CN114934048B - 一种用于肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物的circMTMR14及试剂盒和应用 - Google Patents

一种用于肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物的circMTMR14及试剂盒和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物的circMTMR14及试剂盒和应用，属于肿瘤诊断技术领域，其碱基序列如图1所示，为MTMR14mRNA第5和第6外显子反向剪接形成的新的环状RNA。相比于正常患者，肺癌和结直肠癌患者血液外泌体中circMTMR14呈现高表达，circMTMR14的表达与肺癌细胞的迁移、侵袭和转移的能力呈现正相关。因此，circMTMR14作为肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物应用到肿瘤治疗、肿瘤诊断中，并为治疗相关的药物及诊断产品提供了新思路和新方向。

Description

一种用于肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物的circMTMR14及试 剂盒和应用
技术领域
本申请涉及肿瘤诊断技术领域，尤其涉及一种用于肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物的circMTMR14及试剂盒和应用。
背景技术
肺癌(Lung cancer)是发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤之一，且死亡率很高，已经成为世界范围内男性和女性死亡的主要原因。吸烟仍然是诱发肺癌的主要原因，近年来二手烟和三手烟也逐渐成为肺癌的诱发因素。但肺癌的具体病理机制尚不清楚。肺癌的诊断主要依靠影像学诊断、血清肿瘤标志物检查和组织活检。由于早期肺癌缺乏特异性症状，大多数肺癌患者在没有定期筛查的情况下直到晚期才确诊，预后一般较差且不可逆。手术是早期肺癌患者的推荐治疗方法。对于晚期肺癌患者，放疗和化疗是主要的治疗手段然而，放疗和化疗往往会产生严重的副作用，使患者无法耐受。近年来，分子靶向治疗和免疫治疗日益流行，但只适用于某些特定类型的肺癌患者。因此，迫切需要探索更具体、更有效的肺癌诊断和治疗方法。
只有不到2％的人类基因组序列是蛋白质编码基因，而人类转录组大多数序列是非编码RNA，即没有编码蛋白质的能力。circRNA是一类由mRNA前体反向剪接形成的不具有5’帽子和3’poly(A)尾的单链闭合的新型非编码RNA分子。随着RNAseq技术和生物信息学分析技术的不断更新和完善，大量的circRNA被发现广泛表达于真核生物中，例如在真核细胞中就有近10％的基因转录可以剪接产生circRNA并发挥生物学功能。circRNA在真核细胞中发挥着广泛的生物学功能，例如作用于miRNA“海绵”、蛋白质“海绵”、调节mRNA的稳定性、调节亲本基因转录，此外，有研究表明部分circRNA具有翻译功能蛋白的能力。多项研究表明，circRNA在肿瘤的发生发展和侵袭或转移中起着至关重要的作用。
近年来，circRNA被广泛报道参与非小细胞肺癌的发生发展。circRNA主要以吸附miRNA或编码蛋白的方式促进非小细胞肺癌进程。Botai Li等人发现circNDUFB2通过去稳定IGF2BPs和激活抗肿瘤免疫从而抑制非小细胞肺癌的进展。Daishi Chen等人发现hsa_circ_100395调控miR-1228/TCF21通路来抑制肺癌进展。另外，Yongsheng Zhao等人也认为circCDR1as通过靶向miR-641/HOXA9轴调控非小细胞肺癌细胞的干性和顺铂耐药。但总的来说，大多数circRNA在非小细胞肺癌的过程和发病机制中的具体作用仍不清楚。
因此，探索circRNA在非小细胞肺癌发生发展中的具体作用和分子机制，开发新型早期诊断标志物和可行治疗靶标，对非小细胞肺癌患者的诊断和治疗提供有潜力的临床诊断和治疗背景。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物的circMTMR14及其试剂盒和应用。
根据本发明实施例的第一方面，提供了一种用于肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物的circMTMR14，所述circMTMR14的碱基序列如SEQ ID No.1所示。
根据本发明实施例的第二方面，提供了一种检测样本中肿瘤标志物circMTMR14表达水平的试剂盒，包括与权利要求1所述的circMTMR14特异性互补配对的分子探针和/或用于扩增权权利要求1所述的circMTMR14的引物对。
进一步地，所述引物对选自以下引物对1～6中的至少一种；
其中，引物对1的碱基序列如SEQ ID NO.2～3所示；引物对2的碱基序列如SEQ IDNO.4～5所示；引物对3的碱基序列如SEQ ID NO.6～7所示；引物对4的碱基序列如SEQ IDNO.8～9所示；引物对5的碱基序列如SEQ ID NO.16～17所示；引物对6的碱基序列如SEQ IDNO.18～19所示。
进一步地，所述分子探针对选自以下分子探针对1～3中的至少一种；
其中，分子探针对1的碱基序列如SEQ ID NO.10～11所示；分子探针对2的碱基序列如SEQ ID NO.12～13所示；分子探针对3的碱基序列如SEQ ID NO.14～15所示。
进一步地，所述检测样本包括非小细胞肺癌组织和非小细胞肺癌癌旁组织中的至少一种。
根据本发明实施例的第三方面，提供了第一方面所述的circMTMR14在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
进一步地，所述肿瘤包括肺癌，优选的，所述肿瘤包括非小细胞肺癌。
进一步地，所述肿瘤包括原发瘤和转移瘤。
根据本发明实施例的第四方面，提供了一种用于检测样本中肿瘤标志物表达水平的试剂在制备用于检测非小细胞肺癌的试剂盒中的应用，所述肿瘤标志物circMTMR14的碱基序列如SEQ ID No.1所示。
根据本发明实施例的第五方面，提供了一种用于预防和/或治疗肿瘤的药物，所述药物以第一方面所述circMTMR14为活性成分。
本申请的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：
由上述实施例可知，本申请首次公开MTMR14 mRNA第5和第6外显子反向剪接形成的环状RNA(circMTMR14)，circMTMR14的表达具有明显的人鼠进化保守性，同时还具有耐受RNA酶R消化及放线菌素D处理的特点。circMTMR14在肿瘤组织和细胞中表达上调，且circMTMR14高表达的肿瘤患者预后较差，circMTMR14的表达水平与非小细胞肺癌患者淋巴结转移和远处转移呈正相关；本发明相关实验均证明：无论是稳定表达circMTMR14的肿瘤细胞系，还是内源circMTMR14敲除细胞系，均可以证明circMTMR14高表达显著促进非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而对细胞凋亡能力无显著影响。因此，本发明基于这一新型环状RNA(circMTMR14)核酸序列，可以为肿瘤治疗，尤其是转移瘤的临床治疗或预防方面提供一种新的药物靶点，为提前诊断肿瘤的发生提供了新的思路和策略。应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本申请。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施例，并与说明书一起用于解释本申请的原理。应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例提供的circMTMR14反向剪接位点序列的Sanger测序图；
图2为本发明实施例提供的circMTMR14K反向剪接的扩增产物聚丙烯酰胺凝胶图；
图3为本发明实施例提供的验证circMTMR14的稳定性的RNA酶R消化实验结果图；
图4为本发明实施例提供的检测circMTMR14的半衰期的放线菌素D处理结果图；
图5为本发明实施例提供的检测circMTMR14在肺癌细胞中敲除效率的RT-PCR结果图；
图6为本发明实施例提供的检测敲低circMTMR14后对肺癌增殖能力影响的结果图；
图7为本发明实施例提供的circMTMR14后对肺癌转移能力影响的伤口愈合结果图；
图8为本发明实施例提供的检测敲低circMTMR14后对肺癌迁移能力影响的Transwell结果图；
图9为本发明实施例提供的检测敲低circMTMR14后对肺癌侵袭能力影响的Transwell结果图；
图10为本发明实施例提供的检测circMTMR14在肺癌细胞中过表达效率的RT-PCR结果图；
图11为本发明实施例提供的检测过表达circMTMR14后对肺癌转移能力影响的伤口愈合结果图；
图12为本发明实施例提供的检测过表达circMTMR14后对肺癌迁移能力影响的Transwell结果；
图13为本发明实施例提供的检测过表达circMTMR14后对肺癌侵袭能力影响的Transwell结果图；
图14为本发明实施例提供的分析敲低circMTMR14对肺癌转移蛋白的westernblot结果图；
图15为本发明实施例提供的分析过表达circMTMR14对肺癌转移蛋白的westernblot结果图；
图16为本发明实施例提供的分析敲低circMTMR14后对肺癌体内转移能力影响的裸鼠肺部结果图；
图17为本发明实施例提供的分析敲低circMTMR14后对肺癌体内转移能力影响的肺部和肝脏转移灶H&E染色图。
具体实施方式
这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本申请相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本申请的一些方面相一致的装置和方法的例子。
在本申请使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
本发明提供了检测样本中circMTMR14表达水平的试剂在制备用于非小细胞肺癌检测的试剂盒中的应用。
上述肿瘤标志物PDE1A属于RNA肿瘤标志物。
本文中的“检测”可以指对样品进行非小细胞肺癌的诊断、辅助诊断或预后评估的检测。
本发明提供了一种用于肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物的circMTMR14及试剂盒和应用，所述circMTMR14的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述circMTMR14由MTMR14mRNA第5和第6外显子反向剪接形成的环状RNA。circMTMR14的表达具有明显的人鼠进化保守性，耐受RNA酶R消化及放线菌素D处理，具有较高的稳定性。本发明实验证明，circMTMR14的表达水平在肿瘤组织与癌旁组织中呈显著性差异，因此，可以作为肿瘤诊断生物标志物应用于肿瘤治疗中。且circMTMR14高表达的肺癌患者预后较差，说明circMTMR14本身可以作为评估肿瘤预后作用的标志物。因此，本发明提供了一种用于肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物的试剂盒，包括与第一方面所述circMTMR14特异性互补配对的分子探针和/或用于扩增权第一方面所述的circMTMR14的引物对。
在一些实施例中，所述试剂包括与第一方面所述circMTMR14特异性互补配对的分子探针和/或用于扩增第一方面所述的circMTMR14的引物对。
优选地，所述试剂包括：用于检测circMTMR14的引物对1。
其中，引物对1的碱基序列如SEQ ID NO.2～3所示。
需要说明的是，引物对通常包括上游引物和下游引物，本文中“引物对1的碱基序列如SEQ ID NO.2～3所示”是指引物对中上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述样本包括生物组织样本。
优选地，所述生物组织样本包括非小细胞肺癌癌组织和非小细胞肺癌癌旁组织中的至少一种。
本发明实验证明，circMTMR14高表达显著促进肺癌细胞的迁移和侵袭，而对细胞凋亡、和克隆形成能力无显著影响，因此，circMTMR14作为肿瘤治疗靶点应用于抗肿瘤中。
本发明实验证明，circMTMR14的表达水平与肺癌患者淋巴结转移和远处转移呈正相关。
下面结合实施例对本发明提供的一种用于肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物的circMTMR14及试剂盒和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
MTMR14基因来源的环状RNA(circMTMR14)的发现与鉴定
在本实施案例中，利用生物信息手段结合PCR扩增技术确定MTMR14基因来源的环状RNA(circMTMR14)的存在并对其进行生物学特征的鉴定，具体内容如下：
1.MTMR14基因来源的环状RNA(circMTMR14)的发现
利用circBase(http://www.circbase.org)数据库分析发现，MTMR14基因可剪接形成13种的circRNA，分别是hsa_circ_0001265、hsa_circ_0064145、hsa_circ_0064146、hsa_circ_0124813、hsa_circ_0064147、hsa_circ_0064148、hsa_circ_0064149、hsa_circ_0064150、hsa_circ_0064151、hsa_circ_0064152、hsa_circ_0064153、hsa_circ_0002751和hsa_circ_0124822。
与MTMR14 mRNA的传统线性剪接不同的是，hsa_circ_0001265是由MTMR14基因(chr3:9711115-9712854)编码mRNA的第5外显子和第6外显子通过反向剪接而成，其成熟序列长度为184bp(参见图1)。
进一步通过设计跨环化接头位点的外扩型引物(Divergent primer F:agctgcttcgatacctgtca，SEQ ID NO:2，R:gaagagcacagtcctcctcc，SEQ ID NO:3)，在NCI-H1299细胞中通过PCR成功扩增出接头附近长约136bp的序列并进行Sanger测序，检测到MTMR14第5外显子和第6外显子的3’端和5’端反向剪接序列(参见图1)。可见，本实施例成功鉴定了hsa_circ_0001265的存在，由于该circRNA来源于MTMR14基因，将其命名为circMTMR14(SEQ ID NO:15).
2.MTMR14基因来源的环状RNA(circMTMR14)环化鉴定和保守性分析
首先，设计跨剪接位点的外扩型引物(Divergent primer，SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3)用于鉴定及特异性检测circMTMR14，同时在第17外显子上设计内收型引物(Convergent primer，MTMR14 F:cttgtcactgtctcccaccc，SEQ ID NO:4；MTMR14 R:gcctcattctcagtgcaggt，SEQ ID NO:5)用于检测MTMR14 mRNA。因为circMTMR14是在转录后剪接水平形成的环状RNA，所以其剪接位点序列不存在于基因组上，为了排除观察到的circMTMR14的头尾剪接是由反式剪接、基因组重排或PCR产物产生的等诸多可能性，用设计的外扩型及内收型引物分别扩增circMTMR14和MTMR14mRNA。在A549和NCI-H1299细胞cDNA及基因组DNA(gDNA)中通过PCR扩增(扩增程序如上所述)及琼脂糖凝胶电泳。
结果显示，外扩型引物仅能在cDNA上扩增出条带，在gDNA上不能扩增出条带，而内收型引物在cDNA和gDNA上均能扩增出MTMR14基因(参见图2)。这些结果说明circMTMR14不是通过基因组重排形成的，而是在转录后水平通过反向剪切形成的环状RNA，而且应用外扩型引物可以特异性检测circMTMR14。
3.circMTMR14的稳定性验证
3.1 circRNA缺乏游离的5’末端和3’末端，有其独特的闭合环状结构，因而能够抵抗核酸外切酶RNA酶R(RNase R)的消化作用，因RNA酶R能够消化几乎所有的线性RNA分子，但不易消化circRNA，故RNA酶R消化实验广泛用于circRNA的稳定性鉴定实验，以证明其具有环形结构。本实验首先在肺癌细胞A549、NCI-H1299和NCI-H460中提取总RNA，应用RNA酶R消化处理后，再应用RT-PCR方法分别检测了circMTMR14以及线性MTMR14 mRNA的水平。结果表明，与MTMR14 mRNA相比，circMTMR14的确能够耐受RNA酶R的消化(参见图3)。
上述所需检测RNA的引物对序列，具体如表1所示。
3.2用放线菌素D(Actinomycin D)抑制肺癌细胞A549和NCI-H1299新生RNA的合成，以此来验证circMTMR14的稳定性。通过qRT-PCR检测circMTMR14和MTMR14 mRNA的24h内降解速率，结果表明，MTMR14 mRNA已几乎降解完全，而circMTMR14的半衰期大于24h，这说明circMTMR14具有很高的稳定性(参见图4)。
以上实验进一步证实，circMTMR14具有环化生物学特征和能够耐受RNA酶R消化及放线菌素D处理，具有较高的稳定性.
实施例2
circMTMR14在体外促进非小细胞肺癌的迁移和侵袭能力
通过设计对照NC序列(SEQ ID NO:10,11)和circMTMR14的siRNA序列#1(SEQ IDNO:12,13)和#2(SEQ ID NO:14,15)，再通过qRT-PCR法在肺癌细胞系A549、NCI-H1299和NCI-H460中检测circMTMR14的敲降效率，证明circMTMR14的siRNA序列设计成功(参见图5)，通过观察细胞增殖活性证明了敲低circMTMR14后显著抑制了肺癌细胞的增殖能力(参见图6)。通过伤口愈合实验证明了敲低circMTMR14后显著抑制了肺癌细胞的伤口愈合能力(参见图7)。通过Transwell检测了circMTMR14对肺癌细胞迁移和侵袭能力的影响，结果证明敲低circMTMR14后显著抑制了肺癌细胞的迁移和侵袭能力(参见图8、9)，通过导入pLC5-ciR载体构建circMTMR14过表达质粒，在肺癌细胞系A549、NCI-H1299和NCI-H460中验证circMTMR14的过表达效率，结果证明circMTMR14过表达质粒构建成功(参见图10)。图11、12和13证明了过表达circMTMR14后显著促进了肺癌细胞的迁移侵袭能力和伤口愈合能力。通过western blot发现敲低circMTMR14后，能够引起EMT相关蛋白的变化，可升高E-cadherin的水平，降低N-cadherin的水平，而在肺癌细胞中过表达circMTMR14后N-cadherin的水平显著升高，E-cadherin的水平降低(参见图14和图15)。以上结果都证实circMTMR14在体外促进非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭。
实施例3
circMTMR14在体内促进非小细胞肺癌的转移能力
利用Jet-PRIME reajent将空载shRNA、circMTMR14 shRNA质粒分别转入HEK-293T细胞，次日换成诱导液，收集48h病毒液进行病毒滴度测试，按照M0I为10：1转染非小细胞肺癌细胞，用G418筛选构建稳定转染细胞株，确认转染效率大于90％后，裸小鼠尾静脉注射上述稳转细胞(200万/只)，60天后通过包氏固定液结合H&E染色法观察各器官转移灶的个数，结果证明敲低circMTMR14后显著抑制了体内肺癌的发生和向肝转移的能力(参见图16和17)。
上述所述siRNA探针碱基对序列以及引物对序列，具体如表2所示。
实验方法：
1.细胞培养
人非小细胞肺癌细胞A549，NCI-H1299，NCI-H460和人脐静脉内皮细胞HUVEC培养于具有10％FBS和90％RPMI 1640培养基中。所有细胞在5％CO2，37℃的细胞培养箱中培养。
2.Transwell实验
(1)细胞迁移实验
将高低表达circPOLK的肺癌细胞血清饥饿过夜，消化计数，接种到transwell小室中，密度为2×104/孔，每孔无血清培液200μl。相对应的24孔板中加入600μl含有20％血清的培养液。细胞孵育24小时后，用1％结晶紫对小室进行避光染色30min，接着用1×PBS清洗小室内部的细胞，然后用显微镜拍摄迁移到小室下表面的细胞并计数。
(2)细胞侵袭实验
Matrigel提前放置4℃解冻，小室，24孔板和所用枪头放置-20℃预冷。用细胞培养液将Matrigel按1：20稀释，每个小室中加入100μl的Matrigel，将小室放在24孔板中置于37℃孵箱30min，取出24孔板，弃去小室中未凝固的Matrigel，并用培养液润洗一遍。与此同时，高低表达circPOLK的非小细胞肺癌细胞血清饥饿过夜，消化计数，接种到有Matrigel胶的transwell小室中，密度为3×104/孔，每孔无血清培养液200μl。相对应的24孔板中加入600μl含有20％血清的培养液。细胞孵育24小时后，用1％结晶紫对小室进行避光染色30min，接着用1×PBS清洗小室内部的细胞，然后用显微镜拍摄侵袭到小室下表面的细胞并计数。
3.伤口愈合实验
将细胞以2×105/孔的密度接种在六孔板中，待细胞贴壁后，转染所需质粒或siRNA。待细胞汇合度达到80-100％，用移液器在细胞表面划痕，用PBS洗去表面掉落的细胞，换上新的培养液，显微镜拍下0h的伤口距离，24h后，用PBS清洗六孔板以除去非贴壁细胞，显微镜拍下24h的伤口距离，计算伤口愈合情况。
4.转染
将细胞接种在6孔板中(5×105/孔)。待细胞密度达到30-40％进行转染，每孔取200μl转染buffer至RNA酶free的EP管中，加入2μg的目标siRNA，混匀，静置5min。加入4μl转染试剂，混匀离心，静置20min，然后加入转染试剂，轻微晃动使其混合均匀。
5.Western blot法
(1)蛋白样本提取和定量
①提取：收集提前处理过的细胞，2000rpm离心4min，弃上清，将沉淀转移至EP管中，2000rpm离心4min，弃上清。根据细胞数量加入全细胞裂解液，每隔10min涡旋一次，
进行3次，充分将细胞和裂解液混合均匀，12000rpm，4℃离心30min，收集上清，上清即蛋白样本。
②定量：BSA(2mg/ml)用去离子水倍半稀释作标准曲线，样本蛋白用去离子水稀释10倍。不同浓度的BSA溶液和样本蛋白分别取5μl，加入200μl现配的BCA试剂混合液(A液：B液＝50：1)，充分混匀后置于37℃，30min，用酶标仪读取波长为562nm处的吸光度。根据所得的标准曲线的公式，计算出样本蛋白的浓度，按一定量标定蛋白。
③直接loading法
将预处理的细胞上清弃去，用PBS清洗两遍，根据细胞的密度加入相应量的2.5×loading直接搅拌收细胞，离心，沸水煮10min使蛋白失活，冷却离心，-20℃保存。
(2)蛋白质免疫印迹
①凝胶电泳：配制500ml的1×Running Buffer，蛋白样本按一定顺序和一定量上样。先调节电压70V，待样本跑至分离胶时，可将电压增加至110V，样本离胶底端1cm时，停止电泳。
②转膜：配制900ml的1×Transfer Buffer，将大小合适的PVDF膜用100ml的无水乙醇激活1min，加入配制好的Transfer Buffer。根据实验所需的蛋白大小，将胶切成相应大小，按黑胶白膜方式转膜，330mA横定电流，冰水浴转膜90min。
③牛奶封闭及孵育一抗：转膜时间到后，将PVDF膜放入5％脱脂牛奶(T-PBS配制)中室温封闭1h。弃去牛奶，用T-PBS清洗PVDF膜三遍，加入实验所需的一抗，摇床4℃孵育过夜。
④孵育二抗：回收一抗，用T-PBS洗条带3次，每次10min。加入一抗对应的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温摇床孵育90min，弃去二抗，T-PBS洗3次。
⑤曝光：提前将曝光的东西准备好，条带用ECL显色液(ECL试剂盒中A液与B液1：1)暗处孵育1min，转移至曝光盒中，暗房中X光胶片压片，短时间5-20s(根据条带荧光强度而定)，长时间30min，将胶片取出，显影液中放置1.5min，自来水冲洗，置于定影液中1.5min，成像。
6.RNA提取和逆转录
将预先处理过的六孔板细胞弃去上清，用预冷的PBS漂洗两次，每孔加入1ml的Trizol，反复吹打至溶液透明。将细胞转移至1.5ml RNA酶free的EP管中，加入200μl的氯仿，剧烈震荡30s，4℃静置2min，12000rpm，4℃离心10min。吸取450μl的上清至新的EP管中，加入等量异丙醇，轻柔地上下颠倒5次，冰上静置10min，12000rpm，4℃离心15min。弃去上清，沉淀用500μl预冷的75％乙醇轻柔清洗，8000rpm，4℃离心5min。重复清洗一遍，放置通风处，等乙醇挥干后，加入20μl的DEPC水溶解mRNA，测定mRNA浓度。
使用全式金的TransStart Top Green qPCR SuperMix(Lot#40426)试剂盒将mRNA逆转录为互补DNA(cDNA)。
7.qRT-PCR
qRT-PCR体系为10μl，分别是5μl 2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix，1μl模板cDNA，目标正反向引物各0.6μl，DEPC水2.8μl。其反应条件为95℃预变性15min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，39个循环。
8.统计学分析
使用t检验来检验统计分析，p<0.05被认为实验结果具有显著性差异(*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001)。每个实验至少重复三次。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的内容后，将容易想到本申请的其它实施方案。本申请旨在涵盖本申请的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本申请的一般性原理并包括本申请未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本申请的真正范围和精神由权利要求指出。
应当理解的是，本申请并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本申请的范围仅由所附的权利要求来限制。
序列表
<110> 浙大城市学院
杭州安旭生物科技股份有限公司
<120> 一种用于肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物的circMTMR14及试剂盒和应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 184
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggggtgcaga tgatgcctgg gcagatgtgg aggacgtcac ggaggaggac tgtgctcttc 60
gaagtggtga cacgcatctt tttgataagg tcagaggcta tgacatcaag ctgcttcgat 120
acctgtcagt caaatacatc tgtgacctga tggtggagaa caagaaggtg aagtttggca 180
tgaa 184
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agctgcttcg atacctgtca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaagagcaca gtcctcctcc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cttgtcactg tctcccaccc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcctcattct cagtgcaggt 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggagcgagat ccctccaaaa t 21
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggctgttgtc atacttctca tgg 23
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaaggtgaag gtcgagtc 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaagatggtg atgggatttc 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acgugacacg uucggagaat t 21
<210> 12
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcaugaaggg gugcagauga utt 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aucaucugca ccccuucaug ctt 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caugaagggg ugcagaugau gtt 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caucaucugc accccuucau gtt 23
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cggaattcta atactttcag ggggtgcaga tgatgcctgg 40
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgggatccag ttgttcttac ttcatgccaa acttcacctt 40
<210> 18
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccggcatgaa ggggtgcaga tgatgctcga gcatcatctg caccccttca tgtttttg 58
<210> 19
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aattcaaaaa catgaagggg tgcagatgat gctcgagcat catctgcacc ccttcatg 58

Claims (2)

1.circMTMR14的siRNA在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用，其中，所述circMTMR14的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述circMTMR14的siRNA为si-circMTMR14#1或si-circMTMR14#2，所述si-circMTMR14#1的序列如SEQ ID NO.12-13所示，所述si-circMTMR14#2的序列如SEQ ID NO.14-15所示。
2. 一种用于检测样本中肿瘤标志物circMTMR14表达水平的试剂在制备用于检测非小细胞肺癌的试剂盒中的应用，所述肿瘤标志物circMTMR14碱基序列如SEQ ID No .1所示。
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