CN109528751B - miR-296及其模拟物在促进骨髓间充质干细胞成骨分化及骨形成中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了miR‑296及其模拟物在促进骨髓间充质干细胞成骨分化及骨形成中的应用。本发明通过离体实验探究miR‑296对骨髓间充质干细胞成骨分化及骨形成的调控作用。本发明通过在体实验证明了转染miR‑296能够促进新骨的形成，通过离体实验证明了miR‑296可以通过促进成骨细胞钙结节的形成和标志性酶ALP活性，以及促进成骨分化过程中重要调控转录因子Osterix、Runx2的表达来提高骨髓间充质干细胞成骨分化的能力以及促进在体骨形成。本发明的提出为治疗骨质疏松提供了新的技术手段。

Description

miR-296及其模拟物在促进骨髓间充质干细胞成骨分化及骨 形成中的应用

技术领域

本发明涉及miR-296的新的治疗用途，特别涉及miR-296及其模拟物在促进骨髓间充质干细胞成骨分化及骨形成中的应用。本发明属于医药技术领域。

背景技术

骨质疏松即骨质疏松症，是一种由多种原因引起的以单位体积内的骨量减少为特征的代谢性骨病变。该种疾病见于绝经后妇女与老年人，常表现为骨骼疼痛，骨脆性增加，容易发生骨折，对人体造成严重伤害。目前可通过饮食控制、运动以及适当补充钙剂、维生素D来改善轻度病症，而对于已有骨质疏松迹象或已发生过骨折者，常采用抗骨吸收或促进骨形成的药物来改善症状，严重者需同时辅以外科手术进行固定复位。这些传统的治疗方法在临床应用中均有一定的局限性与创伤性，并发症较多，故探究并发现一种新的治疗方式变得尤为重要。

骨髓间充质干细胞(BMSCs)是人们在哺乳动物的骨髓基质中发现的一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群。并且在骨髓基质中，存在向成骨细胞(增加骨量)及破骨细胞(促进骨吸收)分化的动态平衡体系。而骨质疏松症的发生正是因为骨髓基质中骨量的异常(即骨细胞的平衡体系被打破)而导致的，所以可通过促进骨髓基质中间充质干细胞向成骨细胞分化，增加骨密度来治疗骨质疏松。

微小RNA(MicroRNA/miRNA)是一类在进化上高度保守，长度约为22nt单链小分子非编码RNA，参与转录后的基因调控。有研究表明，其对间充质干细胞的分化过程具有重要的调控作用。我们经实验验证miR-296促进离体水平骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，并促进在体骨形成。因此，本发明的提出为治疗骨质疏松提供了新的技术手段。

发明内容

本发明的目的在于探究miR-296是否具有促进骨髓间充质干细胞向成骨分化以及在体骨形成的潜能，从而为骨质疏松的治疗提供新的技术手段。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明分别通过在体与离体实验探究miR-296对骨髓间充质干细胞成骨分化及骨形成的调控作用。首先在体实验中，体外培养的BMSCs，按实验分组转染，24h后，利用羟基磷灰石孵育细胞沉淀2h后接种于裸鼠(6周龄)后背皮下，8周后将裸鼠后背的移植物取材并进行Masson染色，结果发现转染miR-296后能够促进皮下组织中的新骨形成。其次通过离体培养C57BL/6小鼠来源的骨髓间充质干细胞(BMSCs)并转染miR-296mimic(过表达miR-296)、miR-296AMO(敲减miR-296)、mimic-NC(过表达对照组)及AMO-NC(敲减对照组)，随后利用成骨诱导培养液诱导，检测(1)成骨诱导14天，进行茜素红染色和碱性磷酸酶染色，检测miR-296对BMSCs成骨分化能力的影响；其结果显示miR-296可以通过促进成骨细胞钙结节的形成和标志性酶ALP活性，即miR-296能够提高骨髓间充质干细胞成骨分化的能力；(2)成骨诱导3天，进行Runx2免疫荧光染色，其结果显示miR-296能够促进成骨分化过程中重要调控转录因子Runx2的表达。成骨诱导7天后，采用Western blot实验技术检测成骨相关蛋白Runx2、Osterix的表达水平，其结果显示miR-296能够提高促进成骨分化过程中成骨相关蛋白Runx2、Osterix的表达水平，

因此，在上述研究的基础上，本发明提出了miR-296及其模拟物在制备促进骨髓间充质干细胞成骨分化及骨形成药物中的应用。

其中，优选的，所述的药物用于治疗骨质疏松症。

相较于现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明公开了miR-296具有促进骨髓间充质干细胞成骨分化及增加在体移植的BMSCs的骨形成的作用，为治疗骨质疏松症提供了新的技术手段。

附图说明

图1为miR-296促进BMSCs在体移植骨形成。

体外培养的BMSCs转染miR-296 mimic、miR-296 AMO、mimic-NC、AMO-NC，24h后，用羟基磷灰石孵育细胞沉淀2h后接种于裸鼠(6周龄)后背皮下，8周后将裸鼠后背的移植物取材并进行Masson染色。(A)显微镜下拍照；(B)骨形成百分率的统计图。

图2为miR-296调控骨髓间充质干细胞的成骨分化的茜素红染色结果。

在体外培养的骨髓间充质干细胞(BMSCs)中转染miR-296 mimic、miR-296 AMO、mimic-NC及AMO-NC，成骨诱导培养液成骨诱导14天，进行茜素红染色。(A)培养皿外观和显微镜下钙结节拍照；(B)吸光度法检测矿化结节的形成数量。

图3为miR-296调控骨髓间充质干细胞的成骨分化的碱性磷酸酶染色结果。

在体外培养的骨髓间充质干细胞(BMSCs)中转染miR-296 mimic、miR-296 AMO、mimic-NC及AMO-NC，成骨诱导14天后，进行碱性磷酸酶染色。(A)培养皿外观和显微镜下灰黑色颗粒或块状沉淀形成的数量图片采集；(B)吸光度法检测灰黑色颗粒或块状沉淀形成的数量。

图4为miR-296对成骨相关蛋白表达的影响。

在体外培养的骨髓间充质干细胞(BMSCs)中转染miR-296 mimic、miR-296 AMO、mimic-NC及AMO-NC，成骨诱导7天后，进行Western blot实验来检测以成骨相关蛋白Runx2、Osterix的表达水平。(A)Osterix、Runx2蛋白的表达水平；(B)Osterix、Runx2蛋白表达水平的统计图。

图5为miR-296促进Runx2表达。

在体外培养的骨髓间充质干细胞(BMSCs)中转染miR-296 mimic、miR-296 AMO、mimic-NC及AMO-NC，成骨诱导3天后，进行Runx2免疫荧光染色。(A)显微镜下拍照；(B)Runx2阳性细胞数目百分率统计图。

具体实施方式

下面结合具体实例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例所涉及的材料及其来源：

1.主要试剂、抗体：茜素红染色液、碱性磷酸酶染色试剂、羟基磷灰石、Runx2

2.主要仪器：正置、倒置显微镜

3.骨髓间充质干细胞购于赛业公司。

4.miR-296 mimic、mimic-NC、miR-296 AMO、AMO-NC的具体序列miR-296 mimic：

正义链-GAGGGUUGGGUGGAGGCUCUCC；

反义链-AGAGCCUCCACCCAACCCUCUU；

miR-296 AMO：

GGAGAGCCUCCACCCAACCCUC；

mimic-NC：

正义链-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT；

反义链ACGUGAACAGUUCGGAGAATT；

AMO-NC：

CAGUACUUUUGUGUAGUACAA(上海吉玛公司)。

实施例1：miR-296促进BMSCs在体移植骨形成

1实验方法

1.1体外转染miR-296的BMSCs经新型生物材料羟基磷灰石皮下移植8周后用Masson染色观测转染miR-296对移植物组织中骨形成的影响

1.2实验分组设计：实验分为4组：实验按照转染对照组和处理组分为以下四组:miR-296 mimic、mimic-NC、miR-296 AMO、AMO-NC

1.3实验检测项目：Masson染色

2观察结果

如图1所示，与mimic-NC相比，miR-296 mimic组移植部位骨形成明显增多，相反，miR-296 AMO组，移植部位骨形成明显降低。

实施例2：miR-296调控骨髓间充质干细胞的成骨分化

1实验方法

1.1茜素红染色检测成骨细胞形成的钙结节的多少和碱性磷酸酶染色间接反映成骨细胞的标志性酶ALP活性

1.2实验分组设计：实验按照转染对照组和处理组分为以下四组:miR-296 mimic、mimic-NC、miR-296 AMO、AMO-NC。

1.3转染方法：将骨髓间充质干细胞接种于孔板中，待细胞汇合度达到大约40％时进行转染。弃净孔板中的培养液，更换新鲜的无血清OPTI-DMEM培养基，饥饿细胞2小时，2小时后开始转染。将microRNA的mimic和AMO与转染试剂X-treme充分混合并加入孔板中，使得microRNA的mimic和mimic-NC的终浓度为50nM，而AMO和AMO-NC的终浓度为100nM，转染6小时后更换新鲜的含有10％血清的培养液，转染24小时后进行后续实验。

1.4成骨诱导方法：

待细胞转染microRNA后，观察细胞汇合度，待细胞汇合度达到90％时更换成骨诱导培养液，每三天换一次液，诱导14天。

成骨诱导培养液成分：

小鼠骨髓间质干细胞成骨诱导分化基础培养基175mL

小鼠骨髓间质干细胞成骨诱导分化培养基专用血清20mL

青霉素-链霉素双抗2mL

谷氨酰胺2mL

抗坏血酸400μL

β-甘油磷酸钠2mL

地塞米松20μL

1.5实验检测项目：茜素红染色、碱性磷酸酶染色

2观察结果

成骨诱导培养液成骨诱导14天，进行茜素红、碱性磷酸酶染色。如图2所示，与mimic-NC组相比，miR-296 mimic组茜素红染色可见明显的特征性钙结节形成，表现出成骨细胞特性，即促进了骨髓间充质干细胞成骨分化的能力；相反，miR-296 AMO组茜素红染色可见成骨细胞形成的钙结节形成减少。如图3所示，与mimic-NC相比，miR-296 mimic组碱性磷酸酶染色可见较多的灰黑色颗粒或块状沉淀形成，反映出成骨细胞的标志性酶ALP活性的增强；相反，miR-296 AMO组的碱性磷酸酶染色可见灰黑色颗粒或块状沉淀形成减少。

实施例3：miR-296促进成骨相关蛋白的表达水平

1实验方法

1.1蛋白质免疫印迹(Western blot)实验检测BMSCs经转染和成骨诱导7天后，成骨相关蛋白的表达水平

1.2实验分组设计：实验分为4组：实验按照转染对照组和处理组分为以下四组:miR-296 mimic、mimic-NC、miR-296 AMO、AMO-NC

1.3转染方法：同实施例1

1.4成骨诱导方法：同实施例1

1.5实验检测项目：蛋白质免疫印迹(Western blot)实验

2观察结果

成骨诱导7天后，进行Western blot实验来检测以成骨相关蛋白Runx2、Osterix的表达水平。如图4所示，与mimic-NC相比，miR-296 mimic组Osterix、Runx2的表达水平明显增高，相反，miR-296 AMO组成骨相关蛋白Osterix、Runx2的表达水平明显降低。

实施例4：miR-296促进成骨分化过程中重要调控转录因子Runx2的表达

1实验方法

1.1免疫荧光染色检测成骨分化过程中重要调控转录因子Runx2的表达

1.2实验分组设计：实验分为4组：实验按照转染对照组和处理组分为以下四组:miR-296 mimic、mimic-NC、miR-296 AMO、AMO-NC。

1.3转染方法：同实施例1

1.4成骨诱导方法：同实施例1

1.5实验检测项目：Runx2免疫荧光染色

2.数据处理

本发明的结果采用标准差±标准误来表示。用Graphpad prism 5.0进行作图，各组之间的相关性用T检验来衡量。

3观察结果

成骨诱导3天后，进行Runx2免疫荧光染色。如图5所示，与miR-296 mimic对照组NC相比，转染了miR-296 mimic组Runx2阳性细胞率明显增高，相反，转染miR-296 AMO组Runx2阳性细胞率明显低于对照组。说明miR-296促进成骨分化过程中重要调控转录因子Runx2的表达。

4.结论

miR-296促进离体水平骨髓间充质干细胞成骨分化，及促进其在体移植的骨形成，提高骨髓间充质干细胞治疗骨质疏松的临床应用潜能。

Claims (1)

1.miR-296在制备用于治疗骨质疏松症药物中的应用。

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