CN116083342A - 一种原代上皮细胞的培养体系和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种原代上皮细胞的培养体系和应用，按重量百分比计，所述培养体系包括基础培养基81.5‑97.5％、胎牛血清小于2％且不小于0.5％、抗生素1‑5％和添加剂0.5‑2％，所述添加剂包括多种生长因子。本发明还提供该培养体系在培养上皮细胞以及肠上皮屏障功能实验中的应用。本发明能够实现在低血清条件下长期稳定培养上皮细胞。

Description

一种原代上皮细胞的培养体系和应用
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体地，涉及一种原代上皮细胞的培养体系和应用。
背景技术
上皮细胞是一类位于皮肤或腔道表层的特定类型的细胞，可以根据其形态及功能对此类细胞进行分类。分布范围最广的是被覆上皮，此类上皮主要分布在哦体表皮肤和有腔器官的表面，其功能相对单一，主要起到分隔生物体组织内外环境的作用。上皮细胞的另一大类是腺上皮细胞，多数以零散分布于被覆上皮中的形式存在，承担分泌酶、粘液或激素等物质的功能，根据其存在形式是单细胞还是多细胞，有无导管及分支链接又可以进行细分。除了上述两大类，还有很多功能特化的上皮细胞例如：感觉上皮，主要位于舌、眼、耳、鼻中，接受特定理化刺激；生殖上皮，指覆盖在生殖腺表面的一群上皮细胞，在特性上其与一般上皮的区别主要有两点，一是在发育时，这是最初覆盖于生殖腺原基表面的细胞，其内包含原始的生殖细胞，在形态上较常规的腔道上皮厚；肌上皮，一种位于腺上皮及其导管和基底膜之间的富含肌动蛋白的有收缩功能的细胞，其主要功能是通过收缩辅助腺泡通过导管排出分泌物。
传统的培养上皮细胞的方法还是一般通过基础培养基和血清的组合，但是对于部分上皮细胞来说，较高的血清浓度虽然能促进其生长，但是也会诱导其发生上皮细胞-间充质转化(EMT)，使得其生长和生理特性向间质细胞转化，此外原代分离后的细胞悬液中不可避免的会含有间质细胞等杂细胞，而此时培养基中10％以上比例的高胎牛血清环境中间质细胞的增殖速度明显较上皮细胞要快，在加上上皮细胞的EMT通常经过1-2次传代后，间质细胞会成为占绝对优势的细胞群体，导致无法获得足够纯度和量的上皮细胞。面对这种问题通常改善的方式是用5％的胎牛血清，配合一定浓度的EGF和胰岛素维持上皮细胞的生长；但是5％血清的浓度依旧较高，不能满足很多上皮细胞长时间增殖培养的需求，对EMT和间质细胞的生长抑制也很有限。
申请公开号为CN105647850A的中国发明专利，公开一种上皮培养体系，包括上皮培养基和上皮添加剂；所述上皮添加剂其组成成分及浓度为：重组人表皮细胞生长因子25ng/ml，氢化可的松100ng/ml，重组人胰岛素10ug/ml，人全铁转铁蛋白5ug/ml，腺嘌呤0.18mM，霍乱毒素0.1nM，三碘甲状腺氨酸20-12M，本发明的上皮培养体系，配置简单，通过上皮培养基和上皮添加剂配合使用，能够在2％血清的环境下促进上皮细胞的生长活性，也可以部分抑制成纤维和平滑肌细胞的活性，减少杂细胞的污染。但是，该专利在添加剂中使用了霍乱毒素，虽然作为一种腺苷酸环化酶激活剂，它能够刺激多种上皮细胞的增值，与钙离子的转运相关并促进细胞贴壁；但是作为一种毒性蛋白，其使用有一定生物安全风险。此外该专利的添加成分种类较少，只能适用于少量特定类型的上皮细胞的培养，适用范围有限。
发明内容
为解决现有技术中培养基中针对上皮细胞的营养供应特异性较弱和高浓度血清诱导上皮EMT的问题，本发明的目的是提供一种原代上皮细胞的培养体系和应用，能够实现在低血清条件下长期稳定培养上皮细胞。
根据本发明的第一方面，提供一种原代上皮细胞的培养体系，按重量百分比计，包括：基础培养基81.5-97.5％、胎牛血清小于2％且不小于0.5％、抗生素1-5％和添加剂0.5-2％，所述添加剂包括多种生长因子。
进一步地，所述基础培养基包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、嘌呤、嘧啶、缓冲液和pH指示剂。
进一步地，所述添加剂为在4℃保存时容易分解的物质，所述添加剂以工作浓度100倍的浓度配置成溶液在-20℃长期保存，需要使用时按百分之一的量添加至所述基础培养基中。
进一步地，所述多种生长因子包括重组人表皮细胞生长因子、重组人胰岛素、人全铁转铁蛋白、三碘甲状腺氨酸和牛脑垂体提取物。
进一步地，所述添加剂还包括腺嘌呤和氢化可的松。
进一步地，所述添加剂中各组分在培养体系中的浓度为：重组人表皮细胞生长因子15-25ng/ml、氢化可的松300-600ng/ml、三碘甲状腺氨酸4-8pg/ml、腺嘌呤18-25ug/ml、重组人胰岛素5-10ug/ml、人全铁转铁蛋白5-10ug/ml、牛脑垂体提取物浓度为0.25-0.4％。
进一步地，所述抗生素包括青霉素和链霉素。
进一步地，青霉素和链霉素以工作浓度100倍的浓度配置成溶液在-20℃长期保存，需要使用时按百分之一的量添加至所述基础培养基中。
根据本发明的第二方面，提供一种上述的培养体系在培养多种上皮细胞中的应用。
根据本发明的第三方面，提供一种上述的培养体系在肠上皮屏障功能实验中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下至少之一的有益效果：
1、本发明通过多种重组蛋白的组合使用，形成对多种上皮细胞生长和增殖形成充足和有足够特异性的营养支持，同时利用多种重组蛋白对上皮细胞的营养支持，能够降低培养体系中添加血清量至小于2％且不小于0.5％，而血清浓度的降低可以有效降低间质细胞等杂细胞的生长速度，并减少上皮细胞由于较高浓度血清中不确定成分的刺激发生EMT的速度和比例，更利于上皮细胞的稳定增殖，从而更容易获得高纯度的上皮细胞。
2、本发明能够提高上皮细胞原代分离的成功率，降低杂细胞的生长速度，增加上皮细胞传代后维持其细胞特性的代数。利用培养基的这一特性，可以使原代分离的覆盖上皮细胞在经过多次传代后，依旧可以维持细胞间的紧密连接，可以更容易通过扩增获取足够量的细胞，用于肠上皮屏障功能实验。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为应用例1中的细胞生长情况示意图；
图2为应用例1中细胞IF免疫荧光图；
图3为应用例1中的IF免疫荧光鉴定结果；
图4为应用例2中跨上皮细胞的电阻检测结果；
图5为应用例3中两组细胞生长情况的显微镜表征结果示意图；
图6为应用例3中两组提取纯化的外泌体的透射电镜表征结果示意图；
图7为应用例3中纯化的外泌体的CD9、CD63、CD81的特异性蛋白检测的结果；
图8为应用例3中两组外泌体的BCA定量结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明实施例提供一种原代上皮细胞的培养体系，按重量百分比计，该培养体系包括：基础培养基81.5-97.5％、胎牛血清小于2％且不小于0.5％、抗生素1-5％和添加剂0.5-2％，其中，添加剂包括多种生长因子。
基础培养基包括了在4℃保存时不易分解的成分，在一些实施方式中，基础培养基包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、嘌呤、嘧啶、缓冲液和pH指示剂
在上述基础培养基中，氨基酸是组成蛋白质的基本单位，是细胞蛋白质合成的原料，缺少氨基酸时细胞会发生生长不良；其中部分氨基酸机体无法合成被称为必需氨基酸；但是添加的氨基酸包括必需和非必需氨基酸，非必需氨基酸也可以替代细胞生长过程中耗尽的成分刺激细胞增殖。葡萄糖是用于供能的碳水化合物。维生素中的很多种是多种酶的活性基团成分，因此是细胞生长和增殖必不可少的，由于单纯的细胞无法产生足够多种类和数量的维生素，因此必须在培养基中进行添加。培养基中添加了多种无机盐成分以维持细胞的正常生理功能和细胞的渗透压，其中Na+、K+和Cl–还参与许多大分子物质的跨膜运输；Mg2+是细胞间质的重要组分和很多酶反应的辅酶；Ca2+能够调节细胞膜功能并参与多项细胞生理活动。脂类在培养基中的添加为细胞提供适当的预成形脂质，减少了细胞对其生物合成的需要，能够促进细胞的新陈代谢，提高细胞分裂速率和代谢水平。细胞的增殖需要细胞不断地分裂，其中伴随着DNA的不断复制，嘌呤和嘧啶是DNA的基本组成物质，其添加有利于细胞DNA的快速合成，提高细胞增殖速率。缓冲液中HCO3 -主要发挥缓冲作用，降低培养基pH的变化程度。pH指示剂如酚红的主要作用是指示培养基的酸碱度，提示使用者在培养环境变化至不适宜细胞生长前进行换液。
在一优选实施方式中，基础培养基的组成如表1所示。
表1基础培养基的组成
Figure BDA0004061138650000041
Figure BDA0004061138650000051
Figure BDA0004061138650000061
在一些实施方式中，添加剂为在4℃保存时容易分解的物质，添加剂以工作浓度100倍的浓度配置成溶液在-20℃长期保存，其中工作浓度即在培养体系中的浓度，需要使用时按百分之一的量添加至基础培养基中。
在一些实施方式中，添加剂还包括腺嘌呤和氢化可的松，多种生长因子包括重组人表皮细胞生长因子(EGF)、重组人胰岛素、人全铁转铁蛋白、三碘甲状腺氨酸和牛脑垂体提取物。上述添加剂中多种生长因子的组合，能够形成对胎牛血清中营养物质依赖的降低，和对上皮细胞有针对性的营养支持，以更长地维持体外培养的上皮细胞的增殖时间和细胞特性。
在上述添加剂中，EGF是人体内分泌的一种重要细胞生长因子，有很强的生理活性，其主要功能是促进细胞的分裂，加快新陈代谢。因为EGF也会促进主要杂细胞成纤维细胞的增殖，因此添加剂的浓度不宜过高。腺嘌呤是核酸的组成部分，可以在细胞增殖的过程中参与遗传物质合成，可以降低细胞增殖中合成遗传物质的需求，加速细胞增殖，使细胞能够更好的生长。三碘甲状腺氨酸是甲状腺分泌的一种激素，它在蛋白合成方面有着重要的作用，因此深刻参与细胞的生长、分化、发育等多个生理过程，添加在培养基中，主要也是起到促进细胞增殖的作用。牛脑垂体提取物是一种由牛脑垂体制备的添加物，能够用于非间质细胞的培养中，以降低培养基中血清的使用量，其中包含多种生长因子和激素，是一种良好的细胞培养添加剂，可以在维持目标细胞增殖的同时降低杂细胞的增殖速度。胰岛素可以促进细胞中RNA、蛋白质、脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡，维持其一定浓度可以使细胞保持较高的生长速率。人全铁转铁蛋白中的铁参与DNA的复制和细胞代谢，是一种必需元素，人全铁转铁蛋白能够为细胞补充铁元素，维持细胞的正常生长和增殖。氢化可的松作为一种糖皮质激素，在培养中主要起到降低细胞应激反应，维持细胞稳定生长的作用。通过上述生长因子的共同作用，促进细胞增殖，降低对血清的依赖。
在一优选实施方式中，以培养体系的总重量为基准，添加剂的组成如表2所示。
表2添加剂的组成
Figure BDA0004061138650000062
Figure BDA0004061138650000071
在一些实施方式中，抗生素包括青霉素和链霉素。青霉素和链霉素以工作浓度100倍的浓度配置成溶液在-20℃长期保存，需要使用时按百分之一的量添加至基础培养基中。因为原代分离的细胞由于组织提取的过程中无法做到全程无菌，最后很难避免少量细菌的残留，培养体系中添加青霉素和链霉素两种抗生素可以极大降低原代培养的污染概率，同时不会对细胞的生长造成影响。青霉素和链霉素溶液是以工作浓度100倍的浓度配置成溶液在-20℃长期保存，需要使用时按百分之一的量添加至培养基中，优选地，培养体系中使用50-500U/ml的青霉素和50-500ug/ml的链霉素，此双抗浓度是常规培养原代细胞使用的浓度，根据过往的经验证实，高于此浓度会对部分种类的细胞增殖产生影响，而低于此浓度会更容易使原代分离时附带的极少量微生物污染爆发出来。
胎牛血清是细胞培养中的重要添加成分，含有多种细胞生长所需的生物活性成分，其在培养基中以高浓度存在时(10％-20％)会极大地促进间质细胞的增殖速度，同时会诱发培养中的部分原代上皮细胞发生EMT。在一些实施方式中，胎牛血清的添加量为小于2％且不小于0.5％。本发明实施例的培养体系中由于针对上皮细胞的营养需求添加了添加剂中的多种重组蛋白，所以降低了上皮细胞对血清的依赖，培养体系中血清的添加量只需要小于2％且不小于0.5％。这种低血清的含量也可以降低原代分离后间质细胞等杂细胞的增殖速度并减少EMT发生的比例的进程。
由于上皮细胞的种类和功能的多样性，一种类型的上皮培养体系无法培养所有的上皮细胞种类，上述实施例提供的配方范围可以支持多种上皮细胞的存活和增殖，包括大部分的覆盖上皮细胞、部分腺上皮细胞和生殖上皮细胞，适用范围广泛。
本发明实施例通过多种重组蛋白的组合使用，形成对上皮细胞生长和增殖形成充足和有足够特异性的营养支持，同时利用这些多种组蛋白对上皮细胞的营养支持，降低对培养体系中添加血清量的需求，而血清浓度的降低可以有效降低间质细胞等杂细胞生长速度，更利于上皮细胞获得增殖速度上的优势，进而获得生长优势，从而更容易地获得高纯度的上皮细胞，实现一种低血清条件下能够长期稳定培养多种上皮细胞的培养体系，从而解决现有方案难以获得高纯度的上皮细胞，以及长期的上皮细胞会发生EMT的问题。
以具体应用例和对比例对本发明实施例中的上皮细胞的培养体系的效果进行进一步说明。
应用例1
本发明实施例提供一种上述的培养体系在培养上皮细胞中的应用；具体地，将培养体系用于培养小鼠小肠粘膜上皮细胞，包括以下步骤：
步骤1、按下述表3的浓度配制基础培养基：
表3基础培养基的组成
Figure BDA0004061138650000081
Figure BDA0004061138650000091
步骤2、按下述表4的浓度配制添加剂、抗生素和血清：
表4基础培养基中添加剂、抗生素(双抗生素)和血清的浓度
组分名称 工作浓度
重组人表皮细胞生长因子 20ng/ml
氢化可的松 500ng/ml
重组人胰岛素 10ug/ml
人全铁转铁蛋白 10ug/ml
腺嘌呤 22ug/ml
三碘甲状腺氨酸 6pg/ml
牛脑垂体提取物 0.25％
青霉素 100U/ml
链霉素 100ug/ml
胎牛血清 0.02ml/ml
步骤3、按上述表3和表4配制培养基后，依照以下的步骤从小鼠小肠中分离小肠粘膜上皮细胞：
S1、出生1-3d的小鼠乳鼠，处死后75％酒精浸泡除菌。无菌条件下，开腹腔，分离整个小肠组织；
S2、用1×PBS(pH＝7.2)清洗分离的肠组织，洗去组织表面的血液，再将肠管沿纵向剖开、洗净小肠的内容物；
S3、将洗净的小肠组织，剪成6-8mm的肠断，转入15ml离心管中，加入5ml的原代消化液(0.1％Ⅱ型胶原酶+0.1％Ⅳ型胶原酶)，离心管转入37℃的震荡水浴锅中消化15min。
S4、消化完成后，用1ml微量移液器吹打消化完成的肠段30次左右，之后离心管静置，让肠段自然沉降60s。
S5、沉降完成后，吸取上清悬液至另一新的15ml离心管中，之后在300-400g的离心力下离心5min。
S6、离心完成后，吸弃上清，用上皮培养基重悬细胞沉淀后，转入培养瓶中，添加适量的培养基后置于二氧化碳培养箱中培养。
上述步骤中所用的培养基为通过上述步骤1和2制备得到的原代上皮细胞培养体系，完成分离后一般第二天换液去除未贴壁的死细胞，添加4ml新的原代上皮细胞培养体系继续培养2-5天，期间隔天换液，待瓶中细胞增殖至80-90％铺瓶率即得到足够量的高纯度上皮细胞，经过CK免疫荧光鉴定纯度一般在85％以上，优化流程后可高于90％。
以申请公开号为CN105647850A的专利中的上皮培养基，且同样经过上述流程分离的小鼠小肠粘膜上皮细胞作为对照组；两组细胞的生长情况如图1所示。图1中的2列图片分别为原代分离后用两种不同培养基培养的Day1-Day5的原代小鼠小肠粘膜上皮细胞；其中，a代表本申请的上皮细胞培养体系培养的原代小鼠小肠粘膜上皮细胞；b代表对照组中的上皮培养基培养的原代小鼠小肠粘膜上皮细胞。
由图1生长图片可以看出，第一天的时候，对照组中的培养基贴壁的细胞较多，但是有老化的倾向，且有少量成纤维样细胞，纯度相对较低。第三天时本申请上皮培养体系培养的细胞已经明显有更快的生长速度和统一的铺路石形态；而对照组培养的细胞出现了胞内空泡、生长细胞形态不一等问题。第五天时，本申请上皮细胞培养体系培养的细胞基本已经长满，同时有均一的上皮样的细胞形态，未有明显大量老化的细胞，而对照组培养的原代小鼠小肠粘膜上皮细胞未能有较高的铺瓶率，而且有一定比例明显发生老化的细胞存在，并且有不少长梭状的成纤维杂细胞的存在。
对上述培养的细胞进行IF免疫荧光鉴定上皮细胞的特异性表面标记CK19，结果如图2和3所示。从IF的结果可以明显看出图2的a图使用本申请中上皮细胞培养体系培养的小鼠小肠粘膜上皮细胞相较图2的b图有更高的CK19阳性率，且差异明显。说明本申请中的上皮细胞培养体系分离培养的原代上皮细胞有更高的上皮阳性率，更有利于后续的细胞实验。
应用例2
本发明实施例提供一种上述的培养体系在肠上皮屏障功能实验中的应用；具体地，将培养体系用于肠上皮屏障功能检测，包括以下步骤：
步骤1、按下述表5的浓度配制基础培养基：
表5基础培养基的组成
Figure BDA0004061138650000111
Figure BDA0004061138650000121
步骤2、按下述表6的浓度配制添加剂，抗生素和血清：
表6基础培养基中添加剂、抗生素(双抗生素)和血清的浓度
组分名称 工作浓度
重组人表皮细胞生长因子 25ng/ml
氢化可的松 300ng/ml
重组人胰岛素 5ug/ml
人全铁转铁蛋白 5ug/ml
腺嘌呤 20ug/ml
三碘甲状腺氨酸 5pg/ml
牛脑垂体提取物 0.4％
青霉素 100U/ml
链霉素 100ug/ml
胎牛血清 0.02ml/ml
步骤3、按上述表5和表6配制培养基后，依照以下的步骤进行肠上皮屏障功能实验：
实验分两组，以申请公开号为CN105647850A的专利中的上皮培养基作为对照组，分别用对照组配置的完全培养基和表5和表6浓度配置的上皮培养体系进行培养。
(1)取对数生长期的原代小鼠小肠粘膜上皮细胞，消化下来，PBS清洗后，用上述培养体系和对照组的完全培养基重悬后以1.5×105的密度，以400ul/孔的量接种于放置在24孔板中，10mm内径，0.4um孔径的杯状细胞培养皿(Millicell)中，杯外(孔板中)加入600ul对应的培养基；
(2)将上述24孔板置于二氧化碳培养箱中37℃培养7d，隔天完全换液一次；
(3)7d后镜下观察细胞生长状态，没有大面积细胞脱落既为合格的样本；
(4)将上皮细胞电阻测量仪(EVOM)的探头和电机杯用紫外和酒精灭菌后，先用空白的Millicell的检测空白组的电阻，此数据用于后续检测计算；
(5)生长了7d的两组细胞的Millicell皿，用无菌的0.12MNaCl溶液清洗两次后转入装有0.12MNaCl溶液EVOM电机杯中，加入适量的0.12MNaCl溶液使皿内外的液面平齐；
(6)从皿上插入EVOM的探头，调节探头顶端至培养平面的距离至2mm左右，测量此时各组细胞的电阻值，每孔重复测量三次。此时的电阻值减去空白组膜的电阻值即为细胞的电阻值。
a组使用的是用上述的步骤1，2配置的培养体系培养铺至Millicell的原代小鼠小肠粘膜上皮细胞；而b组使用的是对照组培养的铺至Millicell的原代小鼠小肠粘膜上皮细胞。分别培养7d后检测跨上皮细胞电阻(Trans-epitheliumelectricalresistant，TER)的电阻结果如图4所示。
结果显示a组细胞的TER在26Ω左右，明显高于b组14Ω左右，说明本申请的培养体系能够更好的增殖上皮细胞，并维持上皮细胞间的紧密连接的特性，使形成单层生长的上皮细胞有更高的TER，这更有利于获得分离的上皮细胞的后续研究。
应用例3
本发明实施例提供一种上述的培养体系在小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞外泌体分泌实验中的应用；具体地，将培养体系配合无外泌体胎牛血清用于Ⅱ型肺泡上皮细胞外泌体的收集，包括以下步骤：
步骤1、按下述表1的浓度配制基础培养基：
表7基础培养基的组成
Figure BDA0004061138650000131
Figure BDA0004061138650000141
Figure BDA0004061138650000151
步骤2、按下述表8的浓度配制添加剂，抗生素和血清：
表8基础培养基中添加剂、抗生素(双抗生素)和血清的浓度
组分名称 工作浓度
重组人表皮细胞生长因子 15ng/ml
氢化可的松 500ng/ml
重组人胰岛素 10ug/ml
人全铁转铁蛋白 10ug/ml
腺嘌呤 25ug/ml
三碘甲状腺氨酸 8pg/ml
牛脑垂体提取物 0.25％
青霉素 100U/ml
链霉素 100ug/ml
胎牛血清 0.01ml/ml
步骤3、按上述表7和表8配制培养基后，依照以下的步骤小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞外泌体分泌实验：
实验分两组，以申请公开号为CN105647850A的专利中的上皮培养基作为对照组，分别用对照组配置的完全培养基和表7和表8浓度配置的上皮培养体系进行培养。
(1)取对数生长期的原代小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞，消化下来，PBS清洗后，用上述培养体系和对照组的完全培养基重悬后以4.5×106/瓶的数量接种于T225培养瓶中，加入50ml对应的培养基培养；
(2)将上述T225培养瓶置于二氧化碳培养箱中37℃培养3d，期间不进行换液；
(3)3d后收集两组细胞的培养上清，分别置于冰上备用；
(4)冰上预冷好的培养基上清，4℃条件下3000g离心15min；
(5)离心完成后，将处沉淀外的上清转入100K的超滤管中，4000g离心30min；
(6)超滤浓缩后的剩余液体与外泌体提取试剂盒ExoQuick-TC中的提取试剂按2:1的比例进行混合，之后4℃条件下孵育15h；
(7)孵育完成后，混合液4℃条件下1500g离心30min，获取的沉淀即为纯化后的外泌体。
(8)纯化好的两组外泌体分别在铜网上完成透射电镜的制样，样品最后干燥完成后，在80kV的条件下拍摄外泌体的电镜照片以确定提取的外泌体的完整性。
(9)纯化好的两组外泌体分别加入RIPA裂解液裂解获得外泌体蛋白悬液，经过SDS-PAGE电泳和转膜后，分别用CD9、CD63、CD81的抗体鉴定外泌体蛋白的特异性(WesternBlot检测)。
(10)纯化好的两组外泌体分别用BCA定量法，确定两组培养上清获得的外泌体的量。
a组使用的是用上述的步骤1，2配置的培养体系培养铺至T225瓶的原代小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞；而b组使用的是对照组培养的铺至T225瓶的原代小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞。分别培养3d后倒置显微镜下观察两组细胞状态如图5所示；之后两组提取纯化的外泌体经过透射电镜拍摄的图像如图6所示；纯化的外泌体的CD9、CD63、CD81的特异性蛋白检测的结果如图7所示；两组外泌体的BCA定量结果如图8所示。
由两组细胞培养了3d后细胞生长图片可以看出，a组的细胞依然保持了较高的折光率，细胞立体感较好，b组的细胞有了轻微老化的现象，细胞立体感较弱。两组的透射电镜图片显示提取的外泌体均有典型100nm的直径和完整的膜结构；WesternBlot检测结果也说明两组细胞提取的外泌体特异性蛋白丰度较高，说明两组细胞上清中均提取出了高质量的外泌体。BCA定量两组提取的外泌体，a组的46ug的总量明显高于b组的30ug。说明本申请的培养体系能够更好地维持上皮细胞的高活性，并使上皮细胞能够更好地分泌有多种细胞功能的外泌体，分泌量明显高于对照组的培养体系，这更有利于获得分离的上皮细胞的后续研究。
本申请中的上皮细胞培养体系相较于对照组，大幅提高了氢化可的松的工作浓度，主要是为了抑制原代分离后杂细胞成纤维细胞的生长，因为相较上皮细胞，300-600ng/ml的氢化可的松对成纤维细胞的生长抑制效果要强很多。此外，本申请的上皮细胞培养体系未采用霍乱毒素，一方面降低了培养体系使用中的生物安全风险，由此失去的对上皮细胞生长和贴壁的促进功能通过添加牛脑垂体提取物(BPE)进行了补足，与此同时BPE的生长促进作用更好且适用的上皮细胞种类更多，使得本申请的上皮细胞培养体系可以适用于更多种类原代上皮细胞的分离和培养。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。上述各优选特征在互不冲突的情况下，可以任意组合使用。

Claims (10)

1.一种原代上皮细胞的培养体系，其特征在于，按重量百分比计，所述培养体系包括：基础培养基81.5-97.5％、胎牛血清小于2％且不小于0.5％、抗生素1-5％和添加剂0.5-2％，所述添加剂包括多种生长因子。
2.根据权利要求1所述的原代上皮细胞的培养体系，其特征在于，所述基础培养基包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、嘌呤、嘧啶、缓冲液和pH指示剂。
3.根据权利要求1所述的原代上皮细胞的培养体系，其特征在于，所述添加剂为在4℃保存时容易分解的物质，所述添加剂以工作浓度100倍的浓度配置成溶液在-20℃长期保存，使用时按百分之一的量添加至所述基础培养基中。
4.根据权利要求1所述的原代上皮细胞的培养体系，其特征在于，所述多种生长因子包括重组人表皮细胞生长因子、重组人胰岛素、人全铁转铁蛋白、三碘甲状腺氨酸和牛脑垂体提取物。
5.根据权利要求4所述的原代上皮细胞的培养体系，其特征在于，所述添加剂还包括腺嘌呤和氢化可的松。
6.根据权利要求5所述的原代上皮细胞的培养体系，其特征在于，所述添加剂中各组分在培养体系中的浓度为：重组人表皮细胞生长因子15-25ng/ml、氢化可的松300-600ng/ml、三碘甲状腺氨酸4-8pg/ml、腺嘌呤18-25ug/ml、重组人胰岛素5-10ug/ml、人全铁转铁蛋白5-10ug/ml、牛脑垂体提取物浓度为0.25-0.4％。
7.根据权利要求1所述的原代上皮细胞的培养体系，其特征在于，所述抗生素包括青霉素和链霉素。
8.根据权利要求7所述的原代上皮细胞的培养体系，其特征在于，青霉素和链霉素以工作浓度100倍的浓度配置成溶液在-20℃长期保存，使用时按百分之一的量添加至所述基础培养基中。
9.一种权利要求1-8任一项所述的培养体系在培养上皮细胞中的应用。
10.一种权利要求1-8任一项所述的培养体系在肠上皮屏障功能实验中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117070462A (zh) * 2023-08-17 2023-11-17 镜像绮点(上海)细胞技术有限公司 原代细胞的分离与纯化

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI971628A0 (fi) * 1996-04-19 1997-04-17 Nestle Sa Ihmisen, koolonin immortalisoitu epiteelisolulinja
CN105647851A (zh) * 2016-03-01 2016-06-08 赛百慷（上海）生物技术股份有限公司 一种内皮培养体系
CN105647850A (zh) * 2016-03-01 2016-06-08 赛百慷（上海）生物技术股份有限公司 一种上皮培养体系
CN107151648A (zh) * 2017-06-18 2017-09-12 广东博溪生物科技有限公司 一种黑素细胞与角质形成细胞共培养用培养基
CN107299077A (zh) * 2017-06-18 2017-10-27 广东博溪生物科技有限公司 一种牛脑垂体提取物的提取方法
CN111148829A (zh) * 2017-09-30 2020-05-12 上佳生物科技有限公司 细胞培养基
CN115466712A (zh) * 2022-09-27 2022-12-13 细新(上海)医疗科技有限公司 一种原代大血管内皮细胞的培养体系和应用
CN218778958U (zh) * 2022-12-12 2023-03-31 细新(上海)医疗科技有限公司 一种用于观察肠上皮屏障功能的实验小室

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI971628A0 (fi) * 1996-04-19 1997-04-17 Nestle Sa Ihmisen, koolonin immortalisoitu epiteelisolulinja
CN105647851A (zh) * 2016-03-01 2016-06-08 赛百慷（上海）生物技术股份有限公司 一种内皮培养体系
CN105647850A (zh) * 2016-03-01 2016-06-08 赛百慷（上海）生物技术股份有限公司 一种上皮培养体系
CN107151648A (zh) * 2017-06-18 2017-09-12 广东博溪生物科技有限公司 一种黑素细胞与角质形成细胞共培养用培养基
CN107299077A (zh) * 2017-06-18 2017-10-27 广东博溪生物科技有限公司 一种牛脑垂体提取物的提取方法
CN111148829A (zh) * 2017-09-30 2020-05-12 上佳生物科技有限公司 细胞培养基
CN115466712A (zh) * 2022-09-27 2022-12-13 细新(上海)医疗科技有限公司 一种原代大血管内皮细胞的培养体系和应用
CN218778958U (zh) * 2022-12-12 2023-03-31 细新(上海)医疗科技有限公司 一种用于观察肠上皮屏障功能的实验小室

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117070462A (zh) * 2023-08-17 2023-11-17 镜像绮点(上海)细胞技术有限公司 原代细胞的分离与纯化
CN117070462B (zh) * 2023-08-17 2024-02-23 镜像绮点(上海)细胞技术有限公司 原代细胞的分离与纯化

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