CN113350574B - 图案化类肝小叶微组织制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种图案化类肝小叶微组织制造方法，首先合成甲基丙烯酰胺化丝素蛋白，再配置甲基丙烯酰胺化丝素蛋白预聚液，然后利用甲基丙烯酰胺化丝素蛋白预聚液分别配置含HUVECs细胞的预聚液和含HepG2细胞的预聚液，继后利用光掩模微制造技术得到由交错嵌合在一起的含HUVECs细胞的微凝胶阵列和含HepG2细胞的微凝胶阵列构成的放射状六边形微凝胶结构单元，其具有肝细胞和血管内皮细胞图案化分布特点，模拟了肝脏基本结构单位肝小叶的细胞分布方式和微结构特征，有利于建立肝细胞功能与血管化功能的协同作用，将为进一步通过单元组装或3D组织打印技术实现从微观到宏观的肝组织构建奠定基础。

Description

图案化类肝小叶微组织制造方法
技术领域
本发明属于生物医学材料和生物医学工程技术领域，涉及仿生材料制造方法，尤其涉及用于血管化组织工程肝的仿生微组织及制造方法。
背景技术
肝脏是人体最大的解毒器官和消化腺，在维持人体生命活动中占有极其重要的地位，它既是物质代谢的中心，又担负人体的免疫调节、生物转化、血液循环等复杂的生理功能。因此，由酒精、病毒等因素引起的肝病，特别是肝功能衰竭，严重威胁人类健康。我国为肝病高发区，每年因肝病死亡的人数高达40多万，每年用于治疗肝病的医疗费用高达1000多亿元。肝组织工程主要研究给肝功能损伤患者提供活体移植或做肝功能相关的功能监测、药物代谢和毒性测试等。因此，采用组织工程技术，体外构建类肝脏组织有助于完善肝脏功能研究、促进肝移植发展，有望解决临床需求，并已成为近年研究的热点。
众所周知，在肝脏组织中除了含有大量组成肝板的肝细胞外，还有大量围绕肝板的内皮细胞形成血管网络，且肝细胞与血管内皮细胞按照特殊的空间结构分布。肝小叶是肝脏结构与功能的基本单位，呈六边形棱柱状，中轴贯穿一条纵形静脉，为中央静脉，管壁由内皮细胞组成。肝细胞以中央静脉为中心，向四周略成放射状排列，形成肝细胞素。因此，肝细胞与血管内皮细胞是构建肝脏组织的重要组成细胞，其空间分布、相互作用及功能建立是肝脏组织功能建立的基础。
受肝组织结构启发，人们尝试将两种细胞共同培养以促进肝细胞分化或其功能表达，发现血管内皮细胞的加入确实增进了肝细胞功能表达。还有研究者尝试了在肝细胞球外层构建血管内皮细胞层以模拟肝脏组织中肝细胞与血管内皮细胞共存的模式，并证明血管内皮细胞层的构建可以促进肝细胞球中的血管化。尽管如此，这种细胞共培养的方式对肝细胞及肝脏组织功能的建立是远远不够的，一是缺乏对肝细胞与血管内皮细胞的作用模式及其影响因素的系统研究，二是未关注细胞空间分布的影响，特别是对肝脏组织中两种细胞空间分布微结构的模拟，因此并不能模拟肝脏组织中两种细胞的作用方式，因而对基于细胞功能建立而实现组织功能建立的目标难以实现。
综上，尽管基于肝细胞或干细胞诱导分化肝细胞构建肝脏组织工程取得了一定成效，但离肝脏组织功能建立还相差很远。肝脏基本结构单位是肝小叶，肝小叶不是由肝细胞和血管内皮细胞无序组成的，而是按一定方式排列形成一定空间分布和结构，这种特殊的细胞分布方式和微结构赋予其特殊的生理功能，使肝细胞与血管内皮细胞相互作用建立肝细胞功能与血管化功能的协同作用。基于结构仿生与功能仿生的关系，建立一种空间可控分布的共培养模型可更有效的促进肝细胞与内皮细胞的生长分化，从而增进构建肝组织的生物功能。
因此，亟需构建具有两种细胞复杂可控空间分布特征的微结构单元，从结构上模拟肝脏组织的微结构，以更有效的促进肝细胞与内皮细胞的生长分化，进而增进构建肝组织的生物功能。
发明内容
针对传统肝小叶仿生单元难以实现肝细胞及肝脏组织功能表达的技术问题，本发明的目的旨在提供一种具有肝细胞/血管内皮细胞放射状排列的图案化类肝小叶微组织制造方法，该方法制造的类肝小叶微组织结构保真度高、细胞相容性高、简单高效，所获得的肝细胞/血管内皮细胞六边形共培养模型具有精确的三维空间分布，能够模拟肝小叶的结构特点和功能表达，可以达到促进肝细胞与血管内皮细胞相互作用和肝组织功能建立的目的。
本发明提供的图案化类肝小叶微组织制造方法，包括以下步骤：
(1)配置再生丝素蛋白水溶液
先脱去蚕丝中的丝胶得到丝素纤维，再将丝素纤维溶解于溶解剂溶液中，所得溶液经过滤去除杂质即得到再生丝素蛋白水溶液；
(2)合成乙烯基功能化丝素蛋白
将再生丝素蛋白水溶液稀释后，在搅拌条件下，于50～70℃滴入乙烯基化合物和催化剂的混合液中，滴加完毕后在该温度下继续避光搅拌反应2～4h；所得反应液经去除杂质、冷冻干燥即得到乙烯基功能化丝素蛋白，并置于低温保存；所述乙烯基化合物与催化剂的体积比为(2～4)：(1～3)；
(3)配置乙烯基功能化丝素蛋白预聚液
将乙烯基功能化化丝素蛋白溶解于光引发剂溶液中，配置成乙烯基功能化丝素蛋白终浓度为100～400mg/mL、光引发剂终浓度为5～20mg/mL的乙烯基功能化丝素蛋白预聚液；
(4)制备类肝小叶微组织单元
(i)按照细胞浓度106～107个细胞/mL，将人血管内皮细胞HUVECs和肝癌细胞HepG2分别与步骤(3)配置的乙烯基功能化丝素蛋白预聚液混合均匀得到含HUVECs细胞的预聚液和含HepG2细胞的预聚液；
(ii)采用光掩膜技术得到三维宏观类肝小叶微组织单元，所述三维宏观类肝小叶微组织单元由若干微凝胶片层顺序叠加组装得到；所述微凝胶片层由具有第一图案的含HUVECs细胞的微凝胶阵列和具有第二图案的含HepG2细胞的微凝胶阵列交错嵌合得到。
上述步骤(1)是先脱去蚕丝中的丝胶得到纯的丝素纤维，然后将纯的丝素纤维溶解到溶解剂中得到再生丝素蛋白水溶液。步骤(1)的具体实现包括以下分步骤：
(i)将蚕丝加入到85～100℃的脱胶剂中，并在该温度下搅拌至少30min，之后取出蚕丝并用去离子水清洗；重复上述操作，直至脱去蚕丝中的丝胶；所述蚕丝与脱胶剂的质量/体积比为1:(50～300)g/mL；
(ii)将蚕丝脱去丝胶后的产物干燥得到丝素纤维；
(iii)将干燥后的丝素纤维加入到溶解剂中，于25～80℃持续搅拌直至丝素纤维完全溶解，所得溶液经过滤，得到再生丝素蛋白水溶液。
上述步骤(i)中，所述脱胶剂为碳酸钠或/和碳酸氢钠溶液；所述脱胶剂中溶质的质量浓度为0.05％～1％。
上述步骤(i)中，使用去离子水对蚕丝清洗的目的是去除蚕丝中的胶状丝胶蛋白成分和残留的脱胶剂等，一般清洗2～5遍即可。
上述步骤(i)中将蚕丝放入碳酸钠水溶液中加热搅拌和对加热后的蚕丝清洗的操作，一般重复至少三次，这样就可彻底脱去蚕丝中的丝胶。
上述步骤(ii)中，将蚕丝脱去丝胶后的产物于20～60℃烘干即可。
上述步骤(iii)中，为了便于丝素纤维溶液，可以先将丝素辖内剪碎后再加入到溶解剂中。丝素纤维与溶解剂的质量/体积比为1：(4～20)g/mL；溶解剂可以为溴化锂溶液、硝酸钙溶液、Ajisawa’s试剂、硫氰酸锂溶液等，例如质量浓度为9～9.5M的溴化锂溶液、摩尔比为1∶2∶8的氯化钙-乙醇-水三元溶液(即Ajisawa’s试剂)、10M硫氰酸锂。一般于25～80℃持续搅拌1～4h，丝素纤维即可完全溶解于溶解剂中。
上述步骤(2)的目的是以丝素纤维和乙烯基化合物为原料经酯化反应得到乙烯基功能化丝素蛋白。所述乙烯基化合物为甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸异氰基乙酯或甲基丙烯酸酐等。乙烯基化合物和催化剂的混合液的使用量是过量的；在优选实现方式中，乙烯基化合物和催化剂的混合液的使用量按照每5g丝素纤维使用3～7ml混合液计量。所使用的催化剂为三乙胺，乙烯基化合物与催化剂的体积比为1:0.6。一般再生丝素蛋白水溶液需要进一步稀释后才能使用，将步骤(1)得到的再生丝素蛋白水溶液利用去离子水或PBS缓冲液稀释5～8倍即可。反应液中的杂质包括不溶微粒、未反应完的乙烯基化合物、残留的副反应产物以及催化剂等。反应结束后，所得反应液去除杂质的具体操作为：将所得反应液过滤去除不溶微粒后，转移至透析袋中，于0～4℃下置于去离子水中透析若干天，以除去反应液中残留的副反应产物以及催化剂等；透析所得溶液再次过滤进一步去除不溶微粒得到乙烯基功能化丝素蛋白溶液。乙烯基功能化丝素蛋白溶液经冷冻干燥得到乙烯基功能化丝素蛋白。
上述步骤(3)中，光引发剂溶液为由光引发剂溶解于50～70℃的PBS缓冲液中得到的质量浓度为5～20mg/mL的光引发剂溶液。所述光引发剂为I2959光引发剂或LAP(苯基-(2,4,6-三甲基苯甲酰基)-磷酸锂盐)光引发剂。配置凝胶预聚液在常温常压下进行即可。乙烯基功能化丝素蛋白预聚液中乙烯基功能化丝素蛋白终浓度优选为200～300mg/mL。
上述步骤(4)中，所述微凝胶片层制备步骤为：采用光掩膜技术得到具有第一图案的含HUVECs细胞的微凝胶阵列；再将含HUVECs细胞的微凝胶阵列置于滴有含HepG2细胞的预聚液的上方，进一步采用光掩膜技术得到具有第二图案的含HepG2细胞的微凝胶阵列，且含HUVECs细胞的微凝胶阵列与含HepG2细胞的微凝胶阵列交错嵌合。所述光掩膜技术为将具有图案的光掩膜板置于待处理的预聚液液滴之上，利用紫外光(7.9mW/cm2)曝光10～40s，在光掩膜的透光区域形成图案化微凝胶；之后用PBS缓冲液反复清洗曝光后的产物，以除去未形成凝胶的预聚液，即得到具有图案结构的微凝胶阵列。上述两次掩膜时，第二次掩膜使用的光掩膜板上的第二图案与含HUVECs细胞的微凝胶阵列上的第一图案位置相同，且图案交错放置。含HUVECs细胞的微凝胶阵列上的第一图案为放射状分布的六边形结构、环形结构或长条形结构等，优选为放射状六边形结构(血管结构)，即由中心位置辐射出六组含HUVECs细胞的微凝胶对，每组微凝胶对延伸至正六边形的一个角。含HepG2细胞的微凝胶阵列上的第二图案为与第一图案相契合的放射状分布的花瓣结构、环形结构或长条形结构等，在优选方式为花瓣结构(肝实质结构)，每个含HepG2细胞的微凝胶花瓣位于两组含HUVECs细胞的微凝胶对之间。
含HUVECs细胞的微凝胶阵列上的第一图案和含HepG2细胞的微凝胶阵列上的第二图案由所使用的光掩膜板确定。本发明中，使用的光掩模制备方式为：使用计算机辅助设计软件(CAD)分别设计两种形状与尺寸能够相互契合的放射状六边形图案和花瓣状图案，并将它们采用20000dpi的分辨率打印在菲林板上(CAD/Art Services)，得到两种图案化光掩模，图案尺寸为200～1000μm。上述两种光掩模上下叠放后透光区域图案能够形成六边形-花瓣契合。
为了使两种微凝胶阵列第一图案和第二图案交错嵌合的方法为：将具有第一图案和第二图案的两个光掩膜上分别设计上与模板等大边框标记，来辅助两种图案的对准操作，同时采用高精度的自动对准显微设备观察后进行微调，以确保所得到的放射状六边形微凝胶和花瓣状微凝胶间能够精准契合。
上述微凝胶片层组装方法为：将若干微凝胶片层置于含有矿物油的容器中，利用针头引导亲水性的微凝胶顺序叠加聚集组装在一起，然后再对得到的组装体进行5～10s的紫外光照射，最后将二次交联的稳定组装结构从矿物油中取出并用DPBS缓冲液洗涤若干次去除多余的矿物油即获得类肝小叶微组织单元。最终，将获得类肝小叶微组织单元置于培养基中培养备用即可。
本发明进一步提供了通过上述方法制造的图案化类肝小叶微组织，具有肝细胞和血管内皮细胞放射状排布的图案化分布特点，模拟了肝脏基本结构单位肝小叶的细胞分布方式和微结构特征，有助于建立肝细胞功能与血管化功能的协同作用。这样的细胞放射状分布设计，能够在维持各区域细胞的正常活性与增殖的基础上，通过两种细胞间交互作用，达到促进肝细胞增殖和功能发挥的目的，最终促进模型中的类肝小叶形成。
与现有技术相比，本发明提供的图案化类肝小叶微组织制造方法具有以下有益效果：
1、本发明首先合成乙烯基功能化丝素蛋白，再配置乙烯基功能化丝素蛋白预聚液，然后利用乙烯基功能化丝素蛋白预聚液分别配置含HUVECs细胞的预聚液和含HepG2细胞的预聚液，继后利用光掩模微制造技术得到由交错嵌合在一起的含HUVECs细胞的微凝胶阵列和含HepG2细胞的微凝胶阵列构成的放射状六边形微凝胶结构单元，其具有肝细胞和血管内皮细胞图案化分布特点，模拟了肝脏基本结构单位肝小叶的细胞分布方式和微结构特征，有利于建立肝细胞功能与血管化功能的协同作用，将为进一步通过单元组装或3D组织打印技术实现从微观到宏观的肝组织构建奠定基础。
2、本发明使用的乙烯基功能化丝素蛋白，利用丝素纤维与甲基丙烯酸缩水甘油酯等乙烯基化合物间的酯化反应，在保留丝素蛋白原有组成与空间构象的基础上，使丝素具有可光交联性质，从而赋予其光掩模加工成型性，且制备的乙烯基功能化丝素蛋白溶液粘度低，相对微组织工程制造技术中常用的海藻酸钠、明胶、胶原材料具有更好的微制造操作特性。
3、本发明使用的乙烯基功能化丝素蛋白具有良好的水溶性，且可长期稳定保存，解决了传统丝素蛋白不稳定、溶解性差的问题。
4、本发明提供的类肝小叶微组织单元，可用于肝脏类药物的药物筛选、疾病机理研究以及药物在肝脏中的代谢过程研究等，也可以用于肝移植研究。
5、本发明提供的类肝小叶微组织单元的制备方法，基于常规设备即可实现，且所用原材料无毒、环保，有利于实现工业化生产，所获得的光交联丝素水凝胶除可用于类肝小叶微结构构建外，还可广泛用于细胞载体和组织工程，为再生医学提供新型功能化载体材料。
附图说明
图1为光掩膜原理示意图。
图2为光掩膜板图案及类肝小叶微组织单元示意图；其中，(a)为第一图案，(b)为第二图案，(c)为类肝小叶微组织单元示意图。
图3为未经处理的丝素蛋白、实施例2-实施例4步骤(2)制备的乙烯基功能化丝素蛋白的氢核磁共振图谱。
图4为未经处理的丝素蛋白、实施例2-实施例4步骤(2)制备的乙烯基功能化丝素蛋白的圆二色谱。
图5为实施例1步骤(4)制备的不同图案微凝胶阵列荧光图像。
图6为实施例5制备的含HUVECs细胞的微凝胶阵列、含HepG2细胞的微凝胶阵列及类肝小叶微组织单元体外培养7天后，在FDA/PI溶液中浸泡2min进行细胞活死染色之后的激光共聚焦检测结果；其中，(a)为含HUVECs细胞的六边形微凝胶阵列(仿肝小叶血管结构)的明场照片；(b)为含HUVECs细胞的六边形微凝胶阵列(仿肝小叶血管结构)的荧光照片；(c)为含HepG2细胞的花瓣状微凝胶阵列(仿肝小叶肝板结构)的明场照片；(d)含HepG2细胞的花瓣状微凝胶阵列(仿肝小叶肝板结构)的荧光照片；(e)六边形微凝胶阵列与花瓣状微凝胶阵列嵌合组装后得到的三维类肝小叶微组织单元的荧光照片。
具体实施方式
拟结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明。
以下实施例中使用的光掩膜板制作方法为：使用AutoCAD 2007软件设计满足要求的光掩膜板图案，图案尺寸为200～1000μm，并依据载玻片尺寸，在图案对应位置设计上于载玻片等大的边框标记。并将它们采用20000dpi的分辨率打印在菲林板上(CAD/ArtServices)，得到含不同图案的光掩模板。
以下实施例中采用的光掩膜技术如图1所示，在一个疏水的模板两端分别搭建1-4片载玻片，形成一定高度的间隔。用移液器吸取一定体积的预聚液滴到此间隔空间内，然后将一个载玻片盖在溶液液滴之上，形成一定厚度的预聚液均匀分布的薄片，载玻片上覆盖具有不同图案的光掩膜，在紫外光(7.9mW/cm2)下曝光10～40s，在光掩膜的透光区域形成图案化微凝胶。脱模后，用PBS反复清洗若干次以除去未反应的预聚物溶液，得到粘附在载玻片上的具有不同图案结构的微凝胶阵列。
实施例1
本实施例提供的图案化丝素蛋白凝胶微单元制备包括以下步骤：
(1)配置再生丝素蛋白水溶液
(i)配置3L质量浓度为0.05％的碳酸钠水溶液，用电热套将碳酸钠水溶液加热至约85℃，然后加入30g蚕丝(这里为家蚕生丝)，持续搅拌并保持微沸30min，随后取出蚕丝并用去离子水清洗5遍；重复以上操作三次，以彻底脱去丝胶；
(ii)将蚕丝脱去丝胶后的产物于20℃下烘干得到纯丝素纤维；
(iii)称取干燥后的丝素纤维5g，剪碎后迅速投入到20mL浓度为9.3M的溴化锂溶液中，于60℃持续搅拌4h，丝素纤维完全溶解，将所得溶液通过70μm筛网过滤，以除去杂质，即得到再生丝素蛋白水溶液。
(2)合成乙烯基功能化丝素蛋白
将步骤(1)得到的再生丝素蛋白水溶液用去离子水稀释至30mg/mL后，于50℃滴入由3.5mL甲基丙烯酸缩水甘油酯和2.1mL三乙胺组成的混合液中，滴加完毕后在该温度下继续避光搅拌反应2.5h；反应结束后将所得反应液通过70μm筛网过滤除去不溶微粒，然后转移至截留分子量为3500Da的透析袋中，于4℃下置于去离子水中透析5天，以除去体系中残留的副反应产物以及催化剂等；透析结束后溶液再次通过70μm筛网过滤，以进一步除去不溶微粒得到乙烯基功能化丝素蛋白溶液。最后将所得的乙烯基功能化丝素蛋白溶液冷冻干燥，并于-20℃冰箱中避光保存备用。
(3)配置乙烯基功能化丝素蛋白预聚液
将光引发剂I2959溶解于60℃的PBS缓冲液中，配置质量浓度为5mg/mL的引发剂溶液。
常温常压下，将冻干乙烯基功能化丝素蛋白溶解于上述I2959引发剂溶液中，再于上述溶液中加入罗丹明Rhodamine染料，配置成乙烯基功能化丝素蛋白终浓度为200mg/mL、光引发剂终浓度为5mg/mL，罗丹明浓度为10μg/mL的凝胶预聚液。
(4)制备图案化丝素蛋白凝胶微单元
在一个疏水的模板两端分别搭建两片载玻片，形成300μm高的间隔。用移液器吸取200μL左右的乙烯基功能化丝素蛋白预聚液滴到此间隔空间内，然后将一个载玻片盖在预聚液液滴之上，形成300μm厚度的预聚液均匀分布的薄片，载玻片上覆盖具有六种不同图案的光掩膜，在紫外光(420nm、7.9mW/cm2)下曝光20s，在光掩膜的透光区域形成图案化微凝胶。脱模后，用PBS缓冲液清洗3次以除去未反应掉的预聚物溶液，得到粘附在载玻片上的具有不同图案结构的微凝胶阵列(如图5所示)。
实施例2
本实施例提供的图案化丝素蛋白凝胶微单元制备包括以下步骤：
(1)配置再生丝素蛋白水溶液
(i)配置4L质量浓度为0.5％的碳酸钠水溶液，用电热套将碳酸钠水溶液加热至约90℃，然后加入20g蚕丝(这里为家蚕生丝)，持续搅拌并保持微沸30min，随后取出蚕丝并用去离子水清洗3遍；重复以上操作三次，以彻底脱去丝胶；
(ii)将蚕丝脱去丝胶后的产物于40℃下烘干得到纯丝素纤维；
(iii)称取干燥后的丝素纤维5g，剪碎后迅速投入到50mL摩尔比为1∶2∶8的氯化钙-乙醇-水三元溶液中，于80℃持续搅拌1h，丝素纤维完全溶解，将所得溶液通过70μm筛网过滤，以除去杂质，即得到再生丝素蛋白水溶液。
(2)合成乙烯基功能化丝素蛋白
将步骤(1)得到的再生丝素蛋白水溶液用去离子水稀释至40mg/mL后，于60℃滴入由2mL甲基丙烯酸缩水甘油酯和1.2mL三乙胺组成的混合液中，滴加完毕后在该温度下继续避光搅拌反应2.5h；反应结束后将所得反应液通过70μm筛网过滤除去不溶微粒，然后转移至截留分子量为3500Da的透析袋中，于0℃下置于去离子水中透析3天，以除去体系中残留的副反应产物以及催化剂等；透析结束后溶液再次通过70μm筛网过滤，以进一步除去不溶微粒得到乙烯基功能化丝素蛋白溶液。最后将所得的乙烯基功能化丝素蛋白溶液冷冻干燥，并于-20℃冰箱中避光保存备用。
(3)配置乙烯基功能化丝素蛋白预聚液
将光引发剂I2959溶解于60℃的PBS缓冲液中，配置质量浓度为10mg/mL的引发剂溶液。
常温常压下，将冻干乙烯基功能化丝素蛋白溶解于上述I2959引发剂溶液中，配置成乙烯基功能化丝素蛋白终浓度为200mg/mL、光引发剂终浓度为10mg/mL的凝胶预聚液。
(4)制备图案化丝素蛋白凝胶微单元
在一个疏水的模板两端分别搭建两片载玻片，形成300μm高的间隔。用移液器吸取200μL左右的乙烯基功能化丝素蛋白预聚液滴到此间隔空间内，然后将一个载玻片盖在预聚液液滴之上，形成300μm厚度的预聚液均匀分布的薄片，载玻片上覆盖具有六种不同图案的光掩膜，在紫外光(420nm、7.9mW/cm2)下曝光25s，在光掩膜的透光区域形成图案化微凝胶。脱模后，用PBS缓冲液清洗3次以除去未反应掉的预聚物溶液，得到粘附在载玻片上的具有不同图案结构的微凝胶阵列。
实施例3
本实施例提供的图案化丝素蛋白凝胶微单元制备包括以下步骤：
(1)配置再生丝素蛋白水溶液
(i)配置4L质量浓度为1％的碳酸钠水溶液，用电热套将碳酸钠水溶液加热至微沸约95℃，然后加入20g蚕丝(这里为家蚕生丝)，持续搅拌并保持微沸30min，随后取出蚕丝并用去离子水清洗3遍；重复以上操作三次，以彻底脱去丝胶；
(ii)将蚕丝脱去丝胶后的产物于40℃下烘干得到纯丝素纤维；
(iii)称取干燥后的丝素纤维5g，剪碎后迅速投入到20mL浓度为9M的溴化锂溶液中，于60℃持续搅拌2.5h，丝素纤维完全溶解，将所得溶液通过70μm筛网过滤，以除去杂质，即得到再生丝素蛋白水溶液。
(2)合成乙烯基功能化丝素蛋白
将步骤(1)得到的再生丝素蛋白水溶液用去离子水稀释至40mg/mL后，于60℃滴入由3mL甲基丙烯酸缩水甘油酯和1.8mL三乙胺组成的混合液中，滴加完毕后在该温度下继续避光搅拌反应2.5h；反应结束后将所得反应液通过70μm筛网过滤除去不溶微粒，然后转移至截留分子量为3500Da的透析袋中，于4℃下置于去离子水中透析5天，以除去体系中残留的副反应产物以及催化剂等；透析结束后溶液再次通过70μm筛网过滤，以进一步除去不溶微粒得到乙烯基功能化丝素蛋白溶液。最后将所得的乙烯基功能化丝素蛋白溶液冷冻干燥，并于-20℃冰箱中避光保存备用。
(3)配置乙烯基功能化丝素蛋白预聚液
将光引发剂LAP溶解于60℃PBS缓冲液中，配置质量浓度为10mg/mL的引发剂溶液。
常温常压下，将冻干乙烯基功能化丝素蛋白溶解于上述LAP引发剂溶液中，配置成乙烯基功能化丝素蛋白终浓度为200mg/mL、光引发剂终浓度为10mg/mL的凝胶预聚液。
(4)制备图案化丝素蛋白凝胶微单元
在一个疏水的模板两端分别搭建两片载玻片，形成300μm高的间隔。用移液器吸取200μL左右的乙烯基功能化丝素蛋白预聚液滴到此间隔空间内，然后将一个载玻片盖在预聚液液滴之上，形成300μm厚度的预聚液均匀分布的薄片，载玻片上覆盖具有六种不同图案的光掩膜，在紫外光(420nm、7.9mW/cm2)下曝光20s，在光掩膜的透光区域形成图案化微凝胶。脱模后，用PBS缓冲液清洗4次以除去未反应掉的预聚物溶液，得到粘附在载玻片上的具有不同图案结构的微凝胶阵列。
实施例4
本实施例提供的图案化丝素蛋白凝胶微单元制备包括以下步骤：
(1)配置再生丝素蛋白水溶液
(i)配置4L质量浓度为0.5％的碳酸钠/碳酸氢钠混合水溶液(碳酸钠与碳酸氢钠质量比为1:1)，用电热套将碳酸钠水溶液加热至约90℃，然后加入20g蚕丝(这里为家蚕生丝)，持续搅拌并保持微沸30min，随后取出蚕丝并用去离子水清洗3遍；重复以上操作三次，以彻底脱去丝胶；
(ii)将蚕丝脱去丝胶后的产物于40℃下烘干得到纯丝素纤维；
(iii)称取干燥后的丝素纤维5g，剪碎后迅速投入到100mL浓度为10M硫氰酸锂溶液中，于40℃持续搅拌2.5h，丝素纤维完全溶解，将所得溶液通过70μm筛网过滤，以除去杂质，即得到再生丝素蛋白水溶液。
(2)合成乙烯基功能化丝素蛋白
将步骤(1)得到的再生丝素蛋白水溶液用去离子水稀释至40mg/mL后，于60℃滴入由4mL甲基丙烯酸缩水甘油酯和2.4mL三乙胺组成的混合液中，滴加完毕后在该温度下继续避光搅拌反应2.5h；反应结束后将所得反应液通过70μm筛网过滤除去不溶微粒，然后转移至截留分子量为3500Da的透析袋中，于4℃下置于去离子水中进行透析3天，以除去体系中残留的副反应产物以及催化剂等；透析结束后溶液再次通过70μm筛网过滤，以进一步除去不溶微粒得到乙烯基功能化丝素蛋白溶液。最后将所得的乙烯基功能化丝素蛋白溶液冷冻干燥，并于-20℃冰箱中避光保存备用。
(3)配置乙烯基功能化丝素蛋白预聚液
将光引发剂LAP溶解于60℃的PBS缓冲液中，配置质量浓度为10mg/mL的引发剂溶液。
常温常压下，将冻干乙烯基功能化丝素蛋白溶解于上述LAP引发剂溶液中，配置成乙烯基功能化丝素蛋白终浓度为200mg/mL、光引发剂终浓度为10mg/mL的凝胶预聚液。
(4)制备类肝小叶微组织单元
(i)按照细胞浓度5*106个细胞/mL，将人血管内皮细胞HUVECs和肝癌细胞HepG2分别与步骤(3)配置的乙烯基功能化丝素蛋白预聚液混合均匀得到含HUVECs细胞的预聚液和含HepG2细胞的预聚液；
(ii)本步骤中使用的两种掩膜板图案如图2所示。其中图2(a)给出的为用于制备含HUVECs细胞的微凝胶阵列的第一光掩膜板中的第一图案，第一图案为放射状六边形结构，即由中心位置辐射出六组透光边区域对，与图2(c)中示意的血管内皮细胞位置相对应。图2(b)给出的为用于制备含HepG2细胞的微凝胶阵列的第二光掩膜板中的第二图案，第二种图案为花瓣结构，即沿中心均匀分布的六个三角形透光区域，与图2(c)中示意的肝细胞所在区域相对应。两种光掩模上下叠放后透光区域图案能够形成六边形-花瓣契合，即与图2(c)给出的含HUVECs细胞的微凝胶阵列与含HepG2细胞的微凝胶阵列交错嵌合结构相对应。
首先，在一个疏水的模板两端分别搭建一片载玻片，形成150μm高的间隔。用移液器吸取100μL左右的含HUVECs细胞的预聚液滴到此间隔空间内，然后将一个载玻片盖在预聚液液滴之上，形成预聚液均匀分布的薄片，载玻片上覆盖具有第一图案的光掩膜板，在紫外光(420nm、7.9mW/cm2)下曝光30s，在光掩膜的透光区域形成图案化微凝胶。脱模后，用PBS缓冲液清洗5次以除去未反应掉的预聚物溶液，得到粘附在载玻片上的具有第一图案结构的含HUVECs细胞的微凝胶阵列。
然后，在另一个疏水的模板两端分别搭建另一片载玻片，形成150μm高的间隔。用移液器吸取100μL左右的含HepG2细胞的预聚液滴到此间隔空间内，将含HUVECs细胞的微凝胶阵列的载玻片置于预聚液液滴之上，形成预聚液均匀分布的薄片，再使用第二图案的光掩膜板对其覆盖，在紫外光(420nm、7.9mW/cm2)下曝光30s，在光掩膜的透光区域形成图案化微凝胶。脱模后，用PBS缓冲液清洗5次以除去未反应掉的预聚物溶液，得到粘附在载玻片上的含HUVECs细胞的放射状六边形结构(血管结构)和含HepG2细胞的花瓣形状(肝实质)微凝胶阵列间交错嵌合的微凝胶片层。
重复上述操作，得到8层微凝胶片层，然后按照以下操作将8层微凝胶片层顺序叠加组装在一起：将得到粘附有微凝胶片层载玻片置于含有15毫升矿物油的培养皿中用23G注射器针头沿着载玻片的表面，垂直于微水凝胶阵列的方向手动将微凝胶单元刷入油中，利用针头引导亲水性的微凝胶聚集组装在一起，然后再对得到的组装体在紫外光(420nm、7.9mW/cm2)下照射10s，最后将二次交联的稳定组装结构从矿物油中取出并用DPBS缓冲液洗涤4次去除多余的矿物油获得最终的类肝小叶微组织单元。
将获得的类肝小叶微组织单元置于DMEM培养基中培养备用即可。
实施例5
本实施例提供的图案化丝素蛋白凝胶微单元制备包括以下步骤：
(1)配置再生丝素蛋白水溶液
(i)配置2L质量浓度为0.5％的碳酸钠水溶液，用电热套将碳酸钠水溶液加热至约90℃，然后加入20g蚕丝(这里为家蚕生丝)，持续搅拌并保持微沸30min，随后取出蚕丝并用去离子水清洗3遍；重复以上操作三次，以彻底脱去丝胶；
(ii)将蚕丝脱去丝胶后的产物于40℃下烘干得到纯丝素纤维；
(iii)称取干燥后的丝素纤维5g，剪碎后迅速投入到20mL浓度为9.3M的溴化锂溶液中，于60℃持续搅拌2.5h，丝素纤维完全溶解，将所得溶液通过70μm筛网过滤，以除去杂质，即得到再生丝素蛋白水溶液。
(2)合成乙烯基功能化丝素蛋白
将步骤(1)得到的再生丝素蛋白水溶液用去离子水稀释至40mg/mL后，于60℃滴入由2mL甲基丙烯酸缩水甘油酯和1.2mL三乙胺组成的混合液中，滴加完毕后在该温度下继续避光搅拌反应2.5h；反应结束后将所得反应液通过70μm筛网过滤除去不溶微粒，然后转移至截留分子量为3500Da的透析袋中，于4℃下置于去离子水中透析5天，以除去体系中残留的副反应产物以及催化剂等；透析结束后溶液再次通过70μm筛网过滤，以进一步除去不溶微粒得到乙烯基功能化丝素蛋白溶液。最后将所得的乙烯基功能化丝素蛋白溶液冷冻干燥，并于-20℃冰箱中避光保存备用。
(3)配置乙烯基功能化丝素蛋白预聚液
将光引发剂LAP溶解于60℃的PBS缓冲液中，配置质量浓度为20mg/mL的引发剂溶液。
常温常压下，将冻干乙烯基功能化丝素蛋白溶解于上述LAP引发剂溶液中，配置成乙烯基功能化丝素蛋白终浓度为300mg/mL、光引发剂终浓度为5mg/mL的凝胶预聚液。
(4)制备类肝小叶微组织单元
(i)按照细胞浓度1*107个细胞/mL，将人血管内皮细胞HUVECs和肝癌细胞HepG2分别与步骤(3)配置的乙烯基功能化丝素蛋白预聚液混合均匀得到含HUVECs细胞的预聚液和含HepG2细胞的预聚液；
(ii)本步骤使用的是实施例4中具有第一图案的光掩膜板。
在一个疏水的模板两端分别搭建三片载玻片，形成450μm高的间隔。用移液器吸取300μL左右的含HUVECs细胞的预聚液滴到此间隔空间内，然后将一个载玻片盖在预聚液液滴之上，形成预聚液均匀分布的薄片，载玻片上覆盖具有第一图案的光掩膜板，在紫外光(420nm、7.9mW/cm2)下曝光40s，在光掩膜的透光区域形成图案化微凝胶。脱模后，用PBS缓冲液清洗5次以除去未反应掉的预聚物溶液，得到粘附在载玻片上的具有第一图案结构的含HUVECs细胞的微凝胶阵列。
将获得的含HUVECs细胞的微凝胶阵列置于DMEM培养基中培养备用即可。
(iii)本步骤使用的是实施例4中具有第二图案的光掩膜板。
在一个疏水的模板两端分别搭建三片载玻片，形成450μm高的间隔。用移液器吸取300μL左右的含HepG2细胞的预聚液滴到此间隔空间内，然后将一个载玻片盖在预聚液液滴之上，形成预聚液均匀分布的薄片，载玻片上覆盖具有第二图案的光掩膜板，在紫外光(420nm、7.9mW/cm2)下曝光40s，在光掩膜的透光区域形成图案化微凝胶。脱模后，用PBS缓冲液清洗5次以除去未反应掉的预聚物溶液，得到粘附在载玻片上的具有第二图案结构的含HepG2细胞的微凝胶阵列。
将获得的含HepG2细胞的微凝胶阵列置于DMEM培养基中培养备用即可。
(iv)本步骤中使用的是实施例4中具有第一图案和第二图案的两种光掩膜板。
首先，在一个疏水的模板两端分别搭建三片载玻片，形成450μm高的间隔。用移液器吸取300μL左右的含HUVECs细胞的预聚液滴到此间隔空间内，然后将一个载玻片盖在预聚液液滴之上，形成预聚液均匀分布的薄片，载玻片上覆盖具有第一图案的光掩膜板，在紫外光(420nm、7.9mW/cm2)下曝光40s，在光掩膜的透光区域形成图案化微凝胶。脱模后，用PBS缓冲液清洗5次以除去未反应掉的预聚物溶液，得到粘附在载玻片上的具有第一图案结构的含HUVECs细胞的微凝胶阵列。
然后，在另一个疏水的模板两端分别搭建另三片载玻片，形成450μm高的间隔。用移液器吸取300μL左右的含HepG2细胞的预聚液滴到此间隔空间内，将含HUVECs细胞的微凝胶阵列的载玻片置于预聚液液滴之上，形成预聚液均匀分布的薄片，再使用第二图案的光掩膜板对其覆盖，在紫外光(420nm、7.9mW/cm2)下曝光40s，在光掩膜的透光区域形成图案化微凝胶。脱模后，用PBS缓冲液清洗5次以除去未反应掉的预聚物溶液，得到粘附在载玻片上的含HUVECs细胞的放射状六边形结构(血管结构)和含HepG2细胞的花瓣形状(肝实质)微凝胶阵列间交错嵌合的微凝胶片层。
重复上述操作，得到5层微凝胶片层，然后按照以下操作将5层微凝胶片层顺序叠加组装在一起：将得到粘附有微凝胶片层载玻片置于含有20毫升矿物油的培养皿中用27G×1/2注射器针头沿着载玻片的表面，垂直于微水凝胶阵列的方向手动将微凝胶单元刷入油中，利用针头引导亲水性的微凝胶聚集组装在一起，然后再对得到的组装体在紫外光(420nm、7.9mW/cm2)下照射7s，最后将二次交联的稳定组装结构从矿物油中取出并用DPBS缓冲液洗涤4次去除多余的矿物油获得最终的类肝小叶微组织单元。
将获得的类肝小叶微组织单元置于DMEM培养基中培养备用即可。
实施例6
本实施例提供的图案化丝素蛋白凝胶微单元制备包括以下步骤：
(1)配置再生丝素蛋白水溶液
(i)配置3L质量浓度为1％的碳酸钠水溶液，用电热套将碳酸钠水溶液加热至约85℃，然后加入10g蚕丝(这里为家蚕生丝)，持续搅拌并保持微沸30min，随后取出蚕丝并用去离子水清洗3遍；重复以上操作三次，以彻底脱去丝胶；
(ii)将蚕丝脱去丝胶后的产物于40℃下烘干得到纯丝素纤维；
(iii)称取干燥后的丝素纤维5g，剪碎后迅速投入到20mL浓度为9.3M的溴化锂溶液中，于70℃持续搅拌2.5h，丝素纤维完全溶解，将所得溶液通过70μm筛网过滤，以除去杂质，即得到再生丝素蛋白水溶液。
(2)合成乙烯基功能化丝素蛋白
将步骤(1)得到的再生丝素蛋白水溶液用去离子水稀释至40mg/mL后，于70℃滴入由2mL甲基丙烯酸异氰基乙酯和1.2mL三乙胺组成的混合液中，滴加完毕后在该温度下继续避光搅拌反应2.5h；反应结束后将所得反应液通过70μm筛网过滤除去不溶微粒，然后转移至截留分子量为3500Da的透析袋中，于4℃下置于去离子水中透析5天，以除去体系中残留的副反应产物以及催化剂等；透析结束后溶液再次通过70μm筛网过滤，以进一步除去不溶微粒得到乙烯基功能化丝素蛋白溶液。最后将所得的乙烯基功能化丝素蛋白溶液冷冻干燥，并于-20℃冰箱中避光保存备用。
(3)配置乙烯基功能化丝素蛋白预聚液
将光引发剂I2959溶解于70℃的PBS缓冲液中，配置质量浓度为5mg/mL的引发剂溶液。
常温常压下，将冻干乙烯基功能化丝素蛋白溶解于上述I2959引发剂溶液中，配置成乙烯基功能化丝素蛋白终浓度为300mg/mL、光引发剂终浓度为5mg/mL的凝胶预聚液。
(4)制备类肝小叶微组织单元
(i)按照细胞浓度1*107个细胞/mL，将人血管内皮细胞HUVECs和肝癌细胞HepG2分别与步骤(3)配置的乙烯基功能化丝素蛋白预聚液混合均匀得到含HUVECs细胞的预聚液和含HepG2细胞的预聚液；
(ii)本步骤中使用的是实施例4中具有第一图案和第二图案的两种光掩膜板。
首先，在一个疏水的模板两端分别搭建两片载玻片，形成300μm高的间隔。用移液器吸取200μL左右的含HUVECs细胞的预聚液滴到此间隔空间内，然后将一个载玻片盖在预聚液液滴之上，形成预聚液均匀分布的薄片，载玻片上覆盖具有第一图案的光掩膜板，在紫外光(420nm、7.9mW/cm2)下曝光20s，在光掩膜的透光区域形成图案化微凝胶。脱模后，用PBS缓冲液清洗3次以除去未反应掉的预聚物溶液，得到粘附在载玻片上的具有第一图案结构的含HUVECs细胞的微凝胶阵列。
然后，在另一个疏水的模板两端分别搭建另两片载玻片，形成300μm高的间隔。用移液器吸取200μL左右的含HepG2细胞的预聚液滴到此间隔空间内，将含HUVECs细胞的微凝胶阵列的载玻片置于预聚液液滴之上，形成预聚液均匀分布的薄片，再使用第二图案的光掩膜板对其覆盖，在紫外光(420nm、7.9mW/cm2)下曝光20s，在光掩膜的透光区域形成图案化微凝胶。脱模后，用PBS缓冲液清洗3次以除去未反应掉的预聚物溶液，得到粘附在载玻片上的含HUVECs细胞的放射状六边形结构(血管结构)和含HepG2细胞的花瓣形状(肝实质)微凝胶阵列间交错嵌合的微凝胶片层。
重复上述操作，得到10层微凝胶片层，然后按照以下操作将10层微凝胶片层顺序叠加组装在一起：将得到粘附有微凝胶片层载玻片置于含有20毫升矿物油的培养皿中用27G×1/2注射器针头沿着载玻片的表面，垂直于微凝胶片层的方向手动将微凝胶片层刷入油中，利用针头引导亲水性的微凝胶聚集组装在一起，然后再对得到的组装体在紫外光(420nm、7.9mW/cm2)下照射7s，最后将二次交联的稳定组装结构从矿物油中取出并用DPBS缓冲液洗涤4次去除多余的矿物油获得最终的类肝小叶微组织单元。
将获得的类肝小叶微组织单元置于DMEM培养基中培养备用即可。
为了检测甲基丙烯酰胺是否被成功接枝到丝素蛋白上，对实施例1中步骤(1)所得的未经乙烯基功能化处理的丝素蛋白和实施例2、实施例3、实施例4中步骤(2)所得改性丝素-乙烯基功能化丝素蛋白(分别命名为SF、SF-G2、SF-G3、SF-G4)进行核磁共振分析，得到的氢核磁共振图谱如图3所示，从图中可以看出，δ6.2ppm和δ5.6ppm对应甲基丙烯酸乙烯基中氢的特征吸收峰，δ1.8ppm代表甲基中氢的质子峰，表明甲基丙烯酸甘油酯被成功接枝后到丝素分子上。
为了考察乙烯基功能化改性对丝素蛋白结构完整性的影响，对未经处理的丝素蛋白和实施例2、实施例3、实施例4中步骤(2)所得改性丝素(分别命名为SF、SF-G2、SF-G3、SF-G4)进行圆二色谱分析，得到的圆二色谱图谱如图4所示，在195nm附近的负吸收峰代表丝素蛋白的特征峰，反映出新鲜溶解的丝素蛋白的二级结构主要为无规卷曲。改性前后吸收峰的位置没有出现明显偏移，且负吸收峰强度并未出现较大变化，表明丝素蛋白二级结构的完整性并未受到乙烯基功能化改性的影响。
为了验证乙烯基功能化改性丝素的微制造成型性，对实施例1中步骤(4)所得的使用不同光掩膜制备的具有罗丹明染色标记的各类图案化微凝胶阵列置于倒置荧光显微镜下观察，得到的荧光图像如图5所示，结合CAD设计的光掩膜可制备得到向阳花形、正方形、十字形、圆环形等多类型图案化微凝胶阵列，微凝胶形状规整，图案间隙间无残余凝胶。且所制备的微凝胶阵列具有较好的力学强度，易从载玻片上剥离。这些表明乙烯基功能化改性丝素成型性良好，具有良好的微制造应用前景。
为了验证本发明提供的图案化制备方法能够用于肝小叶的结构模拟，对实施例5中步骤(4)所得的含HUVECs细胞的微凝胶阵、含HepG2细胞的微凝胶阵列及类肝小叶微组织单元体外培养7天后，在FDA/PI溶液中浸泡2min进行细胞活死染色之后置于激光共聚焦显微镜下观察，得到明场图像和荧光图像如图6所示，通过在含HUVECs细胞的放射状六边形微凝胶片层上进行含HepG2细胞的花瓣状微凝胶的二次光刻，可制备放射状六边形与花瓣状结构互相嵌合的微结构组装体，凝胶表现出优秀的生物相容性。在六边形微凝胶中包裹HUVECs细胞模拟肝小叶的血管结构，花瓣状微凝胶中包裹HepG2细胞模拟肝板，组装形成的腔隙可模拟中央静脉及周边的血管网络。共聚焦照片显示两种细胞在微凝胶及其组装体中活性维持良好，两种细胞微图案之间嵌合紧密，组装体形状规整，结构稳定，通过多层组装，能够最终获得具有一定厚度的三维宏观六边形构建体，最终实现从微观到宏观的类肝小叶结构模拟。
这些表明通过本发明提供的制备方法获得的具有HUVECs和HepG2细胞可控空间分布的类肝小叶，可以从结构上模拟肝脏组织的微结构，有望更有效的促进肝细胞与内皮细胞的相互作用和肝组织功能建立；可用于肝脏类药物的药物筛选、疾病机理研究以及药物在肝脏中的代谢过程研究等，也可以用于肝移植研究。
本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种图案化类肝小叶微组织制造方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)配置再生丝素蛋白水溶液
先脱去蚕丝中的丝胶得到丝素纤维，再将丝素纤维溶解于溶解剂中，所得溶液经过滤去除杂质即得到再生丝素蛋白水溶液；
(2)合成乙烯基功能化丝素蛋白
将再生丝素蛋白水溶液稀释后，在搅拌条件下，于50～70℃滴入乙烯基化合物和催化剂的混合液中，滴加完毕后在该温度下继续避光搅拌反应2～4h；所得反应液经去除杂质、冷冻干燥即得到乙烯基功能化丝素蛋白，并置于低温保存；所述乙烯基化合物与催化剂的体积比为(2～4)：(1～3)；
(3)配置乙烯基功能化丝素蛋白预聚液
将乙烯基功能化丝素蛋白溶解于光引发剂溶液中，配置成乙烯基功能化丝素蛋白终浓度为100～400mg/mL、光引发剂终浓度为5～20mg/mL的乙烯基功能化丝素蛋白预聚液；
(4)制备类肝小叶微组织单元
(i)按照细胞浓度106～107个细胞/mL，将人血管内皮细胞HUVECs和肝癌细胞HepG2分别与步骤(3)配置的乙烯基功能化丝素蛋白预聚液混合均匀得到含HUVECs细胞的预聚液和含HepG2细胞的预聚液；
(ii)采用光掩膜技术得到肝细胞/血管内皮细胞放射状排列的三维宏观类肝小叶微组织单元，所述三维宏观类肝小叶微组织单元由若干微凝胶片层顺序叠加组装得到；所述光掩膜技术为将具有图案的光掩膜板置于待处理的预聚液液滴之上，利用紫外光曝光10～40s，在光掩膜的透光区域形成图案化微凝胶；之后用PBS缓冲液清洗曝光后的产物，以除去未形成凝胶的预聚液，即得到具有图案结构的微凝胶阵列；
所述微凝胶片层由具有第一图案的含HUVECs细胞的微凝胶阵列和具有第二图案的含HepG2细胞的微凝胶阵列交错嵌合得到；所述微凝胶片层制备步骤为：采用光掩膜技术得到具有第一图案的含HUVECs细胞的微凝胶阵列；再将含HUVECs细胞的微凝胶阵列置于滴有含HepG2细胞的预聚液的上方，进一步采用光掩膜技术得到具有第二图案的含HepG2细胞的微凝胶阵列，且含HUVECs细胞的微凝胶阵列与含HepG2细胞的微凝胶阵列交错嵌合。
2.根据权利要求1所述的图案化类肝小叶微组织制造方法，其特征在于步骤(1)的具体实现包括以下分步骤：
(i)将蚕丝加入到85～100℃的脱胶剂中，并在该温度下搅拌至少30min，之后取出蚕丝并用去离子水清洗；重复上述操作，直至脱去蚕丝中的丝胶；所述蚕丝与脱胶剂的质量：体积比为1:(50～300)g/mL；
(ii)将蚕丝脱去丝胶后的产物干燥得到丝素纤维；
(iii)将干燥后的丝素纤维加入到溶解剂中，于25～80℃持续搅拌直至丝素纤维完全溶解，所得溶液经过滤，得到再生丝素蛋白水溶液。
3.根据权利要求2所述的图案化类肝小叶微组织制造方法，其特征在于步骤(i)中，脱胶剂为碳酸钠溶液或/和碳酸氢钠溶液；所述脱胶剂中溶质的质量浓度为0.05％～1％。
4.根据权利要求2所述的图案化类肝小叶微组织制造方法，其特征在于步骤(iii)中，丝素纤维与溶解剂的质量/体积比为1：(4～20)g/mL；溶解剂为溴化锂溶液、硝酸钙溶液、Ajisawa’s试剂或硫氰酸锂溶液。
5.根据权利要求1或2所述的图案化类肝小叶微组织制造方法，其特征在于步骤(2)中，乙烯基化合物与催化剂的混合液的使用量按照每5g丝素纤维使用3～7mL混合液计量。
6.根据权利要求1所述的图案化类肝小叶微组织制造方法，其特征在于步骤(3)中，光引发剂溶液为由光引发剂溶解于50～70℃的PBS缓冲液中得到的质量浓度为5～20mg/mL的光引发剂溶液；所述光引发剂为I2959光引发剂或LAP光引发剂。
7.根据权利要求1所述的图案化类肝小叶微组织制造方法，其特征在于第一图案为放射状分布的六边形结构、环形结构或长条形结构；第二图案为与第一图案相契合的放射状分布的花瓣结构、环形结构或长条形结构。
8.权利要求1至7任一权利要求所述方法制造的图案化类肝小叶微组织。
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