CN105963050B - 组织工程血管化肝小叶的制造方法 - Google Patents
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Abstract
一种组织工程血管化肝小叶的制造方法,包括以下步骤:用3D打印机打印肝小叶的相容性支持性边框,在所述边框插入七根毛细玻璃管构成肝小叶的成型模具;按细胞浓度10^6cells/mL将HepG2细胞与温敏性水凝胶溶液混匀,填加到所述模具中,用紫外光照射30s‑200s,固化交联胶原后抽出毛细玻璃管,形成毛细管道;配置浓度为1*10^7cells/mL的人脐静脉内皮细胞,注入到所述毛细管道中并培养,使其长满毛细管道内壁,从而制得血管化的肝小叶。本方法制得的肝小叶生物相容性好,可用于肝脏类药物的药物筛选、疾病机理研究以及药物在肝脏中代谢过程的研究。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域,特别涉及一种组织工程血管化肝小叶的制造方法。
背景技术
3D打印技术又称增材制造,其加工过程简单,无需原胚和模型,可以直接利用计算机建模,将想要的结构直接打印出来,相比于传统的加工方式,3D打印具有快速、精准、易于加工的特点。目前生物模具加工一般采用注塑成型、机床车铣刨磨等技术手段,加工的精度差,且费时费力。对于有特殊结构要求的结构无法进行加工。
肝功能衰竭是一种常见的人类杀手,常见的治疗方法是人工肝,人工肝是指通过体外的机械、理化或生物装置,清除各种有害物质,补充必需物质,改善内环境,暂时替代衰竭肝脏部分功能的一套完整的个体化治疗方法,能为肝细胞再生、肝功能恢复创造条件或等待机会进行肝移植。在需要进行肝移植的病例中,通常没有足够的肝源可以供患者移植,因此,如果可以通过组织工程的方法制造活的组织工程肝脏,将为解决肝功能衰竭提供新的思路。人的肝脏组织大约有50万个肝脏小叶的基本单元组成,每个肝小叶均成六棱柱结构,结构比较均一,因此,如果可以制造出单个肝小叶,将为制造整个肝脏提供新的研究思路。
发明内容
本发明的目的是提供一种组织工程血管化肝小叶的制造方法。
一种组织工程血管化肝小叶的制造方法,所述肝小叶包括六棱柱形的主体和从该主体的端面贯穿该主体的六个小孔和一个大孔,所述大孔位于所述端面的中心,六个小孔环形分布在大孔周围,所述制造方法包括以下步骤:
用3D打印机打印肝小叶的相容性支持性边框,在所述边框插入七根毛细玻璃管构成肝小叶的成型模具;
按细胞浓度10^6cells/mL将HepG2细胞与温敏性水凝胶溶液混匀,填加到所述模具中,用紫外光照射30s-200s,固化交联胶原后抽出毛细玻璃管,形成毛细管道;
配置浓度为1*10^7cells/mL的人脐静脉内皮细胞,注入到所述毛细管道中并培养,使其长满毛细管道内壁,从而制得血管化的肝小叶。
在上述的组织工程血管化肝小叶的制造方法中,优选地,所述六棱柱形的主体厚2毫米、宽3毫米,小孔的内径为250微米,大孔的内径为500微米。
在上述的组织工程血管化肝小叶的制造方法中,优选地,所述温敏性水凝胶为GelMA、胶原、明胶、聚N-异丙基丙基酰胺、泊洛沙姆407、普罗尼克F123/F127中的一种。
在上述的组织工程血管化肝小叶的制造方法中,优选地,所述温敏性水凝胶溶液按以下方法制得:按浓度1-50wt/v%将温敏性水凝胶溶解到PBS中,按浓度0.01-1wt/v%加入紫外引发剂Irgacure 2959,充分混匀之后用离心机离心除去气泡,然后采用0.22微米的滤膜过滤除去细菌。
在上述的组织工程血管化肝小叶的制造方法中,优选地,用硅胶、聚二甲基硅氧烷或PLA作为打印材料。
在上述的组织工程血管化肝小叶的制造方法中,优选地,细胞的培养在37摄氏度5%二氧化碳培养箱中进行培养,培养过程包括:先静置培养两个小时,再翻转后培养两个小时,然后将未贴壁的细胞用PBS清洗除去,在管道内注入新鲜培养基培养三天。
本发明采用3D打印技术和组织工程技术结合的方法,用HepG2细胞作为肝脏的实质细胞来表达肝功能,用HUVEC细胞来构造肝脏内部的毛细血管网络避免肝小叶形成坏死中心,制造出血管化的肝小叶。制得的肝小叶生物相容性好,可用于肝脏类药物的药物筛选、疾病机理研究以及药物在肝脏中代谢过程的研究。所制的肝小叶尺寸与真正肝小叶相似。
附图说明
图1为构造的肝小叶成型模具的结构示意图;
图2为制得的血管化肝小叶结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明。
本实施例组织工程血管化肝小叶的制造方法包括以下步骤:
步骤1,打印肝小叶的支持性PDMS边框和制造肝小叶的模具。具体过程如下:
采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)打印支持性的边框。将PDMS按照基底和交联剂质量比10比1混合均匀,加入到3D打印机的针筒中,按照设定的路径打印出PDMS边框。在PDMS边框中插入七根毛细玻璃管,即构成肝小叶的成型模具,如图1所示。将其用高温高压灭菌处理后待用。
步骤2,按细胞浓度10^6cells/mL将HepG2细胞与温敏性水凝胶溶液混匀,填加到所述模具中,用紫外光照射30s-200s,固化交联胶原后抽出毛细玻璃管,形成毛细管道。具体过程如下:
2-1,采用以下方法配置GelMA(一种温敏性水凝胶):
a)猪皮A型明胶,在60摄氏度溶解到PBS当中,形成10w/v%的溶液;
b)注滴加入甲基丙烯酸酐8v/v%,50摄氏度反应四个小时;
c)为了使反应停止,加入PBS使温度降低到40摄氏度;
d)用截留分子量是12Kda-14Kda的透析袋透析,每天换水三次,透析两周;
e)用冻干机冻干透析完毕的溶液,得到海绵状的GelMA。
2-2,购买sciencell四代的HepG2细胞进行培养瓶培养,采用10%FBS+90%DMEM高糖培养基+1%双抗培养。每周换液两次到三次,待细胞长满平平底即可传代;用磷酸缓冲液清洗细胞,用胰酶消化细胞,消化完毕的细胞重悬于细胞培养基中,用离心机收集细胞。
2-3,将HepG2细胞和温敏性水凝胶GelMA混合。具体如下:
将海绵状的GelMA溶解到PBS中,浓度为15wt/v%,加入0.3wt/v%的巴斯夫紫外引发剂Irgacure 2959,充分混匀之后用离心机离心除去气泡。采用0.22微米的滤膜过滤,除去细菌,得到GelMA溶液;
将离心机收集的HepG2细胞用GelMA溶液混匀,使浓度为10^6cells/mL,从而制得包裹有HepG2细胞的GelMA溶液。
2-4,将包裹有HepG2细胞的GelMA溶液加入到插有毛细玻璃管的肝小叶支持性边框PDMS的间隙当中,采用波长365nm的紫外光照射60s,交联。
2-5,抽出毛细玻璃管,留下中空的管道(即毛细管道)。
步骤3,配置浓度为1*10^7cells/mL的人脐静脉内皮细胞,注入到所述毛细管道中并培养,使其长满毛细管道内壁,从而制得血管化的肝脏小叶。具体过程如下:
3-1,配置浓度为1*10^7cells/mL的人脐静脉内皮细胞。
购买sciencell四代的HUVEC细胞进行培养瓶培养,采用10%FBS+90%DMEM高糖培养基+1%双抗培养。每周换液两次到三次,待细胞长满平平底即可传代。用磷酸缓冲液清洗细胞,用胰酶消化细胞,消化完毕的细胞重悬于细胞培养基中,用离心机收集HUVEC细胞,调整细胞浓度为1*10^7cells/mL。
3-2,将浓度为1*10^7cells/mL的人脐静脉内皮细胞注入到抽出毛细玻璃管留下的中空管道中,静置培养两个小时使细胞贴壁,再反转肝小叶结构,静置培养两个小时使细胞在另一面贴壁。然后将未贴壁的细胞用PBS清洗除去,在孔道内注入新鲜培养基,进行三天的培养。待细胞传代长满内壁,中空管道即形成毛细血管,从而制得血管化肝小叶。
如图2所示,最终制得的血管化肝小叶包括六棱柱形的主体和从该主体的端面贯穿该主体的六个小孔和一个大孔,所述大孔位于所述端面的中心,六个小孔环形分布在大孔周围。六棱柱形的主体厚2毫米、宽3毫米,小孔的内径为250微米,大孔的内径为500微米。所制的肝小叶尺寸与真正肝小叶相似。
Claims (6)
1.一种组织工程血管化肝小叶的制造方法,其特征在于,所述肝小叶包括六棱柱形的主体和从该主体的端面贯穿该主体的六个小孔和一个大孔,所述大孔位于所述端面的中心,六个小孔环形分布在大孔周围,所述制造方法包括以下步骤:
用3D打印机打印肝小叶的相容性支持性边框,在所述边框插入七根毛细玻璃管构成肝小叶的成型模具;
按细胞浓度10^6cells/mL将HepG2细胞与温敏性水凝胶溶液混匀,填加到所述模具中,用紫外光照射30s-200s,固化交联胶原后抽出毛细玻璃管,形成毛细管道;
配置浓度为1*10^7cells/mL的人脐静脉内皮细胞,注入到所述毛细管道中并培养,使其长满毛细管道内壁,从而制得血管化的肝小叶。
2.根据权利要求1所述的组织工程血管化肝小叶的制造方法,其特征在于,所述六棱柱形的主体厚2毫米、宽3毫米,小孔的内径为250微米,大孔的内径为500微米。
3.根据权利要求1所述的组织工程血管化肝小叶的制造方法,其特征在于,所述温敏性水凝胶为胶原、明胶、聚N-异丙基丙基酰胺、泊洛沙姆407、普罗尼克F123/F127中的一种。
4.根据权利要求1所述的组织工程血管化肝小叶的制造方法,其特征在于,所述温敏性水凝胶溶液按以下方法制得:按浓度1-50wt/v%将温敏性水凝胶溶解到PBS中,按浓度0.01-1wt/v%加入紫外引发剂Irgacure 2959,充分混匀之后用离心机离心除去气泡,然后采用0.22微米的滤膜过滤除去细菌。
5.根据权利要求1所述的组织工程血管化肝小叶的制造方法,其特征在于,用硅胶、聚二甲基硅氧烷或PLA作为打印材料。
6.根据权利要求1所述的组织工程血管化肝小叶的制造方法,其特征在于,细胞的培养在37摄氏度5%二氧化碳培养箱中进行培养,培养过程包括:先静置培养两个小时,再翻转后培养两个小时,然后将未贴壁的细胞用PBS清洗除去,在管道内注入新鲜培养基培养三天。
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