CN109385394A - 一种提取、分离和培养同体异种肝原代细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞培养技术领域，一种提取、分离和培养同体异种肝原代细胞的方法，包括以下步骤：(1)灌流液经肝门静脉原位灌注，(2)消化液经肝门静脉原位灌注，(3)肝脏离体，撕碎包膜，过筛获得包含多种肝原代的细胞悬液，(4)获得的细胞悬液常规离心，获得实质细胞和收集的上清液，(5)上清液经密度梯度离心分离出星状细胞和剩余下层细胞悬液，(6)剩余下层细胞悬液分别与连接有肝血窦内皮细胞和枯否细胞特异性的免疫磁珠孵育，经磁场分选后分别获得肝血窦内皮细胞和枯否细胞。肝原代细胞分离后，立即重悬于对应的专门配制的培养基中培养。本发明细胞得率高，分离效果好，为体外构建多细胞肝脏模型提供了稳定的细胞来源。

Description

一种提取、分离和培养同体异种肝原代细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种提取、分离和培养同体异种肝原代细胞的方法，属于细胞培养技术领域。
背景技术
肝脏是脊椎动物特有的大型的内脏器官，在维持内环境的稳态中发挥重要的作用。肝脏参与多种生命活动，例如代谢有毒的异己物质、合成多种血浆蛋白，维持血糖的稳定，激素的生成和胆汁的分泌等。肝脏在调节体内的生化反应中也起着非常重要的作用，比如氨的代谢，免疫调节等。此外，肝脏也是药物代谢的主要场所，是药物毒性的靶器官之一，药物肝毒性是阻碍药物能否真正用于实际临床的最大障碍之一，脏脏的研究对于生命科学和人类健康具有重要意义。
解剖学上，肝脏由多种细胞组成，主要包含肝实质细胞(HCs)和非实质细胞(NPCs)，即肝星状细胞(HSCs)、肝血窦内皮细胞(LSECs)和枯否细胞(KCs)，各细胞发挥各自功能的同时相互协作共同完成肝脏的功能。其中，肝实质细胞个体最大，占肝脏总细胞数目的60％(总质量的80％)，负责肝脏的主要功能，包括外源性(药物)或内源性物质的代谢、胆汁酸的合成、糖元的存储、氨的解毒和合成多种蛋白等。肝星状细胞，又叫“储脂细胞”，占总细胞数目的5-8％，存在于肝脏窦周系内，主要负责储存维生素A，合成细胞外基质，同时分泌多种细胞外因子，如PDGF、TGF-β等，研究发现，星状细胞的激活是肝脏发生损伤的早期特征。肝血窦内皮细胞是一种细长的内皮细胞，具有伪足，占肝脏总细胞数目的20％左右，区别于其他内皮细胞的特征：肝血窦内皮细胞不具有或具有极小的基底膜，同时内皮层具有100-200nm的小孔，肝血窦内皮细胞的这种特征保证了实质细胞与血液之间的物质交换，同时对血液中的大分子具有清除作用。肝血窦内皮细胞在维持肝脏内的稳态中发挥重要的作用，例如，其分泌的NO能够维持血管的舒张同时抑制肝星状细胞的增殖。枯否细胞是一种定居于肝脏内的巨噬细胞，占总细胞数目的15％左右，通过纤长的伪足固定于肝血窦内皮细胞表面，其细胞核呈马蹄形，具有较大的囊泡结构，枯否细胞能够分泌多种炎症因子参与免疫应答反应。
原代细胞在基因表达和细胞行为上与生物体内情况基本保持一致，一直以来被认为是体外实验最好的研究对象，然而，原代细胞的提取过程复杂，细胞活性低，是制约原代细胞运用的关键瓶颈。1976年，Seglen等人经过对肝原代细胞的提取步骤进行优化(Preparation of isolated rat liver cells.Methods in Cell Biology，1976)，提出了两步法灌肝，该方法时至今日仍然是各大研究机构和实验室的常规方法。然而，使用该方法获得的肝实质细胞数量、细胞活力和纯度都非常有限，而且使用该方法只能获得一种肝细胞，即肝实质细胞。非实质细胞在肝脏功能的发挥中起着至关重要的作用。一系列研究表明，非实质细胞在肝脏合成血浆蛋白，维持血糖稳定，激素生成和免疫应答等多方面起到调控的作用，仅肝实质细胞越来越无法满足体外模型对高仿生微环境的要求，因此，迫切需要开发出同时提取、分离4种肝原代细胞的方法以满足细胞生物学、组织培养技术等研究的需求。密度梯度离心，免疫磁珠分选和流式细胞分选术是当今主要的分选细胞的方法，然而他们各自都存在自身的弊端。比如，由于肝血窦内皮细胞和星状细胞的细胞密度非常接近，使用常规的密度梯度离心法，很难获得高纯度的单种细胞。免疫磁珠分选的方法需要制备包含磁珠的各类细胞特有的免疫抗体，而且需要经过多步的孵育、洗涤等步骤，耗时巨大。而流式细胞分选术需要昂贵的大型设备，实验成本非常高。开发短时，高效、低成本的分离肝脏实质细胞和非实质细胞的方法仍然是研究的热点。
此外，肝细胞在分离以后，常规培养条件下细胞很快出现衰老和功能退化等现象，使得目前很难在体外对慢性肝病进行研究。如何实现肝原代细胞体外长期培养成为当前亟需解决的问题。
发明内容
为了克服现有技术中存在的不足，本发明目的是提供一种提取、分离和培养同体异种肝原代细胞的方法。该方法解决了针对目前肝原代细胞提取活性低、纯度低，多种非实质细胞难以分离和培养困难等问题。
为了实现上述发明目的，解决己有技术中存在的问题，本发明采取的技术方案是：一种提取、分离和培养同体异种肝原代细胞的方法，包括以下步骤：
步骤1、将啮齿动物麻醉后，开腹，使用留置针肝门静脉插管，灌流液经肝门静脉原位37℃恒温灌流5-30min，灌流速度为5-25mL/min，且灌流过程中不得产生任何气泡，所述灌流液选自额外添加终浓度为0.5-10mM EGTA和1-50mM HEPES的缓冲液，所述缓冲液选自不含Ca2+，Mg2+的HBSS或D-Hanks或PBS中的一种；
步骤2、替换灌流液，将消化液经肝门静脉原位37℃恒温灌流2-15min，灌流速度为5-20mL/min，所述消化液选自额外添加终浓度为50-300mg/L CaCl2、1-50mM HEPES、10-100mg/L胶原酶、0-100U/mL青霉素和0-100U/mL链霉素的基础培养基，所述胶原酶选自Ⅱ型或Ⅳ型胶原酶中的一种，所述基础培养基选自市售的DMEM-高糖，DMEM-低糖或1640中的一种；
步骤3、将步骤2中消化后的肝脏小心取出置于盛有分离液的器皿中，用镊子小心划破肝脏表面的包膜，钝性分离，轻轻涮动以释放出包含多种肝原代细胞的细胞悬液并过筛，所述分离液选自额外添加终浓度为0.05-5μM地塞米松和2％-10％FBS的基础培养基，所述基础培养基选自市售的DMEM-高糖、DMEM-低糖或1640中的一种，所述过筛选自孔径为20-200μm的组织筛或纱布中的一种；
步骤4、将步骤3制得的细胞悬液加入离心管中，500-800rmp/min离心1-5min后，获取上清液，沉淀用细胞分离液重悬，500-800rmp/min离心1-5min后，获得实质细胞，再将实质细胞立即重悬于专门配制的实质细胞培养基中培养，所述专门配制的实质细胞培养基选自额外添加终浓度为2％-10％FBS、0-100U/mL青霉素、0-100U/mL链霉素、1-10mM L-谷氨酰胺和10-100nM地塞米松的Williams E培养基；
步骤5、向50mL的离心管中加入10-20mL浓度为20％-50％的percoll溶液，再加入5-15mL浓度为10％-20％的percoll溶液，最后加入10-20ml步骤4中获取的上清液，之后1500-2000rmp/min离心10-20min，形成上、下两层界面，分别获取上层界面中和下层界面中的细胞；其中上层界面中所获取细胞为星状细胞，立即重悬于专门配制的星状细胞培养基中培养，下层界面中的细胞悬液经1000-3000rmp/min离心15-20min，用分离液重悬，平均分成两份备用，所述专门配制的星状细胞培养基选自额外添加终浓度为2％-10％FBS、0-100U/mL青霉素、0-100U/mL链霉素和1-10mM L-谷氨酰胺的DMEM培养基；
步骤6、将步骤5中所制备的两份备用细胞悬液100-1000rmp/min离心2-8min后，之后重悬于磁珠分选的缓冲液中，分别与连接有肝血窦内皮细胞和枯否细胞特异性的免疫磁珠孵育0.5-5h，缓慢添加至分选柱中，分选柱置于磁场中，待细胞悬液全部流干，移出磁场，再将吸附在分选柱上的细胞采用磁珠分选专用缓冲液冲洗下来，之后100-1000rmp/min离心1-10min，分别获得肝血窦内皮细胞和枯否细胞，并立即重悬于对应的专门配制的培养基中培养，专门配制的肝血窦内皮细胞培养基选自额外添加终浓度为2％-10％FBS，0-100U/mL青霉素、0-100U/mL链霉素、1-10mM L-谷氨酰胺、10-100nM地塞米松和1-50ng/mL VEGF的1640培养基，专门配制的枯否细胞培养基选自额外添加终浓度为2％-10％FBS、0-100U/mL青霉素、0-100U/mL链霉素和1-10mM L-谷氨酰胺的1640培养基，所述肝血窦内皮细胞特异性的免疫磁珠选自市售的Anti-CD146或Anti-CD31抗体偶联磁珠中的一种，所述枯否细胞特异性的免疫磁珠选自市售的Anti-CD14、Anti-GFAP或Anti-F4/80抗体偶联磁珠中的一种。
利用本发明方法提取、分离的4种肝原代细胞是放置在温度为37℃，CO2含量为5％，湿度为95％的细胞培养箱中培养。
本发明有益效果是：一种提取、分离和培养同体异种肝原代细胞的方法，包括以下步骤：(1)灌流液经肝门静脉原位灌注，(2)消化液经肝门静脉原位灌注，(3)肝脏离体，撕碎包膜，过筛获得包含多种肝原代的细胞悬液，(4)获得的细胞悬液常规离心，获得实质细胞和收集的上清液，(5)上清液经密度梯度离心分离出星状细胞和剩余下层细胞悬液，(6)剩余下层细胞悬液分别与连接有肝血窦内皮细胞和枯否细胞特异性的免疫磁珠孵育，分选后分别获得肝血窦内皮细胞和枯否细胞。4种肝原代细胞分离后，立即重悬于对应的专门配制的培养基中并培养。本发明提供了能够同时提取和分离4种肝原代细胞的方法，与离体的方式灌肝相比，原位灌注的方式细胞在灌注的过程中一直处于体内的环境中，因而大大降低了灌注过程对细胞的损害，提高了细胞的存活率。得益于星状细胞的密度区别于另两种非实质细胞较大，分离采用密度梯度离心的方式，该方法获得的星状细胞纯度高，而且耗时少，成本低。分离肝血窦内皮细胞和枯否细胞采用了免疫磁珠分选，相比于流式细胞术，该方法对设备和操作人员的要求较低，更适合常规实验室的分离，为体外构建多细胞肝脏模型提供了稳定的细胞来源，为后续的药物发现和评价，疾病机制研究提供了保障。
附图说明
图1为实施例1分离获得的培养5天后的大鼠肝实质细胞图。
图2为实施例1分离获得的培养5天后的大鼠肝星状细胞图。
图3为实施例1分离获得的培养5天后的大鼠肝血窦内皮细胞图。
图4为实施例1分离获得的培养5天后的大鼠肝枯否细胞图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，不仅限于大鼠、小鼠，也适用于其他的啮齿动物。
实施例1
将150g雄性SD大鼠麻醉后，开腹，使用型号为0.7×19mm 24G的留置针肝门静脉插管，再将浓度为10mM EGTA和20mM HEPES不含Ca2+，Mg2+的HBSS灌流液经肝门静脉原位37℃恒温灌流10min，灌流速度控制在10mL/min，且灌流过程中不得产生任何气泡；替换灌流液，将浓度为50mg/L CaCl2、50mM HEPES、100mg/LⅣ型胶原酶和100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM-高糖的消化液经肝门静脉原位37℃恒温灌流10min，灌流速度控制在10mL/min；将消化后的肝脏小心取出置于盛有浓度为5μM地塞米松和10％FBS的DMEM-高糖的器皿中，用镊子小心划破肝脏表面的包膜，钝性分离，轻轻涮动以释放出包含多种肝原代细胞的细胞悬液并用孔径为100μm的细胞筛过筛；再将制得的细胞悬液加入离心管中，500rmp/min离心3min，获取上清液，沉淀用细胞分离液重悬，500rmp/min离心3min，获得沉淀细胞，即为肝实质细胞，再将肝实质细胞立即重悬于浓度为2％FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素、10mM L-谷氨酰胺和100nM地塞米松的Williams E培养基中培养；向50mL的离心管中加入15mL浓度为30％的percoll溶液，再加入10mL浓度为20％的percoll溶液，最后加入15ml获取的上清液，1800rmp/min离心20min，形成上、下两层界面，分别获取上层界面中和下层界面中的细胞；其中上层界面中所获取细胞为星状细胞，即为肝星状细胞，立即重悬于浓度为2％FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10mM L-谷氨酰胺的DMEM培养基中培养；下层界面中的细胞悬液经2000rmp/min离心20min，用分离液重悬，平均分成两份备用；再将所制备的两份备用细胞悬液500rmp/min离心5min后，重悬于磁珠分选的缓冲液中，分别与连接有肝血窦内皮细胞和枯否细胞特异性的免疫磁珠孵育5h，肝血窦内皮细胞特异性的免疫磁珠采用Anti-CD146，枯否细胞特异性的免疫磁珠采用Anti-CD14，然后再缓慢添加至分选柱中，分选柱置于磁场中，待细胞悬液全部流干，移出磁场，再将吸附在分选柱上的细胞采用磁珠分选专用缓冲液冲洗下来，之后800rmp/min离心5min，分别获得肝血窦内皮细胞和枯否细胞，并立即将肝血窦内皮细胞重悬于浓度为5％FBS，100U/mL青霉素、100U/mL链霉素、10mM L-谷氨酰胺、100nM地塞米松和1ng/mL VEGF的1640培养基中培养，将枯否细胞重悬于浓度为5％FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10mM L-谷氨酰胺的1640培养基中培养。
实施例2
将100g雄性Wistar大鼠麻醉后，开腹，使用型号为0.7×19mm 24G的留置针肝门静脉插管，再将浓度为2mM EGTA和10mM HEPES的D-Hanks灌流液经肝门静脉原位37℃恒温灌流15min，灌流速度控制在15mL/min，且灌流过程中不得产生任何气泡；替换灌流液，将浓度为50mg/L CaCl2、50mM HEPES、100mg/LⅡ型胶原酶和100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM-高糖的消化液经肝门静脉原位37℃恒温灌流10min，灌流速度控制在10mL/min；将消化后的肝脏小心取出置于盛有浓度为5μM地塞米松和10％FBS的DMEM-高糖的器皿中，用镊子小心划破肝脏表面的包膜，钝性分离，轻轻涮动以释放出包含多种肝原代细胞的细胞悬液并用孔径为100μm的细胞筛过筛；再将制得的细胞悬液加入离心管中，500rmp/min离心3min，获取上清液，沉淀用细胞分离液重悬，500rmp/min离心3min，获得沉淀细胞，即为肝实质细胞，再将肝实质细胞立即重悬于浓度为5％FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素、5mML-谷氨酰胺和20nM地塞米松的Williams E培养基中培养；向50mL的离心管中加入15mL浓度为30％的percoll溶液，再加入10mL浓度为20％的percoll溶液，最后加入15ml获取的上清液，1800rmp/min离心20min，形成上、下两层界面，分别获取上层界面中和下层界面中的细胞；其中上层界面中所获取细胞为星状细胞，即为肝星状细胞，立即重悬于浓度为10％FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和15mM L-谷氨酰胺的DMEM培养基中培养；下层界面中的细胞悬液经2000rmp/min离心20min，用分离液重悬，平均分成两份备用；再将所制备的两份备用细胞悬液500rmp/min离心5min后，重悬于磁珠分选的缓冲液中，分别与连接有肝血窦内皮细胞和枯否细胞特异性的免疫磁珠孵育5h，肝血窦内皮细胞特异性的免疫磁珠采用Anti-CD146，枯否细胞特异性的免疫磁珠采用Anti-CD14，然后再缓慢添加至分选柱中，分选柱置于磁场中，待细胞悬液全部流干，移出磁场，再将吸附在分选柱上的细胞采用磁珠分选专用缓冲液冲洗下来，之后800rmp/min离心5min，分别获得肝血窦内皮细胞和枯否细胞，并立即将肝血窦内皮细胞重悬于浓度为10％FBS，100U/mL青霉素、100U/mL链霉素、20mM L-谷氨酰胺、50nM地塞米松和50ng/mL VEGF的1640培养基中培养，将枯否细胞重悬于浓度为10％FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和20mM L-谷氨酰胺的1640培养基中培养。
实施例3
将20g雄性C3H/He小鼠麻醉后，开腹，使用型号为0.7×19mm 24G的留置针肝门静脉插管，再将浓度为5mM EGTA和20mM HEPES的D-Hanks灌流液经肝门静脉原位37℃恒温灌流10min，灌流速度控制在5mL/min，且灌流过程中不得产生任何气泡；替换灌流液，将浓度为50mg/L CaCl2、50mM HEPES、100mg/LⅡ型胶原酶和100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM-高糖的消化液经肝门静脉原位37℃恒温灌流10min，灌流速度控制在10mL/min；将消化后的肝脏小心取出置于盛有浓度为5μM地塞米松和10％FBS的DMEM-高糖的器皿中，用镊子小心划破肝脏表面的包膜，钝性分离，轻轻涮动以释放出包含多种肝原代细胞的细胞悬液并用孔径为100μm的细胞筛过筛；再将制得的细胞悬液加入离心管中，500rmp/min离心3min，获取上清液，沉淀用细胞分离液重悬，500rmp/min离心3min，获得沉淀细胞，即为肝实质细胞，再将肝实质细胞立即重悬于浓度为3％FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素、3mML-谷氨酰胺和20nM地塞米松的Williams E培养基中培养；向50mL的离心管中加入15mL浓度为30％的percoll溶液，再加入10mL浓度为20％的percoll溶液，最后加入15ml获取的上清液，1800rmp/min离心20min，形成上、下两层界面，分别获取上层界面中和下层界面中的细胞；其中上层界面中所获取细胞为星状细胞，即为肝星状细胞，立即重悬于浓度为10％FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和15mM L-谷氨酰胺的DMEM培养基中培养；下层界面中的细胞悬液经2000rmp/min离心20min，用分离液重悬，平均分成两份备用；再将所制备的两份备用细胞悬液500rmp/min离心5min后，重悬于磁珠分选的缓冲液中，分别与连接有肝血窦内皮细胞和枯否细胞特异性的免疫磁珠孵育5h，肝血窦内皮细胞特异性的免疫磁珠采用Anti-CD146，枯否细胞特异性的免疫磁珠采用Anti-CD14，然后再缓慢添加至分选柱中，分选柱置于磁场中，待细胞悬液全部流干，移出磁场，再将吸附在分选柱上的细胞采用磁珠分选专用缓冲液冲洗下来，之后800rmp/min离心5min，分别获得肝血窦内皮细胞和枯否细胞，并立即将肝血窦内皮细胞重悬于浓度为10％FBS，100U/mL青霉素、100U/mL链霉素、20mM L-谷氨酰胺、50nM地塞米松和50ng/mL VEGF的1640培养基中培养，将枯否细胞重悬于浓度为10％FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和20mM L-谷氨酰胺的1640培养基中培养。
实施例4
将200g雄性SD大鼠麻醉后，开腹，使用型号为0.7×19mm 24G的留置针肝门静脉插管，再将浓度为10mM EGTA和20mM HEPES不含Ca2+，Mg2+的HBSS灌流液经肝门静脉原位37℃恒温灌流15min，灌流速度控制在15mL/min，且灌流过程中不得产生任何气泡；替换灌流液，将浓度为50mg/L CaCl2、50mM HEPES、100mg/LⅡ型胶原酶和100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM-高糖的消化液经肝门静脉原位37℃恒温灌流10min，灌流速度控制在10mL/min；将消化后的肝脏小心取出置于盛有浓度为5μM地塞米松和10％FBS的DMEM-高糖的器皿中，用镊子小心划破肝脏表面的包膜，钝性分离，轻轻涮动以释放出包含多种肝原代细胞的细胞悬液并用孔径为100μm的细胞筛过筛；再将制得的细胞悬液加入离心管中，500rmp/min离心3min，获取上清液，沉淀用细胞分离液重悬，500rmp/min离心3min，获得沉淀细胞，即为肝实质细胞，再将肝实质细胞立即重悬于浓度为2％FBS、20U/mL青霉素、20U/mL链霉素、10mML-谷氨酰胺和100nM地塞米松的Williams E培养基中培养；向50mL的离心管中加入15mL浓度为30％的percoll溶液，再加入10mL浓度为20％的percoll溶液，最后加入15ml获取的上清液，1800rmp/min离心20min，形成上、下两层界面，分别获取上层界面中和下层界面中的细胞；其中上层界面中所获取细胞为星状细胞，即为肝星状细胞，立即重悬于浓度为2％FBS、20U/mL青霉素、20U/mL链霉素和10mM L-谷氨酰胺的DMEM培养基中培养；下层界面中的细胞悬液经2000rmp/min离心20min，用分离液重悬，平均分成两份备用；再将所制备的两份备用细胞悬液500rmp/min离心5min后，重悬于磁珠分选的缓冲液中，分别与连接有肝血窦内皮细胞和枯否细胞特异性的免疫磁珠孵育5h，肝血窦内皮细胞特异性的免疫磁珠采用Anti-CD146，枯否细胞特异性的免疫磁珠采用Anti-CD14，然后再缓慢添加至分选柱中，分选柱置于磁场中，待细胞悬液全部流干，移出磁场，再将吸附在分选柱上的细胞采用磁珠分选专用缓冲液冲洗下来，之后800rmp/min离心5min，分别获得肝血窦内皮细胞和枯否细胞，并立即将肝血窦内皮细胞重悬于浓度为5％FBS，20U/mL青霉素、20U/mL链霉素、10mM L-谷氨酰胺、100nM地塞米松和1ng/mL VEGF的1640培养基中培养，将枯否细胞重悬于浓度为5％FBS、20U/mL青霉素、20U/mL链霉素和10mM L-谷氨酰胺的1640培养基中培养。
实施例5
将100g雄性SD大鼠麻醉后，开腹，使用型号为0.7×19mm 24G的留置针肝门静脉插管，再将浓度为20mM EGTA和15mM HEPES不含Ca2+，Mg2+的HBSS灌流液经肝门静脉原位37℃恒温灌流15min，灌流速度控制在20mL/min，且灌流过程中不得产生任何气泡；替换灌流液，将浓度为50mg/L CaCl2、50mM HEPES、100mg/LⅡ型胶原酶和100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM-高糖的消化液经肝门静脉原位37℃恒温灌流10min，灌流速度控制在10mL/min；将消化后的肝脏小心取出置于盛有浓度为5μM地塞米松和10％FBS的DMEM-高糖的器皿中，用镊子小心划破肝脏表面的包膜，钝性分离，轻轻涮动以释放出包含多种肝原代细胞的细胞悬液并用孔径为100μm的细胞筛过筛；再将制得的细胞悬液加入离心管中，500rmp/min离心3min，获取上清液，沉淀用细胞分离液重悬，500rmp/min离心3min，获得沉淀细胞，即为肝实质细胞，再将肝实质细胞立即重悬于浓度为2％FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素、10mM L-谷氨酰胺和100nM地塞米松的Williams E培养基中培养；向50mL的离心管中加入15mL浓度为30％的percoll溶液，再加入10mL浓度为20％的percoll溶液，最后加入15ml获取的上清液，1800rmp/min离心20min，形成上、下两层界面，分别获取上层界面中和下层界面中的细胞；其中上层界面中所获取细胞为星状细胞，即为肝星状细胞，立即重悬于浓度为2％FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10mM L-谷氨酰胺的DMEM培养基中培养；下层界面中的细胞悬液经2000rmp/min离心20min，用分离液重悬，平均分成两份备用；再将所制备的两份备用细胞悬液500rmp/min离心5min后，重悬于磁珠分选的缓冲液中，分别与连接有肝血窦内皮细胞和枯否细胞特异性的免疫磁珠孵育5h，肝血窦内皮细胞特异性的免疫磁珠采用Anti-CD146，枯否细胞特异性的免疫磁珠采用Anti-CD14，然后再缓慢添加至分选柱中，分选柱置于磁场中，待细胞悬液全部流干，移出磁场，再将吸附在分选柱上的细胞采用磁珠分选专用缓冲液冲洗下来，之后800rmp/min离心5min，分别获得肝血窦内皮细胞和枯否细胞，并立即将肝血窦内皮细胞重悬于浓度为5％FBS，100U/mL青霉素、100U/mL链霉素、10mM L-谷氨酰胺、100nM地塞米松和1ng/mL VEGF的1640培养基中培养，将枯否细胞重悬于浓度为5％FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10mM L-谷氨酰胺的1640培养基中培养。
实施例6
将250g雄性SD大鼠麻醉后，开腹，使用型号为0.7×19mm 24G的留置针肝门静脉插管，再将浓度为5mM EGTA和10mM HEPES不含Ca2+，Mg2+的HBSS灌流液经肝门静脉原位37℃恒温灌流10min，灌流速度控制在15mL/min，且灌流过程中不得产生任何气泡；替换灌流液，将浓度为50mg/L CaCl2、50mM HEPES、100mg/LⅡ型胶原酶和100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM-高糖的消化液经肝门静脉原位37℃恒温灌流10min，灌流速度控制在10mL/min；将消化后的肝脏小心取出置于盛有浓度为5μM地塞米松和10％FBS的DMEM-高糖的器皿中，用镊子小心划破肝脏表面的包膜，钝性分离，轻轻涮动以释放出包含多种肝原代细胞的细胞悬液并用孔径为100μm的细胞筛过筛；再将制得的细胞悬液加入离心管中，500rmp/min离心3min，获取上清液，沉淀用细胞分离液重悬，500rmp/min离心3min，获得沉淀细胞，即为肝实质细胞，再将肝实质细胞立即重悬于浓度为2％FBS、50U/mL青霉素、50U/mL链霉素、10mM L-谷氨酰胺和100nM地塞米松的Williams E培养基中培养；向50mL的离心管中加入15mL浓度为30％的percoll溶液，再加入10mL浓度为20％的percoll溶液，最后加入15ml获取的上清液，1800rmp/min离心20min，形成上、下两层界面，分别获取上层界面中和下层界面中的细胞；其中上层界面中所获取细胞为星状细胞，即为肝星状细胞，立即重悬于浓度为2％FBS、50U/mL青霉素、50U/mL链霉素和10mM L-谷氨酰胺的DMEM培养基中培养；下层界面中的细胞悬液经2000rmp/min离心20min，用分离液重悬，平均分成两份备用；再将所制备的两份备用细胞悬液500rmp/min离心5min后，重悬于磁珠分选的缓冲液中，分别与连接有肝血窦内皮细胞和枯否细胞特异性的免疫磁珠孵育5h，肝血窦内皮细胞特异性的免疫磁珠采用Anti-CD146，枯否细胞特异性的免疫磁珠采用Anti-CD14，然后再缓慢添加至分选柱中，分选柱置于磁场中，待细胞悬液全部流干，移出磁场，再将吸附在分选柱上的细胞采用磁珠分选专用缓冲液冲洗下来，之后800rmp/min离心5min，分别获得肝血窦内皮细胞和枯否细胞，并立即将肝血窦内皮细胞重悬于浓度为3％FBS，50U/mL青霉素、50U/mL链霉素、10mM L-谷氨酰胺、100nM地塞米松和2ng/mL VEGF的1640培养基中培养，将枯否细胞重悬于浓度为5％FBS、50U/mL青霉素、50U/mL链霉素和10mM L-谷氨酰胺的1640培养基中培养。
本发明提取和分离的4种肝细胞数量非常可观，经统计，从25g动物肝脏中可以获得肝实质细胞约为8×107个，星状细胞约为2×106个，肝血窦内皮细胞约为5×106个，枯否细胞约为5×106个。台盼蓝染色发现，肝实质细胞、星状细胞、肝血窦内皮细胞、枯否细胞的存活可达到98％，95％，90％，90％。
本发明方法培养的4种肝原代细胞，在经过长时间的培养后细胞形态仍然稳定，存活率高。如图1所示，肝实质细胞在培养5天后，结构完整，保持典型的多数双核和少数单核结构，胞间蛋白表达良好，而且细胞存活率大于98％。如图2所示，肝星状细胞在培养5天后，星状细胞贴壁生长依然良好，细胞大小形态均一，可见细胞内脂滴的存在，细胞存活率大于95％。如图3所示，肝血窦内皮细胞在培养5天后，除部分区域少量细胞死亡外，细胞形态呈多边形结构，结构清晰，细胞存活率大于90％。如图4所示，枯否细胞在经过5天的培养后，细胞结构依然完整，结构清晰，细胞存活率大于90％。

Claims (1)

1.一种提取、分离和培养同体异种肝原代细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1、将啮齿动物麻醉后，开腹，使用留置针肝门静脉插管，灌流液经肝门静脉原位37℃恒温灌注5-30min，灌流速度为5-25mL/min，且灌流过程中不得产生任何气泡，所述灌流液选自额外添加终浓度为0.5-10mM EGTA和1-50mM HEPES的缓冲液，所述缓冲液选自不含Ca2+，Mg2+的HBSS或D-Hanks或PBS中的一种；
步骤2、替换灌流液，将消化液经肝门静脉原位37℃恒温灌注2-15min，灌流速度为5-20mL/min，所述消化液选自额外添加终浓度为50-300mg/L CaCl2、1-50mM HEPES、10-100mg/L胶原酶、0-100U/mL青霉素和0-100U/mL链霉素的基础培养基，所述胶原酶选自Ⅱ型或Ⅳ型胶原酶中的一种，所述基础培养基选自市售的DMEM-高糖，DMEM-低糖或1640中的一种；
步骤3、将步骤2中消化后的肝脏小心取出置于盛有分离液的器皿中，用镊子小心划破肝脏表面的包膜，钝性分离，轻轻涮动以释放出包含多种肝原代细胞的细胞悬液并过筛，所述分离液选自额外添加终浓度为0.05-5μM地塞米松和2％-10％FBS的基础培养基，所述基础培养基选自市售的DMEM-高糖、DMEM-低糖或1640中的一种，所述过筛选自孔径为20-200μm的组织筛或纱布中的一种；
步骤4、将步骤3制得的细胞悬液加入离心管中，500-800rmp/min离心1-5min后，获取上清液，沉淀用细胞分离液重悬，500-800rmp/min离心1-5min后，获得实质细胞，再将实质细胞立即重悬于专门配制的实质细胞培养基中培养，所述专门配制的实质细胞培养基选自额外添加终浓度为2％-10％FBS、0-100U/mL青霉素、0-100U/mL链霉素、1-10mM L-谷氨酰胺和10-100nM地塞米松的Williams E培养基；
步骤5、向50mL的离心管中加入10-20mL浓度为20％-50％的percoll溶液，再加入5-15mL浓度为10％-20％的percoll溶液，最后加入10-20ml步骤4中获取的上清液，之后1500-2000rmp/min离心10-20min，形成上、下两层界面，分别获取上层界面中和下层界面中的细胞；其中上层界面中所获取细胞为星状细胞，立即重悬于专门配制的星状细胞培养基中培养，下层界面中的细胞悬液经1000-3000rmp/min离心15-20min，用分离液重悬，平均分成两份备用，所述专门配制的星状细胞培养基选自额外添加终浓度为2％-10％FBS、0-100U/mL青霉素、0-100U/mL链霉素和1-10mM L-谷氨酰胺的DMEM培养基；
步骤6、将步骤5中所制备的两份备用细胞悬液100-1000rmp/min离心2-8min后，之后重悬于磁珠分选的缓冲液中，分别与连接有肝血窦内皮细胞和枯否细胞特异性的免疫磁珠孵育0.5-5h，缓慢添加至分选柱中，分选柱置于磁场中，待细胞悬液全部流干，移出磁场，再将吸附在分选柱上的细胞采用磁珠分选专用缓冲液冲洗下来，之后100-1000rmp/min离心1-10min，分别获得肝血窦内皮细胞和枯否细胞，并立即重悬于对应的专门配制的培养基中培养，专门配制的肝血窦内皮细胞培养基选自额外添加终浓度为2％-10％FBS，0-100U/mL青霉素、0-100U/mL链霉素、1-10mM L-谷氨酰胺、10-100nM地塞米松和1-50ng/mL VEGF的1640培养基，专门配制的枯否细胞培养基选自额外添加终浓度为2％-10％FBS、0-100U/mL青霉素、0-100U/mL链霉素和1-10mM L-谷氨酰胺的1640培养基，所述肝血窦内皮细胞特异性的免疫磁珠选自市售的Anti-CD146或Anti-CD31抗体偶联磁珠中的一种，所述枯否细胞特异性的免疫磁珠选自市售的Anti-CD14、Anti-GFAP或Anti-F4/80抗体偶联磁珠中的一种；
提取、分离后的4种肝原代细胞是放置在温度为37℃，CO2含量为5％，湿度为95％的细胞培养箱中培养。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111876372A (zh) * 2020-06-30 2020-11-03 段娟丽 一种小鼠肝实质细胞及非实质细胞的一步分离方法
CN113604419A (zh) * 2021-06-24 2021-11-05 国家纳米科学中心 一种小鼠原代肝脏枯否细胞的提取方法
CN117070462A (zh) * 2023-08-17 2023-11-17 镜像绮点(上海)细胞技术有限公司 原代细胞的分离与纯化

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1212998A (en) * 1981-04-21 1986-10-21 Peter Senak, Jr. Line voltage monitor system
CN1461340A (zh) * 2000-10-03 2003-12-10 北卡罗来纳大学 分离双能肝祖细胞的方法
CN103509751A (zh) * 2013-07-08 2014-01-15 康珞生物科技（武汉）有限公司 人原代肝细胞与肝非实质细胞共培养方法
CN105176816A (zh) * 2015-10-30 2015-12-23 东南大学 一种基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片及其制备和使用方法
CN106139251A (zh) * 2015-04-02 2016-11-23 清华大学 一种三维组织结构体的制备方法及其应用
CN108277198A (zh) * 2018-01-09 2018-07-13 大连理工大学 一种实现二维、三维交叉共培养的肝脏微流控芯片及其应用
WO2019122351A1 (en) * 2017-12-22 2019-06-27 Cellink Ab Tissue-specific human bioinks for the physiological 3d-bioprinting of human tissues for in vitro culture and transplantation

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1212998A (en) * 1981-04-21 1986-10-21 Peter Senak, Jr. Line voltage monitor system
CN1461340A (zh) * 2000-10-03 2003-12-10 北卡罗来纳大学 分离双能肝祖细胞的方法
CN103509751A (zh) * 2013-07-08 2014-01-15 康珞生物科技（武汉）有限公司 人原代肝细胞与肝非实质细胞共培养方法
CN106139251A (zh) * 2015-04-02 2016-11-23 清华大学 一种三维组织结构体的制备方法及其应用
CN105176816A (zh) * 2015-10-30 2015-12-23 东南大学 一种基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片及其制备和使用方法
WO2019122351A1 (en) * 2017-12-22 2019-06-27 Cellink Ab Tissue-specific human bioinks for the physiological 3d-bioprinting of human tissues for in vitro culture and transplantation
CN108277198A (zh) * 2018-01-09 2018-07-13 大连理工大学 一种实现二维、三维交叉共培养的肝脏微流控芯片及其应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIU, JIA等: "Advanced Method for Isolation of Mouse Hepatocytes, Liver Sinusoidal Endothelial Cells, and Kupffer Cells", 《HEPATITIS B VIRUS: METHODS AND PROTOCOLS》 *
QIDI ZHANG等: "Isolation and Culture of Single Cell Types from Rat Liver", 《CELLS TISSUES ORGANS》 *
WEI LIU等: "Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies", 《PROTEOMICS》 *
刘伟等: "小鼠肝实质细胞蛋白质表达谱构建及功能分析", 《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》 *
吴天鸣等: "一氧化氮对大鼠肝缺血-再灌注损伤中肝细胞凋亡的影响", 《中华实验外科杂志》 *
张卓然主编: "《培养细胞学与细胞培养技术》", 31 August 2004, 上海科学技术出版社 *
潘小平等: "肝实质细胞和非实质细胞的永生化研究进展", 《国外医学流行病学传染病学分册》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111876372A (zh) * 2020-06-30 2020-11-03 段娟丽 一种小鼠肝实质细胞及非实质细胞的一步分离方法
CN113604419A (zh) * 2021-06-24 2021-11-05 国家纳米科学中心 一种小鼠原代肝脏枯否细胞的提取方法
CN117070462A (zh) * 2023-08-17 2023-11-17 镜像绮点(上海)细胞技术有限公司 原代细胞的分离与纯化
CN117070462B (zh) * 2023-08-17 2024-02-23 镜像绮点(上海)细胞技术有限公司 原代细胞的分离与纯化

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