CN114480626B - 一种子痫前期相关的基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种子痫前期相关的基因及其应用,属于生物医药技术领域。所述基因为AC011753.5,AC011753.5在子痫前期患者的胎盘中高表达。通过抑制人滋养细胞中AC011753.5的表达能够显著的促进滋养细胞的增殖和侵袭能力。因此,可将其用于制备治疗子痫前期的药物。

Description

一种子痫前期相关的基因及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,尤其涉及一种子痫前期相关的基因及其应用。
背景技术
子痫前期是妊娠期高血压疾病的一种类型,该病是妊娠期孕妇的特有病。如何有效的诊断和治疗子痫前期目前依然是妇产科急需解决的问题。目前,关于子痫前期的发病机制仍然不清楚,但是大部分的证据已经表明滋养层侵袭不足会导致螺旋动脉重铸异常,进而会导致子痫前期的发生。
长链非编码RNA是一类超过200nt核苷酸长度的RNA。尽管长链非编码RNA不具有编码能力,但是它们可以从表观遗传学调控、转录调控以及转录后加工等多种层面来实现对基因表达的调控。而且,长链非编码RNA广泛的参与细胞生长、增殖、分化、凋亡以及个体发育等生命活动的调控。目前,关于长链非编码RNA在子痫前期中的研究相对较少,因此更加深入的探究长链非编码RNA和子痫前期的关系将有助于为子痫前期的诊断和治疗提供新的靶点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与子痫前期诊断和治疗相关的新靶点。
为实现上述目的,本发明提供了如下技术方案。
本发明提供了一种与子痫前期相关的基因标志物,所述基因标志物为AC011753.5,所述AC011753.5的核苷酸序列为ENST00000425576.1,所述ENST00000425576.1的序列如SEQ ID NO.1所示。
此外,本发明提供了检测AC011753.5表达量的试剂在制备子痫前期诊断试剂盒中的应用。
优选地,所述试剂包括检测AC011753.5表达的引物对。
优选地,所述引物对的上游引物序列如SEQ ID NO.2所示,所述引物对的下游引物如SEQ ID NO.3所示。
此外,本发明提供了一种子痫前期诊断试剂盒,所述试剂盒包括检测 AC011753.5表达的引物对,所述引物对的上游引物序列如SEQ ID NO.2所示,所述引物对的下游引物如SEQ ID NO.3所示。
此外,本发明提供了AC011753.5抑制剂在制备治疗子痫前期药物中的应用。
优选地,所述抑制剂为siRNA,所述siRNA的正义链序列为UAGCAAAAUAUGCAAAUACAA,所述siRNA的反义链为GUAUUUGCAUAUUUUGCUAUA;
所述应用包括AC011753.5抑制剂在制备促进滋养细胞增殖药物中的应用;
AC011753.5抑制剂在制备促进滋养细胞侵袭药物中的应用。
此外,本发明提供了一种用于制备治疗子痫前期药物的抑制剂,所述抑制剂为siRNA,所述siRNA的正义链序列为UAGCAAAAUAUGCAAAUACAA,所述siRNA的反义链为GUAUUUGCAUAUUUUGCUAUA。
除此之外,本发明提供了一种治疗子痫前期的药物,所述药物含有AC011753.5抑制剂。
优选地,所述AC011753.5抑制剂是药物的唯一有效成分或有效成分之一;
所述抑制剂为siRNA,所述siRNA的正义链序列为UAGCAAAAUAUGCAAAUACAA,所述siRNA的反义链为GUAUUUGCAUAUUUUGCUAUA。
本发明的有益效果在于
本发明首次发现AC011753.5在子痫前期患者的胎盘中高表达,且与正常孕妇相比检测AC011753.5表达的差异具有优异的特异性和灵敏度。除此之外,本发明发现抑制AC011753.5能够显著的存在人滋养细胞的增殖和侵袭能力,因此可将其用于制备治疗子痫前期的药物。
附图说明
图1 AC011753.5在正常组织和子痫前期组织中的表达差异。
图2 AC011753.5在正常组织和子痫前期组织中的表达差异的ROC曲线。
图3 si-AC011753.5对于AC011753.5表达的抑制效果。
图4 si-NC和si-AC011753.5对于人滋养细胞增殖的影响。
图5 si-NC和si-AC011753.5对于人滋养细胞侵袭的影响。
图6 si-NC和si- AC011753.5对于人滋养细胞侵袭相关蛋白MMP-2和MMP-9的影响。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点,下面通过具体实施方式,对本方案进行阐述。
1. AC011753.5在正常组织和子痫前期组织中的表达差异
选取30例子痫前期和正常胎盘组织,所有胎盘组织均取自剖工产术。子痫前期和正常胎盘组均为单胎,剖宫产分娩,而且排除多肽及生殖器官畸形等妊娠相关合并症和并发症。子痫前期诊断按照第九版妇产科学诊断标准确诊为子痫前期的患者。
(1)按照TRIZOL说明书提取子痫前期组和正常组胎盘组织的RNA;
(2)配置逆转录反应液1:
5×gDNA Eraser Buffer 2ul
gDNA Eraser 1ul
RNA template 1ug
Nuclease-free Water Up to 10ul
42℃,反应2min,置于冰上;
(3)配置反应液2:
上述反应液 10ul
PrimeScript RT MixI 1ul
RT Primer Mix 1ul
5×PrimeScript Buffer 2 4ul
Nuclease-free Water 4ul
37℃ 15min;85℃ 5s;4℃ 保存;
(4)设计和合成AC011753.5引物,引物序列如下:
AC011753.5引物
Forward Primer:5’-ATCGCTTGAATCCAGGAGGC-3’,SEQ ID NO.2
Reverse Primer: 5’-CCTTGTGACTGAACACTCCGA-3’,SEQ ID NO.3
GAPDH引物
Forward Primer:5’- GGGAAACTGTGGCGTGAT-3’,SEQ ID NO.4
Reverse Primer: 5’- GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3’,SEQ ID NO.5
(5)配置荧光定量PCR反应体系:
2×SYBR Premix Ex TaqⅡ 12.5ul
Forward Primer 1ul
Reverse Primer 1ul
cDNA模板 2ul
dH2O Up to 25ul
95℃变性 10min;95℃变性15s,60℃ 变性1min;退火延伸95℃ 30s,60℃ 15s,40个循环;采用2-△△Ct法计算AC011753.5的相对表达量。
结果如图1,从图中可以看出,AC011753.5在子痫前期组中的表达量高于正常组(子痫前期中AC011753.5的相对表达量为2.037±0.683,P < 0.05),而且图2的ROC曲线显示子痫前期组和正常组之间的AUC值为0.8828,说明AC011753.5能够作为区分子痫前期患者和正常孕妇的标志物。
实施例2
抑制AC011753.5对于人滋养细胞HTR-8/Svneo的增殖能力的影响
1.设计和检测AC011753.5的siRNA
(1)si- AC011753.5的序列如下所示
5’-UAGCAAAAUAUGCAAAUACAA-3’ ,SEQ ID NO.6
5’-GUAUUUGCAUAUUUUGCUAUA-3’ ,SEQ ID NO.7;
(2)设置3组,分别为对照组(空转lip2000),si- AC011753.5组和si-NC组,转染48h后,检测AC011753.5的相对表达量;
抑制效果如图3所示,可以看出si- AC011753.5组的AC011753.5表达量为0.108±0.048,P< 0.05,说明si- AC011753.5能够显著的抑制AC011753.5的表达。
2.检测抑制AC011753.5对于人滋养细胞HTR-8/Svneo的增殖能力的影响
(1)将转染si-NC和si- AC011753.5的人滋养细胞HTR-8/Svneo接种于96孔板中,每孔接种2000个细胞,每组设置5个重复;
(2)分别在贴壁后24h,48h,72h和96h使用CCK-8检测si-NC组和si- AC011753.5组的450nm吸光度。
表1 si-NC组和si- AC011753.5的450nm吸光度
24h 48h 72h 96h
si-NC 0.459±0.031 0.617±0.034 0.844±0.064 1.114±0.069
si-AC011753.5 0.541±0.038 0.723±0.042 1.016±0.062 1.361±0.103
实验结果如图4和表1所示,从图中可以看出,抑制AC011753.5后,能够促进人滋养细胞的增殖,且差异具有统计学意义。
实施例3
抑制AC011753.5对于人滋养细胞HTR-8/Svneo的侵袭能力的影响
(1)将Matrigel胶置于4℃溶化为液态,按照5:1的比例将无血清培养基加入至Matrigel胶中,混匀后,将100ul Matrigel胶加入到Transwell小室的上室中,放入培养箱中孵育4小时;
(2)将转染si-NC和si-AC011753.5的人滋养细胞HTR-8/Svneo使用胰酶消化下来,并且使用PBS洗涤细胞,之后使用无血清培养基悬浮细胞,进行细胞计数;
(3)在Transwell小室的下室中加入600ul含10%血清的培养基,上室加入100ul包含2×104个细胞的单细胞悬液,放入细胞培养箱中培养24h;
(4)培养结束后,用镊子将Transwell小室取出,吸干上室的液体,将Transwell小时置于含有甲醇的细胞培养孔中,室温固定30min;
(5)取出Transwell小室,吸去上室的固定液,转移到含有结晶紫染色液的细胞培养孔中,室温染色20min;
(6)使用清水洗去结晶紫染色液,使用棉签小心的擦去上室底部膜表面上的细胞,置于显微镜下进行拍照。
实验结果如图5所示,从图中可以看出,抑制AC011753.5能够显著的促进人滋养细胞的侵袭能力。
实施例4
检测抑制AC011753.5对于人滋养细胞HTR-8/Svneo的侵袭相关蛋白MMP5和MMP9的影响
(1)将人滋养细胞HTR-8/Svneo接种于6孔板中,分别转染si-NC和si-AC011753.5,转染48h后,弃去培养基,使用PBS清洗3次,加入200ul蛋白裂解液;
(2)使用细胞刮刀将细胞刮下,转移至1.5ml的EP管中,冰上裂解30min;
(3)4℃,10000rpm/min,离心15min,使用移液枪小心的吸取上清,即得细胞总蛋白;
(4)根据BCA试剂盒说明书检测蛋白浓度,加入5×上样缓冲液,置于沸水中水浴5min,得到蛋白样品;
(5)配置10%浓缩胶和5%分离胶,按照好电泳槽,进行上样;
(6)80V恒压至溴酚蓝至浓缩胶和分离胶的分界处,改为恒压120V至溴酚蓝跑至分离胶的底部;
(7)按照黑色纤维板,海绵,滤纸,凝胶,PVDF膜,滤纸,海绵和白色纤维板的顺序按照“三明治”模型,恒流250mA电转1.5h;
(8)将PVDF膜取出,置于5%的脱脂奶粉中,室温摇床封闭1h;
(9)针对目的蛋白MMP-2,MMP-9和β-actin进行一抗孵育,4℃,孵育过夜;
(10)去除一抗,使用TBST洗膜3次,每次10min,孵育2抗,室温孵育1h;
(11)按照1:1的比例配置显色液A液和B液,将适量的显色液添加到PVDF膜上,进行显影成像。
得到的实验结果如图6所示,从图中可以看出,抑制AC011753.5能够显著的促进人滋养细胞侵袭相关蛋白MMP-2和MMP-9蛋白的表达。
本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现,在此不再赘述,当然,上述说明并非是对本发明的限制,本发明也并不仅限于上述举例,本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化也应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 青岛大学附属医院
青岛思拓新源细胞医学有限公司
<120> 一种子痫前期相关的基因及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 610
<212> DNA
<213> 人源(Human)
<400> 1
ggagaaaata attttgtttt gtatttgcat attttgctat atattttctt ttttgttgat 60
tacaaaaatt atacagatat tatttagctt atcctcaggt attctgatta gcttttttag 120
ctacactttc ccatttacct accttttagt cagaaaatta tgttatactt ttatgaatta 180
actttgttat tcaagtacaa tttatttatt tatttattat tattttttga aatggagttt 240
cactcttgtc gctcagagta gagtgcagtg gtacgatctc agctcactgc aacctccatt 300
tcccgggagg atcgcttgaa tccaggaggc agaggttgca atagctgaga ttgcacccct 360
gcactccagc ctgggtgacg gagtgagact ctgtctcaaa aaaaaaaaac acattgttat 420
tcggagtgtt cagtcacaag gtcagcctat tttatcaaaa tgtaccagca aaagattgtt 480
gttagcatat atgaaattta gtcacgatgt acactatttt gtctctgtaa gatttattca 540
ctgtgtatgt gtgtgtgtgt gcatgtgcgt gtgtgcatgc gcatgcgtgc acgcgcccgc 600
acagaggatc 610
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atcgcttgaa tccaggaggc 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccttgtgact gaacactccg a 21
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gggaaactgt ggcgtgat 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gagtgggtgt cgctgttga 19
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
uagcaaaaua ugcaaauaca a 21
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
guauuugcau auuuugcuau a 21

Claims (2)

1.检测AC011753.5表达量的试剂在制备子痫前期诊断试剂盒中的应用,其特征在于,所述试剂包括检测AC011753.5表达的引物对,所述引物对的上游引物序列如SEQ ID NO.2所示,所述引物对的下游引物如SEQ ID NO.3所示;
所述AC011753.5的核苷酸序列为ENST00000425576.1,所述ENST00000425576.1的序列如SEQ ID NO.1所示。
2. AC011753.5抑制剂在制备滋养细胞增殖促进药物中的应用,其特征在于,所述AC011753.5的核苷酸序列为ENST00000425576.1,所述ENST00000425576.1的序列如SEQ IDNO.1所示;
所述抑制剂为siRNA,所述siRNA的正义链序列为UAGCAAAAUAUGCAAAUACAA,所述siRNA的反义链为GUAUUUGCAUAUUUUGCUAUA。
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