CN111471682A - miR-23a作为诊断和治疗胃癌伪管生成标志物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于诊断和治疗胃癌伪管生成的miRNA标志物，具体所述miRNA为miR‑23a。本发明公开了miR‑23a在制备诊断胃癌伪管生成的产品以及治疗胃癌伪管生成的药物组合物中的应用。本发明同时公开了一种诊断胃癌伪管生成的试剂盒以及治疗胃癌伪管生成的药物组合物。本发明的试剂盒能够作为胃癌伪管生成诊断的手段之一。本发明的药物组合物对胃癌伪管生成有较好的抑制作用，在胃癌伪管生成以及胃癌的治疗中具有重要的参考和现实意义。

Description

miR-23a作为诊断和治疗胃癌伪管生成标志物的应用
技术领域
本发明涉及一种与胃癌相关的miRNA及其应用，具体涉及与胃癌伪管生成相关的miRNA及其应用，所述的miRNA为miR-23a。属于生物医药领域，具体属于分子生物学技术领域。
背景技术
胃癌是常见恶性肿瘤之一，在全球癌症死因中占第二位(Torre LA,et al.2016)。我国胃癌发病率非常高，发病率和死亡率在恶性肿瘤中均排在前列，并呈逐年增加的趋势，且男性胃癌发病率远高于女性，胃癌已严重威胁了我国人民的身体健康(Zhang J,etal.2017)。胃癌早期的症状不明显，或仅有轻微的症状，当出现明显症状时，很多已经发展为胃癌晚期，生存率显著降低。若能实现胃癌早期诊断并给予合理的治疗，患者在5年内的生存率可达到95％，且可以大幅度减低治疗费用(Sumiyama K.2017)。因此，研究者们现阶段将胃癌的早期诊断筛查及患者的预后改善作为重点关注的课题。目前胃癌诊断的手段主要有内镜、影像学以及血清学检查，各种诊断方法都有其优缺点(金莉彬.2018)。胃镜下活检是最常用的胃癌诊断方法，但其是一种有创的侵入性检查，成本较高；消化道钡剂造影检查能观察胃黏膜的形态及胃壁运动变化，有效诊断出胃癌患者，但该方法在筛查过程中容易漏掉非凹陷性的病变，胃癌诊断的有效性低于胃镜下活检(TashiroA,et al.2006)。这两种方法都依赖于专门的仪器或仪器操作者的经验，技术要求高，患者的依从性差，不适用于大规模的早期胃癌的筛查(田玲蓉等,2019)。血清学检查是通过检测某些特异的生物标志物，通过其分子表达水平，达到胃癌诊断目的，如胃蛋白酶原检查、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染中Hp-IgG抗体检测等(吴勇刚等.2019)，但目前相关的胃癌生物标志物的真阳性率和真阴性率不够理想，容易造成漏检。因此，探索一种新的高特异性的胃癌诊断方法刻不容缓。胃癌发生发展的分子机制复杂，涉及到多种基因调控，当基因水平表达异常，引发细胞功能结构的改变，容易导致细胞的癌变(WangKW,et al.2019)。因此，基于基因水平进行胃癌筛查诊断法也成为了研究的热点。
MicroRNA(miRNA)广泛存在于真核生物中，是一种非编码的具有功能性的单链RNA，其大小约为21-25个核苷酸，其基因高度保守，参与调控相关蛋白编码基因的表达(Rigoutsos I,et al.2010)。现在研究普遍认为人类疾病的发生发展与miRNA密切相关(Wang J,et al.2018)。miRNA在细胞的增殖、分化和凋亡等多过程多方面中发挥着重要的生物调节作用，在多种肿瘤中miRNA表达量与正常细胞表达量差异显著，提示其可作为特异性生物标志物用于癌症诊断。研究表明(Calin GA,et al.2006)，在很多种人类肿瘤疾病中miRNA表达异常，一些miRNA可作为病理分期或肿瘤来源等提示信息，而有一些miRNA在癌症形成过程中起到诱导或促进的作用，这一点在肝癌，胃癌，肺癌，乳腺癌等肿瘤疾病中得到证实。随着基因诊断水平在癌症领域的深入研究，miRNA与癌症形成的初期阶段、癌症患者病情发展阶段、对药物敏感性及预后改善等方面有着密切的联系(刘怡萱等.2016)。因此，基于miRNA的癌症基因诊断治疗优势凸显，为癌症治疗诊治提供了新的研究思路。
在胃癌发生发展过程中，一方面miRNA通过调控原癌基因，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，发挥了促癌作用；另一方面其通过多种机制抑制肿瘤的发生、发展及转移，发挥了抑癌作用(宋菲等.2012)。miR-23a位于染色体19p13.13，在多种肿瘤中表达量高，与调控细胞生长、分化及肿瘤生长转移等生物行为密切相关(Scapoli L,et al.2010；Rao SA,etal.2010)。目前，已有研究者们发现miR-23a表达水平在胃癌组织较正常组织中高，miR-23a表达下调可抑制胃癌细胞BGC823的生长，并预测miR-23a通过调控靶基因金属硫蛋白2A(MT2A)的下调发挥了促进胃癌细胞生长的作用(An J,et al.2013)。还有研究者等通过检测miR-23a及RUNX1在胃癌组织及癌旁组织中的表达，发现RUNX1是miR-23a直接调控的靶基因。随着胃癌浸润深度和临床分期的发展，miR-23a出现表达上调，而RUNX1蛋白表达下调，提示miR-23a及RUNX1可能是诊断胃癌恶性转变及浸润转移中重要的生物标志物(贺荣芳等.2015)。此外，miR-23a通过靶向抑制转移抑制因子1(MTSS1)促进胃腺上皮恶性转化以及胃癌发生浸润转移，揭示了miR-23a高表达是胃癌诊断中潜在的生物标志物(王燕东等.2013)。通过检查分析胃腺瘤患者与健康体检者血清中miR-23a表达水平，结果发现胃腺癌患者血清miR-23a表达水平与肿瘤大小、分化程度及淋巴转移等特性相关性密切，提示检查血清miR-23a表达水平对胃腺癌早期诊断中具有较高的灵敏度和特异性(陈建清等.2019)。Xiuting Hu(Hu XT,et al.2017)等探索了miR-23a/b导致胃癌的分子机制，发现抑癌基因PDCD4是miR-23a/b直接调控的靶基因，因此miR-23a/b可抑制PDCD4表达进而促进肿瘤生长，提示可通过检测miR-23a/b表达水平进行胃癌诊断，为胃癌诊断和治疗提供新的途径。Liu X(Liu X,et al.2016)等研究显示长链非编码RNA GAS5在胃癌组织中表达降低，与miR-23a的表达上调呈负相关，并预测RNAGAS5转录位点中可能存在于miR-23a结合位点中，提示GAS5可以作为治疗胃癌中潜在靶基因。综上所述，miR-23a参与了胃癌的发生发展过程，通过调控靶基因使其蛋白表达量下调，从而发挥促胃癌细胞生长作用。因此，miR-23a可作为胃癌诊断及治疗中重要的潜在生物标志物。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种与胃癌伪管生成发生发展相关的的miRNA标志物，所述标志物可以作为胃癌伪管生成的特异性诊断标志物，应用于胃癌伪管生成的发现；本发明的目的之二在于提供miRNA标志物在筛选治疗胃癌伪管生成的候选药物中的应用。
为了研究与胃癌伪管生成相关的miRNA在胃癌伪管生成中的作用，从而筛选合适的miRNA。我们通过生物信息学技术及现代分子生物学技术从BGC823细胞外泌体中找到了可以作为胃癌伪管生成标志物的miR-23a。
因此，本发明一方面提供了一种miRNA，和检测该miRNA表达水平的试剂在制备诊断胃癌伪管生成的产品中的应用，其实，所述的miRNA为miR-23a。
优先地，本发明所述试剂为特异性扩增miR-23a的引物。
再一方面，本发明在miR-23a应用的基础上，提供了一种诊断胃癌伪管生成的试剂盒，所述试剂盒包括检测miR-23a表达水平的试剂。
优选地，本发明所述试剂为特异性扩增miR-23a的引物。
优选地，本发明所述特异性扩增miR-23a的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。
再一方面，本发明根据miR-23a基因的用途，提供了一种用于制备治疗胃癌伪管生成的药物组合物。
优选地，本发明所述药物组合物包括miR-23a基因的抑制剂。
再一方面，本发明还提供了一种基于miR-23a基因药物组合物，所述药物组合物为miR-23a基因的抑制剂，所述抑制剂为miR-23a的si-miR-23a
优选地，本发明所述的miR-23a基因的抑制剂为含有si-miR-23a的质粒转染BGC823细胞后获取的外泌体。
优选地，本发明所述si-miR-23a的序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明通过生物信息学和现有的分子生物学的技术手段，从胃癌细胞外泌体中筛选到用于胃癌伪管生成诊断和治疗的标志物miR-23a(miR-23a在胃癌细胞外泌体中高表达)。在此基础上，本发明提供了检测miR-23a的试剂在制备诊断胃癌伪管生成的产品中的应用。该应用包括诊断胃癌伪管生成的试剂盒以及制备治疗胃癌伪管生成的药物组合物。本发明的试剂盒能够作为胃癌伪管生成诊断的手段之一。本发明的药物组合物对胃癌伪管生成有较好的抑制作用，在胃癌伪管生成治疗中具有重要的参考和现实意义。
附图说明
图1胃癌相关miRNA及下游靶基因预测。图中A表示横坐标表示样本编号，纵坐标表示miRNA名称，左侧树状图表示miRNA表达水平聚类，图中每个小方块表示一个miRNA在一个样本中的表达水平；图中B表示GSE78091中miR-23a表达情况，横坐标表示样本类型，纵坐标表示miRNA表达水平，左侧箱图为正常样本，右侧箱图为肿瘤样本；图中C表示TCGA胃癌数据库中miR-23a表达情况分析，左侧箱图表示肿瘤样本中miR-23a的表达情况，右侧箱图表示正常样本中miR-23a的表达情况；图中D表示qRT-PCR检测胃癌组织和癌旁组织中miR-23a的表达量；图中E表示qRT-PCR检测人胃正常粘膜上皮细胞系和胃癌细胞系中miR-23a的表达量；图中F表示Western Blot检测胃癌组织和癌旁组织中伪管生成相关因子VEGF、TSP-1的表达量。
图2来源于胃癌细胞的外泌体中含有miR-23a。图中A表示透射电镜观察外泌体形态(bar100nm)，红色箭头指向外泌体；图中B表示Nanosight检测外泌体的粒径；图中C表示Western blot检测外泌体和胃癌细胞中经典标记物TSG101、CD63和Alix；图中D表示qRT-PCR检测正常胃细胞系和各胃癌细胞系exosomes中miR-23a的表达量。图中*表示与对照组相比，具有统计学差异。
图3源于胃癌细胞的外泌体与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)共培养，促进伪管生成。图中A表示激光共聚焦检测外泌体摄取情况；图中B表示HUVECs伪管生成情况；图中C表示HUVECs伪管长度；图中D表示HUVECs伪管成环数；图中E表示HUVECs伪管节点；图中F-G表示Western Blot检测VEGF、TSP-1的表达量；图中H表示EDU检测HUVECs增殖情况。
图4外泌体中的miR-23a促进伪管生成。图中A表示qRT-PCR检测miR-23a表达量；图中B表示HUVECs伪管生成情况(chengyi)；图中C表示HUVECs伪管长度；图中D表示HUVECs伪管成环数；图中E表示HUVECs伪管节点；图中F-G表示WesternBlot检测VEGF、TSP-1的表达量；图中H-I表示EDU检测HUVECs增殖情况；图中*和#表示与对照组相比，具有统计学差异。
图5miR-23a靶向负调控RUNX3。A.miR-23a下游靶向基因RUNX3预测；B，GEPIA数据库确定RUNX3在胃癌中的表达情况；.C，双荧光素酶报告实验
图6miR-23a通过靶向抑制RUNX3的表达，促进伪管生成。图中A表示qRT-PCR检测RUNX3的表达量；图中B-C表示Western Blot检测RUNX3、PIP3、p-Akt、Akt的表达量；图中D表示HUVECs伪管生成情况；图中E表示HUVECs伪管长度；图中F表示HUVECs伪管成环数；图中G表示HUVECs伪管节点；图中H-I表示Western Blot检测VEGF、TSP-1的表达量；图中J-K表示EDU检测HUVECs增殖情况。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。实施例中未进行详细说明的实验方法，通常按照本技术领域常规操作或按照厂商建议的条件进行。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品。
本发明经过广泛而深入的研究，通过生物信息学技术和分子生物学技术，检测胃癌细胞外泌体中miRNA的表达水平，发现其中具有明显表达差异的miRNA片段，探讨其与胃癌伪管生成的发生之间的关系，从而为胃癌伪管生成的检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明发现胃癌细胞外泌体中miR-23a显著性上调，并且通过大量实验证明，采用该miRNA具有较高的阳性检出率；进一步的细胞实验证明，改变胃癌细胞外泌体的表达水平可以影响胃癌伪管的生长，提示miR-23a可以作为药物靶标用于胃癌伪管生成的精准治疗。
“生物标志物”与“标志物”可以等同替代，指代具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。在本发明中，“标志物”指与一个或多个生物分子相关的参数(即“生物标志物”)，例如天然或人工合成产生的核酸(即个体基因，以及编码和非编码DNA和RNA)。本发明中的“标志物”还包括指可通过考虑来自两个或多个不同标志物的表达数据计算或以其他方式获得的单个参数。在本发明中，术语“生物标志物”指代与胃癌伪管生成相关联的基因、基因的片段或变体。
在本发明的实施例中，一种代表性的人miR-23a基因的核苷酸序列SEQ ID NO.4所示。本发明的miR-23a核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。
在本发明中，可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。本发明的miRNA使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。
核酸测序技术的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。
本发明所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。
通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。
本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。
本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测miR-23a的表达。
在某些实施方案中，所述试剂盒包含与一种或多种生物标志物的mRNA特异性结合的一种或多种探针。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含洗涤溶液。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含进行杂交试验的试剂、mRNA分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含使用该试剂盒的说明书。所述试剂盒可以定制供在家使用、临床使用或研究使用。举例说明，本发明提供的试剂盒是基于qRT-PCR实验来源的，本发明不仅提供了一种检测miR-23a的引物，还提供了具体的检测方法，在此基础上，本发明可以提炼出一种用于检测miR-23a表达水平的qRT-PCR检测试剂盒。
这样一种试剂盒可以采用例如试纸条、膜、芯片、盘、测试条、滤器、微球、载片、多孔板或光纤。所述试剂盒的固相支持物可以是例如塑料、硅片、金属、树脂、玻璃、膜、颗粒、沉淀物、凝胶、聚合物、薄片、球、多糖、毛细管、胶片、板或载片。所述生物样品可以是例如细胞培养物、细胞系、组织、口腔组织、胃肠组织、器官、细胞器、生物液体、血液样品、尿液样品或皮肤抑制剂和药物(组合物)。
基于发明人的发现，本发明提供了一种miR-23a的抑制剂，所述抑制剂的性质对本发明来说并不重要，只要它抑制miR-23a基因的功能性表达即可，举例来说，本发明的抑制剂可以是以miR-23a基因为靶序列、且能够抑制miR-23a基因的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA微小RNA、反义核酸的构建物。这些抑制剂作为对于下调miR-23a有用的物质，可用于治疗胃癌伪管生成。
作为本发明的一种优选方式，所述miR-23a的抑制剂是一种miR-23a特异性的siRNA。如本文所用，所述的抑制剂为含有该siRNA的质粒转染BGC823细胞后获得的外泌体，从而获得能够靶向胃癌伪管生成的稳定的药物组合物。在本发明的实施例中，该si-miR-23a在BGC823细胞中能够特异性的抑制miR-23a的表达，从而获得低表达或不表达miR-23a的BGC823细胞外泌体，从而获得能够靶向胃癌伪管生成的稳定的药物组合物，以抑制胃癌伪管的生长，从而达到抑制胃癌伪管生成的发生和发展，以达到靶向治疗胃癌的目的。
本发明的核酸抑制物如siRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。
本发明的药物组合物包括miR-23a的抑制剂以及药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。优先地，本发明使用BGC823细胞外泌体作为药物组合物的最终使用形式(该外泌体是通过含有si-miR-23a的质粒转染BGC823细胞后获得的)，在本发明的实施例中，本发明的药物组合物靶向抑制胃癌伪管的生长，从而达到抑制胃癌伪管生成的发生和发展。当然，本发明的药物组合物还可与其他治疗胃癌伪管生成的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
一、实验方法
1.生物信息学方法筛选胃癌差异miRNA和基因
利用GEO数据库，检索获得胃癌miRNA表达芯片。利用R语言“limma”包，进行差异分析，并利用“pheatmap”包，构建差异miRNA表达热图。利用starBase数据，检索miR-23a在TCGA胃癌样本中的表达情况。通过miRDB数据库，mirDIP数据库，starBase数据库，TargetScan数据库获取miR-23a的调控靶基因。利用MalaCards数据库，检索获得胃癌相关已知基因。通过STRING数据库，构建基因互作网络图。
2.样本的获取
本研究收集于2018年6月～2018年11月在本院进行胃癌切除术的患者肿瘤标本，共采集了40对胃癌组织标本和相邻的癌旁正常组织标本。在这些组织中，有22例Hp阳性(HP+)。Hp阴性(Hp-)组织18例。其中EB病毒(EBV)相关胃癌(EBVaGC)4例，非EBV感染胃癌组织(EBVnGC)18例。纳入标准：所有组织标本均经病理学检查证实为胃癌患者，且患者术前均未进行局部或全身治疗。排除标准：死于非胃癌疾病或事故。所有组织标本于术后经生理盐水清洗后立即放入液氮中速冻1h，随后放入-80℃冰箱中长期保存。本项研究经我院医学伦理委员会批准审核，且征得已有研究对象知情签字同意后展开，并按照“赫尔辛基宣言”进行。
3.胃癌细胞系的培养与筛选
人胃癌细胞株SGC 7901、BGC823、MKN28、MKN4及正常人胃粘膜上皮细胞系EGS-1均购自长沙银润生物技术有限公司(长沙,中国)。细胞在Dulbecco's modifid Eagle'smedium(DMEM；Gibco；Thermo Fisher Scientifi,Inc.,Waltham,MA,USA)中培养，并添加10％胎牛血清(FBS；Gibco；Thermo Fisher Scientifi,Inc.)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。随后利用qRT-PCR检测各胃癌细胞系外泌体中miR-23a的表达量并选取miR-23a表达量最高的胃癌细胞系用于后续实验。
4.细胞转染
按照LipofecTAMine 2000转染试剂盒说明书，以每孔6.0×105的数量将对数生长期细胞平铺于6孔板中，分别转染mimic和inhibitor到胃癌细胞中，每孔板加入25pmol的各组mimic和inhibitor和10μL的转染试剂，使终浓度为10pmol/mL轻柔摇匀，于37℃，5％CO2环境中培养。细胞转染实验分组为：(1)miR-23a mimic组(转染人工合成miR-23a类似物)；(2)miR-23amimic-NC组(转染mimic无意义序列)；(3)miR-23a inhibitor(转染miR-23a抑制物，其中抑制物为含有si-miR-23a的质粒)；(4)miR-23a inhibitor-NC(转染inhibitor无意义序列)。各实验组均独立重复3次。细胞连续培养48h后提取外泌体用于后续实验。
5.ExoQuick法提取外泌体
采用ExoQuick-TCTMExosome沉淀液试剂盒提取外泌体，遵循以下方法：采集血清250μL，300×g离心15min，去除细胞和细胞碎片。将上清液转至无菌容器中，加入63μLExoQuick外泌体沉淀液，然后冷藏过夜。第二天将ExoQuick/血清混合液1500×g离心30min。离心后，外泌体在容器底部可能以米黄色或白色颗粒的形式出现，吸取上清液。1500×g离心5min使残余ExoQuick混合液自旋下来。通过抽吸去除所有液体，注意不要干扰颗粒中沉淀的外泌体。用无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS)在-80℃的低温瓶中保存1/10至1/100的外泌体颗粒，备用。
6.透射电镜观察
为进行电镜分析，将分离的外泌体置于PBS中。将样品吸附在碳包覆镍网架上，用2％钨酸甲酯负染5min。然后用打火纸将污渍从栅格上擦干，用蒸馏水洗两次。水被擦干、样品干燥后，在JEM-1230电子显微镜(Nihon Denshi,Tokyo,Japan)下对样品进行了检验。加速电压为80千伏。
7.Nanosight纳米颗粒粒径分析
将离心所得的exosome沉淀物溶解于500μLPBS中制成悬液，1:100稀释，充分混匀后取300μL上清液，在20℃下保存，采用Nanosight LM10-HS纳米颗粒分析仪(Malvern,TheUnited Kingdom)进行粒径分析。
8.qRT-PCR
采用TRIZOL(15596-018，北京索莱宝科技有限公司，美国)试剂盒根据说明书步骤严格操作提取组织或细胞总RNA，并测定RNA浓度。本研究所用引物由大连Takara公司合成(如表1)。按照一步法miRNA反转录试剂盒(D1801，哈尔滨新海基因检测有限公司，哈尔滨，中国)和cDNA反转录试剂盒(K1622，北京雅安达生物技术有限公司，北京，中国)说明书进行反转录操作，设定反应条件为：42℃，30～50min(反转录反应)；85℃，5s(反转录酶失活反应)。反转录的cDNA稀释至50ng/μL，后续荧光定量PCR备用。每次加2μL，反应扩增体系为25μL。放入荧光定量PCR仪(ViiA7，中山大学达安基因有限公司，英国)中进行检测。反转录反应条件：95℃预变性4min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环。以2μg总cDNA为模板，以U6和β-actin作为内参引物采用相对定量法(2-△△CT法)计算目的基因的相对转录水平：△△Ct＝△Ct实验组-△Ct对照组，△Ct＝Ct(目的基因)-Ct(内参)，目的基因mRNA的相对转录水平＝2-△△Ct。实验重复三次。
表1引物序列
Figure BDA0002434888760000101
9.Western Blot
用裂解缓冲液制备细胞株蛋白裂解液，4℃裂解15min后15000×g离心15min，提取上清液采用BCA试剂盒(20201ES76，翊圣生物科技有限公司，上海)测定每个样品的蛋白浓度。根据不同浓度进行定量，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后采用湿转方法将蛋白转至PVDF膜上，5％BSA室温下封闭1h。滴加稀释的兔抗人一抗RUNX3(1:10000，ab32199，abcam,Cambridge,UK)、鼠抗人一抗VEGF(1:1000，AV202-1，Beyotime，China)、TSP-1(1:10000，ab85762，abcam,Cambridge,UK)、GAPDH(1:10000，ab181602，abcam,Cambridge,UK)等。4℃摇床孵育过夜。TBST洗膜5min×3次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG(ab205718，1:20000，Abcam，Cambridge，UK)稀释液室温下1h。TBST洗膜5min×3次，加入显影液，显影。ImageJ1.48u软件(National Institutes ofHealth)进行蛋白定量分析，以各蛋白的灰度值与内参GAPDH的灰度比值进行蛋白定量分析。实验重复3次。
10.外泌体分组
在胃癌细胞株BGC823中对miR-23a分别进行过表达和干扰处理后(转染方法见上文)，提取外泌体(提取方法见上文)，分为exo-miR-23a inhibitor组(抑制miR-23a表达的胃癌细胞来源的外泌体)、exo-NC-inhibitor组(抑制miR-23a表达的胃癌细胞来源的外泌体阴性对照)、exo-miR-23a mimic组(过表达miR-23a的胃癌细胞来源的外泌体)、exo-NC-mimic组(过表达miR-23a的胃癌细胞来源的外泌体阴性对照)。分组后，方便后续实验。
11.来源于胃癌细胞的外泌体与HUVECs共培养
将PBS溶解的外泌体与CFSE(C1031，Beyotime，China)按体积比10：1比例混合，置于37℃孵育箱中孵育10min，之后用100μL终止液终止反应，再4℃继续孵育30min，14000r/min离心3min，用200μLPBS重悬荧光标记的外泌体，加入去外泌体培养基。将外泌体与24孔板内接种的出现50-60％融合度的HUVEC培养上清液中共孵育48h，分组为：exo-miR-23ainhibitor+H组、exo-NC-inhibitor+H组、exo-miR-23a mimic+H组、exo-NC-mimic+H组以及exo-BGC823+H组(HUVECs与胃癌细胞株BGC823来源的exo共培养)和exo-NC+H组(HUVECs与去除exo的胃癌细胞株培养清液共培养)。以及exo-miR-23a mimic+H+oe-RUNX3组(转染过表达RUNX3的HUVECs与过表达miR-23a胃癌细胞外泌体共培养)和exo-miR-23a mimic+H+oe-NC组(转染过表达RUNX3的HUVECs与转染NC-mimic胃癌细胞外泌体共培养)。
培养后，用4′6-diamidinophenylidole(DAPI,Abbott,USA)对HUVECs进行核染色，然后用共聚焦显微镜(FV10i,Olympus,Japan)对HUVEC细胞观察。观察HUVECs对来源于胃癌细胞的外泌体的摄取情况。利用qRT-PCR检测miR-23a的表达水平。每次实验重复三次。
12.伪管生成实验
微伪管内皮细胞(human umbilical venous endothelial cell,HUVEC)(Catalog#5000，购于ScienCell Research Laboratories)用10％FBS的EGM-2培养液培养。20μl BD Matrigel TMMatrix用不含血清的RPMI-1640培养基1：1稀释(总量40μl)加入Transwell小室的多孔聚碳酯膜上表面(膜孔径8,um)，室温下通风橱中干燥1h聚合成胶。将HUVEC悬液以2×105个/mL，200μl/孔加入上室，下室内分组加入各组外泌体。置于37℃、5％CO2湿化培养箱24h后，光学显微镜下观察HUVEC形成的类微伪管样、首尾相接的管状结构的分支节点数，每孔取5个随机视野，数码相机拍照。
13.双荧光素酶实验
使用生物学网站http://www.targetscan.org进行靶向关系预测，利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-23a与RUNX3的靶向关系。分别构建靶基因RUNX3双荧光素酶报告基因载体以及与miR-23a结合位点突变的突变体：PGLO-RUNX3 WT和PGLO-RUNX3 MUT。将两种报告质粒与miR-23a mimic和阴性对照质粒分别共转染至HEK-293T细胞中，转染24h后裂解细胞，12000rpm/min离心1min，收集上清。使用双荧光素酶报告基因检测系统(
Figure BDA0002434888760000111
ReporterAssay System,E1910,Promega)检测荧光素酶活性。每个细胞样品中加入100μL萤火虫荧光素酶工作液检测萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)活性，加入100μL海肾荧光素酶工作液检测海肾荧光素酶(Renilla luciferase)活性，以萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性作为相对荧光素酶活性。实验重复3次。
二、实验结果
1.miR-23a在胃癌中高表达且miR-23a与胃癌伪管生成相关
利用GEO数据库，检索获得胃癌表达芯片GSE93415，该芯片中包含有20个胃癌样本及与其匹配的20个正常样本。对该芯片中的miRNA表达情况进行差异分析，发现有76个miRNA在胃癌中表现出显著差异表达。如图1A为其中显著性差异最大的前50个miRNA的表达热图。在这些差异miRNA中，我们发现miR-23a在胃癌样本中表现出显著高表达，并且其差异性最为显著。同时，在GEO数据库中，我们获得了另一个胃癌miRNA表达芯片GSE78091，对该芯片中miR-23a的表达水平进行分析发现它在胃癌中表现出显著的高表达(如图1B)，此外，在TCGA胃癌数据中对miR-23a的表达情况进行分析，发现它同样在胃癌中表现出显著的高表达(如图1C)。为进一步证明miR-23a在胃癌中是高表达的，我们首先利用qRT-PCR检测胃癌组织(GC)中miR-23a的表达量，以癌旁组织为对照(Adjcent)，结果显示(如图1D)：与癌旁组织相比，miR-23a在胃癌组织中的表达量明显增加；随后，我们又利用qRT-PCR检测了人胃正常粘膜上皮细胞系GES-1和胃癌细胞系(SGC 7901、BGC823、MKN28、MKN4)中miR-23a的表达，结果显示(如图1E)：与GES-1相比，SGC 7901、BGC823、MKN28、MKN4中miR-23a的表达量显著上升，综上结果可证明miR-23a在胃癌中是高表达的。同时，我们还利用Western Blot检测胃癌组织中伪管生成相关因子VEGF、TSP-1的表达量，以癌旁组织为对照，结果显示(如图1F)：与癌旁组织相比，VEGF在胃癌组织中的表达量明显增高，而TSP-1的表达量呈现的趋势则相反，说明在胃癌组织中，伪管生成更加显著。
2.来源于胃癌细胞的外泌体中含有miR-23a
已有研究表明，miR-23a能够被鼻咽癌等肿瘤细胞分泌的外泌体携带，进而发挥调控功能。这些结果暗示在胃癌外泌体中，它极有可能被胃癌外泌体携带，参与胃癌伪管生成。为验证这一推测，我们利用ExoQuick法提取正常胃粘膜上皮细胞系GES-1和胃癌细胞系(SGC7901、BGC823、MKN28、MKN4)中的外泌体并对其进行了鉴定，首先我们通过透射电镜观察外泌体的超微结构，可以清晰地观察到分泌物呈现exosomes典型的形貌特征，大小不等，具有脂质双层分子膜包绕形成的球体结构，其外部为双层脂质分子膜的深染区，内部为不均质浅染区，可见部分为蛋白质密度物质(如图2A)。然后利用Nanosight粒径分析对外泌体粒径进行检测，结果显示(如图2B)：提取的外泌体粒径主要分布在100nm左右。同时采用Western blot对胃癌细胞和外泌体表面标志物(CD63、Alix、TSG101)进行检测，结果显示(如图2C)：它们在外泌体中均有较高表达。我们还利用了qRT-PCR检测正常胃细胞系GES-1和各胃癌细胞系外泌体中miR-23a的表达量，结果显示(如图2D)：与正常胃粘膜上皮细胞系GES-1相比，从不同胃癌细胞中提取的外泌体中miR-23a的表达量均有明显增加，其中来源于BGC823的外泌体中miR-23a含量最高，用于后续实验。综上结果，可证明来源于胃癌细胞的外泌体中含有miR-23a。
3.来源于胃癌细胞的外泌体与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)共培养，促进伪管生成
为了验证来源于胃癌细胞的外泌体与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)共培养后能够促进伪管生成，我们首先分两组进行后续实验，exo-BGC823+H组(HUVECs与胃癌细胞株BGC823来源的exo共培养)和exo-NC+H组(HUVECs与去除exo的胃癌细胞株培养液共培养)。
我们用CFSE标记外泌体(绿色)、DAPI标记HUVECs细胞核(蓝色)，利用共聚焦显微镜观察HUVECs对外泌体的摄取情况，结果如图3A所示：发现HUVECs摄取CFSE-exosomes现象随着时间的增加越来越明显。然后我们利用伪管生成实验检测HUVECs伪管生成能力，测量形成的伪管长度，成环数和节点，结果显示(如图3B-E)：exo-BGC823+H组的伪管生成能力大于exo-NC+H组，表现在其伪管长度，成环数和节点均较exo-NC+H组有明显增加。同时，我们利用Western Blot检测了exo-BGC823+H组和exo-NC+H组中VEGF、TSP-1的表达量，结果显示(如图3F-G)：与exo-NC+H组相比，exo-BGC823+H组中VEGF的表达量明显增加，而TSP-1的表达趋势则正好相反，该结果也进一步验证胃癌细胞来源的外泌体能增加伪管生成能力。我们还利用EdU检测了exo-BGC823+H组和exo-NC+H组中HUVECs细胞增殖的情况，结果显示(如图3H)：与exo-NC+H组相比，exo-BGC823+H组中HUVECs细胞增殖显著增加。综上结果，可证明来源于胃癌细胞的外泌体与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)共培养后能够促进伪管生成。
4.外泌体中的miR-23a促进伪管生成
为了进一步研究胃癌细胞来源的外泌体促进伪管生成是否是由于miR-23a，首先我们分组进行后续实验：在BGC823中对miR-23a分别进行过表达和干扰处理后，qRT-PCR检测各组中miR-23a的表达，结果显示(如图4A)：与exo-NC-mimic组相比，exo-miR-23a mimic组中miR-23a的表达量明显上升，而与exo-NC-inhibitor组相比，exo-miR-23a inhibitor组中miR-23a的表达量却明显下降。将各组外泌体与HUVECs共培养，利用伪管生成实验检测HUVECs伪管生成能力，测量形成的伪管长度，成环数和节点，结果显示(如图4B-E)：exo-miR-23a mimic+H组的伪管生成能力大于exo-NC-mimic+H组，其伪管长度，成环数和节点均较exo-NC-mimic+H组有明显增加，而exo-miR-23a inhibitor+H组的伪管生成能力却小于exo-NC-inhibitor+H组，其伪管长度，成环数和节点的生长趋势也正好相反。同时，我们利用Western Blot检测了各组细胞中VEGF、TSP-1的表达量，结果显示(如图4F-G)：与exo-NC-mimic+H组相比，exo-miR-23a mimic+H组中VEGF的表达量明显增加，而与exo-NC-inhibitor+H组相比，exo-miR-23a inhibitor+H组中VEGF的表达量却明显减少，TSP-1的表达趋势则正好相反。我们还利用EdU检测了HUVECs细胞增殖的情况，结果显示(如图4H-I)：与exo-NC-mimic+H组相比，exo-miR-23a mimic+H组中HUVECs细胞增殖显著增加，而与exo-NC-inhibitor+H组相比，exo-miR-23a inhibitor+H组中HUVECs细胞增殖显著减少。综上结果，外泌体中的miR-23a促进伪管生成。
5.RUNX3是miR-23a的下游靶基因
为了进一步了解miR-23a在胃癌中的作用机制，利用RNA22等数据库对miR-23a的下游靶基因进行预测，确定了RUNX3和miR-23a的靶向结合关系(图5A)，同时使用GEPIA数据库确定RUNX3在胃癌中的表达情况，结果显示和对照组相比，在胃癌组织中RUNX3显著低表达(图5B)。为证实RUNX3是miR-23a的直接靶基因，利用双荧光素酶报告基因实验进行靶点验证，结果显示(图5C)：与NC-mimic组相比，miR-23a-mimic组中RUNX3野生型3'-UTR的荧光素酶活性被miR-23a显著抑制，而突变型3'-UTR的荧光素酶活性在不同处理的组别中没有明显变化。
6.miR-23a通过靶向RUNX3调控AKT通路促进伪管生成
为了验证miR-23a通过靶向抑制RUNX3的表达，促进伪管生成，我们在HUVECs与exo-miR-23a mimic共培养体系中过表达RUNX3，利用qRT-PCR检测各组中RUNX3的表达量，结果显示(如图6A)：与exo-miR-23a mimic+H+oe-NC组相比，exo-miR-23a mimic+H+oe-RUNX3组中RUNX3的表达量显著上升。同时我们利用Western Blot检测了RUNX3、PIP3、p-Akt/Akt的表达量，结果显示(如图6B-C)：与exo-miR-23a mimic+H+oe-NC组相比，exo-miR-23a mimic+H+oe-RUNX3组中RUNX3的表达量显著上升，但PIP3，p-Akt/Akt的表达趋势却相反。接着我们利用伪管生成实验检测HUVECs伪管生成能力，测量形成的伪管长度，成环数和节点，结果显示(如图6B-E)：exo-miR-23a mimic+H+oe-NC组的伪管生成能力大于exo-miR-23a mimic+H+oe-RUNX3组，表现在其伪管长度，成环数和节点均较exo-miR-23a mimic+H+oe-RUNX3组有明显增加。同时，我们利用Western Blot检测了各组VEGF、TSP-1的表达量，结果显示(如图6F-G)：与exo-miR-23a mimic+H+oe-NC组相比，exo-miR-23a mimic+H+oe-RUNX3组TSP-1的表达量明显增加，VEGF的表达趋势则正好相反。我们用EdU法检测HUVECs细胞增殖的情况，结果显示(如图6H-I)：与exo-miR-23a mimic+H+oe-NC组相比，exo-miR-23amimic+H+oe-RUNX3组中HUVECs细胞增殖显著减少。综上结果可验证，miR-23a通过靶向抑制RUNX3的表达，促进伪管生成。
综上所述，miR-23a在胃癌细胞分泌的外泌体中处于高表达状态，并且高表达的胃癌细胞来源外泌体miR-23a可促进胃癌伪管生成，胃癌伪管生成与胃癌进展密切相关，具体机制为外泌体miR-23a通过靶向RUNX3调控AKT通路从而参与胃癌伪管生成，揭示外泌体miR-23a为影响胃癌伪管生成的重要途径，通过抑制外泌体miR-23a表达可为胃癌治疗提供一种新方法。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 湖南博医翻译咨询有限公司
<120> miR-23a作为诊断和治疗胃癌伪管生成标志物的应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agcagccagt tacccaaga 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgacagtgcg agactccatc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> si-miR-23a核苷酸序列
<400> 3
cccctcccta aacgaaggac 20
<210> 4
<211> 73
<212> DNA
<213> miR-23a核苷酸序列
<400> 4
ggccggctgg ggttcctggg gatgggattt gcttcctgtc acaaatcaca ttgccaggga 60
tttccaaccg acc ccc ctccctaaa cgaaggac 73

Claims (11)

1.一种miRNA，所述miRNA为miR-23a，其特征在于，检测miR-23a表达水平的试剂在制备诊断胃癌伪管生成的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为特异性扩增miR-23a的引物。
3.一种诊断胃癌伪管生成的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测miR-23a表达水平的试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂为特异性扩增miR-23a的引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增miR-23a的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
6.一种miR-23a基因的用途，其特征在于，用于制备治疗胃癌伪管生成的药物组合物。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述药物组合物包括miR-23a基因的抑制剂。
8.一种治疗胃癌伪管生成的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括miR-23a基因的抑制剂。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述miR-23a基因的抑制剂为si-miR-23a。
10.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述的miR-23a基因的抑制剂为含有si-miR-23a的质粒转染BGC823细胞后获取的外泌体。
11.根据权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述si-miR-23a的序列如SEQ IDNO.3所示。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112175951A (zh) * 2020-09-30 2021-01-05 深圳大学 一种miRNA-23a-5p抑制剂及其在制备治疗高盐损害疾病的药物中的应用

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