CN113995768A - 寡核苷酸在抑制新冠病毒所致的多组织器官细胞损伤中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了寡核苷酸在抑制新冠病毒以及其它原因所致的多组织器官细胞损伤中的应用、抑制lncRNA EPB41L4A‑AS1基因表达的物质的应用。抑制lncRNA EPB41L4A‑AS1基因表达的物质在如下任一中的应用：(1)制备抑制细胞凋亡的产品，或抑制细胞凋亡；(2)制备提高ACE2蛋白含量的产品，或提高ACE2蛋白含量；(3)制备促进ACE2基因表达的产品，或促进ACE2基因表达；(4)制备抑制组织器官细胞损伤的产品，或抑制组织器官细胞损伤；所述lncRNA EPB41L4A‑AS1的序列为SEQ ID No.1所示。本发明实施例表明，lncRNA EPB4114A‑AS1的抑制能显著增强ACE2的表达，抑制细胞的凋亡。

Description

寡核苷酸在抑制新冠病毒所致的多组织器官细胞损伤中的 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及寡核苷酸在抑制新冠病毒以及其它原因所致的多组织器官细胞损伤中的应用。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的感染所致疾病的预防，诊断和治疗为亟待解决 的重大社会公共卫生安全问题。
SARS-CoV-2主要通过其Spike蛋白的受体结合域结合人细胞表面受体ACE2蛋白来侵染细胞，入侵细胞后，SARS-CoV-2会导致ACE2水平的下降，而ACE2作为肾 素-血管紧张素的重要因子，除调节人体血压外，还与细胞的增殖、炎症反应和细胞凋 亡有关。其中ACE2的失调而导致细胞凋亡可能是新冠患者多组织损伤的一个重要原 因。
非编码核酸(ncRNA)是一类由RNA聚合酶II转录所产生的不具备编码蛋白的 RNA转录本，其中长度大于200个核酸的非编码核酸称为长链非编码核酸(lncRNA)。 近年来的研究发现lncRNA在调节机体的生理和病理过程中发挥重要作用。
发明内容
本发明的目的之一在于提供抑制lncRNA EPB41L4A-AS1基因表达的物质的应用。
本发明提供了抑制lncRNA EPB41L4A-AS1基因表达的物质在如下任一中的应用：
(1)制备抑制细胞凋亡的产品；
(2)抑制细胞凋亡；
(3)制备提高ACE2蛋白含量的产品；
(4)提高ACE2蛋白含量；
(5)制备促进ACE2基因表达的产品；
(6)促进ACE2基因表达；
(7)制备抑制组织器官细胞损伤的产品；
(8)抑制组织器官细胞损伤。
所述lncRNA EPB41L4A-AS1的序列为SEQ ID No.1所示。
所述抑制lncRNAEPB41L4A-AS1基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默 实现。
所述基因敲除(gene knockout)是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。
所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。 基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两 种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的 基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行 特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑 (quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。
可选地，根据上述的应用，所述抑制lncRNAEPB41L4A-AS1基因表达的物质为 如下任一种：
1)靶向所述lncRNA EPB41L4A-AS1的寡核苷酸；
2)产生靶向所述lncRNAEPB41L4A-AS1的寡核苷酸的DNA分子；
3)产生靶向所述lncRNAEPB41L4A-AS1的寡核苷酸的表达载体；
4)产生靶向所述lncRNA EPB41L4A-AS1的寡核苷酸的重组微生物。
可选地，根据上述的应用，所述靶向所述lncRNA EPB41L4A-AS1的寡核苷酸的 靶序列为SEQ ID No.20所示序列的第841-861位和/或SEQ ID No.20所示序列的第 917-937位。
可选地，根据上述的应用，其特征在于，所述寡核苷酸为sgRNA、siRNA、shRNA、miRNA或反义RNA。
可选地，根据上述的应用，所述siRNA的序列如SEQ ID No.12或SEQ ID No.14 所示。所述shRNA的序列可如SEQ ID No.8或SEQ ID No.9所示。
可选地，根据上述的应用，所述产生靶向所述lncRNA EPB41L4A-AS1的shRNA 的DNA分子序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示。
上述重组微生物可为重组慢病毒，具体可为实施例所述表达靶向 EPB41L4A-AS1-1 shRNA的质粒和/或表达靶向EPB41L4A-AS1-2shRNA的质粒。
可选地，根据上述的应用，所述组织器官细胞损伤由新型冠状病毒所引起。
可选地，根据上述的应用，所述组织器官细胞损伤为肺细胞损伤、肝细胞损伤和/或血管内皮细胞损伤。
本发明还提供了一种产品，包含上述的抑制lncRNAEPB41L4A-AS1基因表达的 物质，所述产品具有如下至少一种功能：
(1)抑制细胞凋亡；
(2)提高ACE2蛋白含量；
(3)促进ACE2基因表达；
(4)抑制组织器官细胞损伤。
本发明还提供了抑制lncRNA EPB41L4A-AS1基因表达的物质和抑制ACE2基因 表达的物质在制备促进细胞凋亡产品或促进细胞凋亡中的应用。
上文中，所述细胞具体可为肺细胞、肝细胞和/或血管内皮细胞，例如HepG2、 A549和/或HUVEC细胞。
本发明实施例表明lncRNA EPB4114A-AS1在新冠病毒以及其它因素所致的多组织器官细胞损伤中起着重要作用。在本发明实施例中，与对照相比，SARS-CoV-2的 侵染或低氧处理能显著上调lncRNA EPB41L4A-AS1的表达，同时伴随着ACE2表达 水平的下降，提示两者之间可能存在某种调控关系。本发明实施例表明，lncRNA EPB4114A-AS1的抑制能显著增强ACE2的表达，抑制细胞的凋亡。本发明提供的抑 制lncRNAEPB41L4A-AS1的寡核苷酸可以通过上调ACE2的表达而应用于抑制新冠 病毒所致的多组织器官细胞损伤中。
附图说明
图1为SARS-CoV-2感染细胞后LncRNA EPB41L4A-AS1的表达水平的生物信息 学分析；A为GEO数据库中GSE148729芯片中，SARS-CoV-2/SARS-CoV感染Caco2 和Calu3细胞4h、12h、24h后lncRNA EPB41L4A-AS1的表达水平；B为GEO数据 库中GSE148729芯片中，SARS-CoV-2/SARS-CoV感染Caco2和Calu3细胞4h、12h、 24h后ACE2的表达水平；C为GEO数据库中GSE147507芯片中，SARS-CoV-2感 染Calu3、A549和过表达ACE2蛋白的A549细胞后lncRNAEPB41L4A-AS1的表达 水平；D为GEO数据库中GSE159522芯片中，SARS-CoV-2感染过表达ACE2蛋白 的A549细胞后lncRNA EPB41L4A-AS1的表达水平；E为GEO数据库中GSE154613 芯片中，SARS-CoV-2感染过表达ACE2蛋白的A549细胞后lncRNA EPB41L4A-AS1 的表达水平；F为用Spike蛋白新冠病毒假病毒感染Calu-3和Caco-2细胞24h后 lncRNA EPB41L4A-AS1和ACE2的表达水平；G为低氧处理A549、HepG2和HUVEC 细胞24小时、48小时后lncRNAEPB41L4A-AS1的表达水平；*表示p＜0.05，**表示 p＜0.01，***表示p＜0.001。
图2为在人源细胞株中抑制LncRNA EPB41L4A-AS1的表达，检测ACE2的表达 的情况(EAS1代表EPB41L4A-AS1)；A为在人源细胞株HepG2、A549和HUVEC细 胞中利用shRNA慢病毒敲低lncRNA EPB41L4A-AS1后，lncRNA EPB41L4A-AS1和 ACE2的RNA水平；B为在HepG2和A549细胞中利用shRNA慢病毒稳定敲低lncRNA EPB41L4A-AS1后ACE2的蛋白水平；C为利用靶向lncRNA EPB41L4A-AS1的siRNA 瞬时抑制lncRNA EPB41L4A-AS1的表达后检测lncRNAEPB41L4A-AS1的抑制效率 和ACE2的蛋白水平；**表示p＜0.01，***表示p＜0.001。
图3为LncRNA EPB41L4A-AS1的抑制对细胞凋亡的影响(EAS1代表EPB41L4A-AS1)；A.增强HepG2细胞的凋亡水平，采用的方法有20ng/ml的TNFα或 20ug/ml的LPS或1％O2诱导48小时；B.增强A549和HUVEC细胞的凋亡水平，采 用的方法有10ng/mi的TNFα或10ug/ml的LPS或1％O2诱导48小时，A和B的结果 均为采用蛋白质免疫印迹检测细胞凋亡的标志cleaved-caspase3的水平。
图4为ACE2对lncRNA EPB41L4A-AS1调节细胞凋亡的影响(EAS1代表 EPB41L4A-AS1)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域 普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文 献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等， 如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、LncRNA EPB41L4A-AS1在SARS-CoV-2侵染的细胞中表达上调的生 物信息学分析
本实施例用于生物信息学的方法分析了lncRNA EPB41L4A-AS1(序列如SEQ IDNo.20所示，编码该lncRNA EPB41L4A-AS1的基因GenBank号为114915，2021年9 月6日)在SARS-CoV-2感染人源不同细胞系后的表达情况，具体如下：
通过对公共数据库GEO中GSE148729芯片数据的lncRNA EPB41L4A-AS1的表 达量分析，发现在人结肠癌细胞系Caco-2和人肺腺癌细胞系Calu-3细胞中，lncRNA EPB41L4A-AS1的表达量在SARS-CoV-2侵染24小时后异常上调，ACE2的表达量在 SARS-CoV-2侵染24小时后异常下调(图1A和B)。通过对GSE147507芯片的数据 分析，发现lncRNA EPB41L4A-AS1的表达量在SARS-CoV-2侵染人肺腺癌细胞系 Calu-3后发生显著上调，lncRNA EPB41L4A-AS1的表达量在SARS-CoV-2侵染人肺癌 细胞系A549后发生显著上调(图1C)。通过对GSE159522芯片数据分析，发现lncRNA EPB41L4A-AS1的表达量在被SARS-CoV-2侵染的人肺癌细胞系A549中发生显著的 上调(图1D)。通过对GSE154613芯片数据分析，发现lncRNAEPB41L4A-AS1的表 达量在被SARS-CoV-2侵染的人肺癌细胞系A549中发生显著的上调(图1E)。
结果表明lncRNA EPB41L4A-AS在SARS-CoV-2侵染后异常高表达。
实施例2、新冠病毒假病毒/低氧诱导对lncRNA EPB41L4A-AS1表达的影响
HepG2(目录号TCHu72)为人肝癌细胞系，Calu-3(目录号TCHu157)为人肺腺癌 细胞系，Caco-2(目录号TCHu146)为人结直肠腺癌细胞系，均为中国科学院细胞库 产品，培养基为含10％的胎牛血清(Biowest)的DMEM培养基(Gibco)；A549
Figure BDA0003314238600000051
为人肺癌细胞系，为美国ATCC公司产品，培养基为含10％胎牛 血清(Biowest)的DMEM培养基(Gibco)；HUVEC
Figure BDA0003314238600000052
为人脐静 脉内皮细胞，为美国ATCC公司产品，培养基为含10％胎牛血清(Biowest)的DMEM 培养基(Gibco)。上述细胞的培养条件均为37摄氏度，5％的二氧化碳。
将Calu-3和Caco-2细胞以终浓度为10万个/mL的密度接种到6孔板中，待细胞 贴壁后，加入10uL滴度为5E7 TU/mL的新冠病毒Spike蛋白假病毒(FNV215，复 百澳)于培养液中，培养24h。利用RNAiso plus(TAKARA)裂解细胞，采用氯仿分离 和异丙醇沉淀以及75％乙醇纯化的方法获细胞的总RNA，用ReverTraAce qPCR RT试 剂盒(日本东洋纺公司)将总RNA逆转录成cDNA，然后采用SYBR法在ABI7300 荧光定量PCR仪上检测基因的表达。
将处于对数期的A549、HepG2和HUVEC细胞接种到6孔板中，设置正常氧浓度 (21％O2)培养的细胞为对照组，实验组为低氧条件(氧浓度为1％O2)下培养24小 时和48小时的细胞。采用与上述同样的方法检测lncRNAEPB41L4A-AS1的表达。
用于检测内参基因ACTB的引物：
正向：5’-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3’；
反向：5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’。
用于检测LncRNAEPB41L4A-AS1的引物如下：
正向：5’-CCACCCTGAGTCTGGTGAGT-3’；
反向：5’-CCTGGCATAGTCGATGATGTA-3’。
用于检测ACE2的引物如下：
正向：5’-ACAGTCCACACTTGCCCAAAT-3’；
反向：5’-TGAGAGCACTGAAGACCCATT-3’。
结果如图1中的F和G所示。F为用Spike蛋白新冠病毒假病毒感染Calu-3和 Caco-2细胞24h后lncRNA EPB41L4A-AS1和ACE2的表达水平；0小时表示Spike 蛋白新冠病毒假病毒感染前Calu-3和Caco-2细胞lncRNA EPB41L4A-AS1和ACE2的 表达水平，24小时表示用Spike蛋白新冠病毒假病毒感染Calu-3和Caco-2细胞24h 后lncRNA EPB41L4A-AS1和ACE2的表达水平，与感染前相比，lncRNA EPB41L4A-AS1的表达量在新冠病毒spike蛋白假病毒感染Calu-3和Caco-2细胞24h 时均发生约50％的上调，而ACE2的mRNA水平有约50％的下调。G为低氧处理A549、 HepG2和HUVEC细胞24小时、48小时后lncRNA EPB41L4A-AS1的表达水平，表 明低氧(1％O2)处理细胞24小时和48小时，lncRNA的表达显著升高。表明新冠病毒spike蛋白假病毒和低氧能引起lncRNA EPB41L4A-AS1的异常升高。
实施例3、在人源细胞株中利用shRNA抑制LncRNA EPB41L4A-AS1的表达， 检测ACE2的表达的情况
一、敲低1ncRNA EPB41L4A-AS1的细胞系的构建
将编码阴性对照NC和靶向EPB41L4A-AS1的shRNA的DNA序列的oligo退火 后连接到pLKO.1载体(购自addgene公司)上，得到稳定表达NC shRNA(shNC)、 靶向EPB41L4A-AS1-1 shRNA(shEPB41L4A-AS1-1)和靶向EPB41L4A-AS1-2 shRNA (shEPB41L4A-AS1-2)的质粒。
阴性对照shNC oligo：
正义链：5’-CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTT CGGAGAATTTTTG-3’(SEQ ID No.1)；
反义链：5’-AATTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGAC ACGTTCGGAGAA-3’(SEQ ID No.2)。
靶向EPB41L4A-AS1的shRNA的shEPB41L4A-AS1-1 oligo
正义链：5’-CCGGGGATGTCCTTGGTGAGGATTTCTCGAGAAATCCTCACCAAGGACATCCTTTTTG-3’(SEQ ID No.3)；
反义链：5’-AATTCAAAAAGGATGTCCTTGGTGAGGATTTCTCGAGAAATCCTCACCAAGGACATCC-3’(SEQ ID No.4)。
靶向EPB41L4A-AS1的shRNA的shEPB41L4A-AS1-2oligo：
正义链：5’-CCGGGAGGAGTACTGACATAATTACCTCGAGGTAATTATGTCAGTACTCCTCTTTTTG-3’(SEQ ID No.5)；
反义链：5’-AATTCAAAAAGAGGAGTACTGACATAATTACCTCGAGGTAATTATGTCAGTACTCCTC-3’(SEQ ID No.6)。
表达NC shRNA的质粒为将pLKO.1载体的Agel和EcoR1识别位点之间的片段(小 片段)替换为编码阴性对照NC的shRNA的oligo，该oligo正义链序列如SEQ ID No.l 所示，该oligo反义链序列如SEQ ID No.2所示。该质粒表达名称为shNC的shRNA， shNC序列如SEQID No.7所示，靶序列为TTCTCCGAACGTGTCACGT。
表达靶向EPB41L4A-AS1-1 shRNA的质粒为将pLKO.1载体的Agel和EcoR1识 别位点之间的片段(小片段)替换为编码靶向EPB41L4A-AS1的shRNA的oligo，该 oligo正义链序列如SEQ ID No.3所示，该oligo反义链序列如SEQ ID No.4所示。该 质粒表达名称为shEPB41L4A-AS1-1的shRNA，shEPB41L4A-AS1-1序列如SEQ ID No.8所示，靶序列为GGAUGUCCUUGGUGAGGAUUU(即SEQ ID No.20第841-861 位)。
表达靶向EPB41L4A-AS1-2 shRNA的质粒为将pLKO.1载体的Agel和EcoR1识 别位点之间的片段(小片段)替换为编码靶向siEPB41L4A-AS2的shRNA的oligo， 该oligo正义链序列如SEQ ID No.5所示，该oligo反义链序列如SEQ ID No.6所示。 该质粒表达名称为shEPB41L4A-AS1-2的shRNA，shEPB41L4A-AS1-2序列如SEQ ID No.9所示，靶序列为GAGGAGUACUGACAUAAUUAC(即SEQ ID No.20第917-937 位)。
分别将上述质粒转染到HepG2、A549和HUVEC细胞中，转染试剂为lipo3000 (美国赛默飞公司)，具体转染方法如下：
按10万个/mL的浓度将HepG2、A549或HUVEC细胞接种于6孔板中进行培养。 待细胞贴壁后，分别加入2微克的上述质粒和5微升1ipo3000。体系终体积为2mL/ 孔，其中，上述质粒终浓度为1微克/mL，lipo3000终浓度为2.5微升/mL。转染12小 时后给细胞换成新鲜的完全培养基，48小时后加入含1μg/ml嘌呤霉素的新鲜培养基 进行筛选，存活的细胞即为表达相应shRNA的细胞。
二、基因表达分析
采用与实施例2中相同的方法提取细胞的总RNA和检测lncRNA EPB41L4A-AS1 和ACE2的RNA水平，以ACTB为内参。
结果如图2中A所示，与转染阴性对照shRNA(shNC)的细胞相比，lncRNA EPB41L4A-AS1在转染靶向EPB41L4A-AS1的shRNA(shEPB41L4A-AS1-1、 shEPB41L4A-AS1-2)的HepG2和A549细胞中表达水平下降了约50％，在HUVEC细 胞中约下降了90％。此外，ACE2的mRNA水平在lncRNAEPB41L4A-AS1表达被抑 制的HepG2、A549和HUVEC细胞中上调了约2-4倍。
三、蛋白定量分析
将实施例3中第一步筛选出来的细胞用蛋白裂解液(配方为50mM TRIS-HCl，pH8.0，4M urea and 1％Triton X-100，蛋白酶抑制剂)裂解后获得细胞的总蛋白，然后采 用蛋白质免疫印迹的方法检测内参蛋白ACTB和ACE2的水平，检测ACTB蛋白的抗 体为Proteintech，#20536-1-AP，ACE2蛋白的抗体为Abcam，ab108252。
结果如图2中的B所示，shNC为表达shNC的细胞进行蛋白分析结果，shRNA-1 为表达shEPB41L4A-AS1-1的细胞进行蛋白分析结果，shRNA-2为表达 shEPB41L4A-AS1-1的细胞进行蛋白分析结果，表明ACE2的蛋白水平在 EPB41L4A-AS1被抑制的HepG2和A549细胞中显著增加。
实施例4、在人源细胞株中利用siRNA瞬时抑制LncRNA EPB41L4A-AS1的表 达，检测ACE2的表达的情况
一、细胞siRNA的转染
siRNA由苏州吉玛公司合成。siRNA oligo序列具体如下。靶向EPB41L4A-AS1 的siRNA的靶序列与实施例3的shRNA的靶序列一致。
NC：
正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID No.10)；
反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID No.11)。
siEPB41L4A-AS1-1：
正义链：5’-GGAUGUCCUUGGUGAGGAUUU-3’(SEQ ID No.12)；
反义链：5’-AAAUCCUCACCAAGGACAUCC-3’(SEQ ID No.13)。
siEPB41L4A-AS1-2：
正义链：5’-GAGGAGUACUGACAUAAUUAC-3’(SEQ ID No.14)；
反义链：5’-GUAAUUAUGUCAGUACUCCUC-3’(SEQ ID No.15)。
将和实施例2中相同的细胞HepG2和A549细胞按10万个/mL的浓度铺板到6 孔板中，待细胞贴壁后，将靶向lncRNA EPB41L4A-AS1的siRNA siEPB41L4A-AS1-1 和siEPB41L4A-AS1-2以及阴性对照siRNA NC采用脂质体转染的方式转染到细胞中， 脂质体转染试剂为lipo2000(美国赛默飞公司)。其中siRNA的浓度终浓度为50nM/L， lipo2000的终浓度为2.5微升/mL。转染6小时后，将细胞的培养液换成新鲜的培养 液，然后继续培养42小时。
二、基因表达分析和蛋白定量检测
待实施例4中第一步的细胞处理时间到后，提取细胞的总RNA和总蛋白，采用 与实施例2相同的检测基因表达和实施例3相同的蛋白定量分析的方法检测 EPB41L4A-AS1的RNA水平和ACE2的蛋白水平。
结果如图2C所示，与转染阴性对照NC的细胞相比，EPB41L4A-AS1在转染siEPB41L4A-AS1-1、siEPB41L4A-AS1-2的HepG2和A549细胞中表达水平分别下降 了约60％和75％，ACE2的蛋白水平在转染siEPB41L4A-AS-1和siEPB41L4A-AS-2 的HepG2和A549细胞中显著增加。
实施例5、LncRNA EPB41L4A-AS1的抑制对细胞凋亡的影响
细胞凋亡是细胞死亡的一种重要形式，是组织器官发生严重损伤的一个重要因素， 而重症新冠患者多伴随着严重的组织器官衰竭。Caspase 3被剪切后产生cleavedCaspase3是细胞凋亡激活的标志。诱导细胞凋亡的方式很多，包括TNFα、LPS或低 氧的诱导等。增强HepG2细胞的凋亡水平，采用的方法有20ng/ml的TNFα或20ug/ml 的LPS或1％O2诱导48小时：增强A549和HUVEC细胞的凋亡水平，采用的方法有10ng/ml的TNFα或10ug/ml的LPS或1％O2诱导48小时。
调整处于对数生长期的敲低lncRNA EPB41L4A-AS1和相应对照的细胞(即实 施例3转染相应质粒的细胞)的浓度，使每毫升细胞悬液中含有约9万的细胞，取2ml 的细胞悬液接种于6孔细胞培养板中培养。至细胞完全贴壁后，分别采用20ng/ml TNFα、20ug/ml LPS或1％O2诱导48小时，同时设置不诱导的对照(加入等量PBS)。 待诱导时间到后，采用实施例3中相同的方式收取细胞的总蛋白，采用蛋白质免疫印 迹的方法检测cleaved Caspase3的水平，采用的抗体为CST，#9664。
实验结果如图3所示，TNFα、LPS和低氧(1％O2)均能诱导细胞发生不同程度 的凋亡。其中，TNFα诱导HepG2细胞的凋亡程度相对最高。在诱导细胞凋亡后，与 对照细胞(shNC)相比，敲低lncRNA EPB41L4A-AS1的细胞的cleaved Caspase3水 平降低，表明TNFa显著诱导HepG2、A549和HUVEC细胞的凋亡，lncRNA EPB41L4A-AS1的抑制能显著抑制细胞的凋亡水平。
实施例6、ACE2对lncRNA EPB41L4A-AS1调节细胞凋亡的影响
调整处于对数生长期的敲低lncRNAEPB41L4A-AS1和相应阴性对照细胞(即实 施例3转染相应质粒的细胞)的浓度，使每毫升细胞悬液中有约10万个细胞，取2ml 细胞悬液接种于6孔板中。待细胞贴壁后，向细胞中转染阴性对照NC siRNA、特异 的靶向ACE2的siRNA或对照质粒Vector(pCDNA3.1，优宝生物VT1001)或过表达 ACE2的质粒。ACE2过表达的质粒为将对照质粒pCDNA3.1载体的BamHI和XhoI 识别位点之间的片段替换为ACE2的编码区片段(GenBank编号为59272，2021年10 月9日)。siRNA的转染试剂采用lipo2000(美国赛默飞公司)，转染方法与实施例4 相同。质粒的转染试剂采用1ipo3000，转染的方法与实施例3相同，对照质粒Vector 和过表达ACE2的质粒ACE2的终浓度均为1微克/mL，lipo3000的终浓度为2.5微升 /mL。转染24小时后，加入TNFα(HepG2加入20ng/ml，A549加入10ng/ml)培养 48小时。
采用与实施例3中相同的方式收取细胞的总蛋白，采用蛋白质免疫印迹的方法检测ACE2和cleaved Caspase3的水平。
阴性对照NC siRNA
正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID No.16)；
反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID No.17)。
siACE2 siRNA
正义链：5’-CCAUCUACAGUACUGGAAA-3’(SEQ ID No.18)；
反义链：5’-UUUCCAGUACUGUAGAUGG-3’(SEO ID No.19)。
处理组具体分为如下12组。
shNC+siNC：实施例3转染表达NC shRNA的质粒的细胞，再转染上述NC siRNA， 转染48小时后检测蛋白水平。
shNC+siACE2：实施例3转染表达NC shRNA的质粒的细胞，再转染上述siACE2siRNA，转染48小时后检测蛋白水平。
shEAS1+siNC：实施例3转染表达靶向EPB41L4A-AS1-1 shRNA的质粒的细胞， 再转染上述NC siRNA，转染48小时后检测蛋白水平。
shEAS1+siACE2：实施例3转染表达靶向EPB41L4A-AS1-1 shRNA的质粒的细胞， 再转染上述siACE2 siRNA，转染48小时后检测蛋白水平。
shNC+Vector：实施例3转染表达NC shRNA的质粒的细胞，再转染对照质粒pCDNA3.1，转染48小时后检测蛋白水平。
shNC+ACE2：实施例3转染表达NC shRNA的质粒的细胞，再转染过表达ACE2 的质粒，转染48小时后检测蛋白水平。
shNC+siNC+TNFα：实施例3转染表达NC shRNA的质粒的细胞，再转染上述NCsiRNA，转染24小时后加入TNFα培养，培养48小时后检测蛋白水平。
shNC+siACE2+TNFα：实施例3转染表达NC shRNA的质粒的细胞，再转染上述siACE2 siRNA，转染24小时后加入TNFα培养，培养48小时后检测蛋白水平。
shEAS1+siNC+TNFα：实施例3转染表达靶向EPB41L4A-AS1-1 shRNA的质粒的 细胞，再转染上述NC siRNA，转染24小时后加入TNFα培养，培养48小时后检测蛋 白水平。
shEAS1+siACE2+TNFα：实施例3转染表达靶向EPB41L4A-AS1-1 shRNA的质粒 的细胞，再转染上述siACE2 siRNA，转染24小时后加入TNFα培养，培养48小时后 检测蛋白水平。
shNC+Vector+TNFα：实施例3转染表达NC shRNA的质粒的细胞，再转染对照 质粒pCDNA3.1，转染24小时后加入TNFα培养，培养48小时后检测蛋白水平。
shNC+ACE2+TNFα：实施例3转染表达NC shRNA的质粒的细胞，再转染过表达 ACE2的质粒，转染24小时后加入TNFα培养，培养48小时后检测蛋白水平。
实验结果如图4所示，在不加TNFα组中，细胞的凋亡水平(cleaved caspase 3水平)相对较低，lncRNAEPB41L4A-AS1对细胞凋亡的影响不显著。但在TNFα诱导细 胞凋亡组中，lncRNA EPB41L4A-AS1的抑制能显著减少cleaved Caspase3的水平，同 时上调ACE2的水平，而当lncRNA EPB41L4A-AS1被抑制的细胞中抑制ACE2的表 达后，细胞的cleavedCaspase3的水平显著上升，表明lncRNAEPB41L4A-AS1调节细 胞凋亡是通过ACE2来介导的。因此提示，SARS-CoV-2诱导的lncRNA EPB41L4A-AS1 高表达是新冠患者多组织器官的损伤的一个重要原因，靶向lncRNA EPB41L4A-AS1 从而上调ACE2表达的疗法对于新冠患者的肝细胞损伤和肺细胞损伤等的治疗具有积 极意义。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨 和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较 宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发 明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本 发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的 改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 清华大学深圳国际研究生院
<120> 寡核苷酸在抑制新冠病毒所致的多组织器官细胞损伤中的应用
<130> 211925
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccggttctcc gaacgtgtca cgtctcgaga cgtgacacgt tcggagaatt tttg 54
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aattcaaaaa ttctccgaac gtgtcacgtc tcgagacgtg acacgttcgg agaa 54
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccggggatgt ccttggtgag gatttctcga gaaatcctca ccaaggacat cctttttg 58
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aattcaaaaa ggatgtcctt ggtgaggatt tctcgagaaa tcctcaccaa ggacatcc 58
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccgggaggag tactgacata attacctcga ggtaattatg tcagtactcc tctttttg 58
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aattcaaaaa gaggagtact gacataatta cctcgaggta attatgtcag tactcctc 58
<210> 7
<211> 44
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
uucuccgaac gugucacguc ucgagacgug acacguucgg agaa 44
<210> 8
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggauguccuu ggugaggauu ucucgagaaa uccucaccaa ggacaucc 48
<210> 9
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaggaguacu gacauaauua ccucgaggua auuaugucag uacuccuc 48
<210> 10
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
uucuccgaac gugucacgu 19
<210> 11
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acgugacacg uucggagaa 19
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggauguccuu ggugaggauu u 21
<210> 13
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaauccucac caaggacauc c 21
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaggaguacu gacauaauua c 21
<210> 15
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
guaauuaugu caguacuccu c 21
<210> 16
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
uucuccgaac gugucacgu 19
<210> 17
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acgugacacg uucggagaa 19
<210> 18
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccaucuacag uacuggaaa 19
<210> 19
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
uuuccaguac uguagaugg 19
<210> 20
<211> 1194
<212> RNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 20
ugucgggucc caaaauacgu ggucuaaagu ccuuugggcu ccugccgcug ccagcacuga 60
ucauaugcuc uugacccugg ucgggugggg ggaugucugg auaccuccuc uguggaaaga 120
acuggccaca cauccgcaga ggugacucgg gcugagaacc caggcuccuc cucccuuugg 180
ugacacgccc cucggucccu cacuggcacu ucucccuccg gccacacggc ggcgucucgc 240
cauagcgcag cggccgaugg uacagcccgc uccccccucg cgcucucgga cagugggucc 300
uuccacuugu agaaaagcau ugugggacgg aagccugucc uuucuuccuu uuggugcgag 360
cuugcugugg uuuuugcucu ggguccucug ggauggcgcc uggcuguggc cgcguggucu 420
cucacgcagg ggcgccgggc gggggaacgc ggccacccug agucugguga gucgacugcg 480
gcggccugug uccgaagugu ccggggccgu gaacaagggc agcggccugg ccucaggccu 540
gcguucccac guuuggaaac ggggagcuuc gucgauuugu guuuacauca ucgacuaugc 600
cagggaguuc uccagauaag ccugguuuua uuuucgucag ugaaaaggcc uuaccguaua 660
acugacuuua ugcuugcccu gcccccguau aaaauaacuu aaaagcagcg ugccugguua 720
cagcuguuuc cacgugcggu gcucgucggg agugaucacc uacccuacag guggaagaug 780
gaugccugaa guguagacug cugcuagcug aauaccaucu gggagcauaa aggugaccug 840
aaggaugucc uuggugagga uuuugaaaau uugaucuuca caagaguugc cuggaucauu 900
ugaaauuucu gggagucuga ggaguacuga cauaauuacc ugcuggaguc uguaaauaca 960
cauuuaagac agugaggaug ugaauaaaua uauuaaugca cuuuggcauu uguguuuuaa 1020
gugauuaacu gccagaaaca gcuauuucua aaaaguuaua agggaggagg gguucuuuuu 1080
ugaucaguau ucacugcugu caccauaauu aauagccuua aaauagcuug uguuuggccc 1140
aaagagaaau guacuuucuu ccagugacuc aaaaaucgug gcuagaacua gacu 1194

Claims (10)

1.抑制lncRNA EPB41L4A-AS1基因表达的物质在如下任一中的应用：
(1)制备抑制细胞凋亡的产品；
(2)抑制细胞凋亡；
(3)制备提高ACE2蛋白含量的产品；
(4)提高ACE2蛋白含量；
(5)制备促进ACE2基因表达的产品；
(6)促进ACE2基因表达；
(7)制备抑制组织器官细胞损伤的产品；
(8)抑制组织器官细胞损伤；
所述lncRNA EPB41L4A-AS1的序列为SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抑制lncRNA EPB41L4A-AS1基因表达的物质为如下任一种：
1)靶向所述lncRNA EPB41L4A-AS1的寡核苷酸；
2)产生靶向所述lncRNAEPB41L4A-AS1的寡核苷酸的DNA分子；
3)产生靶向所述lncRNA EPB41L4A-AS1的寡核苷酸的表达载体；
4)产生靶向所述lncRNA EPB41L4A-AS1的寡核苷酸的重组微生物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述靶向所述lncRNA EPB41L4A-AS1的寡核苷酸的靶序列为SEQ ID No.20所示序列的第841-861位和/或SEQ ID No.20所示序列的第917-937位。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述寡核苷酸为sgRNA、siRNA、shRNA、miRNA或反义RNA。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：
所述siRNA的序列如SEQ ID No.12或SEQ ID No.14所示。
所述shRNA的序列如SEQ ID No.8或SEQ ID No.9所示。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述产生靶向所述lncRNA EPB41L4A-AS1的shRNA的DNA分子序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示。
7.根据权利要求1-6任一所述的应用，其特征在于：所述组织器官细胞损伤由新型冠状病毒所引起。
8.根据权利要求1-6任一所述的应用，其特征在于：所述组织器官细胞损伤为肺细胞损伤、肝细胞损伤和/或血管内皮细胞损伤。
9.一种产品，其特征在于：包含权利要求1-8任一项中所述的抑制lncRNA EPB41L4A-AS1基因表达的物质，所述产品具有如下至少一种功能：
(1)抑制细胞凋亡；
(2)提高ACE2蛋白含量；
(3)促进ACE2基因表达；
(4)抑制组织器官细胞损伤。
10.抑制lncRNAEPB41L4A-AS1基因表达的物质和抑制ACE2基因表达的物质在制备促进细胞凋亡产品或促进细胞凋亡中的应用。
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