CN110551679B - 一种含腺泡三脉管结构肝单元芯片的精准打印构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含腺泡三脉管结构肝单元芯片的精准打印的构建方法，属于微流体技术、组织工程和生物三维(3D)打印领域。此方法利用生物三维打印机将含有细胞的水凝胶在微流体芯片中构建肝组织模型，并通过微流体芯片的结构设计对肝细胞水凝胶模型进行灌注培养，来模拟人体内肝脏微环境。芯片具有多层并含有三类不同的微通道结构来重现肝小叶中肝动脉‑门静脉‑中央静脉的三脉管系统。本发明为药物开发以及肝脏药物毒性测试提供更加准确的分析测试平台。

Description

一种含腺泡三脉管结构肝单元芯片的精准打印构建方法
技术领域
本发明涉及一种含腺泡三脉管结构肝单元芯片的精准打印构建方法，用于模拟肝小叶中肝动脉-门静脉-中央静脉的三脉管系统并用以药物开发以及肝脏药物毒性测试，属于微流体技术、组织工程和生物三维(3D)打印领域。
背景技术
肝脏作为行使体内代谢功能最重要的器官，承担着代谢解毒、免疫凝血、蛋白质合成等500多种重要的生理功能。因此，在体外构建可模拟肝脏功能的组织模型对于药物开发以及药物安全测试，肝脏疾病研究等具有重要意义。
肝腺泡被认为是肝脏的最小结构单位，也是最小的功能单位，是应用肝血管灌注法，根据肝细胞与肝内微循环血流的关系而建立的。肝腺泡体积较小，是由相邻两个肝小叶各1/6部分组成，其体积约为肝小叶的1/3，以门管区血管发出的终末门尾静脉和终末肝微动脉及胆管分支为中轴，两端以邻近的中央静脉为界。每个肝腺泡接受一个终末血管(门静脉系和肝动脉系)的血供。肝腺泡有三个代谢区。Ⅰ带是指最接近门脉终末支中轴肝细胞，此区血液成分近动脉性，氧分压高，细胞代谢比较活跃，抗病能力强，再生出现早。Ⅰ带的外侧为Ⅱ带，肝细胞营养条件次于Ⅰ带；近中央静脉的腺泡两端部分为Ⅲ带，肝细胞营养条件较差，细胞再生能力也较弱，易受药物和有毒物质的损害。不良、酒精中毒、药物中毒或病毒性肝炎时，常首先起Ⅲ带肝细胞变性坏死。肝腺泡概念与肝的病理变化有关，故有一定实际意义。因为通过体外仿肝腺泡三脉管结构的肝单元芯片的研究，对了解人体内肝的病理变化具有重要的意义。
传统二维细胞培养模型缺乏细胞外基质与复杂的三维结构，动物模型成本高昂且具有伦理学问题。当前，肝芯片技术迅速发展，它是一种微流体肝细胞培养装置，其基本原理是将一种或多种肝细胞植入芯片中，通过微流控技术提供模拟人体生理的理化微环境。通过使用微流体芯片来进行肝组织的培养，可降低流体对细胞的剪切应力，传输氧和营养，运输代谢废物，控制细胞之间的相互作用。然而，现存的肝芯片技术仍存在诸多不足之处，因此迫切需要新的研究手段来研究肝单元的体外微环境的构建。微流体技术能够提供模拟人体生理的理化微环境，可通过构建微流道来实现腺泡三脉管结构，从而模拟出肝腺泡的浓度梯度扩散；3D生物打印技术能够快速地构建三维含细胞的水凝胶体系，其精确定位可以实现肝的实质细胞与非实质细胞之间的复杂空间排列。使得构建体外含腺泡三脉管肝单元芯片精确模型成为可能。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供了一种含腺泡三脉管结构肝单元芯片的精准打印构建方法。
本发明的技术方案如下：
含腺泡三脉管结构肝单元芯片的精准打印构建方法，包括如下步骤：
1)配制含有肝相关细胞或肝相关细胞系的生物墨水；所述生物墨水的成分还包括GelMa、胶原和明胶，所述生物墨水的溶剂为PBS溶液；
通过刻蚀方法使用PDMS材料构建微流体芯片；
2)将所述生物墨水加载到多喷头的微挤出式生物三维打印机的供料系统中，按照指定路径将肝小叶单元支架结构打印入微流体芯片的细胞培养区域中；得到包含肝单元支架结构的肝芯片；
3)将包含肝单元支架结构的肝芯片进行体外灌注式培养，获得含腺泡三脉管结构肝单元芯片。
作为本发明的优选，所述的肝相关细胞包括原代肝细胞、肝的非实质细胞中的中一种或多种；所述的肝相关细胞包括HepaRG细胞。肝的非实质细胞包括Kuffer细胞、星形细胞、内皮细胞等。
作为本发明的优选，所述的GelMa在所述生物墨水中的含量为0.03～0.06g/ml，胶原在所述生物墨水中的含量为1～3mg/ml，明胶在所述生物墨水中的含量为0.005～0.05g/ml。
作为本发明的优选，所述微流体芯片至上到下依次包括进液层、细胞培养层、样品检测层；所述的进液层上开设有培养液进液通道、第一检测出液区域、第一静脉出口、第一定位十字；细胞培养层内开设六边形细胞培养区域、第二检测出液区域、第二静脉出口、第二定位十字，细胞培养区域周围设有长方体柱列，长方体柱列将细胞培养区域与外部流道隔开；样品检测层开设有样品检测通道、第三检测出液区域、中央静脉导出口、第三中央静脉出口、第三定位十字；
所述的第一静脉出口、第二静脉出口和第三中央静脉出口上下位置一一对应，所述第一定位十字、第二定位十字、第三定位十字上下位置一一对应，所述第一检测出液区域、第二检测出液区域、第三检测出液区域上下位置一一对应；
所述的培养液进液通道开设至长方体柱列的外围，所述的中央静脉导出口位于六边形细胞培养区域的正中心下方；中央静脉导出口通过流道与第三中央静脉出口连通；所述的样品检测通道包括若干组，每组样品检测通道包括三条检测通道，三条检测通道的起点分别位于细胞培养区域径向的三等分点处；三条检测通道的终点即为第三检测出液区域；所述细胞培养层和样品检测层之间设有超滤膜。
作为本发明的优选，其中细胞培养层的长方体柱列中的长方体间的距离从两端到中间逐渐增大构成微流道，最大间隙不超过15微米，最小间隙为2微米。
作为本发明的优选，所述体外灌注式培养的方法为：使用蠕动泵输送培养基进行灌注培养，培养基由进液层的培养液进液通道进入微流体芯片，由样品检测层的中央静脉出口离开微流体芯片，灌注速度为0.5～5μl/h，微流体芯片在37℃，二氧化碳浓度为5％的环境中进行培养，灌注培养14天后终止培养。
作为本发明的优选，所述肝小叶单元支架结构为单层或多层的网格结构。
本发明还进一步公开了所述方法构建的含腺泡三脉管结构肝单元芯片在药物开发或者药物毒性检测中的应用。
所述的药物可以为乙酰氨基酚、布洛芬、吲哚美辛等。
本发明通过调配GelMa、胶原、明胶等材料的浓度，确保模型中细胞存活率达到90％以上且结构的机械性能保持稳定。
本发明可通过生物三维打印的方式构建具有精准结构的肝小叶生物支架模型。
本发明可确定一种快速构建微流体芯片结构的方法，制造出含腺泡三脉管结构肝单元的易于观察且不漏液的微流体肝芯片。
本发明设计出一种具有浓度梯度的微流控芯片，其通过由长方体柱列组成的微流道的形状特点，使得培养基在六边形六边的中央最容易流入；通过培养基在水凝胶中缓慢的扩散速度以及细胞吸收速率来模拟具有浓度梯度的体内微环境。
本发明有通过对含腺泡三脉管肝单元芯片进行灌注式培养，将为药物开发以及肝脏药物毒性测试提供更加准确的分析测试平台。
附图说明
图1是微流体芯片结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。
本发明基于生物三维打印技术，复合一种或多种物理、化学、生物方法，添加生长因子或小分子物质等，构建肝小叶单元，保证细胞的高存活率；运用微流体技术模拟肝的供血系统，构建含肝腺泡三脉管结构模型，用以药物开发和肝脏药物毒性测试。
含腺泡三脉管结构肝单元芯片的精准打印构建过程如下：
1)配制含有肝相关细胞或肝相关细胞系的生物墨水；所述生物墨水的成分还包括GelMa、胶原和明胶，所述生物墨水的溶剂为PBS溶液；所述的GelMa在所述生物墨水中的含量为0.03～0.06g/ml，胶原在所述生物墨水中的含量为1～3mg/ml，明胶在所述生物墨水中的含量为0.005～0.05g/ml。
通过刻蚀方法使用PDMS材料构建微流体芯片；
所述微流体芯片至上到下依次包括进液层A、细胞培养层B、样品检测层C；所述的进液层A上开设有培养液进液通道1、第一检测出液区域2a、第一静脉出口3a、第一定位十字4a；细胞培养层B内开设六边形细胞培养区域5、第二检测出液区域2b、第二静脉出口3b、第二定位十字4b，细胞培养区域5周围设有长方体柱列6，长方体柱列6将细胞培养区域5与外部流道隔开；样品检测层C开设有样品检测通道7、第三检测出液区域2c、中央静脉导出口8、第三中央静脉出口3c、第三定位十字4c；
所述的第一静脉出口3a、第二静脉出口3b和第三中央静脉出口3c上下位置一一对应，所述第一定位十字4a、第二定位十字4b、第三定位十字4c上下位置一一对应，所述第一检测出液区域2a、第二检测出液区域2b、第三检测出液区域2c上下位置一一对应；
所述的培养液进液通道1开设至长方体柱列6的外围，所述的中央静脉导出口8位于六边形细胞培养区域的正中心下方；中央静脉导出口8通过流道与第三中央静脉出口3c连通；所述的样品检测通道7包括若干组，每组样品检测通道7包括三条检测通道，三条检测通道的起点分别位于细胞培养区域5径向的三等分点处；三条检测通道的终点即为第三检测出液区域2c；所述细胞培养层B和样品检测层C之间设有超滤膜。超滤膜减少液体流动对细胞的剪切应力，对微流体芯片进行封装，防止泄露。
进液层A、细胞培养层B、样品检测层C上优选设置多组上下位置对应的定位十字，用于确保进液层A、细胞培养层B、样品检测层C之间能准确的对应安装。
培养液由培养液进液通道1进入微流体芯片，依据A层开设的流道流至长方体柱列6外围，长方体柱列6构成微通道，培养液经长方体柱列6间的间隙进入细胞培养区域5；并由位于C层的中央静脉导出口8导出，最终从位于A层的的第一静脉出口3a流出；
样品检测通道7分别检测细胞培养区域5内不同径向位置的区域的生物化学性质。
2将所述生物墨水加载到多喷头的微挤出式生物三维打印机的供料系统中，按照指定路径将肝小叶单元支架结构打印入微流体芯片的细胞培养区域中；得到包含肝单元支架结构的肝芯片；
3将包含肝单元支架结构的肝芯片进行体外灌注式培养，获得含腺泡三脉管结构肝单元芯片。
作为本发明的优选，所述的肝相关细胞包括原代肝细胞、肝的非实质细胞中的中一种或多种；所述的肝相关细胞包括HepaRG细胞。肝的非实质细胞包括Kuffer细胞、星形细胞、内皮细胞等。
作为本发明的优选，其中细胞培养层(B)中的六边形细胞培养区域边界由方形阵列构成，阵列间的距离从两端到中间逐渐减小，最大不超过15微米。
作为本发明的优选，所述体外灌注式培养的方法为：使用蠕动泵输送培养基进行灌注培养，培养基由进液层(A)的培养液进液通道进入微流体芯片，由样品检测层(C)的中央静脉出口离开微流体芯片，灌注速度为0.5～5μl/h，微流体芯片在37℃，二氧化碳浓度为5％的环境中进行培养，灌注培养14天后终止培养。
可采用包括但不限于PDMS、PC、PCL等多种材料来构建肝芯片主体。其中PDMS采用软刻蚀微加工的方法来构建，PCL采用打印的方式，PC采用微加工的方式来进行构建。
含腺泡三脉管结构肝单元芯片的灌注培养的终止条件为肝单元内部产生稳定的营养物质浓度梯度，2/3处检测通道中的葡萄糖浓度、白蛋白浓度以及尿素浓度最高，中央静脉区域中细胞色素P450-Cyp2E1浓度、α1AT浓度最高。
所述的含腺泡三脉管结构肝单元芯片在药物开发或肝脏药物毒性测试中的应用，运用肝毒性药物对肝芯片进行检测，观察其中心区域，药毒靶位的功能特征与体内微环境的相似性来验证肝芯片的功能，并用其进行药物开发来观察新药对肝芯片内肝单元的影响。

Claims (7)

1.一种含腺泡三脉管结构肝单元芯片的精准打印构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)配制含有肝相关细胞或肝相关细胞系的生物墨水；所述生物墨水的成分还包括GelMa、胶原和明胶，所述的GelMa在所述生物墨水中的含量为0.03～0.06g/ml，胶原在所述生物墨水中的含量为1～3mg/ml，明胶在所述生物墨水中的含量为0.005～0.05g/ml；所述生物墨水的溶剂为PBS溶液；
通过刻蚀方法使用PDMS材料构建微流体芯片；
所述微流体芯片至上到下依次包括进液层(A)、细胞培养层(B)、样品检测层(C)；所述的进液层(A)上开设有培养液进液通道(1)、第一检测出液区域(2a)、第一静脉出口(3a)、第一定位十字(4a)；细胞培养层(B)内开设六边形细胞培养区域(5)、第二检测出液区域(2b)、第二静脉出口(3b)、第二定位十字(4b)，细胞培养区域(5)周围设有长方体柱列(6)，长方体柱列(6)将细胞培养区域(5)与外部流道隔开；样品检测层(C)开设有样品检测通道(7)、第三检测出液区域(2c)、中央静脉导出口(8)、第三中央静脉出口(3c)、第三定位十字(4c)；
所述的第一静脉出口(3a)、第二静脉出口(3b)和第三中央静脉出口(3c)上下位置一一对应，所述第一定位十字(4a)、第二定位十字(4b)、第三定位十字(4c)上下位置一一对应，所述第一检测出液区域(2a)、第二检测出液区域(2b)、第三检测出液区域(2c)上下位置一一对应；
所述的培养液进液通道(1)开设至长方体柱列(6)的外围，所述的中央静脉导出口(8)位于六边形细胞培养区域的正中心下方；中央静脉导出口(8)通过流道与第三中央静脉出口(3c)连通；所述的样品检测通道(7)包括若干组，每组样品检测通道(7)包括三条检测通道，三条检测通道的起点分别位于细胞培养区域(5)径向的三等分点处；三条检测通道的终点即为第三检测出液区域(2c)；所述细胞培养层(B)和样品检测层(C)之间设有超滤膜；
2)将所述生物墨水加载到多喷头的微挤出式生物三维打印机的供料系统中，按照指定路径将肝小叶单元支架结构打印入微流体芯片的细胞培养区域中；得到包含肝单元支架结构的肝芯片；
3)将包含肝单元支架结构的肝芯片进行体外灌注式培养，获得含腺泡三脉管结构肝单元芯片。
2.如权利要求1所述的含腺泡三脉管结构肝单元芯片的精准打印构建方法，其特征在于，所述的肝相关细胞包括原代肝细胞、肝的非实质细胞中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的含腺泡三脉管结构肝单元芯片的精准打印构建方法，其特征在于，其中细胞培养层(B)的长方体柱列中的长方体间的距离从两端到中间逐渐增大构成微流道，最大间隙不超过15微米，最小间隙为2微米。
4.如权利要求1所述的含腺泡三脉管结构肝单元芯片的精准打印构建方法，其特征在于，所述体外灌注式培养的方法为：使用蠕动泵输送培养基进行灌注培养，培养基由进液层(A)的培养液进液通道进入微流体芯片，由样品检测层(C)的中央静脉出口离开微流体芯片，灌注速度为0.5～5μl/h，微流体芯片在37℃，二氧化碳浓度为5％的环境中进行培养，灌注培养14天后终止培养。
5.如权利要求1所述的含腺泡三脉管结构肝单元芯片的精准打印构建方法，其特征在于，所述肝小叶单元支架结构为单层或多层的网格结构。
6.权利要求1所述方法构建的含腺泡三脉管结构肝单元芯片在药物开发或者药物毒性检测中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的药物为乙酰氨基酚、布洛芬、吲哚美辛。
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