CN117070462A - 原代细胞的分离与纯化 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种原代细胞的分离与纯化方法，包括如下步骤：1)样本组织消化和细胞悬液制备；2)磁珠分离与纯化。本发明的分离与纯化方法具有高纯度、高活性、能够快速分离、可定制性、易于操作等有点，适用于多种类型的原代细胞，如肿瘤细胞、肌肉细胞、神经细胞、皮肤细胞等，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，具体涉及一种肿瘤原代细胞的分离与纯化方法。
背景技术
原代培养也叫初代培养，是从供体取得组织后在体外进行的首次培养，原代培养的肿瘤细胞因组织刚刚离体，其生物学特性未发生很大变化，基因保留量在90％以上，用于药物敏感性试验及机制探究相关试验，其数据更具有说服力。
原代细胞的分离与纯化主要包括组织消化法、机械分离法、磁珠分离法、FACS分选。组织消化法使用特定的消化酶，如胶原酶、透明质酸酶、胰酶等，将组织中的细胞分离出来。不同类型的组织可能需要使用不同的消化酶和条件。通过优化消化酶的浓度、反应时间和温度，可以提高分离效率和细胞活性。机械分离法使用机械力，如刮刀、搅拌、过滤等，将组织中的细胞分离出来。机械分离法通常与消化法结合使用，以提高细胞分离的效率。磁珠分离法利用磁性微球与细胞表面特异性抗原结合，通过磁场的作用实现细胞的分离。磁珠分离法具有高度灵敏和特异性。针对特定类型的原代细胞，可以选择合适的抗体和磁珠来实现高效纯化。FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorting，荧光激活细胞分选)基于流式细胞仪，通过检测荧光标记的细胞，可以实现高速、高精度的细胞分离。FACS适用于对细胞活性和纯度要求较高的原代细胞分离。
将上述技术在实际应用中结合使用，根据所需分离的细胞类型和实验条件，进行优化，以达到最佳的原代细胞分离和纯化效果具有重要意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种基于磁珠分离技术的原代细胞分离与纯化方法。
具体，本发明第一方面提供了一种原代细胞的分离与纯化方法，包括如下步骤：1)样本组织消化和细胞悬液制备；2)磁珠分离与纯化。
在某些实施方式中，所述步骤2)磁珠分离与纯化进一步包括抗体标记、磁珠耦合、磁珠分离、细胞收集与洗涤、细胞释放与培养的步骤。
在某些实施方式中，所述原代细胞选自肿瘤细胞、肌肉细胞、神经细胞或皮肤细胞。
在某些实施方式中，所述抗体标记根据目标细胞的表面标志物，选择特异性抗体；优选地，采用CD34抗体标记造血干细胞，使用CA15-3抗体标记乳腺癌原代细胞。
在某些实施方式中，所述原代细胞为乳腺癌原代细胞。
在某些实施方式中，所述样本组织消化采用的消化液组分选自PRMI-1640、胶原酶II、胶原酶IV、透明质酸酶和DNA酶；优选地，所述消化液中胶原酶II使用浓度为约0.05％、胶原酶IV使用浓度为约0.05％、透明质酸酶使用浓度为约0.025％和DNA酶使用浓度为约0.0002％。
在某些实施方式中，所述乳腺癌原代细胞培养的培养基组分包括RPMI1640，DMEM，青霉素/链霉素双抗，EGF，FGF10，胎牛血清；优选地，所述RPMI1640，DMEM的配比为2:1。
在某些实施方式中，所述EGF浓度为5-10mg/ml，所述FGF10浓度为10-20mg/ml，青霉素/链霉素双抗浓度为2-3％，所述胎牛血清为5-10％；优选地，所述EGF浓度为8mg/ml，所述FGF10浓度为15mg/ml，青霉素/链霉素双抗浓度为2％，所述胎牛血清为8％。
本发明第二发明提供了根据本发明第一方面所述的方法获得的原代细胞；优选地，所述原代细胞为乳腺癌原代细胞。
本发明第三方面提供了根据本发明第二方面所述的原代细胞在疾病模型构建、药物筛选、疗法评估中的应用。
本发明相对于现有技术的有益效果是：
1)高纯度：通过特异性抗体识别和结合目标细胞，实现高度纯化的细胞分离，有效减少非目标细胞的污染。
2)高活性：采用温和的组织消化方法和磁性分离过程，减少细胞在分离过程中的损伤，保持分离后细胞的高活性。
3)快速分离：相较于传统密度梯度离心等分离方法，磁珠分离法操作简便，分离时间短，更适合大量样本的处理。
4)可定制性：根据不同类型的原代细胞，可以选择特定的抗体，定制化分离纯化方案，满足多样化的实验需求。
5)易于操作：整个分离过程操作简单，容易上手，适用于各种实验室环境。可扩展性：该方法适用于多种类型的原代细胞，如肿瘤细胞、肌肉细胞、神经细胞、皮肤细胞等，具有广泛的应用前景。
6)有助于研究：高纯度、高活性的原代细胞有助于提高实验结果的可靠性和准确性，为相关领域的研究提供有力支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1显示乳腺癌原代细胞培养生长曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种利用磁珠分离和纯化原代细胞的方法，包括如下步骤：
组织消化：首先，将待分离的组织样本切成细小块，然后使用优化过的高效、温和的组织消化方法对组织进行消化。例如，可以使用定制的消化酶混合物，通过调整消化酶的种类、浓度、反应时间和温度等参数，以实现对原代细胞的最大程度保护和分离效率的提高。
细胞悬液制备：将消化后的组织样本过滤和离心，去除细胞碎片和杂质，得到含有原代细胞的悬液。
抗体标记：选择与目标原代细胞表面抗原高度匹配的特异性抗体，将抗体加入细胞悬液中，充分混匀后在适当的温度下孵育一定时间，使抗体与细胞表面抗原结合。例如使用CA15-3抗体纯化乳腺癌细胞，使用CD34抗体纯化造血干细胞；若需要，可使用二抗进行抗体标记，例如荧光二抗或生物素标记的二抗。
磁珠耦合：将抗体标记的细胞悬液与修饰过的磁珠混合，充分混匀后在适当的温度下孵育一定时间，使磁珠与抗体结合。
磁珠分离：将混合物放置在磁场中，利用磁场对磁珠的作用力将磁珠-抗体-原代细胞复合物与未结合的细胞分离。此过程可以根据需要重复进行，以提高纯化程度。
细胞收集与洗涤：将磁珠-抗体-原代细胞复合物从磁场中移出，用适当的洗涤液洗涤，去除非特异性结合的细胞和杂质。
细胞释放与培养：用适当的方法将原代细胞从磁珠和抗体上解离，收集并转移到培养皿中，使用适当的培养基和条件培养分离纯化后的原代细胞。
本发明的方法适用不同类型原代细胞的培养。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另作定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。除非特别说明，本发明所用试剂、仪器、设备和方法均为本技术领域的常规市购试剂、仪器、设备和方法。
实施例1原代细胞的分离与纯化
1.1组织消化与初步分离
无菌条件下，在手术切除后的半小时内收集乳腺癌标本，取50mL塑料无菌离心管，内装4℃预冷的RPMI1640细胞培养液20mL，培养液内含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。切取非坏死部位的肿瘤样本置于所述无菌离心管内，离心管置冰上运输，迅速带回实验室。将肿瘤样本转移至细胞培养皿内，用PBS冲洗三次，将血细胞清洗掉，剔除表面筋膜等非肿瘤组织。将处理后的肿瘤组织转移至新的细胞培养皿内，用无菌手术刀片、手术剪和手术镊将组织切成1mm3左右的块状。将切碎的肿瘤组织转移至离心管，300g离心120s，去上清，再用下表1所示的消化液进行重悬，置37℃恒温摇床上进行振荡消化，时间1小时。将消化后的肿瘤组织悬液300g离心5分钟，弃去上清液，消化的肿瘤组织用10mL 1×PBS重悬，研磨过100目筛(孔径0.16mm)，将其收集于100mm培养皿中。将收集的细胞悬液过40μm孔径的细胞筛并收集于50mL离心管内，用血细胞计数板计数。然后将其1200转/分，离心5分钟，弃去上清，沉淀用无血清RPMI1640重悬，悬液的密度为1×105-1×106/mL。
1.2磁珠分离与纯化
细胞经免疫磁珠分离,具体步骤为：加入CA15-3+磁珠，4-8℃混匀放置15-60分钟。加入PBS缓冲液清洗细胞并离心(300g,10min，4-8℃)；重悬细胞再加适量PBS缓冲液；准备好分离柱，并用缓冲液清洗，把细胞悬液倒入柱子中，用500ul的PBS缓冲液冲洗柱子，共三次；将柱子移开磁场到一合适的容器中，用1mLPBS缓冲液稍用力冲洗，获得CA15-3+细胞，即为乳腺癌原代细胞。
1.3细胞计数和功能分析
调整细胞密度为1×106cell/mL。按细胞悬液：0.4％台盼蓝＝3:1(v:v)充分混匀，取20uL细胞混匀液加入细胞计数板中，用Countstar细胞计数器进行细胞活率及体积检测，三次检测结果均达到80％以上。说明实施例1提供的原代细胞分离纯化方法能够很好的保持乳腺癌原代细胞的活性，不会其造成损伤。
1.4细胞培养和扩增
在下表2的细胞培养基中将原代细胞制备成终浓度为1×105ml的细胞悬液。将细胞悬液加入培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。48h后，细胞生长达到对数期，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况并拍照。待细胞生长至80％以上融合后再次导致显微镜观察，重复传代培养3次，获得乳腺癌细胞。培养过程中，每天记录细胞数量，对不同培养基培养的乳腺癌细胞绘制生长曲线，结果见图1。
表2培养基配方
根据细胞增殖曲线，本发明提供的培养基3相对于培养基1和2具有显著更优的细胞增殖效果。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这中叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (10)
1.一种原代细胞的分离与纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：1)样本组织消化和细胞悬液制备；2)磁珠分离与纯化。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)磁珠分离与纯化进一步包括抗体标记、磁珠耦合、磁珠分离、细胞收集与洗涤、细胞释放与培养的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述原代细胞选自肿瘤细胞、肌肉细胞、神经细胞或皮肤细胞。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述抗体标记根据目标细胞的表面标志物，选择特异性抗体；优选地，采用CD34抗体标记造血干细胞，使用CA15-3抗体标记乳腺癌原代细胞。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述原代细胞为乳腺癌原代细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述样本组织消化采用的消化液组分选自PRMI-1640、胶原酶II、胶原酶IV、透明质酸酶和DNA酶；优选地，所述消化液中胶原酶II使用浓度为约0.05％、胶原酶IV使用浓度为约0.05％、透明质酸酶使用浓度为约0.025％和DNA酶使用浓度为约0.0002％。。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述乳腺癌原代细胞培养的培养基组分包括RPMI1640，DMEM，青霉素/链霉素双抗，EGF，FGF10，胎牛血清；优选地，所述RPMI1640，DMEM的配比为2:1。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述EGF浓度为5-10mg/ml，所述FGF10浓度为10-20mg/ml，青霉素/链霉素双抗浓度为2-3％，所述胎牛血清为5-10％；优选地，所述EGF浓度为8mg/ml，所述FGF10浓度为15mg/ml，青霉素/链霉素双抗浓度为2％，所述胎牛血清为8％。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法获得的原代细胞；优选地，所述原代细胞为乳腺癌原代细胞。
10.根据权利要求9所述的原代细胞在疾病模型构建、药物筛选、疗法评估中的应用。
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