CN108004311B - 长链非编码rna nonmmut002009及其过表达质粒在诊断和治疗骨骼系统疾病中的应用 - Google Patents

长链非编码rna nonmmut002009及其过表达质粒在诊断和治疗骨骼系统疾病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种长链非编码RNA NONMMUT002009及其过表达质粒在诊断和治疗骨骼系统疾病中的应用，长链非编码RNA NONMMUT002009可用于制备诊断骨骼系统疾病药物中；长链非编码RNA NONMMUT002009过表达质粒可用于治疗诊断骨骼系统疾病药物中，长链非编码RNA NONMMUT002009过表达质粒可与miR‑139‑3p特异性结合，并抑制miR‑139‑3p的表达，从而达到治疗骨骼系统疾病的目的。骨骼系统疾病包括骨质疏松、炎症性骨质丢失、关节退行性变或股骨头坏死疾病等。

Description

长链非编码RNA NONMMUT002009及其过表达质粒在诊断和治 疗骨骼系统疾病中的应用
技术领域
本发明涉及分子生物医学领域，具体涉及长链非编码RNA NONMMUT 002009及其过表达质粒在诊断和治疗骨骼系统疾病中的应用。
背景技术
骨质疏松是一种因骨量降低，骨组织微结构破坏，骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性骨病。随着世界人口老龄化趋势日益严重，骨质疏松的发病率越来越高。据第六次人口普查显示，我国65岁以上的老年人已占总人口的7.5％，预计到2020年我国骨质疏松患者将超过2.5亿，占全世界骨质疏松患者的一半以上。世界卫生组织已将骨质疏松症与糖尿病、心血管病共同列为危害老年人健康的三大杀手。
成骨细胞是骨形成的基本功能单位，在骨不断的自我更新过程中是重要的功能细胞。成骨细胞主导的骨形成与破骨细胞主导的骨吸收两者间保持的动态平衡是骨量维持正常的基础。成骨细胞来源于造血干细胞分化而成的骨髓间充质干细胞，成熟的成骨细胞进入分泌骨质阶段时就不再进行细胞分裂，增殖达到一定数量的成骨细胞即进入分化阶段，经过分化成熟才能进行矿化作用。
长链非编码RNA是一类转录本长度大于200bp的非编码RNA，可作为人类基因组中一类重要的调控分子通过多种方式发挥其生物学功能，其在成骨分化过程中也起着重要调控作用。长链非编码RNA NONMMUT002009分子位于小鼠1号染色体chr1：90837274-90839133，对于其在成骨细胞分化和骨形成过程中的作用，以及其在骨质疏松症、炎症性骨质丢失等骨骼系统疾病的诊断和治疗中的作用尚未见研究和报道。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种长链非编码RNANONMMUT002009及其过表达质粒在诊断和治疗骨骼系统疾病中的应用，长链非编码RNANONMMUT002009可用于制备诊断骨骼系统疾病药物中；长链非编码RNA NONMMUT002009过表达质粒可用于治疗诊断骨骼系统疾病药物中，长链非编码RNA NONMMUT002009过表达质粒可与miR-139-3p特异性结合，并抑制miR-139-3p的表达，从而达到治疗骨骼系统疾病的目的。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。
(一)长链非编码RNA NONMMUT002009在制备诊断骨骼系统疾病药物中的应用。
优选的，所述长链非编码RNA NONMMUT002009的基因组碱基序列为SEQ No.1。
优选的，所述骨骼系统疾病为骨质疏松、炎症性骨质丢失、关节退行性变或股骨头坏死疾病。
(二)长链非编码RNA NONMMUT002009在制备诊断骨质疏松症药物中的应用。
优选的，所述长链非编码RNA NONMMUT002009的基因组碱基序列为SEQ No.1。
优选的，所述长链非编码RNA NONMMUT002009的上游引物序列为5’-GCAAAGTTGTGCCATCCAG-3’；所述长链非编码RNA NONMMUT002009的下游引物序列为5’-CCACTTAGCGA TAAAAAGAAATCT-3’。
(三)长链非编码RNA NONMMUT002009过表达质粒在制备治疗骨骼系统疾病药物中的应用。
优选的，所述骨骼系统疾病为骨质疏松、炎症性骨质丢失、关节退行性变或股骨头坏死疾病。
(四)长链非编码RNA NONMMUT002009过表达质粒在制备治疗骨质疏松症药物中的应用。
优选的，所述RNA NONMMUT002009过表达质粒可与miR-139-3p特异性结合，并抑制所述miR-139-3p的表达。
上述(一)、(二)、(三)和(四)中药物的应用中，所述药物包括药学上可接受的一种或多种载体，所述载体包含稀释剂、粘合剂、吸附载体、填充剂和崩解剂；所述药物还包括添加剂，所述添加剂包含稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂和表面活性剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的长链非编码RNA NONMMUT002009及其过表达质粒在制备治疗骨骼系统疾病药物中的应用，长链非编码RNA NONMMUT002009可用于制备诊断骨骼系统疾病药物中；长链非编码RNA NONMMUT002009过表达质粒可用于治疗诊断骨骼系统疾病药物中，长链非编码RNA NONMMUT002009过表达质粒可与miR-139-3p特异性结合，并抑制miR-139-3p的表达，从而达到治疗骨骼系统疾病的目的。骨骼系统疾病包括骨质疏松、炎症性骨质丢失、关节退行性变或股骨头坏死疾病等。
附图说明
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1是本发明的qPCR技术检测NONMMUT002009在后肢去负荷骨质疏松小鼠模型骨组织中的表达结果图；
图2是本发明的NONMMUT002009过表达质粒在小鼠前成骨细胞MC3T3-E1中的表达结果图。
图3是本发明的NONMMUT002009过表达质粒对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化标志基因Runx2、ALP的表达结果图；其中，a图为NONMMUT002009过表达质粒对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化标志基因Runx2的表达结果图；b图为NONMMUT002009过表达质粒对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化标志基因ALP的表达结果图；
图4是本发明利用茜素红染色技术检测转染NONMMUT002009过表达质粒对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1矿化结节形成的调控结果图；
图5是本发明的NONMMUT002009过表达质粒对miR-139-3p调控表达图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域的技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。
实施例1
长链非编码RNA NONMMUT002009在诊断骨质疏松症中的应用，包括以下步骤：
步骤1，设计并制备NONMMUT002009的特异性引物，RNA ONMMUT 002009的特异性引物序列见表1；其中，RNA ONMMUT002009的基因组碱基序列为：
GCCCAGTGCCATCCTCTCTCCTCACTAACTTTAGCAATCAGGAAATATGGGGAGCTGTTTGTGAGCTGGAAGTGACCAGGGAAAGCCTCACTGGGAGCCATCTTTGTGGAGCCTCCCCCCACCATGTGCTCTGTATCCCCGATTTCCACAGTCCCAGTGCTTTGGGAATTGTCCGCTGGAAGGAAGAGCTCATGGGCCACTTTAATTTCAGAATTGACCAGCAGCTGGAGATGACTCAGGTCTCAGGGGGAACTATTCCAGGAAACTGGCTTTTCACTTCTGGAACCTTCTCTAGTTGAGTCAGCAACCAGCACTGGCATCTGGAGTCAGCTCCACTTAAACCCACCTATGGCCTTACAGGGAATGTGGAATGTCAGAGACCTGCTCAGTCAGACGCAGTGGCTGCAGATATAGCACAGGAGTCCGGGGATCCCTGCCAGGGCACACAGTTTTGTTTTACTTCTAAGTAGTAACTCTAGGAGAGGTTACTGGGAGAGACAGTAAGGAGGTAGACAAACTGATACAAGATCTGTCTACTTAGGATGAGTTTTTCTCTCACACCTGAAAGCCAGCAAAGACGGTAACTTTTCCTTGGGCTGTGAGATGCCGTGGCCGCTCGCTTTCACGATTCTGTGGCGGCACACATGGTTTTCAGAGGCTGGTGGAACTCGAGTCCCTTGCCAAGAAAGGAAGAAATGGGATAAATGTGAGACGTGCCGAGAGCTAGAGCCAACTGTGGCCTGTGTCGTGGGCTGGGAAGGAGTGGCTGCTTGCATAATTGCTTGTGAAGCAGTTTGTAGCAGGCTCTCTCCCTGACTGTTAAAACCCAGGCAGTCTCTGCCTAATGGTTATAATTAGCTGGGGAAACGGGCACAGCGTCTCCTCATCTGGTTTCCACACAGTTCATAGAATGCCTTTTATGTTCCATGGTGGCCTCTGGTACGACAGATTCAGAGCTTTCTGCTTCATGGTTATTTTTGTGTATCTTAGGAGTATATTTTCAAGCCCGTTTCTAAATATCTCGACGATTAGTCTGGAGTTGGCTCCTGCTCCCtctttagaggacaggggcttatgtagcccaggatggcccctctaactcaccatgtagctttctcaccttgaattccggaaattcttgcctctgctttccgagtgctgCTTCTAGAGAAGGAAAGAAGCTAACCCCCGAGGGGCTTAGCATGCGTCTGAGGGGCTCCCTGTCTTCTCTGCGGAGGTCTCACTGTGAGAGGTGGCCACACCCTCTCTCCAACGTCTCAGTAGCATCCCATGATGGCTGCTAAGCATCTGGGCATTGCTCTGTGAGGTCCCACCAGGAGGAGCCAGCACCCTCCCGTGCTGGTAGGTGACAAGGAGGGGGGTTGCTCATGTAGGATCATATAAGATCAGAAATGTTGAAAGAATTTGTGGTCACAGGAAAGATGTAGATTCAAATTGTTGTTGTCGAGCACTGTCACAGAACAAAAATGCAAGGCAATGGCTGTCAATCAAACAGAACAATCTCAATTTCAGATGCGTTTCTTTAAAAGGTGTGTCTCAAATCATTTGCTTTTGAAGGTTTCTGCAAAGTTGTGCCATCCAGTGCCATAGTAAACCCCACCCTCTTCTCTTAGGCCTCACCATAGGATCTCTGCAACTAAGGAGTCTGTGAGAGGCAATGAGGGAAAGATTTCTTTTTATCGCTAAGTGGTGGCTtcccagcctgtgggaggcagaggcaggtgcgtctctgagtttaaggccagcctggtctacagagaaaattccaggacagccagggctacatagagaaaccctgtctggaaaaacaaaaTTACCTCCcaaacaaacaaaccaac。
步骤2，建立HU后肢去负荷骨质疏松小鼠模型
将6月龄雄性C57BL/6J小鼠用小鼠固定器固定，露出尾部并均匀涂抹安息香酊止痒并涂抹松香，将尾部缠上胶布并连接一小环，不要缠得过紧，露出尾尖以观察血运。之后将小鼠放进尾吊笼，尾部通过小环挂在横杆上，调整横杆高度使小鼠后肢完全离地，并使其前肢着地可以自由活动，并能进食、饮水，每天观察小鼠情况，确保其后肢完全离地，尾吊21天后处死小鼠，收集小鼠股骨样本。
步骤3，提取小鼠股骨样本RNA，包含以下步骤：
子步骤3.1，取小鼠股骨样本，将肌肉剥离干净，得骨组织；将所得骨组织置于研钵中，向其中边加液氮边迅速研磨，直至将骨组织完全磨为粉末，得骨组织粉末，备用。
子步骤3.2，RNA提取
1)将骨组织粉末和RNAiso加入匀浆器中，骨组织粉末和RNAiso的比例为(50-100)mg：1ml，匀浆，将匀浆后所得的上清液移入1.5ml无RNA酶的EP管中。
2)在RNAiso中加入20％体积的三氯甲烷，充分震荡混匀约30s；冰上静置5min后，在4℃下离心15min，转速为12000rpm，使用无RNA酶枪头将EP管中离心后的上清液移入另一无酶EP管中，冰上静置。
3)向另一无酶EP管的上清液中加入等体积的异丙醇，充分震荡混匀，在4℃下离心15min，转速为12000rpm，弃去上清液，保留沉淀物。
4)向无酶EP管的沉淀物中加入足量预冷的70％DEPC水配制的酒精，震荡混匀，洗涤沉淀，在4℃离心10min，转速为7500rpm，弃去上清液，倒扣无酶EP管使无酶EP管内酒精充分挥发，根据所提RNA量加入15-30μL的DEPC水，接着进行充分地吹打与静置，使RNA充分溶解。
5)使用紫外分光光度计分别检测RNA在260nm与280nm处的吸光度值OD260和OD280，OD260/OD280的比值在1.8-2.0之间，则说明RNA的纯度较好可用于后续试验。
步骤4，利用qPCR技术检测NONMMUT002009在后肢去负荷骨质疏松小鼠模型骨组织样本中的表达水平：
1)cDNA合成：使用TAKARA反转录试剂盒，先将提取的小鼠股骨样本RNA反转录为cDNA，反转录条件为：37℃15min；85℃5min。
2)qPCR检测：取cDNA为模板，以GAPDH为内参，采用qPCR检测NONMMUT002009基因在后肢去负荷骨质疏松小鼠模型骨组织样本中的表达水平，qPCR反应条件为：95℃30s，变性；95℃5s；60℃30s，40个循环；其中，NONMMUT002009与GAPDH引物序列如表1所示：
表1 MICRORNA序列
Figure GDA0001554712660000081
qPCR检测NONMMUT002009在后肢去负荷骨质疏松小鼠模型骨组织样本中的表达水平结果如图1所示，结果表明NONMMUT002009在后肢去负荷骨质疏松小鼠模型骨组织样本中表达降低，说明NONMMUT002009在骨组织中的表达量与骨质疏松相关，NONMMUT002009可用于制备诊断骨质疏松症等骨骼系统疾病的药物中。
实施例2
长链非编码RNA NONMMUT002009过表达质粒在治疗骨质疏松疾病中的应用，包括以下步骤：
步骤1，设计并制备NONMMUT002009过表达质粒
根据NONMMUT002009基因序列，克隆目的基因，以pEX-3为载体、XhoI/EcoRI为克隆位点构建重组表达载体；使用重组载体转染细胞，挑选出阳性克隆菌群并进行鉴定；抽提足够量NONMMUT002009过表达质粒，保存于-20℃。
步骤2，转染
试验分为两组，分别为：(1)转染对照组：转染空质粒载体；(2)转染过表达质粒组：转染NONMMUT002009过表达质粒。
每孔的配置，取前成骨细胞MC3T3-E1，以1×106/孔的细胞数接种于6孔板中，2mL含10％胎牛血清、1％双抗，DMEM细胞培养基；24小时内细胞汇合约达到60-70％；在250μL的DMEM无血清培养基加入20μmol/L mimic 5μL或inhibitor10μL柔和混匀；用250μL无血清的DMEM稀释5μL lipofectamin 2000试剂，轻轻混匀，室温放置5分钟；将稀释好的microRNA和lipofectamin 2000试剂混合，轻柔混匀，室温放置20分钟，以便形成microRNA/lipofectamin 复合物；将500μL复合物加到含有细胞的培养板孔内，补加1.5ml的DMEM无血清培养基，来回轻柔摇晃细胞培养板。将细胞在37℃的CO2培养箱中孵育6小时后，更换培养基，继续孵育；待48h后，进行转染后的其它检测步骤。
步骤3，提取转染后小鼠MC3T3-E1细胞的RNA
在含有转染细胞的培养板每孔中加入RNAiso，待细胞充分裂解后，转移到新的1.5ml EP管，其余提取步骤同实施例1中的长链非编码RNA NONMMUT 002009在骨质疏松疾病中的应用中RNA的提取。
步骤4，qPCR检测miR-139-3p表达水平，具体检测步骤参考实施例1中长链非编码RNA NONMMUT 002009在骨质疏松疾病中的应用中qPCR技术检测方法。
试验结果如图2所示，结果表明NONMMUT002009过表达质粒可有效增加NONMMUT002009在小鼠前成骨细胞MC3T3-E1中的表达。
实施例3
采用上述NONMMUT002009过表达质粒对前成骨细胞中成骨分化标志基因Runx2和ALP的表达水平进行试验分析，具体如下：
前成骨细胞的分组、转染及RNA提取同实施例2，接着取各组的cDNA为模板，以GAPDH作为内参，采用qPCR检测成骨分化标志基因Runx2和ALP的表达。所用GAPDH、Runx2和ALP引物序列如表2所示：
表2 GAPDH、Runx2和ALP引物序列
Figure GDA0001554712660000101
试验结果如图3所示，结果表明，NONMMUT002009过表达质粒可有效促进MC3T3-E1成骨分化标志基因Runx2、ALP的表达，表明NONMMUT002009过表达质粒可作为治疗骨质疏松症等骨骼系统疾病的药物靶点。
实施例4
采用NONMMUT002009过表达质粒对前成骨细胞的矿化功能进行试验分析，具体如下：
茜素红染色及其半定量检测：
前成骨细胞的分组同实施例2，将细胞接种于12孔板，细胞汇合约达到60-70％时进行相应转染处理。转染完成后更换为成骨诱导液对细胞继续培养，每两天换液一次。在培养第7天时对各组细胞再次进行转染处理，之后继续诱导培养。在第一次转染后第21天进行茜素红染色，首先移弃原有培养基，用DPBS对细胞轻轻漂洗3遍。每孔加入足量预冷的70％酒精固定15min，而后双蒸水轻柔漂洗3次。之后每孔加入300μL配好的茜素红染液(40mM)，室温孵育15min，双蒸水轻柔地漂洗3次。加入足量的DPBS进行孵育，室温下静置15min，而后将液体吸干即可观察红色结节，红色结节的结果如图4所示。
由图4可知，NONMMUT002009过表达质粒可有效促进成骨细胞矿化结节的形成，表明NONMMUT002009可作为治疗骨质疏松症等骨骼系统疾病药物作用的靶点。
实施例5
利用生物信息学预测NONMMUT002009的结合位点，通过RegRNA2.0数据库分析，预测得到NONMMUT002009可与miR-139-3p结合，如表3所示。
表3
Figure GDA0001554712660000111
实施例6
利用qPCR检测NONMMUT002009与miR-139-3p是否可以结合，具体如下：
(1)设计并制备miR-139-3p的特异性引物，miR-139-3p的特异性引物序列为:5’-GCGGCCCTGTTGGAGAAAAA-3’；
(2)取前成骨细胞MC3T3-E1，以1×106/孔的细胞数接种于6孔板中，转染48h后(实验分组及转染方法同实施例2)，提取总RNA。使用TAKARA反转录试剂盒，先将提取的RNA反转录为cDNA，反转录条件为：37℃1h；85℃5min。取各组的cDNA为模板，以U6为内参，采用qPCR检测miR-139-3p基因在骨质疏松模型骨组织样本中的表达量。qPCR反应条件为：95℃30s，变性；95℃5s；60℃30s，40个循环。
试验结果如图5所示，结果表明，NONMMUT002009可以特异性结合miR-139-3p，并抑制miR-139-3p的表达。
上述试验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS统计软件来进行统计分析的，两组之间的差异采用t检验，认为当*P<0.05时具有统计学意义。
NONMMUT002009及其过表达质粒可用于制备诊断和治疗骨骼系统疾病的药物。其中，骨骼系统疾病为骨质疏松、炎症性骨质丢失、关节退行性变或股骨头坏死等；药物包括药学上可接受的一种或多种载体，包括但不限于稀释剂、粘合剂、吸附载体、填充剂、崩解剂等；药物还包括添加剂，添加剂包含稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂。
虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军第四军医大学
<120> 长链非编码RNA
NONMMUT002009及其过表达质粒在诊断和治疗骨骼系统疾病中的应用
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<160> 1
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<210> 1
<211> 1859
<212> DNA
<213> 小鼠种（Mus musculus）
<400> 1
gcccagtgcc atcctctctc ctcactaact ttagcaatca ggaaatatgg ggagctgttt 60
gtgagctgga agtgaccagg gaaagcctca ctgggagcca tctttgtgga gcctcccccc 120
accatgtgct ctgtatcccc gatttccaca gtcccagtgc tttgggaatt gtccgctgga 180
aggaagagct catgggccac tttaatttca gaattgacca gcagctggag atgactcagg 240
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agaggttact gggagagaca gtaaggaggt agacaaactg atacaagatc tgtctactta 540
ggatgagttt ttctctcaca cctgaaagcc agcaaagacg gtaacttttc cttgggctgt 600
gagatgccgt ggccgctcgc tttcacgatt ctgtggcggc acacatggtt ttcagaggct 660
ggtggaactc gagtcccttg ccaagaaagg aagaaatggg ataaatgtga gacgtgccga 720
gagctagagc caactgtggc ctgtgtcgtg ggctgggaag gagtggctgc ttgcataatt 780
gcttgtgaag cagtttgtag caggctctct ccctgactgt taaaacccag gcagtctctg 840
cctaatggtt ataattagct ggggaaacgg gcacagcgtc tcctcatctg gtttccacac 900
agttcataga atgcctttta tgttccatgg tggcctctgg tacgacagat tcagagcttt 960
ctgcttcatg gttatttttg tgtatcttag gagtatattt tcaagcccgt ttctaaatat 1020
ctcgacgatt agtctggagt tggctcctgc tccctcttta gaggacaggg gcttatgtag 1080
cccaggatgg cccctctaac tcaccatgta gctttctcac cttgaattcc ggaaattctt 1140
gcctctgctt tccgagtgct gcttctagag aaggaaagaa gctaaccccc gaggggctta 1200
gcatgcgtct gaggggctcc ctgtcttctc tgcggaggtc tcactgtgag aggtggccac 1260
accctctctc caacgtctca gtagcatccc atgatggctg ctaagcatct gggcattgct 1320
ctgtgaggtc ccaccaggag gagccagcac cctcccgtgc tggtaggtga caaggagggg 1380
ggttgctcat gtaggatcat ataagatcag aaatgttgaa agaatttgtg gtcacaggaa 1440
agatgtagat tcaaattgtt gttgtcgagc actgtcacag aacaaaaatg caaggcaatg 1500
gctgtcaatc aaacagaaca atctcaattt cagatgcgtt tctttaaaag gtgtgtctca 1560
aatcatttgc ttttgaaggt ttctgcaaag ttgtgccatc cagtgccata gtaaacccca 1620
ccctcttctc ttaggcctca ccataggatc tctgcaacta aggagtctgt gagaggcaat 1680
gagggaaaga tttcttttta tcgctaagtg gtggcttccc agcctgtggg aggcagaggc 1740
aggtgcgtct ctgagtttaa ggccagcctg gtctacagag aaaattccag gacagccagg 1800
gctacataga gaaaccctgt ctggaaaaac aaaattacct cccaaacaaa caaaccaac 1859

Claims (2)

1.扩增长链非编码RNA NONMMUT002009的引物对在制备诊断骨质疏松症试剂中的应用，其特征在于，所述长链非编码RNA NONMMUT002009的基因组碱基序列为SEQ No.1；
所述长链非编码RNA NONMMUT002009的上游引物序列为5’-GCAAAGTTGTGCCATCCAG-3’；
所述长链非编码RNA NONMMUT002009的下游引物序列为5’-CCACTTAGCGATAAAAAGAAATCT-3’。
2.长链非编码RNA NONMMUT002009过表达质粒在制备治疗骨质疏松疾病药物中的应用。
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