TWI841414B - 包含外泌體及生物巨分子之組合物、包含其的醫藥組成物及其用途 - Google Patents

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連文瑜
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Abstract

本發明提供一種組合物，其包含一外泌體及一生物巨分子。本發明之組合物可用於治療、預防或減緩發炎性疾病。本發明進一步提供包含其的醫藥組成物及其用途。

Description

包含外泌體及生物巨分子之組合物、包含其的醫藥組成物及其用途
本發明涉及一種可用於治療、預防或減緩發炎性疾病的組合物，另提供包含所述組合物的醫藥組成物及所述組合物的用途。
發炎反應是指生物組織受到外傷或病原性感染等刺激後，產生的一連串生理反應，包括紅腫、發熱、疼痛等。由於發炎反應是生物體對外界病原體的反應之一，屬於一種免疫反應，因此對生物體是有益的。然而若長期處於發炎的狀態，亦即「慢性發炎」，可能會引起慢性發炎性疾病，如：花粉症、牙周炎、類風濕性關節炎等。一般而言，慢性發炎大概可能維持數月至好幾年；相對的，急性發炎則是組織或器官因為有外來刺激而產生立即的反應，且發生在數分鐘到數天等較短的時間之內。
細胞激素與免疫調節相關，已知有多種細胞激素會參與發炎反應，其中包括介白素-1β (interleukin-1β，IL-1β)，這是一種會促進發炎的細胞激素，與發炎性疾病和自身免疫性疾病有關。近年來，IL-1β已成為一發炎性疾病的治療標的。
發炎性疾病一般會對病患生活品質造成嚴重影響，因此目前仍迫切需要開發一種能夠有效治療發炎性疾病的新藥物。
為達前述目的，本發明提供一種組合物，其包含一外泌體及一生物巨分子，且能有效治療、預防或減緩發炎性疾病。
較佳的，所述生物巨分子為多醣體、胜肽、蛋白質、信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)、小分子干擾核糖核酸(small interfering RNA，siRNA)或小分子核糖核酸(microRNA，miRNA)。
較佳的，所述蛋白質為類胰島素生長因子(Insulin Like Growth Factor，IGF)或沉默交配型訊息調節因子2同源蛋白(silent mating type information regulation 2 homolog，SIRT)。
較佳的，所述類胰島素生長因子為IGF-1。
較佳的，所述沉默交配型訊息調節因子2同源蛋白為SIRT-1、SIRT-2或SIRT-6。
較佳的，所述外泌體是分泌自免疫細胞、神經元細胞、上皮細胞、內皮細胞、胚胎細胞或間質幹細胞。
較佳的，所述間質幹細胞是來自臍帶、脂肪細胞、胎盤組織、牙髓或骨髓。
為達前述目的，本發明另外提供一種醫藥組成物，其包含前述組合物及藥學上可接受之載劑。
較佳的，所述醫藥組成物之劑型為非經腸道的劑型。更佳的，所述非經腸道的劑型為注射劑型或外用液劑。依據本發明，所述注射劑型可為針劑劑型。
為達前述目的，本發明另外提供一種前述組合物之用途，其係用於製備治療、預防或減緩發炎性疾病之藥物。
較佳的，所述發炎性疾病為急性發炎疾病與慢性發炎疾病。
較佳的，所述發炎性疾病為蕁麻疹性血管炎、化膿性關節炎、復發性多軟骨炎、類風濕性關節炎、痛風(尿酸結晶關節炎)或骨關節炎等。
為達前述目的，本發明另外提供一種前述組合物之用途，其係用於製備促進局部傷口癒合之藥物。
較佳的，所述藥物的給藥途徑為患部投予或靜脈注射。
本發明之組合物可以降低IL-1β誘導軟骨細胞發炎之MMP-13表現量，進而治療、預防或減緩發炎性疾病。
以下配合圖式及本發明之製備例及實驗例，進一步闡述本發明為達成預定發明目的所採取的技術手段。
製備例 1 SW1353 人類軟骨細胞株之培養
將2×10 5個SW1353人類軟骨細胞(以下簡稱SW1353細胞)接種於3.5公分(cm)培養皿或將1×10 6的SW1353細胞接種於10 cm培養皿，以添加10%胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)及1%盤尼西林-鏈黴素(penecillin-streptomycin)的杜氏改良培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)作為基礎培養基，並將培養皿靜置於37°C、5% 二氧化碳(CO 2)之培養箱內培養。
製備例 2 外泌體之製備
將分離自臍帶之間質幹細胞培養於完全培養基，其內含α-MEM培養基、5-10%人類血小板裂解液、1%L-麩醯胺酸(L-glutamine)、1%非必要胺基酸(non-essential amino acids)、1%丙酮酸鈉(sodium pyruvate)、1%盤尼西林-鏈黴素(penecillin-streptomycin)。靜置於37°C、5% CO 2之培養箱內生長，待細胞生長至80%至90%的培養皿滿度時，將培養基更換為無其他添加物的α-MEM培養基，並將間質幹細胞繼續培養48小時，以誘導外泌體釋放，再以濃縮過濾方式對間質幹細胞培養基樣本進行離心，以取得間質幹細胞之外泌體。使用奈米粒子追蹤分析儀透過CD9、CD63、CD81標記外泌體並分析樣本中外泌體數目，以供後續實施例使用。
實施例 1 以外泌體處理經誘導發炎之 SW1353 細胞
將製備例1的SW1353細胞培養一天後，於前述無其他添加物的α-MEM培養基，添加10 ng/ml IL-1β以誘導發炎反應指標；或在添加前述IL-1β後再立即進行下列處理：分別添加製備例2的20×10 8、50×10 8、100×10 8顆的外泌體處理24小時；或添加蛋白質：IGF-1、SIRT-1、SIRT-2或SIRT-6處理，使每一處理組中培養基的各蛋白質濃度分別為100 ng/ml後處理24小時；或添加前述IGF-1、SIRT-1、SIRT-2或SIRT-6時也添加製備例2的20×10 8、50×10 8的外泌體處理24小時。在IL-1β誘導後，各處理組別分別為：20×10 8顆外泌體、50×10 8顆外泌體、100×10 8顆外泌體、IGF-1、SIRT-1、SIRT-2、SIRT-6、20×10 8顆外泌體+IGF-1、20×10 8顆外泌體+SIRT-1、20×10 8顆外泌體+SIRT-2、20×10 8顆外泌體+SIRT-6、50×10 8顆外泌體+IGF-1、50×10 8顆外泌體+SIRT-1、50×10 8顆外泌體+SIRT-2、50×10 8顆外泌體+SIRT-6。另外有對照組為未經任何處理的SW1353細胞，以及IL-1β組為僅經過IL-1β誘導之SW1353細胞。將各組別之SW1353細胞萃取全RNA後以即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)定出軟骨細胞中人類基質金屬蛋白酵素-13 (human Matrix Metalloproteinase，hMMP-13)之相對基因表現，並以管家基因(housekeeping gene)GAPDH作為基因表現量之標準。hMMP-13表現量為IL-1β誘導之發炎反應、骨關節炎反應指標，目前已有研究指出hMMP-13是發炎性疾病、關節炎病程發展的關鍵酵素，而會進一步導致細胞受損。
其中，SW1353細胞的全RNA萃取係以如下步驟進行：製備之前，先拍攝細胞影像紀錄，再以PBS溶液清洗10 cm培養皿中的細胞，接著加入300微升RNA裂解緩衝液，並均勻混合，將混合液移至Spin-Away™ Filter(Zymo research)進行離心(14000×g、30秒)，離心之後保留上清液，再加入等體積的99.8%酒精，均勻混合後，將混合液移至Zymo-Spin™ IIICG Column (Zymo research)進行離心(14000×g、30秒)；離心之後移除上清液，再加入RNA Wash Buffer (Zymo research)進行離心(14000×g、30秒)；移除上清液後，於Zymo-Spin™ IIICG Column內膜的正中央加入80微升(μL)DNase I及DNA Digestion Buffer (Zymo research)混合液，靜置15分鐘後，再加入400 μL RNA Prep Buffer (Zymo research) 進行離心(14000×g、30秒)；移除上清液後，再加入700 μL RNA Wash Buffer進行離心(14000×g、30秒)；移除上清液後，再加入400 μL RNA Wash Buffer進行離心(14000×g、1分鐘)以去除殘餘試劑。將Zymo-Spin™ IIICG Column移至新的1.5毫升(mL)微量離心管，於Zymo-Spin™ IIICG Column內膜的正中央加入100微升DNase/RNase-Free Water(Zymo research)，進行離心(14000×g、1分鐘)，並收集流出之濾液，即為全細胞RNA。
而即時定量聚合酶連鎖反應(Quantitative Real-time PCR) 係如以下步驟進行：取9 μL全細胞RNA，並加入0.4 μL如下表1所示之引子(10微微莫耳濃度)，再添加Power SYBR® Green RNA-to-CT™ 1-Step Kit (Applied Biosystems)，得到待反應之樣品，接著將前述待反應之樣品置於聚合酶連鎖反應器中，並設定反應條件如下：a) 48°C，30分鐘；b) 95°C，10分鐘；c) 95°C，15秒；60°C，60秒，以上步驟進行40個循環；之後進行d) 95°C，15秒；60°C，15秒；95°C，15秒。並換算細胞之hMMP-13 mRNA含量與細胞之hGADPH mRNA含量的比值，以得知各組細胞的相對hMMP-13 mRNA含量，而相對基因表現量係經由2 −ΔΔCt法計算得出。 表1：即時聚合酶連鎖反應使用之引子對
基因 前置引子(forward primer) 反置引子 (reverse primer)
hMMP-13 CCTTGATGCCATTACCAGTCTCC (SEQ ID NO:1) AAACAGCTCCGCATCAACCTGC (SEQ ID NO:2)
hGADPH GCACCAGGTGGTCTCCTCT (SEQ ID NO:3) TGACAAAGTGGTCGTTGAGG (SEQ ID NO:4)
各組的hMMP-13表現量的結果如圖1所示，可以由20×10 8顆外泌體、50×10 8顆外泌體、100×10 8顆外泌體組別的結果得出，IL-1β誘導後處理外泌體可使hMMP-13表現量降低，且降低程度與外泌體數量具關聯性。
單純添加IGF-1或SIRT-6雖然可以使hMMP-13表現量降低，但降低程度不如外泌體造成的降低程度明顯。而SIRT-1及SIRT-2則幾乎沒有使hMMP-13表現量降低。
當外泌體搭配SIRT-1及SIRT-2處理時，則明顯使hMMP-13表現量降低，即降低發炎反應。而當外泌體再搭配IGF-1或SIRT-6處理時，發炎反應下降更為明顯。尤其是，當20×10 8顆外泌體再添加SIRT-1、SIRT-2或SIRT-6處理SW1353細胞之發炎反應，相當於使用100×10 8顆外泌體單純處理。單獨使用20×10 8顆外泌體處理時，hMMP-13的表現量下降47.1%；而單獨使用SIRT-1、SIRT-2或SIRT-6處理時，hMMP-13的表現量下降0.7%、-4.2%或12%，然而當同時使用20×10 8顆外泌體再分別添加SIRT-1、SIRT-2或SIRT-6處理時，hMMP-13的表現量分別下降73.7%、73.2%或75.8%，優於同時處理蛋白質及外泌體兩者降低程度的分別加總(47.1%+0.7%)、(47.1%-4.2%)或(47.1%+12%)，表示同時使用20×10 8顆外泌體再分別添加SIRT-1、SIRT-2或SIRT-6處理時，對於hMMP-13的表現量之降低具有相乘、協同功效(synergistic effect)。
而當單獨使用50×10 8顆外泌體處理時，hMMP-13的表現量下降66.5%；分別單獨使用SIRT-1、SIRT-2或SIRT-6處理時，hMMP-13的表現量分別下降0.7%、-4.2%或12%，然而當同時使用50×10 8顆外泌體再分別添加SIRT-1、SIRT-2或SIRT-6處理時，hMMP-13的表現量分別下降了86.1%、87.1%及79.3%，優於同時處理蛋白質及外泌體兩者降低程度的分別加總(66.5%+0.7%)、(66.5%-4.2%)、(66.5%+12%)，表示同時使用50×10 8顆外泌體再分別添加SIRT-1、SIRT-2或SIRT-6處理時，對於hMMP-13的表現量之降低具有相乘、協同功效。因此，同時投予外泌體再分別處理SIRT-1、SIRT-2或SIRT-6對於降低細胞的發炎反應具有相乘、協同之功效。
此外，圖2示出20×10 8顆外泌體、50×10 8顆外泌體、100×10 8顆外泌體、20×10 8顆外泌體+IGF-1、20×10 8顆外泌體+SIRT-1、20×10 8顆外泌體+SIRT-2、20×10 8顆外泌體+SIRT-6、50×10 8顆外泌體+IGF-1、50×10 8+SIRT-1、50×10 8+SIRT-2、50×10 8+SIRT-6顆外泌體組及對照組在萃取全細胞RNA前所記錄之細胞生長情形。可從圖2結果得知，外泌體會促進軟骨細胞增生，並且外泌體數量與增生影響具關聯性。外泌體再添加SIRT-1或SIRT-6，SW1353時細胞增生更為明顯。
綜上所述，本發明之組合物因為同時具有外泌體及生物巨分子，而可以降低發炎及細胞之受損程度。
根據本發明可作之不同修正及變化對於熟悉該項技術者而言均顯然不會偏離本發明的範圍與精神。雖然本發明已敘述特定的較佳具體事實，必須瞭解的是本發明不應被不當地限制於該等特定具體事實上。事實上，在實施本發明之已述模式方面，對於熟習該項技術者而言顯而易知之不同修正亦被涵蓋於下列申請專利範圍之內。
無
圖1為實施例1各組中SW1353人類軟骨細胞的hMMP-13相對表現量； 圖2為顯微鏡觀察實施例1各組中SW1353細胞之生長情形。
無
TWI841414B_112121272_SEQL.xml

Claims (7)

  1. 一種組合物，其包含一外泌體及一生物巨分子，其中，所述生物巨分子為一蛋白質，所述蛋白質為沉默交配型訊息調節因子2同源蛋白(silent mating type information regulation 2 homolog，SIRT)-1、SIRT-2或SIRT-6，且所述外泌體是分泌自間質幹細胞。
  2. 如請求項1所述之組合物，其中所述間質幹細胞是來自臍帶、脂肪細胞、胎盤組織、牙髓或骨髓。
  3. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1或2所述組合物及藥學上可接受之載劑。
  4. 如請求項3所述之醫藥組成物，其中所述醫藥組成物之劑型為非經腸道的劑型。
  5. 如請求項4所述之醫藥組成物，其中所述非經腸道的劑型為注射劑型或外用液劑。
  6. 一種如請求項1或2所述組合物之用途，其係用於製備治療、預防或減緩發炎性疾病之藥物。
  7. 一種如請求項1或2所述組合物之用途，其係用於製備促進局部傷口癒合之藥物。
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CN111107887A (zh) * 2017-09-20 2020-05-05 诺瓦迪普生物科学股份公司 包含脂肪干细胞的生物材料及其制备方法

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