CN108277198A - 一种实现二维、三维交叉共培养的肝脏微流控芯片及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微流控技术领域，一种实现二维、三维交叉共培养的肝脏微流控芯片及其应用，其中微流控芯片包括上层盖板、上层基板、上层多孔膜、中间层基板、下层多孔膜、下层基板及下层盖板，所述上层基板上设置有上层基板培养腔室，下层基板上设置有下层基板培养腔室，所述上层多孔膜、中间层基板及下层多孔膜设置有中间层基板培养腔室，本发明在芯片上可实现多种细胞的二维、三维交叉共培养，进而模拟肝脏等器官的体外培养；芯片上培养室大小可变，可以获得不同数量的细胞样本，进而可进行灵活的分子生物学的测试，譬如RT‑PCR,Western‑blot，此外，该肝脏芯片可以用于药物的肝毒性的筛选和保肝药物的活性评价。

Description

一种实现二维、三维交叉共培养的肝脏微流控芯片及其应用

技术领域

本发明涉及一种实现二维、三维交叉共培养的肝脏微流控芯片及其应用，属于微流控技术领域。

背景技术

微流控芯片(Microfluidics)又称芯片实验室(Lab-on-a-chip)，是在微米量级空间操控流体的一种科学与技术，可把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。是21世纪最为重要的前沿技术之一，被认为是解决创新药物、化妆品和保健品研发成本过高、周期过长等关键问题，革新原有技术体系的关键技术，正面临着重大的发展机遇和挑战。

器官微流控芯片(Organ on a chip)是微流控芯片的一个亚类，已被业界公认为当今对哺乳动物细胞及其微环境进行精准操控的主流平台。它是在一块几平方厘米薄片内培养一种或多种功能细胞，从而模拟器官的一种仿生技术，器官芯片里的“器官”非常微小，但是具备真实器官的基本生理功能。微流控芯片在体外构建模拟器官具有以下优势：1.微流控芯片内单元构件的微纳米尺度使它能够同时容纳分子，细胞，组织，甚至器官；2.芯片特殊的流体精准操控体系使得它能同时测量物理量，化学量和生物量，兼有体积小、消耗低、高通量等特点；3.芯片内能够同时培养器官所包含的多种细胞，而且细胞的空间排列可以模仿器官的生理结构；4.它可以重建器官在体内的生理环境，比如流体剪切力、信号分子浓度梯度。可以说器官芯片从“组成”、“结构”和“环境”三方面对器官进行了模拟，仿真程度很高。

人体器官的微结构中细胞的生长方式和状态是各不相同的，例如，毛细血管壁细胞由单层的内皮细胞组成，细胞外包裹着薄层的基底膜，而肿瘤等细胞生长于三维条件下，细胞与细胞间相互紧密联系，形成一个三维整体，血液中的营养物质或养分透过二维生长的血管内皮到达三维生长的肿瘤组织。而传统细胞体外培养模型只能形成仅二维或仅三维的细胞生长形式，无法满足体外二维、三维交叉共培养的需求。

人体内的肝脏具有高度组织的解剖学结构。肝小叶是肝脏的最小结构和功能单位，整体呈现正六边形，由无数个从中央向外周发散的整齐排列的肝板组成，肝板与肝板之间含有微小的毛细血管，血液由处于多边形顶点的肝门静脉汇入中央静脉，这就是肝脏的微环境。微环境中肝实质细胞处于三维生长的状态，且被证实三维培养的肝实质细胞有利于肝细胞的极性和胆小管的形成，而内皮细胞等非实质细胞处于二维或近似二维生长的状态。此外，肝实质细胞的顶点相互融合形成胆小管，胆汁由胆小管排出，并周期性的排出至小肠，部分重吸收会血液。然而，现有的微流控肝脏芯片模型，缺乏这种高仿生的结构。例如，Alexander S.Mosig,et al利用微流控芯片构建了一个可灌流培养的3D肝脏模型(Amicrofluidically perfused three dimensional human livermodel.BIOMATERIALS2015)，其技术手段为利用一片多孔膜，上层接种血管内皮细胞(HUVECs)和外周血单核巨噬细胞((PBMCs)，下层接种肝实质细胞(HepRG)和肝星状细胞(LX-2)，上层灌流培养液以此模拟肝脏微环境——此结构的弊端在于忽视了肝实质细胞生长的三维环境，也无法模拟微环境中的窦间隙结构。Mian Long,et al等人提出了一种3D组装的肝血窦芯片(Mimicking liver sinusoidal structures and functions using a3d-configured microfluidic chip.LAB CHIP 2017)，其将分离的四种小鼠肝细胞分别接种于芯片的两个腔室，上层接种肝血窦内皮细胞(LSECs)和枯否细胞(KCs)，下层接种肝实质细胞(HCs)和肝星状细胞(HSCs)，该结构很大程度上的模拟了肝血窦的结构，但是，二维生长的肝实质细胞以及肝实质细胞与肝星状细胞间100uM的距离，大大削弱了两者之间的相互联系。同时，该结构缺乏胆汁的循环途径。

发明内容

为了克服现有技术中存在的不足，本发明目的是提供一种实现二维、三维交叉共培养的肝脏微流控芯片及其应用。本发明模拟肝血窦的微环境，由上层用于细胞二维培养的培养层、上层多孔膜、中间层用于细胞三维培养的培养层、下层多孔膜和下层用于细胞二维培养的培养层组成，上层模拟肝脏内毛细血管的血液流动，并为下层的细胞提供营养，运输废弃物。中间层模拟肝实质细胞的三维培养，下层模拟胆汁的排泄。

为了实现上述发明目的，解决己有技术中存在的问题，本发明采取的技术方案是：一种实现二维、三维交叉共培养的肝脏微流控芯片，包括上层盖板、上层基板、上层多孔膜、中间层基板、下层多孔膜、下层基板及下层盖板，所述上层基板采用半镂空结构，上面分别设置有上层基板培养腔室、上层基板进液口及上层基板出液口，并且上层基板进液口通过上层基板微通道与上层基板培养腔室连通，所述上层多孔膜的上表面与上层基板的半镂空结构区域紧贴，形成封闭腔室，用于肝血窦内皮细胞的二维培养，所述下层基板采用半镂空结构，上面分别设置有下层基板培养腔室及下层基板出液口，并且下层基板培养腔室通过下层基板微通道与下层基板出液口连通，所述下层多孔膜的下表面与下层基板的半镂空结构区域紧贴，形成封闭腔室，用于胆管上皮细胞的二维培养，所述中间层基板采用全镂空结构，上面设置有中间层基板出液口，所述上层多孔膜的下表面与中间层基板的全镂空结构区域上表面紧贴，下层多孔膜的上表面与中间层基板的全镂空结构区域下表面紧贴，以此形成封闭中间层基板培养腔室，用于肝实质细胞的三维培养，所述上层基板培养腔室、上层多孔膜、中间层基板培养腔室、下层多孔膜和下层基板培养腔室垂直方向上的中心一一对齐，所述上层基板出液口、中间层基板出液口和下层基板出液口垂直方向上的中心一一对齐，所述上层盖板通过四个螺钉从上到下依次将上层基板、上层多孔膜、中间层基板、下层多孔膜、下层基板及下层盖板压紧固定；所述上层基板、中间层基板、下层基板的材料选自石英、玻璃、PMMA、PDMS聚合物、聚碳酸酯、聚酯、琼脂糖、壳聚糖或海藻酸钠中的一种；所述上层多孔膜、下层多孔膜的材料选自PET、聚碳酸酯、PDMS或聚偏氟乙烯中的一种，所述上层盖板、上层基板、上层多孔膜、中间层基板、下层多孔膜、下层基板及下层盖板之间可拆卸围接。

所述一种实现二维、三维交叉共培养的肝脏微流控芯片，用于体外模拟肝脏器官，进而在检测药物的肝脏毒性方面中的应用。

本发明有益效果是：与己有技术相比，本发明在芯片上可实现多种细胞的二维、三维交叉共培养，进而模拟肝脏等器官的体外培养；芯片上培养室大小可变，可以获得不同数量的细胞样本，进而可进行灵活的分子生物学的测试，譬如RT-PCR,Western-blot等，此外，该肝脏芯片可以用于药物的肝毒性的筛选和保肝药物的活性评价等，同时可用于肝脏等器官疾病发生、发展等机制的研究。

附图说明

图1是本发明的结构示意图；

图中：1、上层盖板，2、上层基板，2a、上层基板培养腔室，2b、上层基板进液口，2c、上层基板微通道，2d、上层基板出液口，3、上层多孔膜，4、中间层基板培养腔室，5、中间层基板，5a、中间层基板出液口，6、下层多孔膜，7、下层基板，7a、下层基板培养腔室，7b、下层基板微通道，7c、下层基板出液口，8、下层盖板。

图2是多孔膜上肝血窦内皮细胞通透性表征图，从左至右是荧光素钠、5.5KD的菊粉、40kD的葡聚糖和70kD的葡聚糖的表观渗透率。

图3是使用该芯片检测利福平的肝毒性图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明。

如图1所示，一种实现二维、三维交叉共培养的肝脏微流控芯片，包括上层盖板1、上层基板2、上层多孔膜3、中间层基板5、下层多孔膜6、下层基板7及下层盖板8，所述上层基板2采用半镂空结构，上面分别设置有上层基板培养腔室2a、上层基板进液口2b及上层基板出液口2d，并且上层基板进液口2b通过上层基板微通道2c与上层基板培养腔室2a连通，所述上层多孔膜3的上表面与上层基板2的半镂空结构区域紧贴，形成封闭腔室，用于肝血窦内皮细胞的二维培养，所述下层基板7采用半镂空结构，上面分别设置有下层基板培养腔室7a及下层基板出液口7c，并且下层基板培养腔室7a通过下层基板微通道7b与下层基板出液口7c连通，所述下层多孔膜6的下表面与下层基板7的半镂空结构区域紧贴，形成封闭腔室，用于胆管上皮细胞的二维培养，所述中间层基板5采用全镂空结构，上面设置有中间层基板出液口5a，所述上层多孔膜3的下表面与中间层基板5的全镂空结构区域上表面紧贴，下层多孔膜6的上表面与中间层基板5的全镂空结构区域下表面紧贴，以此形成封闭的中间层基板培养腔室4，用于肝实质细胞的三维培养，所述上层基板培养腔室2a、上层多孔膜3、中间层基板培养腔室4、下层多孔膜6和下层基板培养腔室7a垂直方向上的中心一一对齐，所述上层基板出液口2d、中间层基板出液口5a和下层基板出液口7c垂直方向上的中心一一对齐，所述上层盖板1通过四个螺钉从上到下依次将上层基板2、上层多孔膜3、中间层基板5、下层多孔膜6、下层基板7及下层盖板8压紧固定；所述上层基板2、中间层基板5、下层基板7的材料选自石英、玻璃、PMMA、PDMS聚合物、聚碳酸酯、聚酯、琼脂糖、壳聚糖或海藻酸钠中的一种；所述上层多孔膜3、下层多孔膜6的材料选自PET、聚碳酸酯、PDMS或聚偏氟乙烯中的一种。所述上层盖板、上层基板、上层多孔膜、中间层基板、下层多孔膜、下层基板及下层盖板之间可拆卸围接。所述一种实现二维、三维交叉共培养的肝脏微流控芯片，用于体外模拟肝脏器官，进而在检测药物的肝脏毒性方面中的应用。

实施例

本实施例采用图1结构，上层盖板、下层盖板的材料选自亚格力，上层基板、中间层基板、下层基板材料选自PDMS聚合物；上层多孔膜、下层多孔膜的材料选自聚碳酸酯，上层基板培养腔室为圆柱体，直径为6mm，高为200um；中间层基板培养腔室为圆柱体，直径为6mm，高为500um；下层基板培养腔室为圆柱体，直径为6mm，高为200um。上层基板的流体经上层盖板流入基板内，而后分两个去向，一个经上层基板通道连接至芯片外，另一个经上层多孔膜、中间层基板、下层多孔膜，进入下层基板；流入下层基板的流体经由中间层基板、上层基板、上层盖板，最终连接至芯片外。在上层多孔膜上表面(上层基板培养腔室下面)培养肝血窦内皮细胞(LSECs)，与体内相似，血管内皮细胞长成一层致密的细胞膜，具有毛细血管的屏障作用和生理功能，模拟了肝脏中“毛细血管”，细胞与细胞之间形成紧密连接，不漏液。该模拟的“毛细血管”具备真实毛细血管的通透性特性，分子量越大，渗透速度越慢(荧光素钠>5.5KD菊粉>40kD的葡聚糖>70kD的葡聚糖)，如附图2所示。再向该微流控芯片的上层基板培养腔室中加入不同浓度的利福平(Rifampicin)，药物透过肝血窦内皮层，作用于肝实质细胞，检测肝实质细胞的活性，实验结果与动物体内实验结果是一致的，如图3所示。

本实施例具有以下优点：目前，用于药物临床前肝毒性检测的模型主要有两种，即动物实验和孔板模型。传统的肝毒性检测中细胞水平的孔板模型过于简单，只是将细胞静态的暴露于药物溶液中，难以模拟体内的真实微环境，而动物在药物代谢和药物转运等方面与人体都有出入，许多药物在临床前显示没有毒性，而临床或上市后才发现具有肝毒性。本实施例模拟了肝脏的微环境，运用于利福平肝脏毒性的检测，与临床结果一致。

Claims (2)

1.一种实现二维、三维交叉共培养的肝脏微流控芯片，包括上层盖板、上层基板、上层多孔膜、中间层基板、下层多孔膜、下层基板及下层盖板，其特征在于：所述上层基板采用半镂空结构，上面分别设置有上层基板培养腔室、上层基板进液口及上层基板出液口，并且上层基板进液口通过上层基板微通道与上层基板培养腔室连通，所述上层多孔膜的上表面与上层基板的半镂空结构区域紧贴，形成封闭腔室，用于肝血窦内皮细胞的二维培养，所述下层基板采用半镂空结构，上面分别设置有下层基板培养腔室及下层基板出液口，并且下层基板培养腔室通过下层基板微通道与下层基板出液口连通，所述下层多孔膜的下表面与下层基板的半镂空结构区域紧贴，形成封闭腔室，用于胆管上皮细胞的二维培养，所述中间层基板采用全镂空结构，上面设置有中间层基板出液口，所述上层多孔膜的下表面与中间层基板的全镂空结构区域上表面紧贴，下层多孔膜的上表面与中间层基板的全镂空结构区域下表面紧贴，以此形成封闭的中间层基板培养腔室，用于肝实质细胞的三维培养，所述上层基板培养腔室、上层多孔膜、中间层基板培养腔室、下层多孔膜和下层基板培养腔室垂直方向上的中心一一对齐，所述上层基板出液口、中间层基板出液口和下层基板出液口垂直方向上的中心一一对齐，所述上层盖板通过四个螺钉从上到下依次将上层基板、上层多孔膜、中间层基板、下层多孔膜、下层基板及下层盖板压紧固定；所述上层基板、中间层基板、下层基板的材料选自石英、玻璃、PMMA、PDMS聚合物、聚碳酸酯、聚酯、琼脂糖、壳聚糖或海藻酸钠中的一种；所述上层多孔膜、下层多孔膜的材料选自PET、聚碳酸酯、PDMS或聚偏氟乙烯中的一种，所述上层盖板、上层基板、上层多孔膜、中间层基板、下层多孔膜、下层基板及下层盖板之间可拆卸围接。

2.根据权利要求1所述一种实现二维、三维交叉共培养的肝脏微流控芯片，用于体外模拟肝脏器官，进而在检测药物的肝脏毒性方面中的应用。