찰의 결과, 지지체 상에서 배양을 실시함으로써 다수의 사구체 구조가 형성된 것에 반하여, 종래법 (펠릿 이식군) 에서는 형성되지 않았다. 도 16 오른쪽에 나타내는 망라적 유전자 발현 해석의 결과, 이식 1 개월째의 이식편은, 생후 0 ∼ 8 주상 등의 성숙 정도인 것이 나타났다. 도 17 에 나타내는 왼쪽 3 열의 결과로부터, 이식 4 주째의 조직을 대상으로 한 전자 현미경 관찰의 결과, 형성된 조직은, 다리 세포, 슬릿막, 내피 세포, 근위 요세관, 메산지움 세포 등으로 이루어지는 정상 네프론의 구조를 형성하였다. 도 17 오른쪽 도면으로부터, 면역 염색의 결과, 다리 세포나 슬릿막의 존재가 나타났다. 또한, 이식 3 주째에 저분자량 형광 덱스트란을 투여 후 형광 라이브 관찰한 결과를 나타낸다 (도 18). 형성된 조직은, 먼저, 혈관 내에 유입되고, 사구체 내부에서 여과되어, 근위 요세관에 회수된 것으로부터 신장의 원뇨 생성 기능을 가지고 있는 것이 나타났다 (도 18). 이상으로부터, 본 발명에 의해 인위적으로 제작한 신장 원기를 생체 내에 이식함으로써, 자율적인 성숙을 유도하여, 기능적인 신장 조직을 제조하는 것에 성공하였다.
〔실시예 5〕
(방법과 결과)
상이한 경도 조건 (Sample A, B, C) 의 지지체 (PA 겔 평면 기판의 제작) 의 마트리겔 코팅 전 (사선)·후 (흑색 베타) 에 있어서의 영률의 변화. 코팅의 유무에 상관없이, 경도 조건을 엄밀하게 제어할 수 있는 것을 나타낸다 (도 19). 본 겔 기판의 제작은 실시예 1 에 기재된 방법을 사용하여 실시하였다.
〔실시예 6〕
(방법과 결과)
1 개의 기판 상에, 상이한 경도 조건이 혼재하는 경도의 멀티 패턴 겔을 제작하는 것에 성공하였다 (도 20). 패턴 1 에서는 중심부가 단단한 겔을, 패턴 2 에서는 중심부가 약간 단단한 겔을 제작하였다 (도 20 왼쪽 도면). 도 20 오른쪽 도면은, 경도 조건을 장축 방향으로 측정한 결과를 나타내고, 목적으로 하는 경도 조건이 제작되어 있는 것을 나타낸다.
경도의 공간 패턴을 갖는 겔 기판의 제작 방법은 이하와 같다. 겔의 반응 용액으로서, 아크릴아미드 수용액 (40 ％ w/v, A4058, Sigma), 비스아크릴아미드 수용액 (2 ％ w/v, M1533, Sigma), 증류수를 혼합하여 제작한 용액 10 ㎖ 를 제작하였다. 그 후, 차광하면서 Irgacure2959 (0.5 ％ w/v, DY15444, Ciba) 를 50 ㎎ 첨가한 후에 37 ℃ 의 탕욕으로 용해시키고, 진공 챔버를 사용하여 돌비시켰다. 그 후, 본 반응액 10 ㎕ 를 Dimethyldichlorosilane (DCDMS, D0358, TCI) 로 표면 소수화된 슬라이드 유리 (S2112, MATSUNAMI) 상에 적하한 후, 위로부터 Allytricholorosilane (ATCS, 107778-5g, Sigma) 처리한 환형 커버 유리 (φ = 12 ㎜, MATSUNAMI) 를 겹쳐 샌드위치 구조로 하였다. 그 위에, 포토마스크를 두고, 254 ㎚ 의 자외광을 조사하였다. 포토마스크는 아세틸셀룰로오스 (G254B, Agar) 에 레이저 프린터 (MC860, OKI) 를 사용하여 인쇄한 것을 사용하였다. 마스크 패턴의 디자인은 Adobe Photoshop 을 이용하여, 외경 12 ㎜, 내경 2 ∼ 4 ㎜ 의 원형 마스크를 제작하였다. 광 조사에는, 광원을 수은 램프 (C-HGFI, Nikon) 로 하고, 반응 용액에 균일하게 조사하기 위해서 광 파이버와 투광관을 사용하였다. 자외선 조사 시간은, 목적으로 하는 경도에 따라 분 간격으로 조정하였다. 그 후 증류수를 첨가하고, 슬라이드 유리 기판으로부터 박리하여, 겔이 코트된 커버 유리 기판을 얻었다. 그 후 인산 완충액을 첨가하여 하루 정치하고, 미반응의 모노머를 제거하였다. 겔의 영률은 원자간력 현미경 (Nanowizard 3, JPK Instruments, Germany) 의 나노인덴테이션 측정에 의해 결정하였다. PA 겔 표면에 대한 접착 분자 (마트리겔 또는 라미닌) 의 코팅은 이하의 순서로 실시하였다. 먼저, 0.2 ㎎/㎖ 의 N-Sulfosuccinimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoate (Sulfo-SANPAH, 22589, Pierce) 의 20 mM HEPES (pH 8.5) 용액을 PA 겔 기판 상에 적하하고, UV 램프 (Z169633-1EA, Sigma) 를 20 분간 조사하였다. 그 후, 4.4 ㎎/㎖ 의 마트리겔 용액 (원액을 20 mM HEPES (pH 8.5) 용액으로 227 배로 희석, 354234, BD), 또는 10.0 ㎎/㎖ 의 라미닌 용액 (원액을 20 mM HEPES (pH 8.5) 용액으로 227 배로 희석, 354232, BD) 을 1 ㎖ 적하하고, 16 시간 37 ℃ 인큐베이터에 정치하였다. 그 후 PA 겔을 인산 완충액으로 잘 린스하여, 미가교의 마트리겔이나 라미닌을 제거하였다.
다음으로 제작한 패턴 겔을 사용하여, iPS 유래 간장 내배엽 세포, HUVEC, MSC 를, 10 : 7 : 2 의 비율로 혼합하고, 총 세포 수로서 약 2 × 106 cells 를 파종하고자 하였다 (도 21). 그 결과, 패턴 1 에서는, 세포 파종 후 30 시간 동안에 중심의 단단한 영역에 세포가 모여, 신속하게 집합체를 형성하였다. 패턴 2 에서는, 세포 집합체의 형성을 확인했지만 중심으로의 집합 속도는 약간 지연되는 경향이었다. 중심부가 100 ㎪ 인 조건이 최적인 것이 시사되었다.
〔실시예 7〕
(방법과 결과)
포지티브 패턴에서는, 각 원형 부분이 단단하고, 그 주변이 부드러워지도록 설계하였다 (도 22 왼쪽). 네거티브 패턴에서는, 각 원형 부분이 부드럽고, 그 주변이 단단해지도록 설계하였다 (도 22 오른쪽). 이와 같은 다수의 경도 패턴을 갖는 겔 기판은, 실시예 6 에 기재된 수법을 베이스로 하고, 4 × 4 의 원형 패턴 (원의 직경 약 2 ㎜, 원의 중심간 거리 약 2.7 ㎜) 을 갖는 포토마스크에 의해, 직경 25 ㎜ 의 겔 기판에 노광하여 제작하였다. 이들 패턴화 지지체를 사용함으로써 임의의 장소에, 임의의 크기의 집합체를 형성할 수 있는 것으로 생각된다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 받아들이는 것으로 한다.
산업상 이용가능성
본 발명은, 신약의 탐색 및 약효의 판정, 재생 의료, 질병, 병태의 진단, 유용 물질 생산 등에 이용 가능하다.
Claims (25)
- 임의의 종류의 세포 및/또는 조직과 간엽계 세포의 혼합물을 배양하여, 세포 집합체를 형성시키는 것을 포함하는, 세포 집합체를 in vitro 에서 제작하는 방법.
- 제 1 항에 있어서,
세포 집합체가, 자기 조직화에 의해, 고차 구조가 부가된 삼차원 조직 구조를 형성할 수 있는 것인 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
임의의 종류의 세포 및/또는 조직과 간엽계 세포의 혼합물을 간엽계 세포가 수축 가능한 겔상 지지체 상에서 배양하는 방법. - 제 3 항에 있어서,
배양이 이차원 배양인 방법. - 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
겔상 지지체가 평면이거나, 혹은, 겔상 지지체의 배양하는 측의 단면이 U 또는 V 자의 형상인 방법. - 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
겔상 지지체의 중심부의 경도가 주변부의 경도보다 단단한 방법. - 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
겔상 지지체의 주변부의 경도가 중심부의 경도보다 단단한 방법. - 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
겔상 지지체가 패턴화되어 있고, 중심부의 경도가 주변부의 경도보다 단단하다고 하는 패턴을 1 개 이상 갖는 방법. - 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
겔상 지지체가 패턴화되어 있고, 주변부의 경도가 중심부의 경도보다 단단하다고 하는 패턴을 1 개 이상 갖는 방법. - 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
임의의 종류의 세포 및/또는 조직이 총 세포 수로서 40 만 개 이상이고, 간엽계 세포가 10 만 ∼ 40 만 개인 방법. - 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
세포 집합체의 크기가 1 ㎜ 이상인 방법. - 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
세포 집합체의 형성이 자율적인 것인 방법. - 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
족장 재료를 사용하지 않고, 임의의 종류의 세포 및/또는 조직과 간엽계 세포의 혼합물을 배양하는 방법. - 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
간엽계 세포와 혼합하는 세포 및/또는 조직이, 간장, 췌장, 장, 폐, 신장, 심장, 뇌 또는 암에서 유래하는 방법. - 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
간엽계 세포와 혼합하는 세포가, 다능성 세포인 방법. - 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
간엽계 세포와 혼합하는 조직이, 다능성 세포로부터 유도된 조직인 방법. - 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
다능성 세포가, 생체로부터 얻어진 다능성 세포, 재프로그램으로부터 유도하여 얻어진 다능성 세포, 또는 그들의 조합인 방법. - 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제작된 세포 집합체.
- 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제작된 세포 집합체를 자기 조직화시켜, 고차 구조가 부가된 삼차원 조직 구조를 형성시키는 것을 포함하는, 삼차원 조직 구조의 제작 방법.
- 배양하는 측의 단면이 U 또는 V 자의 형상인 겔상 배양 지지체.
- 중심부의 경도가 주변부의 경도보다 단단한 겔상 배양 지지체.
- 주변부의 경도가 중심부의 경도보다 단단한 겔상 배양 지지체.
- 중심부의 경도가 주변부의 경도보다 단단하다고 하는 패턴을 1 개 이상 갖는 겔상 배양 지지체.
- 주변부의 경도가 중심부의 경도보다 단단하다고 하는 패턴을 1 개 이상 갖는 겔상 배양 지지체.
- 제 20 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 기재된 겔상 배양 지지체 상에서, 임의의 종류의 세포 및/또는 조직과 간엽계 세포의 혼합물을 배양하여, 세포 집합체를 형성시키는 것을 포함하는, 세포 집합체를 in vitro 에서 제작하는 방법.
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