CN111455050B - 非编码rna作为宫颈癌诊治标志物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了非编码RNA作为宫颈癌诊治标志物的用途，该非编码RNA是LINC01060，通过检测LINC01060的表达水平来实现诊断的目的。本发明研究证明与正常对照相比，宫颈癌组织中LINC01060表达水平显著上调。根据LINC01060基因与宫颈癌之间存在的相关性，可以制备诊断宫颈癌的产品。另外，本发明研究证明LINC01060可影响宫颈癌细胞增殖和侵袭，故可将LINC01060作为治疗宫颈癌的药物的治疗靶标。

Description

非编码RNA作为宫颈癌诊治标志物的用途
技术领域
本发明属于诊断领域，涉及非编码RNA作为宫颈癌诊治标志物的用途。
背景技术
宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤，在全球女性恶性肿瘤中发病率居第二位，仅次于乳腺癌。据世界范围统计每年宫颈癌的新发病例约529,800，有275,100妇女死于宫颈癌，死亡率己占妇科恶性肿瘤的首位。超过85％的病例发生在发展中国家，发达国家仅占18％。与发达国家或地区相比，发展中国家或地区宫颈癌的发病率和死亡率均较高。近几十年来，随着宫颈细胞学检测技术、阴道镜检查及活检技术的发展，宫颈癌的发病率和死亡率较前明显下降，但是随着现代女性生活习惯的改变，生殖道病毒性疾病不断增加，性传播疾病普遍流行，使得宫颈癌发病年龄趋向于年轻化，而且晚期宫颈癌的发生率逐渐下降，早期宫颈癌的发生率明显上升。随着医学技术的发展，在宫颈癌的早期发现、早期诊断、手术治疗、放化疗和基因治疗等方面都取得了突破性的进展，临床医生完全可以阻断宫颈癌的发生并治愈宫颈癌。但目前对于宫颈癌发生发展的分子生物学机制仍不清楚。因此，探寻并揭示宫颈癌的发病机制，明确宫颈上皮细胞在恶性转化过程中生物学行为的改变，寻找新的高效的宫颈癌分子生物学诊断、基因治疗和预后监测的特异性标志物，是当前宫颈癌实验室研究、临床诊断及治疗中需要我们研究和亟待解决的难题，这也是最大限度的预防、降低宫颈癌发生的一条重要途径。从长远来看，对于维护全球女性的身心健康具有非凡的意义。
发明内容
根据本发明的一个方面，本发明提供了检测LINC01060表达的产品在制备诊断宫颈癌的工具中的应用。
进一步，上面所提到的检测产品包括：通过反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测LINC01060的表达水平以诊断宫颈癌的产品。
进一步，所述通过反转录PCR检测LINC01060表达水平以诊断宫颈癌的产品至少包括一对特异扩增LINC01060的引物；所述通过实时定量PCR检测LINC01060表达水平以诊断宫颈癌的产品至少包括一对特异扩增LINC01060的引物；所述通过原位杂交检测LINC01060表达水平以诊断宫颈癌的产品包括：与LINC01060的核酸序列杂交的探针；所述通过芯片检测LINC01060表达水平以诊断宫颈癌的产品包括与LINC01060的核酸序列杂交的探针。
在本发明的具体实施方案中，所述通过实时定量PCR检测LINC01060表达水平以诊断宫颈癌的产品至少包括的一对特异扩增LINC01060的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种诊断宫颈癌的工具，所述工具能够通过检测样本中LINC01060的表达来诊断宫颈癌。
进一步，所述工具包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。
其中，所述芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测LINC01060转录水平的针对LINC01060的寡核苷酸探针；所述试剂盒包括用于检测LINC01060转录水平的试剂；所述试纸包括用于检测LINC01060转录水平的试剂；所述高通量测序平台包括用于检测LINC01060转录水平的试剂。
更进一步，所述检测LINC01060转录水平的试剂包括针对LINC01060的引物和/或探针。
与LINC01060的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
在本发明的具体实施方案中，所述针对LINC01060的引物序列如下：正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物如SEQ ID NO.2所示。
用于诊断宫颈癌的LINC01060来源包括但不限于组织和体液，体液包括血液、组织液等存在DNA的体内液体成分。在本发明的具体实施方案中，用于诊断宫颈癌的LINC01060的来源是组织。
本发明的LINC01060(Gene ID:401164)的具体序列可在国际公共核酸序列数据库GeneBank中查询到。
本发明提供了一种用于治疗宫颈癌的药物组合物，所述药物组合物包括抑制LINC01060的试剂。
进一步，所述试剂不受限制，只要是可以抑制LINC01060表达水平或抑制LINC01060功能活性即可。
所述试剂包括LINC01060的siRNA或shRNA。在本发明的具体实施方案中，所述LINC01060的siRNA序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
本发明的药物组合物可以作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可以与本发明的药物组合物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物组合物的效果即可。
本发明的药物组合物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
本发明的药物组合物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。
本发明的药物组合物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物组合物或预防药物组合物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。
本发明还提供了LINC01060在制备治疗宫颈癌的药物中的应用。
本发明还提供了抑制LINC01060的试剂在制备治疗宫颈癌的药物中的应用。
进一步，所述药物限定同前面所述的。
在本发明的上下文中，“诊断宫颈癌”既包括判断受试者是否已经患有宫颈癌、也包括判断受试者是否存在患有宫颈癌的风险。
附图说明
图1显示利用QPCR检测LINC01060在宫颈癌组织和正常宫颈组织中的表达差异统计图；
图2显示利用MTT检测LINC01060表达对宫颈癌细胞增殖影响的生长曲线图；
图3显示LINC01060表达对宫颈癌细胞侵袭影响的结果统计图。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 LINC01060在宫颈癌中的差异表达
1、标本来源
标本选自医院手术切除的55例宫颈癌组织(其中鳞癌35例，腺癌20例)，正常宫颈组织25例(均来自同期子宫体肌瘤行全子宫切除的宫颈组织)。患者年龄28-69岁。
2、病例筛选
(1)所有宫颈癌患者均为初诊，术前均未接受过化疗、放疗或其他治疗。
(2)所有切片均经过常规HE染色，经过至少两位病理学专家独立诊断，并与临床病理报告相对比。
3、所用试剂
表1所用试剂
试剂 公司
Tris 上海碧云天生物技术研究所
酸性酚 上海碧云天生物技术研究所
氯仿 上海碧云天生物技术研究所
异戊醇(分析纯) 天津市富余宇精细化工有限公司
PCR试剂盒 Invitrogen公司
琼脂糖 上海碧云天生物技术研究所
DEPC sigma
无水乙醇 天津市红岩化学试剂厂
4、所用设备
表2所用设备
仪器设备 公司 国家
-80℃低温医用冰箱 SANYO公司 日本
微量核酸定量分析仪 Therm公司 美国
低温高速离心机 Eppendorf公司 德国
Vortex漩涡混合器 Scientific Industries公司 美国
移液器 Eppendorf公司 德国
超净工作台 苏净 中国
纯水仪 Millipour公司 美国
电子天平 梅特勒公司 瑞士
5、主要试剂配制
0.1％DEPC水：DEPC溶液1ml，加蒸馏水999ml，充分混匀后静置，37℃过夜，高压后分装至EP管，-20℃冰箱中保存待用。
6、RNA提取
1)研磨，匀浆过程中使用过的器具放入84消毒液中浸泡消毒一天后，再用洗涤灵洗刷干净晾干后泡酸过夜，洗刷晾干后包上铝箔高压灭菌后，180℃烘烤4小时才能够进行RNA抽提。
2)在进行RNA提取之前，需要运用液氮将研钵等器械预冷，从-80℃冰箱中取出已提前准备好并冻存的样本，快速研磨，中间可以补充液氮，保持低温。一般组织块不超过300mg，50mg己足够。
3)细胞均质化：将研磨完的组织用预冷的小勺小心放入1.5m1离心管中。每50mg研磨完全的组织中加入lml Trizol，室温孵育5min，使细胞充分裂解，释放胞内核内容物。
4)RNA的分离：加入200μ1氯仿(200μ1/1ml Trizol)，颠倒混匀，剧振15s，室温静置2-3min，12,000g 4℃离心15分钟，吸取上层水相至另一干净的离心管。提取RNA用的离心管是无RNA酶的。
5)RNA的沉淀：加500μ1异丙醇(500μ1/1m1 Trizol)至吸取的上清中，这时能看到白雾状，室温静置孵育10min，然后12,000g 4℃离心10分钟。
6)RNA的洗涤与溶解：离心后能在管底明显看到白色沉淀，弃上清，加lml 75％乙醇清洗RNA沉淀，在转盘上转5min。最后7,500g 4℃离心5分钟。弃上清，开离心管口让其内残留的乙醇挥发，待RNA沉淀变为胶体透明状则证明乙醇充分挥发干净。加入100μ1-200μ1DEPC水室温溶解RNA 10-20min。
7)提取RNA质量的检测：取2-4μ1溶解的RNA用微量核酸定量分析仪检测RNA的浓度和纯度，质量较好的RNA OD260与OD280的比值应该在1.8和2.0之间。
7、逆转录和QPCR
逆转录合成cDNA第一链，反转录条件设置为：37℃15min，85℃5s，4℃保存，反转录的体系为：1.0μL的PrimeScript RT Enzyme Mix，1.0μL的4×RT Peimer Mix，4.0μL的5×PrimeScript Buffer，4.0μL的RNase Free dH2O，10μL的RNA溶液。qRT-PCR(QPCR)程序为：95℃30s；95℃5s，60℃30s，共40个循环，反应体系为：SYBR Primix Ex TaqⅡ10μL，0.8μL的上下游引物，3.4μL的dH2O，5μL的cDNA。根据每个反应的Ct值，用2-△△Ct方法计算目的基因mRNA的表达水平，内参为GAPDH。引物序列见表3。
表3引物序列
Figure BDA0002439298270000071
8、统计分析
实验数据采用SPSS21.0软件进行分析，计量资料用均数±标准差表示，多组差异比较用单因素方差分析，组间比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
9、结果
结果如图1所示，与正常宫颈组织相比，宫颈癌组织中LINC01060平均表达水平明显上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例2 LINC01060表达对宫颈癌细胞增殖的影响
1、细胞复苏：将宫颈癌细胞系HeLa从液氮中取出，用镊子夹住迅速放入37℃水浴锅中，快速在水中摇晃至其完全融化。在超净台中，将融化的细胞悬液吸取放入已提前放入5m1完全培养基的15m1离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，用少许完全培养基将细胞沉淀垂悬起，放入培养瓶中培养。
2、培养条件：37℃，5％CO2，用含10％FBS的DMEM培养基培养Hela细胞系。
3、细胞传代：宫颈癌细胞系HeLa静放在培养箱中培养，待细胞愈合度到90％左右时再进行传代。首先将细胞培养基吸弃，加入足够体积的无菌PBS清洗细胞上残留的培养基以防影响胰酶发挥作用。吸弃PBS，加入胰酶在37℃培养箱中静置消化1-2min，在显微镜下观察，细胞全部不贴壁时加入至少三倍体积的含有血清的培养基终止胰酶的消化。将细胞悬液移入细胞离心管中，1000转离心5min。吸弃上清，完全培养基悬浮，1:3分入培养瓶中培养。
4、siRNA合成
针对LINC01060区域选择作用靶点，根据确定序列的原则设计，委托上海吉玛制药技术有限公司选择合成针对LINC01060的siRNA(LINC01060-siRNA)：其正义链为5’-UCUAACUGGAAACUCAUUGCG-3’(SEQ ID NO.5)，反义链为5’-CAAUGAGUUUCCAGUUAGAUG-3’(SEQID NO.6)。确定该序列用于本研究。同时合成含荧光标志的通用随机阴性序列(NC-siRNA)用于计算转染率，转染48h后利用QPCR检测siRNA转染效率，结果显示，NC-siRNA组LINC01060相对表达量为0.907±0.084，LINC01060-siRNA组LINC01060相对表达量为0.418±0.052，差异具有统计学意义(P<0.05)。
5、用Lipofectamine 2000进行细胞转染
1)在24孔板中进行细胞转染。转染的前24h，将0.5-2*105个细胞铺在500μL无抗生素培养基中，这样可使进行实验时细胞密度达到80％-95％。
2)转染样品的制备方法：
a、将DNA稀释于50μL的无血清Opti-MEM低血清培养基中，并颠倒慢慢混匀。
b、使用前轻轻混匀Lipofectamine 2000，然后取相应的量稀释在Opti-MEM培养基中。室温下静置5分钟。
c、室温下静置5分钟后，混合Lipofectamine 2000和siRNA的稀释液(总体积为100μL)。
3)细胞板的每个孔中加混合液100μL，并前后轻轻摇动细胞板使混合液与孔中的培养液混匀。
4)检测目的基因的表达情况前，细胞于37℃CO2培养箱中培养18-48小时。
6、细胞增殖检测
6.1MTT溶液的配制方法和注意事项
1)在本实验用100m1PBS溶解0.5g的MTT，充分搅拌，配制成5mg/ml的溶液，在超净台内用微孔滤膜过滤除菌，小剂量分装。4℃避光保存两周内有效或在-20℃长期保存，避免反复冻融，一般来说现配现用最好。
2)注意：MTT需要避光袋或是黑纸、锡箔纸包裹，以避免光分解。如果MTT的颜色呈灰绿色时，就不要再用了。
3)MTT对细菌较为敏感，而且具有致癌性，实验者需要戴透明的薄膜手套，穿实验服进行操作。同时操作台内要避光。
4)MTT法只能用来检测活细胞的相对活力及相对数，不能测定细胞的绝对数。
6.2实验步骤
按照上面的步骤进行细胞转染，在转染的不同时间点进行MTT检测。MTT检测的步骤如下：
1)细胞内加入0.5％MTT 20μl，继续培养4h。
2)小心吸去上清，每孔加入15μl的二甲基亚飒，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。
3)用酶标仪检测490nm处每组各孔的吸光值。
4)用时间作为横坐标，吸光值作为纵坐标绘制细胞的生长曲线。本实验重复三次。
7、统计分析
实验数据采用SPSS21.0软件进行分析，计量资料用均数±标准差表示，多组差异比较用单因素方差分析，组间比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
8、结果
将细胞连续用MTT和DMSO处理6天，用酶标仪测量各组细胞的OD值，以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标，应用SigmaPlot 12.0软件系统绘制细胞生长曲线，结果见图2，表明抑制LINC01060表达可以显著抑制宫颈癌细胞增殖。
实施例3 LINC01060表达对宫颈癌细胞侵袭的影响
Transwell细胞侵袭实验
1)将Matrigel胶置于4℃过夜融化；
2)用预冷的无血清培养基3倍稀释Matrigel胶至使用浓度(10mg/mL)；
3)用50μL稀释的Matrigel胶包被24孔Transwell上层，置于37℃孵育4-5h，等待胶凝固；
4)Trypsin消化细胞，将细胞用PBS洗两遍后用含1％FBS的培养基重悬细胞；
5)计数2*105细胞重悬于100μL含1％FBS的培养基铺于Matrigel胶上层；
6)Transwell下层放置含10％FBS的完全培养基；
7)将细胞置于37℃培养箱孵育24h-48h；
8)从24孔板中取出Transwell用结晶紫染色，用棉签擦去上层未穿过Metrigel胶的细胞，拍照、计数。
结果如图3所示，表明抑制LINC01060表达可以显著抑制宫颈癌细胞侵袭。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 上海市长宁区妇幼保健院
<120> 非编码RNA作为宫颈癌诊治标志物的用途
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaatcttctg gtcactgtt 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctaataact gtcttctgtc aa 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agaaggctgg ggctcatttg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggggccatc cacagtcttc 20
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ucuaacugga aacucauugc g 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caaugaguuu ccaguuagau g 21

Claims (6)

1.检测LINC01060表达的产品在制备诊断宫颈癌的工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括通过反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片、或高通量测序平台检测LINC01060表达水平以诊断宫颈癌的产品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述通过反转录PCR检测LINC01060表达水平以诊断宫颈癌的产品至少包括一对特异扩增LINC01060的引物；所述通过实时定量PCR检测LINC01060表达水平以诊断宫颈癌的产品至少包括一对特异扩增LINC01060的引物；所述通过原位杂交检测LINC01060表达水平以诊断宫颈癌的产品包括：与LINC01060的核酸序列杂交的探针；所述通过芯片检测LINC01060表达水平以诊断宫颈癌的产品包括与LINC01060的核酸序列杂交的探针。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述通过实时定量PCR检测LINC01060表达水平以诊断宫颈癌的产品至少包括的一对特异扩增LINC01060的引物如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示。
5.LINC01060的抑制剂在制备治疗宫颈癌的药物中的应用，其特征在于，所述抑制剂为针对LINC01060的siRNA或shRNA。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述siRNA序列如SEQ ID NO.5和6所示。
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