CN111118156B - 诊断和治疗膀胱癌的分子标志物LncRNA AC012640.1及其用途 - Google Patents

诊断和治疗膀胱癌的分子标志物LncRNA AC012640.1及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子诊断和生物医药技术领域，公开了一种诊断和治疗膀胱癌的分子标志物LncRNA AC012640.1及其用途，AC012640.1的序列如SEQ ID NO:1所示，其可作为膀胱癌的肿瘤分子标志物和治疗靶点，能够用于诊断膀胱癌，对于患有膀胱肿瘤的患者，可使用本发明的检测试剂检测肿瘤组织的LncRNA AC012640.1表达量，当检测发现LncRNA AC012640.1表达量显著高于肿瘤旁边的正常膀胱组织或试剂盒中提供的正常膀胱组织时，可作为判定其为恶性组织的依据以及治疗靶点选择依据，再采用LncRNA AC012640.1的表达抑制剂siRNA治疗膀胱癌。

Description

诊断和治疗膀胱癌的分子标志物LncRNA AC012640.1及其 用途
技术领域
本发明涉及分子诊断和生物医药技术领域，具体涉及一种诊断和治疗膀胱癌的分子标志物LncRNA AC012640.1及其用途。
背景技术
膀胱癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，膀胱癌的发病率在所有恶性肿瘤中排名第11，在男性恶性肿瘤中排名第6。全球癌症统计数据的最新数据表明，每年的膀胱癌新病例和死亡分别高达440,000和150,000。膀胱癌与不同的组织病理学类型和临床表现有关，这使其更难以诊断和治疗。膀胱癌的最常见的组织病理学类型是尿道上皮癌。此外，由于频繁和远处转移，非肌肉浸润性膀胱癌患者的5年生存率高达85％，而肌肉浸润性膀胱癌患者的5年生存率仅为6％。尽管进行了手术，放疗和化疗，但浸润性和转移性膀胱癌患者的死亡率仍然很高。
近年来，已证实ncRNA，包括小型ncRNA(例如microRNA)和长非编码RNA(LncRNA)在各种生物过程中，尤其是在癌症中起着关键作用。LncRNA的生物学功能包括染色体沉默、基因组印迹、染色质修饰、转录激活、转录干扰和核转运。LncRNA在膀胱癌发展中的这种作用尚不清楚，需要进一步研究。因此，需要为膀胱癌的诊断、预后判断发掘新的生物标志物和治疗剂，以及为膀胱癌的治疗提供突破点。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种诊断和治疗膀胱癌的分子标志物LncRNA AC012640.1及其用途，LncRNA AC012640.1可作为膀胱癌的肿瘤分子标志物和治疗靶点，能够用于诊断膀胱癌；LncRNA AC012640.1的表达抑制剂siRNA可用于治疗膀胱癌。
AC012640.1基因可检测到一个转录本，长度为688bp，序列如SEQ ID NO:1所示；这个转录本未编码蛋白质，因此为LncRNA。
发明人在对膀胱癌的研究过程中发现，肿瘤样本中AC012640.1的表达量高于癌旁正常组织。在随后的实验中还发现，敲低AC012640.1的表达后，膀胱癌细胞的迁移和侵袭受到抑制。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。
(一)LncRNA AC012640.1在制备膀胱癌诊断剂中的应用，LncRNA AC012640.1的序列如SEQ ID NO:1所示。
(二)一种用于检测膀胱癌的诊断试剂盒，包括检测LncRNA AC012640.1表达量的试剂。
优选的，所述检测LncRNA AC012640.1表达量的试剂为RT-PCR试剂、Northern检测试剂或RNA检测探针。
进一步优选的，所述检测LncRNA AC012640.1表达量的试剂为RT-PCR试剂，所述RT-PCR试剂包含序列如SEQ ID NO:2所示的正向扩增引物，以及序列如SEQ ID NO:3所示反向扩增引物。
优选的，所述诊断试剂盒还包括RNA提取试剂。
优选的，所述诊断试剂盒还包括阴性对照和阳性对照；所述阴性对照为正常膀胱组织样品，所述阳性对照为已经被鉴定为高表达LncRNA AC012640.1的膀胱癌组织样品。
(三)LncRNA AC012640.1基因表达的抑制剂在制备治疗膀胱癌药物中的应用。
优选的，所述抑制剂为抑制LncRNA AC012640.1基因表达的siRNA。
优选的，所述siRNA的序列为如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示中的至少一种。
(四)一种治疗膀胱癌的药物，所述药物包含抑制LncRNA AC012640.1基因表达的抑制剂和药物学上可接受的载体。
优选的，所述抑制剂为抑制LncRNA AC012640.1基因表达的siRNA。
优选的，所述siRNA的序列为如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示中的至少一种。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
对于患有膀胱肿瘤的患者，可使用本发明的提供的检测试剂检测肿瘤组织的LncRNA AC012640.1表达量，当检测发现LncRNA AC012640.1表达量显著高于肿瘤旁边的正常膀胱组织或试剂盒中提供的正常膀胱组织时，可作为判定其为恶性组织的依据以及治疗靶点选择依据。然后可施用LncRNA AC012640.1表达抑制剂，例如本发明提供的siRNA来进行治疗。
附图说明
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为54例膀胱癌组织样本中LncRNA AC012640.1表达量的统计图；lowexpression为低表达，high expression为高表达；
图2为显示膀胱癌组织和正常膀胱组织样本中LncRNA AC012640.1表达量的分布的散点图；adjacent tissues为正常膀胱组织，tumor tissues为膀胱癌组织；
图3为LncRNA AC012640.1在转化细胞系SV-HUC-1细胞和肿瘤细胞系(T24、5637、RT4、J82)中的表达量统计图；
图4为向T24中分别转入3种siRNA后LncRNA AC012640.1的表达量统计图，*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；
图5为向5637中分别转入3种siRNA后LncRNA AC012640.1的表达量统计图，*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；
图6为向T24转入siRNA-2的划痕实验照片；
图7为根据图6的实验照片计算的T24的相对迁移能力；
图8为向5637转入的siRNA-2的划痕实验照片；
图9为根据图8的实验照片计算的5637的相对迁移能力；
图10为向T24和5637转入siRNA-2的transwell实验照片；
图11为根据图10的实验照片计算的T24的相对迁移能力；
图12为根据图10的实验照片计算的5637的相对迁移能力；
图13为向T24转入siRNA-2的培养0-96小时的生长曲线；
图14为向5637转入siRNA-2的培养0-96小时的生长曲线；
图15为向T24转入siRNA-3的划痕实验照片；
图16为根据图15的实验照片计算的T24的相对迁移能力；
图17为向5637转入的siRNA-3的划痕实验照片；
图18为根据图17的实验照片计算的5637的相对迁移能力；
图19为向T24和5637转入siRNA-3的transwell实验照片；
图20为根据图19的实验照片计算的T24的相对迁移能力；
图21为根据图19的实验照片计算的5637的相对迁移能力；
图22为向T24转入siRNA-3的培养0-96小时的生长曲线；
图23为向5637转入siRNA-3的培养0-96小时的生长曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域的技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。
实施例1
54例膀胱癌组织样本中的LncRNA AC012640.1表达量检测
1.1RNA提取
(1)样本组织需剪碎研磨成匀浆后加入1mL Trizol裂解液，细胞需要用PBS缓冲液清洗两遍后加入1mL Trizol，之后将消化好的组织或细胞移入不含RNA酶的1.5mL EP管中，室温放置5min。
(2)每1mL Trizol加入200μL氯仿，用力剧烈震荡，室温下静置5min。4℃条件下，12000g，高速离心15min。
(3)取出EP管，可见液体分三层，上层为目的RNA萃取液，中间层蛋白杂质，下层为浑浊液，用微量移液器吸取400μL上层液体，并小心转移至新的EP管中。
(4)在新的EP管中按照1:1的比例加入异丙醇，上下快速颠倒混匀，可看见絮状沉淀，室温静置10min。4℃条件下，12000g，高速离心10min。
(5)弃上清，注意不要把沉淀倒出，加入75％乙醇l mL(按750μL无水乙醇+250μLDEPC水配制)进行洗涤。4℃条件下，12000g，高速离心5min。弃上清，重复一次。
(6)用微量移液器将EP管底部的剩余液体吸出，在通风橱中干燥沉淀l0min，待沉淀干燥后加入20μL DEPC水溶解RNA沉淀，小心吹打混匀。
(7)取1μL RNA溶液用紫外分光光度计测量RNA浓度。
1.2 RNA反转录
根据TaKaRa公司的逆转录试剂盒说明书进行操作。
1.3 RT-qPCR
总反应体系20μL：2×SYBR Green PCR Master mix(Taraka公司)10μL，引物1.0μL，cDNA 2μL，双氧水7μL；
引物序列为：
AC012640.1-F：5’-GGCACTACTGTTACCACCGTCAC-3’(SEQ ID NO:2)
AC012640.1-R：5’-AGGCACACTGATGGATTGGAATCG-3’(SEQ ID NO:3)
使用LightCycler480荧光定量PCR仪进行扩增反应，程序设定如下：95℃5min；95℃5s，60℃30s，72℃20s，40循环；72℃5min；
结果如图1所示，54例确诊为膀胱癌组织样本中，有81.5％的肿瘤组织发生了LncRNA AC012640.1高表达，图2显示，LncRNA AC012640.1的表达量显著高于正常的膀胱组织(P＜0.05)，因此可认为，LncRNA AC012640.1可作为膀胱癌的诊断标志物之一。
实施例2
膀胱癌细胞系中的LncRNA AC012640.1表达量检测
采用实施例1的方法，对四种膀胱上皮癌细胞系T24、5637、RT4、J82中的LncRNAAC012640.1表达量进行检测，并与转化细胞系SV-HUC-1中的表达量进行比较。
结果如图3所示，四种膀胱癌细胞系中LncRNA AC012640.1表达量均高于转化细胞系SV-HUC-1，尤其是T24和5637中。
实施例3
LncRNA AC012640.1的敲低
根据实施例2的实验结果，选择T24和5637细胞系用来做LncRNA AC012640.1的敲低实验，并检测敲低后的相关基因表达和细胞迁移能力。
1)LncRNA AC012640.1的敲低
LncRNA AC012640.1的敲低使用siRNA的方法来实现，具体方法如下：六孔板铺上细胞，第二天长满培养板50％时，用Opti-MEM饥饿30min；
取2.5nmol siRNA/siNC用125μL DEPC水溶解，每个孔的取量为10μL。取两个管标号A、B，每管加入100μL Opti-MEM；A管加入10μL lipofectamine3000，B管中加入siRNA或者siNC 10μL，分别混匀室温静置5min。将A、B两管充分混匀，静置15min加入到六孔板中，转染6-8h。
发明人在研究中使用了三种siRNA，序列如下：
5’-UUGUGAAAAAUAGAAUGUCCU-3’
siRNA-1：3’-ACAACACUUUUUAUCUUACAG-5’(核心序列为UUGUGAAAAAUAGAAUGUCCU，SEQ ID NO：4)
5’-UUAUUUCACGUUAGCUUUGCC-3’
siRNA-2：3’-AGAAUAAAGUGCAAUCGAAAC-5’(核心序列为UUAUUUCACGUUAGCUUUGCC，SEQ ID NO：5)
5’-UUCUUCAAGGACAUUUUAGAU-3’
siRNA-3：3’-ACAAGAAGUUCCUGUAAAAUC-5’(核心序列为UUCUUCAAGGACAUUUUAGAU，SEQ ID NO：6)
实验结果如图4和5所示，将以上三种siRNA分别转入T24和5637细胞系后，两种细胞系中的LncRNA AC012640.1表达量均降低。
2)肿瘤细胞的迁移能力测试
对肿瘤细胞进行划痕实验(图6-9为转入siRNA-2的划痕试验结果图，图15-18为转入siRNA-3的划痕试验结果图)和transwell实验(图10-12为转入siRNA-2的transwell实验结果图，图19-21为转入siRNA-3的transwell实验结果图)。
划痕实验的具体方法如下：
转染后当细胞密度达到60％-70％左右时，垂直于孔板在细胞培养板内快速划线(横竖各划2道)，尽量保证各个划痕宽度一致。弃去细胞培养基，加入PBS缓冲液清洗细胞两到三次。加入不含血清的培养基，用倒置显微镜拍照，拍照时间记为0h。放入细胞培养箱培养，在12h、24h、8h分别在倒置显微镜下相同视野处拍照，并观察对照组和实验组细胞的迁移情况。
transwell实验的具体方法如下：
转染后将细胞消化离心，用无血清培养基重悬细胞，细胞计数板计数后，用无血清培养基按照每个小室2×104个细胞数配制成细胞悬液。在transwell小室下(即24孔板底部)加入500μL含10％FBS的完全培养基，小室内加入200μL配制的细胞悬液，并在37℃含5％CO2的细胞培养箱中继续培养36-48h。用小镊子取出transwell小室，吸去小室内外的培养基。用4％的多聚甲醛常温固定30min。每孔加入500μL 0.1％的结晶紫染色液，使transwell小室底膜完全浸没在结晶紫染色液内，常温下染色30min。在倒置显微镜下拍照观察小室底部由小室内穿过来的细胞数。
结果如图6-21所示，与未被敲低的肿瘤细胞相比，转入siRNA的T24和5637细胞迁移能力降低。
3)肿瘤细胞的增殖能力测试
消化转染后的细胞并离心和重悬细胞，使用细胞计数板计数细胞数，对照组和实验组各设置0h、24h、48h、96h四组，将96孔板转移至37℃含5％CO2的细胞培养箱中，分别在细胞转染后的0h、24h、48h、96h取出，在避光条件下每孔中加入培养基总体积10％的CCK-8试剂，继续培养30-60min，96孔板中溶液颜色由无色变为黄色。用酶标仪在450nm波长下测量96孔板中各孔的吸光值(OD值)。
结果如图13-14、图22-23所示，肿瘤细胞的增殖能力显著降低。
综上所述，LncRNA AC012640.1的表达抑制剂可有效抑制高表达LncRNAAC012640.1的膀胱癌细胞的迁移和增殖，从而可作为这类膀胱癌的治疗剂或辅助治疗剂。
虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 陕西帆昌生物科技有限公司
<120> 诊断和治疗膀胱癌的分子标志物LncRNA AC012640.1及其用途
<130> 1
<141> 2020-01-17
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 688
<212> DNA
<213> 人()
<400> 1
acacagagga tgccatagga cattctattt ttcacaacaa tcgaaggagc caaatgaatt 60
gcagaagtca ccatttttaa tgaggaaaca ctgaattggc aaagctaacg tgaaataaga 120
cctgactcca aaatctaaaa tgtccttgaa gaacacttca aggtctagcg ccttgccagg 180
caccgttctc cttgaatctc acagcagccc tgtgagtagg cactactgtt accaccgtca 240
ctttgcagac agggaacccg agggacaaag aagttaaggg atttcctcaa agccacagct 300
aggaagagcg gcagaactgc gattccaatc catcagtgtg cctccactat ccctattcct 360
taagatcgtg ccaaaggctg agtcacttgc actaagtagc ctagaacagt ctctggggaa 420
acgcgcccgc cgacaaggat cgccagaacc ggcgcgggca ccgcgcggcg accaggagct 480
ctggtcaccg aaggccaggc tggaggccag agcagccgcc cgcacccggt caccgcctcg 540
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<212> RNA
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 6
uucuucaagg acauuuuaga u 21

Claims (4)

1.LncRNA AC012640.1基因表达的抑制剂在制备治疗膀胱癌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，所述抑制剂为抑制LncRNA AC012640.1基因表达的siRNA。
3.根据权利要求2所述的应用，所述siRNA的序列为如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQID NO:6所示中的至少一种。
4.一种治疗膀胱癌的药物，其特征在于，所述药物包含抑制LncRNA AC012640.1基因表达的抑制剂和药物学上可接受的载体，所述抑制剂为抑制LncRNA AC012640.1基因表达的siRNA，所述siRNA的序列为如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示中的至少一种。
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