CN111454948A - LncRNA EPB41L4A-AS1作为诊断和治疗急性髓系白血病标志物的应用 - Google Patents

LncRNA EPB41L4A-AS1作为诊断和治疗急性髓系白血病标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于治疗急性髓系白血病的长链非编码RNA，具体的所述长链非编码RNA为LncRNA EPB41L4A‑AS1。本发明公开了LncRNA EPB41L4A‑AS1在制备治疗急性髓系白血病的产品中的用途。本发明同时公开了一种治疗急性髓系白血病的药物组合物和一种评价LncRNA EPB41L4A‑AS1的试剂盒。本发明的药物组合物对急性髓系白血病有较好的抑制作用，在急性髓系白血病治疗中具有重要的参考和现实意义。本发明的试剂盒能够LncRNA EPB41L4A‑AS1的表达水平的评价手段之一，对LncRNA EPB41L4A‑AS1作为药物组合物应用时具有较好的衡量和指导作用。

Description

LncRNA EPB41L4A-AS1作为诊断和治疗急性髓系白血病标志 物的应用
技术领域
本发明涉及一种与急性髓系白血病相关的长链非编码RNA及其在急性髓系白血病中应用，所述的长链非编码RNA为LncRNA EPB41L4A-AS1。属于生物医药领域，具体属于分子生物学技术领域。
背景技术
急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是骨髓中未成熟髓系造血细胞引起的的恶性肿瘤。这是一种高度异质性血液系统恶性肿瘤，其发病率随着人的年龄而增加，在65岁达到顶点，据美国国立卫生研究院(National Institutes ofHealth，NIH)统计，每年每10万人中有2.4人被诊断为急性髓系白血病，其死亡率约占因癌症而死亡的人数的1.2％。急性髓系白血病也是一种侵袭性血液肿瘤，具有多种基因型、表型、表观遗传特征和对抗白血病干预的净反应，对细胞毒性治疗具有耐药性。其特点是复发率高，这也急性髓系白血病治疗失败最主要的原因。尽管急性髓系白血病具有异质性，但它表现出避免程序性细胞死亡和抵抗细胞毒性刺激的共同特征。再生和静止的白血病干细胞(he self-renewable and quiescent leukemia stem cells，LSCs)，是急性髓系白血病细胞的一个罕见群体，也是导致急性髓系白血病复发和耐化疗的主要原因。为了根除LSCs从而控制急性髓系白血病，异基因造血细胞移植已经发展了几十年，并成功地用于急性髓系白血病的治疗。此外，包括免疫检查点抑制剂、嵌合抗原受体T细胞和双特异性抗体在内的新免疫治疗策略也在当前的急性髓系白血病治疗中得到越来越多的测试和应用。虽然近期一些治疗急性髓系白血病的新方法已被提出，但除了急性早幼粒细胞白血病，半数的急性髓细胞白血病是迄今为止无法治愈的，其仍然会导致一半以上的青年患者和90％的老年患者死亡。目前，与急性髓系白血病的发展和进展相关的详细和精确的机制仍不清楚，这妨碍了科学家们建立更好的策略来消除LSCs和治愈急性髓系白血病。
成人骨髓是造血的主要部位，为急性髓系白血病等恶性造血疾病的发生发展提供了研究方向。在生理状态下，骨髓微环境与造血干细胞之间的相互作用维持着干细胞腔室增殖、分化和稳态的微妙平衡。但在恶性情况下，急性髓系白血病细胞浸润骨髓，干扰正常造血干细胞-微环境稳态。最近研究发现，调控型非编码RNAs(例如miRNAs、长链非编码RNA、环状RNA等)广泛参与基因翻译和转录以及炎症、个体发生和血管生成等生理和病理过程，在白血病细胞的增殖、分化和凋亡中起着重要的作用，其中一些可能被用作预测预后的生物标志物。最近的一些研究发现表明，长链非编码RNA(Long noncoding RNAs,LncRNAs)表达谱与急性髓系白血病的复发性突变、临床特征和预后相关。此外，长链非编码RNA可作为急性髓系白血病预后的生物标志物。在长链非编码RNA表达的基础上，可能使这些患者免受其他毒副作用。这说明这些长链非编码RNA的一部分可能在白血病发生中起重要作用。长链非编码RNA的长度一般在200-100000个核苷酸之间，位于细胞核或胞质内，按照其来源可分为反义长非编码RNA(Antisense LncRNA)，内含子非编码RNA(Intronic tran)，Longintergenc noncoding RNA(lincRNA)，启动子相关LncRNA(Promoter-associatedLncRNA)，非翻译区LncRNA(UTR associated LncRNA)五种类型。LncRNA功能繁多，可以调控在表观遗传、转录及转录后水平上基因的表达，其参与了X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程，与人类疾病的发生、发展和防治有着密切的关系。总的来说，这些成果为研究急性髓系白血病及其相关的潜在长链非编码RNA的存在提供了新的视角，也为急性髓系白血病的诊断和/或治疗提供了新的研究方向。
有文献报道，作为长链非编码RNA大家族中的一员，长链非编码RNAEPB41L4A-AS1在肿瘤细胞糖酵解和谷氨酰胺分解中起重要作用，其通过介导第二型组蛋白去乙醯酶(Histone deacetylase 2,HDAC2)的核仁转位调节糖酵解和谷氨酰胺分解。也有文献报道，长链非编码RNAEPB41L4A-AS1的异常表达参与了复发性流产(recurrentmiscarriage，RM)早期的病因学，它可能是复发性流产早期治疗的候选诊断标志和潜在治疗靶点。此外，也有文献报道，miR-146a通过与长链非编码RNAEPB41L4A-AS1和长链非编码RNA SNHG7的相互作用抑制骨髓源性间充质干细胞；CIRC 0009910(环状RNA0009910)的基因敲除可通过miRNA抑制急性髓系白血病细胞的增殖和诱导细胞凋亡，所以，CIRC 0009910可能是未来急性髓系白血病治疗的潜在治疗靶点。因此，我们推测长链非编码RNAEPB41L4A-AS1也有可能与某个miRNA相关作用，从而在急性髓系白血病中发挥促进或抑制作用，所以在急性髓系白血病中，长链非编码RNAEPB41L4A-AS1也有可能是一种很有前途的诊断和/或治疗急性髓系白血病生物标志物。本发明通过体内和体外实验从分子机制和应用方面证实了这一推测并以此为基础提出了一个针对急性髓系白血病的诊断试剂盒和治疗的药物组合。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种长链非编码RNA标志物在筛选治疗急性髓系白血病的候选药物中的应用；本发明的目的之二在于提供一种评价该长链非编码RNA表达水平的试剂盒。
为了研究与急性髓系白血病相关的长链非编码RNA在急性髓系白血病中的作用，从而筛选合适的长链非编码RNA。我们通过生物信息学技术及现代分子生物学技术从AML组织中找到了可以作为急性髓系白血病标志物的LncRNAEPB41L4A-AS1。
因此，本发明一方面本发明根据LncRNA EPB41L4A-AS1基因的用途，提供了一种LncRNAEPB41L4A-AS1在制备治疗急性髓系白血病的产品中的用途。
优选地，本发明所述的LncRNAEPB41L4A-AS1如SEQ ID NO.1所示。
优选地，本发明所述的LncRNAEPB41L4A-AS1的靶基因为miR-20a-5p。
优选地，本发明所述的LncRNAEPB41L4A-AS1通过miR-20a-5p促进LRIG1表达。
优选地，本发明所述的LRIG1抑制ErbB信号通路。
再一方面，本发明提供了一种治疗急性髓系白血病的药物组合物，所述药物组合物包括LncRNAEPB41L4A-AS1。
优选地，本发明所述的药物组合物为含有LncRNAEPB41L4A-AS1的质粒。
再一方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括检测LncRNAEPB41L4A-AS1表达水平的试剂。
优选地，所述试剂为特异性扩增LncRNAEPB41L4A-AS1的引物。
优选地，所述特异性扩增LncRNAEPB41L4A-AS1的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示。
本发明通过生物信息学和现有的分子生物学的技术手段，从AML组织中筛选到用于急性髓系白血病治疗的标志物LncRNAEPB41L4A-AS1(LncRNAEPB41L4A-AS1在AML组织中低表达)。在此基础上，本发明一方面提供了一种LncRNAEPB41L4A-AS1在制备治疗急性髓系白血病的产品中的用途；再一方面，本发明还提供了一种基于LncRNAEPB41L4A-AS1的用于治疗急性髓系白血病的药物组合物；再一方面，本发明还提供了一种检测LncRNAEPB41L4A-AS1的表达水平的试剂盒。本发明的LncRNAEPB41L4A-AS1及其药物组合物对急性髓系白血病有较好的抑制作用，在急性髓系白血病治疗中具有重要的参考和现实意义。另外，本发明提供的检测LncRNAEPB41L4A-AS1的试剂盒在LncRNAEPB41L4A-AS1作为药物组合物应用于急性髓系白血病治疗时，对评价药物的持续作用时间和更准确的给药时间等提供了很好的帮助，对LncRNAEPB41L4A-AS1作为药物组合物应用时具有较好的衡量和指导作用。
附图说明
图1EPB41L4A-AS1在AML干细胞中低表达，过表达EPB41L4A-AS1抑制AML干细胞增殖、促进凋亡。图中A表示GEO数据库对比AML干细胞与正常人造血干细胞EPB41L4A-AS1的含量；图中B表示qRT-PCR检测比较正常人造血干细胞和AML干细胞的EPB41L4A-AS1含量差异；图中C表示qRT-PCR比较KG1a干细胞和普通细胞EPB41L4A-AS1含量差异；图中D表示CCK8检测过表达EPB41L4A-AS1对KG1a干细胞的增殖能力影响；图中E表示软琼脂克隆实验检测过表达EPB41L4A-AS1对KG1a干细胞成球能力的影响，scale bar＝100μm；图中F表示Hoechst/PI染色检测过表达EPB41L4A-AS1对KG1a干细胞的影响，视野为200×；图中G表示流式细胞术检测过表达EPB41L4A-AS1对KG1a干细胞凋亡的影响；图中H表示WB检测过表达EPB41L4A-AS1对KG1a干细胞凋亡蛋白表达的影响；图中*代表与Nomal组或者control组相比P<0.05。
图2EPB41L4A-AS1上调LRIG1表达抑制ErbB通路，抑制AML干细胞增殖、促进凋亡。图中A表示WB检测过表达EPB41L4A-AS1对干性相关通路蛋白的影响；图中B表示WB检测过表达EPB41L4A-AS1对ErbB通路蛋白的影响；图中C表示WB检测敲减LRIG1后过表达EPB41L4A-AS1对KG1a干细胞ErbB通路蛋白的表达影响；图中D表示CCK8检测敲减LRIG1后过表达EPB41L4A-AS1对KG1a干细胞增殖能力的影响；图中E表示软琼脂克隆实验检测敲减LRIG1后过表达EPB41L4A-AS1对KG1a干细胞成球能力的影响，scale bar＝100μm；图中F表示Hoechst/PI染色检测过表达EPB41L4A-AS1对KG1a干细胞的影响，视野为200×；图中G表示流式细胞术检测过表达EPB41L4A-AS1对KG1a干细胞凋亡的影响；图中*代表与control组相比P<0.05。
图3EPB41L4A-AS1通过ceRNA作用抑制miR-20a-5p表达，上调LRIG1的表达量。图中A所示数据库预测EPB41L4A-AS1主要定位在核中；图中B所示FISH检测EPB41L4A-AS1主要定位于核中，视野为400×；图中C所示Starbase数据库预测miR-20a-5p可同时与EPB41L4A-AS1和LRIG1的mRNA结合；图中D所示双荧光素酶报告基因实验检测miR-20a-5p与LRIG1(下)、EPB41L4A-AS1(上)及其突变体的结合；图中E所示RIP实验检测EPB41L4A-AS1与miR-20a-5p结合；图中F所示qRT-PCR及WB检测过表达miR-20a-5p对LRIG1的mRNA和蛋白水平变化；图中G所示qRT-PCR检测过表达EPB41L4A-AS1对miR-20a-5p表达的影响；图中H所示qRT-PCR检测过表达EPB41L4A-AS1对LRIG1的mRNA表达的影响；图中I所示WB检测过表达EPB41L4A-AS1对LRIG1蛋白表达的影响；图中*代表与control组或者Anti-lgG组相比P<0.05。
图4EPB41L4A-AS1通过miR-20a-5p调节LRIG1调控ErbB通路抑制AML干细胞细胞增殖并促进细胞凋亡。图中A所示WB检测过表达EPB41L4A-AS1后过表达miR-20a-5p对ErbB通路蛋白表达的影响；图中B所示CCK8检测过表达EPB41L4A-AS1后过表达miR-20a-5p对细胞增殖能力的影响；图中C所示Hoechst/PI染色检测过表达EPB41L4A-AS1后过表达miR-20a-5p对细胞凋亡的影响；图中D所示软琼脂克隆实验检测过表达EPB41L4A-AS1后过表达miR-20a-5p对细胞成球能力的影响，scale bar＝100μm；图中E所示流式细胞术检测过表达EPB41L4A-AS1后过表达miR-20a-5p对细胞凋亡的影响；图中F所示WB检测过表达EPB41L4A-AS1后过表达miR-20a-5p对ErbB通路蛋白表达的影响；图中*代表与control组相比P<0.05。
图5AML模型中过表达EPB41L4A-AS1可抑制AML细胞的体内生长。图中A所示流式细胞术检测过表达EPB41L4A-AS1和miR-20a-5p后人CD45+细胞所占百分比；图中B所示流式细胞术检测各组人CD45+细胞中LRIG1表达量差异；图中C所示比较各组小鼠生存期差异；图中D所示HE染色检测各组小鼠肝、脾、肺组织中AML侵润情况，视野为400×；图中*代表与control组相比P<0.05。
图6在AML患者白血病干细胞中，miR-20a-5p高表达，LRIG1低表达，且二者呈负相关关系。图中A表示qRT-PCR检测miR-20a-5p在AML干细胞及正常人造血干细胞表达的差异；图中B表示qRT-PCR检测AML干细胞和正常人造血干细胞中LRIG1蛋白的含量差异；图中C所示在AML干细胞中相关性分析比较EPB41L4A-AS1与miR-20a-5p；图中D所示在AML干细胞中相关性分析比较LRIG1的mRNA与miR-20a-5p的；图中*代表与Nomal组相比P<0.05。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。实施例中未进行详细说明的实验方法，通常按照本技术领域常规操作或按照厂商建议的条件进行。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品。
本发明经过广泛而深入的研究，通过生物信息学技术和分子生物学技术，检测AML组织中长链非编码RNA的表达水平，发现其中具有明显表达差异的长链非编码RNA片段，探讨其与急性髓系白血病的发生之间的关系，从而为急性髓系白血病的靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过实验，本发明发现AML组织中LncRNA EPB41L4A-AS1显著性下调，进一步的实验证明，改变LncRNA EPB41L4A-AS1的表达水平可以影响AMLSC的生长，提示LncRNAEPB41L4A-AS1可以作为药物靶标用于急性髓系白血病的精准治疗。
“生物标志物”与“标志物”可以等同替代，指代具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。在本发明中，“标志物”指与一个或多个生物分子相关的参数(即“生物标志物”)，例如天然或人工合成产生的核酸(即个体基因，以及编码和非编码DNA和RNA)。本发明中的“标志物”还包括指可通过考虑来自两个或多个不同标志物的表达数据计算或以其他方式获得的单个参数。在本发明中，术语“生物标志物”指代与急性髓系白血病相关联的基因、基因的片段或变体。
基于发明人的发现，本发明提供了一种LncRNA EPB41L4A-AS1在制备治疗急性髓系白血病的产品中的用途以及由此制备的药物组合物和该药物组合物在治疗急性髓系白血病的应用，所述药物组合物的性质对本发明来说并不重要，只要它含有LncRNAEPB41L4A-AS1基因的功能性即可，举例来说，本发明的药物组合物可以是以LncRNAEPB41L4A-AS1基因的合成序列构建的重组质粒、其能抑制AMLSC的自我更新(本发明的优先实施例中有详细介绍)。在此基础上，本发明根据LncRNA EPB41L4A-AS1的核苷酸序列，以及LncRNA EPB41L4A-AS1在急性髓系白血病的作用机制(LncRNA EPB41L4A-AS1通过miR-20a-5p促进LRIG1表达，LRIG1表达抑制ErbB信号通路，影响AML干细胞增殖凋亡，从而抑制急性髓系白血病干细胞的自我更新)从而设计出的针对提高LncRNA EPB41L4A-AS1的基因表达的试剂或者其他组分，另外还可以设计直接提高LRIG1的基因表达的试剂或其他组分以及针对miR-20a-5p的表达的试剂或其他组分，这些试剂或组分都能起到治疗急性髓系白血病的作用，都应属于本发明的保护范围之内。例如，本发明提供的可以上调LncRNA EPB41L4A-AS1的质粒或上调LRIG1的质粒或下调miR-20a-5p的质粒。当然，人工直接合成的LncRNAEPB41L4A-AS1或LRIG1也属于本专利的范围之内。
本发明的LncRNA EPB41L4A-AS1或LRIG1或miR-20a-5p可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。
当然，本发明的药物组合物还可与其他治疗急性髓系白血病的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。
在本发明的实施例中，一种代表性的人LncRNA EPB41L4A-AS1基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1所示。本发明的LncRNA EPB41L4A-AS1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。
通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。
本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。
本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测LncRNA EPB41L4A-AS1的表达。
在某些实施方案中，所述试剂盒包含与一种或多种生物标志物的mRNA特异性结合的一种或多种探针。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含洗涤溶液。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含进行杂交试验的试剂、mRNA分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含使用该试剂盒的说明书。所述试剂盒可以定制供在家使用、临床使用或研究使用。举例说明，本发明提供的试剂盒是基于qRT-PCR实验来源的，本发明不仅提供了一种检测LncRNA EPB41L4A-AS1的引物，还提供了具体的检测方法，在此基础上，本发明可以提炼出一种用于检测LncRNA EPB41L4A-AS1表达水平的qRT-PCR检测试剂盒。该试剂盒在LncRNA EPB41L4A-AS1作为药物组合物应用于急性髓系白血病治疗时，用于评价LncRNA EPB41L4A-AS1的表达水平，从而对评价药物的持续作用时间和更准确的给药时间等提供帮助，这对LncRNAEPB41L4A-AS1作为药物组合物应用时具有较好的衡量和指导作用。
一、实验方法
1.临床样本收集
将本单位自2017年5月至2018年12月捐献外周血造血干细胞的健康供者作为研究对象，男性33例(53.23％)，女性29例(46.77％)，年龄21-78岁，中位年龄43岁。供者接受常规体检，体检合格后可捐献外周血造血干细胞。动员供者外周血造血干细胞：给予供者皮下注射rhG-CSF 5μg/(kg.d)，q12h，共4.5天。动员后采用血细胞分离仪分离外周血造血干细胞。选取2017年5月至2018年12月在本院血液科住院的62例初治AML患者为研究对象，诊断均按照FAB分型和WHO分型诊断为AML，所有患者均行骨髓细胞形态学、流式细胞术检测。男性32例(51.61％)，女性30例(48.39％)，年龄20-78岁，中位年龄42岁，FAB分型：急性粒细胞白血病未分化型(M1)5例，急性粒细胞白血病部分分化型(M2)20例，急性早幼粒细胞白血病型(M3)11例，急性粒-单核细胞白血病型(M4)16例，急性单核细胞白血病(M5)7例，红白血病(M6)3例。采集患者骨髓液，通过流式细胞仪分离出CD34+(Miltenyi Biotec，130-113-741，Mouse，1:50)、CD38-(Miltenyi Biotec，130-113-426，Mouse，1:50)及CD123+(MiltenyiBiotec，130-113-884，Mouse，1:50)的AML干细胞。
2.细胞培养及分组
HEK293T细胞购自中国科学院细胞库，KG1a购自ATCC细胞库，HEK293T使用DMEM培养液(Gibco，12800017)培养(10％FBS，1％双抗)，KG1a使用RPMI1640培养液(Gibco，31800022)培养(10％FBS，1％双抗)，培养方式均为常规细胞培养。
构建慢病毒包装系统，由生物公司(赛业生物)购买敲减LRIG1的核心质粒pLKO.1以及过表达EPB41L4A-AS1的pBABE和过表达miR-339-5pAmp+核心质粒LV3及N包装质粒pVSVG、pREV、pMDL、PIK，利用Turbofect(Thermo，R0531)转染试剂将四种质粒转染进293T后，12h后换培养液，24h和48h分别收集培养液，使用0.22μm滤网过滤培养液，收获病毒，使用QuickTiterTM Lentivirus Titer Kit(VPK-107，Cell biolabs，USA)检测病毒滴度，1ml病毒感染1x106个细胞培养24h进行换液，48h后利用Puromycin(1μg/ml)筛选出稳定敲减LRIG1和过表达EPB41L4A-AS1及miR-20a-5p的细胞。
3.细胞软琼脂克隆培养
将1.2％低熔点琼脂糖与2×的1640培养基以1:1的体积比混合制备0.6％的底层琼脂，6孔板中每个孔1.4ml温室凝固，取对数期细胞，调细胞浓度为10000个/ml，将0.6％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1的体积比混合，制备0.3％的上层琼脂，每孔加1ml上层琼脂和100ul单细胞悬液(约1000个cell/well)，混匀，室温凝固。置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养2周，计数含50个细胞以上得克隆，计算细胞集落形成率。
4.FISH检测EPB41L4A-AS1在白血病细胞中的定位
制备KG1a细胞悬液(2×105个/ml)，滴入载玻片中，轻轻推匀悬液于载玻片中，在空气中摇晃使其快速干燥。按照RiboTMlncRNAFISH Probe Mix(Red)(锐博生物，中国)说明书操作。具体方法如下：在6孔培养板中放入盖玻片，取对数生长期细胞按3×104个/孔接种到六孔板上，培养2天使细胞融合度达到80％左右。取出玻片，PBS清洗5min后加入1ml 4％多聚甲醛室温固定10min，经蛋白酶K(2μg/ml)，甘氨酸及乙酞化试剂处理后，加入250μl预杂交液，42℃孵育1h；吸除预杂交液，加入250μl含有探针(300ng/ml)的杂交液，42℃杂交过夜；PBST清洗3次，每次5min后加入用PBST稀释的DAPI(1：800)染液染核，加入到24孔培养板中，染色5min；PBST清洗3次，每次3min；用抗荧光猝灭剂封片，荧光显微镜(Olympus，Japan)下选取5个不同视野进行观察并拍照。
5.CCK8检测细胞活性
将细胞按每孔1×105个细胞接种于预先每孔加入100μL培养液的96孔板中培养，每孔加入10μL CCK8溶液(C0038，碧云天，中国)，继续培养2h，弃上清，振荡10min，通过酶联免疫检测仪(MK3，Thermo，USA)测定450nm波长处OD值。
6.实时荧光定量PCR法
采用TRIZOL(Invitrogen，Carlsbad，5CA，USA)试剂盒根据说明书步骤严格操作提取组织或细胞总RNA，并测定RNA浓度。本研究所用引物由大连Takara公司合成(表1)。对于miRNA，采取PolyA加尾法检测试剂盒(B532451，生工，中国)进行操作(内含通用型PCR引物R和U6通用PCR引物R)，得到含PolyA尾的miRNA的cDNA。非miRNA反转录按照cDNA反转录试剂盒(K1622，北京雅安达生物技术有限公司，北京，中国)说明书进行反转录操作，设定反应条件为：42℃，30～50min(反转录反应)；85℃，5s(反转录酶失活反应)。反转录的cDNA稀释至50ng/μL，后续荧光定量PCR备用。每次加2μL，反应扩增体系为25μL。放入荧光定量PCR仪(ViiA7，中山大学达安基因有限公司，中国)中进行检测。反转录反应条件：95℃预变性4min；95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环。以2μg总cDNA为模板，GAPDH作为内参引物采用相对定量法(2－△△Ct法)计算目的基因的相对转录水平：△△Ct＝△Ct实验组-△Ct对照组，△Ct＝Ct(目的基因)-Ct(内参)，目的基因mRNA的相对转录水平＝2-△△Ct。每次实验重复三次。
表1.实时定量PCR引物序列
Figure BDA0002434888650000091
7.Western Blot检测法
取出各组细胞，用PBS洗涤2次后，再加入RIPA(P0013B，碧云天生物技术有限公司，上海，中国)，含PMSF及磷酸酶抑制剂，漩涡仪上震荡5min，4℃12000r/min离心30min。取上清，用BCA试剂盒(P0012，碧云天生物技术有限公司，上海，中国)检测总蛋白浓度。取50μg蛋白溶于2×SDS上样缓冲液中，100℃煮沸，5min后，将上述各样品经质量浓度10％SDS－PAGE凝胶电泳，湿转法将蛋白转移至PVDF膜，5％脱脂奶粉在室温下封闭1h，然后将PVDF膜与稀释的一抗LRIG1(#12752，1:1000，Rabbit，CST，USA)、Cleaved-caspase3(#9661，1:1000，Rabbit，CST，USA)、BAX(ab232479，1:1000，Rabbit，abcam，UK)、Bcl2(ab32124，1:1000，Rabbit，abcam，UK)、EGFR(ab52894，1:1000，Rabbit，abcam，UK)、p-EGFR(ab40815，1:1000，Rabbit，abcam，UK)、HER2(ab16901，1:1000，Mouse，abcam，UK)、p-HER2(ab131102，1:500，Rabbit，abcam，UK)和β-actin(ab8226，1:1000，Mouse，abcam，UK)孵育，用TBST洗3次后将膜与相对于HRP标记二抗(山羊抗鼠或山羊抗兔，全式金)孵育1h。TBST漂洗后，置于干净的玻璃平板上。取ECL荧光检测试剂盒(BB-3501，Ameshame公司，英国)中等量的A液和B液，暗室中混匀，将其滴加膜上，放入凝胶成像仪中曝光成像。用Bio-Rad图象分析系统(美国BIO-RAD公司)照相，用Quantity One v4.6.2软件分析，以相应蛋白条带的灰度值/β-actin蛋白条带的灰度值表示相对蛋白含量，重复三次。
8.Hoechst33342/PI双染凋亡检测
培养细胞，待细胞稳定后，分别在细胞的培养液中加入Hoechst33342至培养液内浓度为5μg/ml同时加入PI至培养液内浓度为10μg/ml。避光，放入培养箱中温育20min。荧光显微镜下观察细胞，随机选取多个视角拍照，记录统计蓝色光点和红色光点的数目。
9.流式细胞术
利用ANNEXIN V-FITC/PI试剂盒(索莱宝，CA1020，北京)，用27ml的去离子水稀释3ml Binding Buffer(10×)至30ml，每次用3ml。收集细胞(1×106个/次)，然后用冷的PBS洗涤。(对于贴壁细胞，先用胰酶消化，再用PBS洗涤)。用1ml 1×的Binding Buffer悬浮细胞，300×g离心10min，弃上清。用1ml 1×的Binding Buffer重悬细胞，使细胞的密度达到1×106个/ml。每管加入100μL细胞(1×105个)。再向管中加入5μl Annexin V-FITC。室温，避光，轻轻地混匀，10min。加入5μL PI，室温，避光，孵育5min。加入PBS至500μl，轻轻混匀。在1小时内用流式细胞仪BD FACS CantoⅡ(BD Immunocytometry Systems)检测，利用Flow Jo软件分析。
将细胞制成单细胞悬浮液，重悬于染色缓冲液(BD Biosciences)中，，KG1a细胞使用CD34-PE(Miltenyi Biotec，130-113-741，Mouse，1:50)和CD38-FITC(Miltenyi Biotec，130-113-426，Mouse，1:50)进行干细胞筛选。通过Flow Jo软件分析。
10.双荧光素酶报告基因实验
使用生物学预测网站Starbase网站进行EPB41L4A-AS1、LRIG1与miR-20a-5p的靶位点预测，利用双荧光素酶报告基因实验验证EPB41L4A-AS1、LRIG1与miR-20a-5p是否存在靶向关系。分别构建靶基因EPB41L4A-AS1、LRIG1双荧光素酶报告基因载体以及与miR-20a-5p结合位点突变的突变体：PGLO-EPB41L4A-AS1 WT、PGLO-LRIG1 WT和PGLO-EPB41L4A-AS1MUT、PGLO-LRIG1 MUT。将报告质粒与过表达miR-20a-5p质粒和阴性对照质粒分别共转染至HEK293T细胞中，转染24h后裂解细胞，12000r/min离心1min，收集上清。使用双荧光素酶报告基因检测系统(
Figure BDA0002434888650000111
Reporter Assay System,E1910,Promega)检测荧光素酶活性。以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶作为相对荧光素酶活性。实验重复3次。
11.RNA免疫沉淀(RIP)
采用RIP试剂盒(millipore，USA)检测EPB41L4A-AS1与AGO2蛋白结合情况。用预冷PBS洗HPMEC细胞后弃上清。用等体积的RIPA裂解液(P0013B，碧云天)冰浴5min裂解细胞，14000rpm，4℃离心10min取上清。细胞提取液一部分取出作为input，一部分与抗体孵育进行共沉淀，具体步骤为：每一个共沉淀反应体系取50μL磁珠清洗后重旋与100μL RIP WashBuffer中，依据实验分组加入5μg抗体孵育以便结合。磁珠-抗体复合物经清洗后与重悬于900μLRIP Wash Buffer，加入100μL细胞提取液4℃孵育过夜。样品置于磁座上收集磁珠-蛋白复合物。样品及Input分别经蛋白酶K消化后提取RNA，用于后续PCR检测。RIP所用抗体为：兔抗人AGO2(ab186733，1：50，abcam，上海中国)室温混匀30min，以兔抗人IgG(ab109489，1：100，Abcam，上海中国)作为阴性对照。
12.实验动物分组和处理
选取5～8周龄，体重为(18.38～22.92)g左右的NOD/SCID雌性小鼠(购自上海灵畅公司)64只。实验前于我院动物实验中心SPF级环境中饲养。温度环境舒适，无菌饲料及饮水，昼夜交替各12h，适应性饲养7天。培养CD34+CD38-的KG1a细胞，细胞计数，通过尾静脉将分离的AML病人单个核细胞移植到经过300cGay照射的小鼠(NOD/SCID)体内，每只小鼠移植1×107个KG1a细胞，每只小鼠移植200μl的体积。注射的白血病干细胞分别经以下处理：组一：注射CD34+CD38-的KG1a细胞。组二：注射过表达EPB41L4A-AS1的CD34+CD38-的KG1a细胞。组三：注射过表达miR-20a-5p的CD34+CD38-的KG1a细胞。组四：注射过表达EPB41L4A-AS1后同时过表达miR-20a-5p的CD34+CD38-的KG1a细胞。以上所有实验动物经过动物保护和使用委员会批准，本研究中所有动物实验均符合当地实验动物的管理和使用原则，并遵循美国国立卫生研究院颁布的《实验动物管理与使用指南》。
13.HE染色
颈椎脱臼法将小鼠处死后，取出肝、肺、脾组织，10％中性甲醛溶液中固定过夜，石蜡包埋。连续切片。HE染色流程如下：二甲苯中脱蜡梯度酒精浓度水化，自来水冲洗3min后，苏木精染色8min，自来水冲洗5min，伊红液染色2min，行常规脱水、透明、树脂封片。高倍镜下观察细胞病理特征差异变化。
二、实验结果
1.EPB41L4A-AS1在AML干细胞中低表达，过表达EPB41L4A-AS1抑制AML干细胞增殖、促进凋亡
LNC RNA的异常表达影响着多种癌症的发生发展，为探究急性白血病(AML)干细胞相对于正常人造血干细胞的LNC RNA表达差异，通过GSE17054芯片分析发现相对于正常人造血干细胞，EPB41L4A-AS1在AML干细胞中显著低表达(如图1.A)，提示EPB41L4A-AS1参与AML干细胞发生发展过程。为确定EPB41L4A-AS1是否在AML干细胞中低表达，我们通过收集AML患者外周血，通过流式细胞术分选出CD34+CD38-细胞，通过qRT-PCR检测EPB41L4A-AS1发现，相对于收集的正常人造血干细胞，AML干细胞中EPB41L4A-AS1表达明显低于正常人造血干细胞(如图1.B)，表明EPB41L4A-AS1确实在AML干细胞中低表达。
为了研究EPB41L4A-AS1对AML干细胞生物学特性的影响，我们首先通过流式细胞术分选出CD34+CD38-的KG1a细胞，并通过qRT-PCR对比普通KG1a中EPB41L4A-AS1的含量，结果发现CD34+CD38-的KG1a干细胞中EPB41L4A-AS1的含量明显低于KG1a细胞(如图1.C)。为检测EPB41L4A-AS1的功能，我们在KG1a干细胞中过表达EPB41L4A-AS1，并利用CCK8检测细胞活力的变化，结果显示，KG1a中过表达EPB41L4A-AS1后，细胞活力显著降低(如图1.D)。同时，我们通过3D培养检测KG1a干细胞成球能力的差异，同样的，过表达EPB41L4A-AS1后KG1a干细胞的成球能力显著下降(如图1.E)。为检测EPB41L4A-AS1对KG1a干细胞凋亡的影响，通过Hoechst/PI染色以及流式细胞术检测发现，过表达EPB41L4A-AS1后KG1a干细胞凋亡细胞比例显著增加(如图1.F、G)。同时，我们通过WB检测发现，KG1a干细胞中过表达EPB41L4A-AS1后，BAX、cleaved-caspase3蛋白发生上调，Bcl-2蛋白发生下调(如图1.H)，提示EPB41L4A-AS1促进了KG1a干细胞的凋亡。
2.EPB41L4A-AS1上调LRIG1表达抑制ErbB通路，抑制AML干细胞增殖、促进凋亡
为探究EPB41L4A-AS1通过何种途径影响KG1a干细胞的增殖、凋亡，我们首先通过WB检测了影响干细胞增殖、凋亡的的通路蛋白(包括ERK通路，wnt/β-catenin通路，STAT3通路，ErbB通路)，结果发现KG1a中过表达EPB41L4A-AS1后ErbB通路发生显著变化(如图2.A)，提示KG1a干细胞中ErbB通路发生了显著变化，为探究EPB41L4A-AS1是通过何种途径影响ErbB通路，我们通过检测ERBB信号通路相关蛋白，EGFR、HER2 LRIG1，发现过表达EPB41L4A-AS1后，LRIG1表达显著上调，p-EGFR、p-HER2下调(如图2.B)，这些结果使我们猜测EPB41L4A-AS1可能通过调控LRIG1的表达，调控ErbB通路。为验证这一猜测，我们在KG1a干细胞中敲减LRIG1后，过表达EPB41L4A-AS1，发现在敲减LRIG1后，过表达EPB41L4A-AS1不再引起EGFR、p-EGFR、HER2、p-HER2表达变化(如图2.C)，表明EPB41L4A-AS1引起的ErbB通路蛋白变化主要由LRIG1所介导。同时，我们同样的检测了KG1a干细胞敲减LRIG1后，过表达EPB41L4A-AS1后利用CCK8检测细胞的增殖能力变化，发现敲减LRIG1后过表达EPB41L4A-AS1不再引起KG1a干细胞的增殖能力的下降(如图2.D)，利用3D培养检测发现，敲减LRIG1后过表达EPB41L4A-AS1同样不再引起细胞成球能力的改变(如图2.E)，表明过表达EPB41L4A-AS1引起的增殖、成球能力的变化由LRIG1介导。通过Hoechst/PI染色和流式细胞术检测KG1a干细胞敲减LRIG1后过表达EPB41L4A-AS1后细胞凋亡的变化，结果发现敲减LRIG1后过表达EPB41L4A-AS1不再引起细胞凋亡的改变(如图2.F、G)，表明EPB41L4A-AS1引起的细胞凋亡增加由LRIG1介导。
3.EPB41L4A-AS1作为miR-20a-5p ceRNA上调LRIG1的表达
为探究EPB41L4A-AS1是通过何种途径影响LRIG1的表达，我们通过数据库预测EPB41L4A-AS1在细胞中的定位，并通过FISH检测EPB41L4A-AS1在细胞中的定位，发现EPB41L4A-AS1主要定位在细胞质中(如图3.A、B)，提示EPB41L4A-AS1可能通过吸附机制影响LRIG1的表达。我们通过Starbase数据库预测既可以和EPB41L4A-AS1结合，同时又能抑制LRIG1表达的miRNA，发现miR-20a-5p满足这一条件(如图3.C)，提示EPB41L4A-AS1可能通过吸附miR-20a-5p，从而抑制miR-20a-5p对LRIG1的调控，进而促进了LRIG1的表达。为验证这一猜想，我们首先通过荧光素酶报告基因实验检测EPB41L4A-AS1与miR-20a-5p以及miR-20a-5p与LRIG1的mRNA的3‘UTR区域是否发生结合，发现二者均能发生结合，而突变掉相互结合的位点，荧光值不再降低(如图3.D)。为进一步证实这一推测，我们通过RIP实验检测IgG和AGO2蛋白对EPB41L4A-AS1和miR-20a-5p的富集情况，验证EPB41L4A-AS1与miR-20a-5p是否相互结合，结果显示AGO2可增加EPB41L4A-AS1和miR-20a-5p的富集(如图3.E)。为检测miR-20a-5p是否影响EPB41L4A-AS1和LRIG1的表达，我们通过WB和qRT-PCR检测过表达miR-20a-5p对EPB41L4A-AS1和LRIG1的mRNA及蛋白的影响，发现EPB41L4A-AS1和LRIG1的mRNA及蛋白水平均发生下调(如图3.F)，表明miR-20a-5p可以抑制LRIG1的mRNA及蛋白表达。同时，我们通过过表达EPB41L4A-AS1后，利用qRT-PCR检测miR-20a-5p以及LRIG1的mRNA的表达，发现miR-20a-5p发生下调(如图3.G)，LRIG1的mRNA发生上调(如图3.H)，且通过WB检测发现LRIG1的蛋白水平发生上调(如图3.I)，表明过表达EPB41L4A-AS1可通过抑制miR-20a-5p的表达，进而促进LRIG1的mRNA及蛋白表达。
4.EPB41L4A-AS1通过miR-20a-5p调节LRIG1抑制AML干细胞细胞增殖并促进细胞凋亡
为探究EPB41L4A-AS1是否通过miR-20a-5p调节LRIG1的表达，进而调控ErbB通路，从而影响AML干细胞的增殖、凋亡。首先，我们在KG1a干细胞中过表达EPB41L4A-AS1，同时过表达miR-20a-5p，通过WB检测LRIG1和ErbB通路蛋白的表达变化，发现过表达EPB41L4A-AS1，同时过表达miR-20a-5p后LRIG1和EGFR、p-EGFR、HER2、p-HER2蛋白表达得到一定的回补(如图4.A)。同时，利用CCK8检测发现，过表达EPB41L4A-AS1后，过表达miR-20a-5p可抑制由过表达EPB41L4A-AS1引起的增殖能力降低(如图4.B)。通过3D培养同样发现，过表达miR-20a-5p可抑制由过表达EPB41L4A-AS1引起的成球能力降低(如图4.D)。利用Hoechst/PI染色发现，过表达EPB41L4A-AS1引起KG1a干细胞凋亡增多，而同时过表达miR-20a-5p则抑制了这一现象(如图4.C)，并同时使用流式细胞术得到了相同的结论(如图4.E)。我们通过WB检测发现过表达EPB41L4A-AS1促进包括BAX、cleaved-caspase3凋亡蛋白的表达，抑制了bcl-2的表达，过表达EPB41L4A-AS1后过表达miR-20a-5p则逆转了这一现状(如图4.F)。
5.AML模型中过表达EPB41L4A-AS1可抑制AML细胞的体内生长
为探究EPB41L4A-AS1对体内白血病模型的影响，我们首先通过放射处理NOD/SCID小鼠，并通过尾静脉注射CD34+CD38-的KG1a细胞以构建白血病模型。注射的白血病干细胞分别经以下处理：组一：注射CD34+CD38-的KG1a细胞。组二：注射过表达EPB41L4A-AS1的CD34+CD38-的KG1a细胞。组三：注射过表达miR-20a-5p的CD34+CD38-的KG1a细胞。组四：注射过表达EPB41L4A-AS1后同时过表达miR-20a-5p的CD34+CD38-的KG1a细胞。
注射细胞6周后，通过流式细胞术检测尾血中人CD45+的细胞所占细胞的百分比，发现注射过表达miR-20a-5p组含人CD45+的细胞数目最多，注射普通KG1a干细胞和注射同时过表达EPB41L4A-AS1和miR-20a-5p的人CD45+细胞百分比次之，而过表达EPB41L4A-AS1则含量最少(如图5.A)。同时，我们同样通过流式细胞术检测了各组中人CD45+细胞中LRIG1的表达，发现过表达EPB41L4A-AS1组LRIG1含量最高，注射普通KG1a干细胞和注射同时过表达EPB41L4A-AS1和miR-20a-5p的人CD45+中LRIG1含量次之，而注射过表达miR-20a-5p组LRIG1含量最少(如图5.B)。通过对比各组小鼠生存期发现，过表达EPB41L4A-AS1组生存期最长，注射普通KG1a干细胞和注射同时过表达EPB41L4A-AS1和miR-20a-5p组生存期短于过表达EPB41L4A-AS1组，而过表达miR-20a-5p组生存期最短(如图5.C)。将各组小鼠肝、脾和肺进行HE染色，比较各组小鼠中各个器官白细胞浸润情况，过表EPB41L4A-AS1组小鼠肝、脾和肺中白细胞浸润最少，注射KG1a干细胞和注射同时过表达EPB41L4A-AS1和miR-20a-5p组白细胞浸润多于过表达EPB41L4A-AS1组，而过表达miR-20a-5p组白细胞浸润最多(如图5.D)。
6.在AML患者白血病干细胞中，miR-20a-5p高表达，LRIG1低表达，且二者呈负相关关系
为检测miR-20a-5p以及LRIG1是否在AML患者白血病干细胞中高表达，我们通过提取AML患者白血病干细胞，并对比正常人造血干细胞，通过qRT-PCR检测发现，AML患者白血病干细胞中miR-20a-5p表达明显高于正常人造血干细胞(如图6.A)。同时，通过流式细胞术检测AML患者白血病干细胞和正常人造血干细胞中LRIG1的表达，发现正常人造血干细胞中LRIG1含量明显高于AML干细胞(如图6.B)。此外，我们对比了AML患者白血病干细胞中EPB41L4A-AS1的含量与miR-20a-5p含量的相关性分析，发现二者存在显著的负相关(如图6.C)。同时，我们也对比了AML患者白血病干细胞中miR-20a-5p与LRIG1的mRNA含量，发现二者同样存在显著的负相关(如图6.D)。这些数据表面，在AML患者白血病干细胞中，低表达的EPB41L4A-AS1提高了miR-20a-5p的表达量，从而抑制了LGRI1的表达，进而促进了白血病干细胞中ErbB通路，从而提高了AML干细胞增殖以及抗凋亡能力。
综上所述，急性髓系白血病干细胞中长链非编码EPB41L4A-AS1可竞争性结合miR-20a-5p，并靶向抑制LRIG1的表达，进而促进ErbB信号通路，诱发急性髓系白血病干细胞增殖和凋亡减弱，提示长链非编码EPB41L4A-AS1、miR-20a-5p和LRIG1表达水平的高低与急性髓系白血病干细胞增殖和凋亡密切相关。本发明中长链非编码EPB41L4A-AS1、miR-20a-5p和LRIG1可联合用于诊断预示急性髓系白血病干细胞的增殖和凋亡状态，并具有精准性高的特点。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 湖南科互生物医药有限公司
<120> LncRNA EPB41L4A-AS1作为诊断和治疗急性髓系白血病标志物的应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1194
<212> DNA
<213> LncRNA EPB41L4A-AS1核苷酸序列
<400> 1
tgtcgggtcc caaaatacgt ggtctaaagt cctttgggct cctgccgctg ccagcactga 60
tcatatgctc ttgaccctgg tcgggtgggg ggatgtctgg atacctcctc tgtggaaaga 120
actggccaca catccgcaga ggtgactcgg gctgagaacc caggctcctc ctccctttgg 180
tgacacgccc ctcggtccct cactggcact tctccctccg gccacacggc ggcgtctcgc 240
catagcgcag cggccgatgg tacagcccgc tcccccctcg cgctctcgga cagtgggtcc 300
ttccacttgt agaaaagcat tgtgggacgg aagcctgtcc tttcttcctt ttggtgcgag 360
cttgctgtgg tttttgctct gggtcctctg ggatggcgcc tggctgtggc cgcgtggtct 420
ctcacgcagg ggcgccgggc gggggaacgc ggccaccctg agtctggtga gtcgactgcg 480
gcggcctgtg tccgaagtgt ccggggccgt gaacaagggc agcggcctgg cctcaggcct 540
gcgttcccac gtttggaaac ggggagcttc gtcgatttgt gtttacatca tcgactatgc 600
cagggagttc tccagataag cctggtttta ttttcgtcag tgaaaaggcc ttaccgtata 660
actgacttta tgcttgccct gcccccgtat aaaataactt aaaagcagcg tgcctggtta 720
cagctgtttc cacgtgcggt gctcgtcggg agtgatcacc taccctacag gtggaagatg 780
gatgcctgaa gtgtagactg ctgctagctg aataccatct gggagcataa aggtgacctg 840
aaggatgtcc ttggtgagga ttttgaaaat ttgatcttca caagagttgc ctggatcatt 900
tgaaatttct gggagtctga ggagtactga cataattacc tgctggagtc tgtaaataca 960
catttaagac agtgaggatg tgaataaata tattaatgca ctttggcatt tgtgttttaa 1020
gtgattaact gccagaaaca gctatttcta aaaagttata agggaggagg ggttcttttt 1080
tgatcagtat tcactgctgt caccataatt aatagcctta aaatagcttg tgtttggccc 1140
aaagagaaat gtactttctt ccagtgactc aaaaatcgtg gctagaacta gact 1194
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcgggtccca aaatacgtgg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgtgtcacca aagggaggag g 21

Claims (10)

1.一种长链非编码RNA，所述长链非编码RNA为LncRNA EPB41L4A-AS1，其特征在于，LncRNA EPB41L4A-AS1在制备治疗急性髓系白血病的产品中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的LncRNA EPB41L4A-AS1如SEQ IDNO.1所示。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的LncRNA EPB41L4A-AS1的靶基因为miR-20a-5p。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的LncRNA EPB41L4A-AS1通过miR-20a-5p促进LRIG1表达。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的LRIG1抑制ErbB信号通路。
6.一种治疗急性髓系白血病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括LncRNAEPB41L4A-AS1。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物为含有LncRNAEPB41L4A-AS1的质粒。
8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测LncRNA EPB41L4A-AS1表达水平的试剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂为特异性扩增LncRNAEPB41L4A-AS1的引物。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增LncRNA EPB41L4A-AS1的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112575076A (zh) * 2020-11-02 2021-03-30 深圳恒生医院 一种用于检测和评估早期自然流产的LncRNA标记物及应用其的产品
CN112661826A (zh) * 2020-12-25 2021-04-16 中山大学 小肽ERpeptide及其在急性髓系白血病中的应用
CN113995768A (zh) * 2021-10-21 2022-02-01 清华大学深圳国际研究生院 寡核苷酸在抑制新冠病毒所致的多组织器官细胞损伤中的应用

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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