CN113350508B - 下调基因表达的试剂在制备前列腺癌药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了下调基因表达的试剂在制备前列腺癌药物中的应用，属于肿瘤生物学技术领域。本发明发现下调基因Lnc‑RP5‑952N6.1在前列腺癌细胞中的高表达可以有效的抑制前列腺癌细胞的增殖和转移，因此可将下调基因Lnc‑RP5‑952N6.1表达的试剂用于制备前列腺癌药物。

Description

下调基因表达的试剂在制备前列腺癌药物中的应用
本案为分案申请，原申请的发明名称为：一种前列腺癌标志物及其治疗药物，原申请的申请日为： 2021-02-03，原申请的申请号为：202110151318X。
技术领域
本发明属于肿瘤生物学技术领域，尤其涉及下调基因表达的试剂在制备前列腺癌药物中的应用。
背景技术
前列腺癌是老年男性中常见的一种泌尿系统恶性肿瘤。随着饮食和生活方式的改变以及人口的老龄化，前列腺癌患者的数量不断增多，严重威胁着中老年男性的健康。与此同时，前列腺癌也呈现出年轻化的趋势。前列腺癌患者的早期临床症状不明显，患者就诊时常常已经处于晚期，从而失去了手术治疗的机会。因此，如果可以早诊断和早干预前列腺癌的进展，将有助于减轻前列腺癌对于患者的危害并提高患者的治疗效果。然而，前列腺癌的发病机制十分复杂，所以前列腺癌的发生及进展过程中的发病机制尚未完全清楚。因此，研究前列腺癌的发生和发展机制，将有助于更好的诊断和治疗前列腺癌。
发明内容
本发明的目的在于提供一种前列腺癌标志物及其治疗药物。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
其一，本发明提供了一种基因在前列腺癌诊断中的应用，所述基因为Lnc-RP5-952N6.1。
其二，本发明提供了试剂在制备诊断前列腺癌的产品中的应用，所述试剂为能够特异性检测Lnc-RP5-952N6.1基因表达产物水平的试剂。
优选地，所述试剂包括检测Lnc-RP5-952N6.1基因表达的特异性引物。
优选地，所述特异性引物的上游引物序列为5’-CCAGCTCTGGGATCAACTGG-3’；所述特异性引物的下游引物序列为5’-CGTTCACGTTGAGGCTGAAC-3’。
其三，本发明提供了Lnc-RP5-952N6.1抑制剂在制备前列腺癌药物中的应用。
优选地，所述Lnc-RP5-952N6.1抑制剂为shRNA，所述shRNA的正义链为：
5'-CACCGCGGCTTCCTCTAGAATAAAGCGAACTTTATTCTAGAGGAAGCCGC -3'；
所述shRNA的反义链为：
5'-AAAAGCGGCTTCCTCTAGAATAAAGTTCGCTTTATTCTAGAGGAAGCCGC -3'。
其四，本发明提供了一种前列腺癌药物，所述药物包括有效剂量的Lnc-RP5-952N6.1抑制剂，所述Lnc-RP5-952N6.1抑制剂为shRNA，所述shRNA的正义链为：
5'-CACCGCGGCTTCCTCTAGAATAAAGCGAACTTTATTCTAGAGGAAGCCGC -3'；
所述shRNA的反义链为：
5'-AAAAGCGGCTTCCTCTAGAATAAAGTTCGCTTTATTCTAGAGGAAGCCGC -3'。
8. Lnc-RP5-952N6.1抑制剂在制备前列腺癌细胞增殖抑制剂中的应用。
9. Lnc-RP5-952N6.1抑制剂在制备前列腺癌细胞转移抑制剂中的应用。
其五，本发明提供了一种筛选前列腺癌潜在治疗药物的方法，所述方法包括如下步骤：
（1）使用待筛选药物处理前列腺癌细胞；
（2）测定前列腺癌细胞中Lnc-RP5-952N6.1的表达情况；
其中，如果待筛选药物能够降低Lnc-RP5-952N6.1的表达，则该待筛选药物为前列腺癌潜在治疗药物。
本发明的有益效果在于：
本发明发现Lnc-RP5-952N6.1在前列腺癌组织和前列腺癌细胞中高表达，且前列腺癌组织和癌旁组织中Lnc-RP5-952N6.1的表达差异具有优异的AUC值，因此Lnc-RP5-952N6.1可以作为诊断前列腺癌的标志物，并且可以用于筛选前列腺癌候选治疗药物。
其次，本发明通过实验发现Lnc-RP5-952N6.1抑制剂能够有效的抑制前列腺癌细胞的增殖和转移，因此可以利用Lnc-RP5-952N6.1抑制剂制备前列腺癌治疗药物。
附图说明
图1 Lnc-RP5-952N6.1在前列腺癌组织和癌旁组织中的表达差异；
图2 前列腺癌组织和癌旁组织中Lnc-RP5-952N6.1表达差异的ROC曲线；
图3 Lnc-RP5-952N6.1在不同前列腺癌细胞中的表达差异；
图4 sh-Lnc-RP5-952N6.1的敲减效果；
图5 CCK-8实验对于细胞增殖的检测结果；
图6 EDU实验对于细胞增殖的检测结果；
图7 划痕实验对于细胞迁移的检测结果；
图8 Transwell实验对于细胞侵袭的检测结果。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
标本收集
收集30例于山东省立医院诊断的前列腺癌组织以及其对应的癌旁组织，本专利收集的前列腺患者是经B超定位前列腺穿刺诊断为前列腺癌，手术之后经病理确诊为前列腺癌的患者。
实施例1
组织总RNA提取
（1）在开始实验之前，将实验所需的器材使用0.1%的DEPC水浸泡过夜，放入烤箱中烘干备用；
（2）取50mg左右的新鲜肿瘤组织和癌旁组织，使用眼科剪将组织剪碎放入到预冷的研钵中，倒入液氮，快速的研磨粉碎组织，研磨结束后将组织转移至新的无RNA酶的1.5mlEP管中；
（3）加入1ml的Trizol裂解液，室温下静置5min，加入200ul氯仿，使用涡旋器涡旋30s，冰上放置10min；
（4）将EP管放入4℃离心机中，12000g离心15min，结束后，将上清液小心转移至新的1.5ml EP管中；
（5）加入等体积的异丙醇混匀，冰上放置10min，将EP管放入到4℃离心机中，12000g离心10min，弃去上清；
（6）加入1ml 75%乙醇（DEPC水配置）洗涤沉淀，将EP管放入到4℃离心机中7500g离心3min；
（7）吸取乙醇溶液，将离心管开口放置在室温下，待RNA沉淀干燥后，加入50ul无RNA酶水溶解RNA，测量RNA的浓度和纯度。
总RNA逆转录反应
（1）RNA热变性
表1 RNA热变性反应体系
试剂 使用量
Total RNA 1ul
Oligo(dT)<sub>20</sub> 1ul
RNase Free H<sub>2</sub>O 10ul
Total Volume 12ul
反应条件：将上述混合液放入PCR仪中65℃条件下处理5min，冰上冷却。
（2）RNA的逆转录反应
表2 逆转录反应体系
试剂 使用量
步骤（1）反应液 12ul
5×RT Buffer 4ul
dNTP Mixture 2ul
RNase Inhibitor 1ul
ReverTra Ace 1ul
Total Volume 20ul
反应条件
42℃，20min；99℃ 5min；4℃ 5min；-20℃保存。
荧光定量PCR反应检测Lnc-RP5-952N6.1的表达
（1）Lnc-RP5-952N6.1和β-actin的引物序列
Figure 824047DEST_PATH_IMAGE002
（2）荧光定量PCR反应体系
试剂 使用量
cDNA 2ul
Forward Primer 1ul
Reverse Primer 1ul
SYBR qPCR Mix 10ul
ROX reference dye 0.4ul
RNase Free H<sub>2</sub>O 5.6ul
Total Volume 20ul
反应条件：预变性：95℃ 60s；变性 95℃ 15s，退火 60℃ 30s 延伸 72℃ 60s 40个循环；再延伸 72℃ 5min。
根据2-∆∆Ct计算Lnc-RP5-952N6.1在前列腺癌组织中相对表达量。
其中，Lnc-RP5-952N6.1在前列腺癌组织中的相对表达量2.581±0.958，同时，绘制的ROC曲线显示，Lnc-RP5-952N6.1在前列腺癌组织和癌旁组织中的差异表达的AUC值为0.9144，95% confidence interval为0.8420 to 0.9869，Std. Error为0.03695。
上述结果说明，Lnc-RP5-952N6.1在前列腺癌组织中的相对表达量显著高于癌旁组织，且差异具有优异的敏感性和特异性，因此，可以通过比较前列腺癌组织和癌旁组织中的Lnc-RP5-952N6.1表达来辅助诊断前列腺癌。
实施例2
检测Lnc-RP5-952N6.1在前列腺癌细胞中的表达差异
（1）按照实施例1的方法提取BPH-1细胞，DU-145细胞，LnCap细胞，PC3细胞，VCaP细胞的RNA；
（2）按照实施例1的方法，检测Lnc-RP5-952N6.1在BPH-1细胞，DU-145细胞，LnCap细胞，PC3细胞，VCaP细胞中的表达差异。
其中，DU-145细胞中Lnc-RP5-952N6.1的相对表达量为3.606±0.243；
LnCap细胞中Lnc-RP5-952N6.1的相对表达量为2.613±0.199；
PC3细胞中Lnc-RP5-952N6.1的相对表达量为2.332±0.452；
VCaP细胞中Lnc-RP5-952N6.1的相对表达量为3.023±0.310；
上述结果说明，相较于人前列腺增生细胞BPH-1，Lnc-RP5-952N6.1在前列腺癌细胞中的相对表达量显著提高，其中Lnc-RP5-952N6.1在DU-145细胞中的表达量最高，因此后续研究实验中选择使用DU-145细胞。
实施例3
设计Lnc-RP5-952N6.1的shRNA sh-Lnc-RP5-952N6.1
（1）根据Lnc-RP5-952N6.1的序列SEQ ID NO.5设计shRNA，并构建于pENTR™/U6质粒上，具体如下：
Top Strand：
5'-CACCGCGGCTTCCTCTAGAATAAAGCGAACTTTATTCTAGAGGAAGCCGC -3'；SEQ IDNO.6;
Bottom Strand
5'-AAAAGCGGCTTCCTCTAGAATAAAGTTCGCTTTATTCTAGAGGAAGCCGC -3'；SEQ IDNO.7;
（2）将sh-Lnc-RP5-952N6.1转染到DU-145细胞中，检测sh-Lnc-RP5-952N6.1的抑制效果。
其中，转染sh-Lnc-RP5-952N6.1的DU-145细胞中，Lnc-RP5-952N6.1的相对表达量为0.198±0.031，说明sh-Lnc-RP5-952N6.1能够有效的抑制Lnc-RP5-952N6.1的表达。
实施例4
使用CCK-8检测sh-Lnc-RP5-952N6.1对于DU-145细胞增殖的影响
（1）转染前一天将DU-145细胞接种于96孔板中，过夜培养后，使用Lipofectamine2000将 sh-NC和sh-Lnc-RP5-952N6.1进行转染；
（2）分别与转染0h，24h,48h,72h使用CCK-8检测450nm OD值。
其中，24h时sh-NC的OD值为0.354±0.024，sh-Lnc-RP5-952N6.1的OD值为0.263±0.023， P < 0.05；
48h时sh-NC的OD值为0.533±0.034，sh-Lnc-RP5-952N6.1的OD值为0.372±0.023， P < 0.05；
72h时sh-NC的OD值为0.789±0.034，sh-Lnc-RP5-952N6.1的OD值为0.590±0.032， P < 0.05；
上述结果说明，sh-Lnc-RP5-952N6.1能够有效的抑制DU-145细胞的增殖。
实施例5
使用EDU进一步检测sh-Lnc-RP5-952N6.1对于DU-145细胞增殖的影响
（1）转染前一天将DU-145细胞接种于96孔板中，过夜培养后，使用Lipofectamine2000将 sh-NC和sh-Lnc-RP5-952N6.1进行转染；
（2）转染48h后，加入100ulEDU孵育2h，孵育结束后，去除EDU，使用PBS清洗细胞2次；
（3）加入4%的多聚甲醛固定30min，去除多聚甲醛加入100ul 0.2%甘氨酸孵育5min，PBS清洗细胞2次；
（4）加入100ul 0.5% Triton-100处理10min，PBS清洗，加入100ul Apollo处理10min，PBS清洗；
（5）再次加入100ul 0.5% Triton-100处理10min，处理结束后，加入100ul甲醇清洗2次，之后，使用PBS清洗；
（6）加入DAPI染色5min，PBS清洗，荧光显微镜下进行拍照。
如图6所示，可以看出，转染sh-Lnc-RP5-952N6.1的细胞中EDU染色阳性的细胞相较于对照组显著减少，该结果进一步证明了sh-Lnc-RP5-952N6.1对于前列腺癌细胞增殖的抑制效果。
实施例6
细胞划痕实验检测细胞迁移能力
（1）将DU-145细胞接种于6孔板中，过夜培养后，使用Lipofectamine 2000将 sh-NC和sh-Lnc-RP5-952N6.1进行转染；
（2）待细胞汇合度达到90%时，使用200ul的移液器枪头在正中央位置划一条直线；
（3）利用PBS将脱落的细胞冲洗掉，24h后，在倒置显微镜下进行拍照和统计。
实验结果如图7所示，从图中可以看出，sh-Lnc-RP5-952N6.1能够有效的抑制前列腺癌细胞的迁移能力。
实施例7
Transwell小室实验检测细胞侵袭能力
（1） Matrigel 4℃过夜融化，用预冷的无血清培养基按照1:3的比例稀释；
（2）将稀释后的30ul基质胶加入到chamber上室，轻轻摇晃至平铺于小室底部，放入细胞培养箱中放置4h；
（3）将转染sh-NC和sh-Lnc-RP5-952N6.1的DU-145细胞制成细胞悬液，调整细胞密度为5×104/ml，取200ul细胞悬液加入到chamber上室内；
（4）在24孔板中加入500ul含FBS的DMEM培养基，形成下室，然后将Transwe小室放入24孔板中；
（5）在细胞培养箱中培养48h，取出Transwell小室，使用PBS进行清洗，然后使用棉签轻柔擦去微孔膜内部的细胞；
（6）使用多聚甲醛进行固定，固定后使用结晶紫进行染色；
（7）在倒置显微镜下进行拍照并计算穿过小室的下层细胞数。
实验结果如图8所示，可以看出，sh-Lnc-RP5-952N6.1能够有效的抑制前列腺癌细胞的侵袭能力。
本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述，当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 山东第一医科大学附属省立医院（山东省立医院）
<120> 一种前列腺癌标志物及其治疗药物
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccagctctgg gatcaactgg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgttcacgtt gaggctgaac 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgtcttcccc tccatcgt 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaggtgtgg tgccagattt 20
<210> 5
<211> 2086
<212> DNA
<213> 人源(Human)
<400> 5
cattttagct ttgccatccg cggacggctt gagtgttaac cagctcggtg gaccgtttgc 60
ctttctgcga gggcagcggc ttcctctaga ataaagaatg aagaaaattg aaatgatctc 120
tgaaactcga gaatagttat gtaaaagaga aaaaacaaag tctatcgttc aaaggctact 180
gaaccaggaa acaggcagcc cgcgttaaaa tcccagctct gggatcaact ggttagatta 240
ttttcattca ggcatctttt ctttctgcac tacttcatct accagttgct aacattgaat 300
gaacctttac agtgttccag gtactgtttt aagagatttt ctatactcat ataacatttt 360
tgaaagaaaa agtgaaatat aggcctacat gttcagcctc aacgtgaacg tgatgaggat 420
gaagaccttt atgataatcc actttcactt agtgaatcgg gattggactg ctgcattcta 480
aaaataatgg tgagaagaat gaataaatta gagtttacta tgtaataaaa ccttctaaaa 540
aagaggagag gtagcagaat ttacaagaag gttaaacctg accttactga agagaatgat 600
accctcatag cagcgcatct tctttgctca cagaaagctc cttggacaaa tgtgttttga 660
gtttcaagtg agcaaacctt caatgtgtct gccattttgg ggaagaagtt gtaacttgga 720
gtgaaggtag agggatttat tatgagagct ttgctagcag acatctcatt ctttaagaca 780
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tctgaagcct gagaggaaaa tgaaagacaa gaggctgtgg ctgcagctgt gtctgctgac 900
aacaggataa aaatggttgc attgagagtg agctgcattt tcaccaggca gagcaaactg 960
ggagctaatg tgtttcttgg aaatcaaaag aggactccaa gaatagaagc ttttaagagg 1020
actggctgga gagtcaaaga agatccatta gcttctggac cactgaaaac ctaagggctg 1080
atggtggggc agggtaagtg gccggcagca gggagacatt ttctgtatct aggatggtat 1140
agaaaagacc cccactggac agatctacaa agaacaacta aagagtctca tggtagaaca 1200
ggtcagctct ggacatcatt caaatccagg ggagcctctt atactggatt gcaattgtgt 1260
tgggcatgta caatggtgtt ctttttctct aatggcttct ttcttctggt cagtctctgg 1320
aaggggtgaa agagtgagaa atagtagcca gcaagtgtag aaagagatgt ggaagagaga 1380
acggggaaac agaaattgca tttctcccac gttccaaatg taggttatcc gggttaaatg 1440
taggccccac ctgactaggc aaagattttt tcctttgttg tgagtttgaa aagaactaaa 1500
catcatactg aagtggaatt attgaaattg gatagaccca ggttcaaatg ttgactcagt 1560
tatgtaacat cttgtgaatt ttgacaggtt ccttaactcc actgagtctg tttttatacc 1620
catgaaatgg atgtaggatt gttatgaaca ttaattgaaa aattatatat aaaataagtg 1680
tccagcatag ttcctggcac atactagtgc ttgaaaacta ccaatcaact tcatcaattt 1740
gtgttatgcc ctgcatgggc acatatttgt cctgatactc ttcaaaatgt agaagtaccc 1800
acagaaaaat tgtctcagtt caagcacagt attattaata ttctactgag tactaagtat 1860
ggtcgttaat agtctaatat gaggaagtca aaacagtctc tggaaaaagt ctttctgcaa 1920
gctttttgaa gcttcaggga ttgctacaaa gactggaaaa tcgatcttga actcagcctt 1980
ttaatttctt ttcatgatta ctgttctcaa atggagaatg caattaaaat taatgctgtc 2040
ttagttcact tgcctcaaaa taaacattga tcaaattcta tgtgaa 2086
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caccgcggct tcctctagaa taaagcgaac tttattctag aggaagccgc 50
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaaagcggct tcctctagaa taaagttcgc tttattctag aggaagccgc 50

Claims (8)

1. Lnc-RP5-952N6.1抑制剂在制备前列腺癌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Lnc-RP5-952N6.1抑制剂为shRNA，所述shRNA的正义链为：
5'-CACCGCGGCTTCCTCTAGAATAAAGCGAACTTTATTCTAGAGGAAGCCGC -3'；
所述shRNA的反义链为：
5'-AAAAGCGGCTTCCTCTAGAATAAAGTTCGCTTTATTCTAGAGGAAGCCGC -3'。
3.一种前列腺癌药物，其特征在于，所述药物包括有效剂量的Lnc-RP5-952N6.1抑制剂，所述Lnc-RP5-952N6.1抑制剂为shRNA，所述shRNA的正义链为：
5'-CACCGCGGCTTCCTCTAGAATAAAGCGAACTTTATTCTAGAGGAAGCCGC -3'；
所述shRNA的反义链为：
5'-AAAAGCGGCTTCCTCTAGAATAAAGTTCGCTTTATTCTAGAGGAAGCCGC -3'。
4.Lnc-RP5-952N6.1抑制剂在制备前列腺癌细胞增殖抑制剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为shRNA，所述shRNA的正义链为：
5'-CACCGCGGCTTCCTCTAGAATAAAGCGAACTTTATTCTAGAGGAAGCCGC -3'；
所述shRNA的反义链为：
5'-AAAAGCGGCTTCCTCTAGAATAAAGTTCGCTTTATTCTAGAGGAAGCCGC -3'。
6. Lnc-RP5-952N6.1抑制剂在制备前列腺癌细胞转移抑制剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为shRNA，所述shRNA的正义链为：
5'-CACCGCGGCTTCCTCTAGAATAAAGCGAACTTTATTCTAGAGGAAGCCGC -3'；
所述shRNA的反义链为：
5'-AAAAGCGGCTTCCTCTAGAATAAAGTTCGCTTTATTCTAGAGGAAGCCGC -3'。
8.一种筛选前列腺癌潜在治疗药物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）使用待筛选药物处理前列腺癌细胞；
（2）测定前列腺癌细胞中Lnc-RP5-952N6.1的表达情况；
其中，如果待筛选药物能够降低Lnc-RP5-952N6.1的表达，则该待筛选药物为前列腺癌潜在治疗药物。
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