CN116103403A - 一种用于卵巢癌诊断和预后判断的生物标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于卵巢癌诊断和预后判断的生物标志物及其应用，涉及生物医药技术领域；所述生物标志物为SNRPB。本发明发现SNRPB在卵巢癌患者中高表达且与卵巢癌不良预后相关，首次证明SNRPB不仅可以作为卵巢癌的诊断和预后判断的生物标记物，还可以作为卵巢癌的预防和治疗的作用靶点。另外本发明发现BRCA2调控新策略，首次证明干扰SNRPB调控BRCA2外显子3跳跃，导致PALB2结合位点的丢失进而造成DNA修复功能缺陷，而增加卵巢癌细胞对顺铂的敏感性，可以作为卵巢癌治疗的新策略。并且，本发明更进一步阐明了SNRPB可以调控POLA1和BRCA2的可变剪接。

Description

一种用于卵巢癌诊断和预后判断的生物标志物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种用于卵巢癌诊断和预后判断的生物标志物及其应用。
背景技术
卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤，病死率居妇科恶性肿瘤之首，被称为“妇癌之王”。卵巢癌起病隐匿，临床上70％的患者就诊时已届晚期。肿瘤细胞减灭术联合以铂类为基础的化疗是晚期卵巢癌患者的一线标准治疗方案。目前卵巢癌发病机制不清，难于实施源头预防，无法实现卵巢癌风险人群筛检和早期诊断，治疗后易发生化疗耐药，多数患者复发死亡。因此，阐明卵巢癌发生发展机制、实现早期筛检、逆转化疗耐药，实施精准靶向治疗，是亟待解决的重大临床问题。
本发明前期基于浆液性卵巢癌差异表达的RNA-seq数据联合TCGA卵巢癌数据挖掘分析，发现了浆液性卵巢癌中新的关键核心剪接因子SNRPB。小核核糖核蛋白的核心组分由几种Sm蛋白组成，其中包括Sm-B/B′(SNRPB)、Sm-D1(SNRPD1)、Sm-D2(SNRPD2)、Sm-D3(SNRPD3)、Sm-E(SNRPE)、Sm-F(SNRPF)和Sm-G(SNRPG)。Sm蛋白结合核内小RNA形成小核核糖核蛋白复合物参与pre-mRNA剪接和调控。SNRPB在人类恶性肿瘤中发挥重要的调控作用。SNRPB介导的RNA剪接驱动肝细胞癌的增殖和干性维持。SNRPB促进非小细胞肺癌细胞的增殖和转移，SNRPB干扰导致RAB26mRNA内含子7的保留，进而通过激活无意义介导的RNA衰变下调RAB26mRNA表达，此外，SNRPB介导非小细胞肺癌的顺铂耐药。SNRPB通过抑制p53表达促进宫颈癌的恶性进展。泛癌研究发现SNRPB在几乎所有肿瘤中明显升高，SNRPB启动子低甲基化水平促进了SNRPB的高表达，SNRPB表达与肿瘤的病理和TNM分期相关，是不良预后的危险因素。小核核糖核蛋白的Sm核心成分促进同源重组修复，其中SNRPB被证实与CHK1和RAD51存在相互作用。由此可见，SNRPB是恶性肿瘤中的关键驱动基因，靶向SNRPB表达可能是一项治疗肿瘤的有效策略。反义寡核苷酸(Antisenseoligonucleotides，ASO)通过沃森-克里克碱基配对结合到特定的靶序列上，是疾病治疗的强大工具。FDA批准的RNA疗法中大部分是用于治疗遗传疾病的反义寡核苷酸和小干扰RNA(SmallinterferingRNA，siRNA)候选药物，因此开发SNRPB的ASO以及实现对肿瘤细胞的定向转运及杀伤对于高级别浆液性卵巢癌的治疗具有巨大的临床转化应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于卵巢癌诊断和预后判断的生物标志物及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明研究发现SNRPB在卵巢癌患者中高表达且与卵巢癌不良预后相关，首次证明SNRPB不仅可以作为卵巢癌的诊断和预后判断的生物标记物，还可以作为卵巢癌的预防和治疗的作用靶点。
本发明针对卵巢癌发生发展机制进行了相关研究，通过研究核心剪接因子在输卵管伞及卵巢癌组织中的差异表达水平、功能实验明确了SNRPB对卵巢癌细胞增殖和转移的影响，RNA-seq分析了SNRPB干扰前后调控的差异表达基因，并且以RNA-seq数据为基础进行了可变剪接事件的分析，确定了SNRPB是参与卵巢癌发生发展的关键核心剪接因子，SNRPB在卵巢癌中高表达，并与卵巢癌患者不良预后密切相关，SNRPB调控DNA聚合酶α(POLA1)外显子3跳跃进而影响其表达。SNRPB调控BRCA2外显子3跳跃导致PALB2结合位点的丢失进而造成DNA修复功能缺陷，野生型的BRCA2转变为一种类似“突变”型，降低了同源重组修复的效率，有望应用于高级别浆液性卵巢癌药物的开发，扩展顺铂的使用范围、增加顺铂的敏感性和/或缓解顺铂耐药的临床难题。另外本发明设计了针对SNRPB的ASO药物，经证实可以明显下调SNRPB表达，有望应用于高级别浆液性卵巢癌药物的开发。
基于此，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种卵巢癌的生物标志物，所述生物标志物为SNRPB。
本发明还提供检测SNRPB表达水平的试剂在制备卵巢癌诊断和/或预后判断产品中的应用。
所述检测SNRPB表达水平的试剂包括通过免疫印迹方法、免疫组化方法、酶联免疫吸附方法、RT-qPCR检测方法、免疫荧光检测等常用检测方法检测SNRPB含量所需要的试剂。
进一步地，所述产品为试剂盒或试剂。
进一步地，所述诊断包括预后判断。
本发明还提供一种卵巢癌诊断和/或预后判断产品，包括检测SNRPB表达水平的试剂。
本发明还提供一种降低SNRPB表达水平的物质在制备预防和/或治疗卵巢癌的药物中的应用。
进一步地，所述物质为反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。
进一步地，所述卵巢癌为高级别浆液性卵巢癌。
本发明还提供一种预防和/或治疗卵巢癌的药物，包括降低SNRPB表达水平的试剂。
本发明还提供一种降低SNRPB表达水平的物质在制备提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性的药物中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明发现SNRPB在卵巢癌患者中高表达且与卵巢癌不良预后相关，首次证明SNRPB不仅可以作为卵巢癌的诊断和预后判断的生物标记物，还可以作为卵巢癌的预防和治疗的作用靶点。另外本发明发现BRCA2调控新策略，首次证明干扰SNRPB调控BRCA2外显子3跳跃，导致PALB2结合位点的丢失进而造成DNA修复功能缺陷，而增加卵巢癌细胞对顺铂的敏感性，可以作为卵巢癌治疗的新策略。并且，本发明更进一步阐明了SNRPB可以调控POLA1和BRCA2的可变剪接。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为SNRPB在卵巢癌患者样本中高表达并与卵巢癌患者不良预后正相关；其中，A：TCGA-GTEX数据分析卵巢癌(n＝426)、正常输卵管(FT，n＝5)和卵巢组织(n＝88)中SNRPBmRNA表达差异；B：CPTAC数据库中SNRPB在卵巢癌(n＝85)和卵巢组织(n＝22)中的差异蛋白表达分析；C：SNRPB表达对总生存率的影响(高表达组，n＝689；低表达组，n＝967)，采用Kaplan-MeierPlotter(http：//kmplot.com/)进行分析；D：基于CSIOVDB数据库中SNRPBmRNA表达与卵巢癌患者临床预后的相关性分析；E：SNRPB在卵巢癌(n＝33)和正常输卵管(n＝27)组织中差异表达的qPCR分析；F：SNRPB在卵巢癌(n＝136)和正常输卵管(n＝75)组织中免疫组化评分的差异分析；G：SNRPB表达对总生存期的影响(高表达组，n＝74；低表达组，n＝62)；*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001，****：p<0.0001；
图2为对照组、siRNA沉默SNRPB的卵巢癌细胞株HEY和SKOV3以及过表达SNRPB的卵巢癌细胞株HEY的SNRPBmRNA检测结果；
图3为对照组、siRNA沉默SNRPB的卵巢癌细胞株HEY和SKOV3以及过表达SNRPB的卵巢癌细胞株HEY的免疫印迹结果；
图4为对照组、siRNA沉默SNRPB的卵巢癌细胞株HEY(B)和SKOV3(A)以及过表达SNRPB的卵巢癌细胞株HEY(C)的相对细胞存活率；
图5为对照组、siRNA沉默SNRPB的卵巢癌细胞株HEY(B)和SKOV3(A)以及过表达SNRPB的卵巢癌细胞株HEY(C)的克隆形成能力检测结果；
图6为对照组、siRNA沉默SNRPB的卵巢癌细胞株HEY和SKOV3以及过表达SNRPB的卵巢癌细胞株HEY的迁移(A)和侵袭(B)能力检测结果；
图7为SNRPB沉默抑制卵巢癌细胞在体内的致瘤能力；其中，A为照组(sh-Ctrl)和SNRPB沉默组(sh-SNRPB#1和sh-SNRPB#2)卵巢肿瘤体内代表图；B为对照组(sh-Ctrl)和SNRPB沉默组(sh-SNRPB#1和sh-SNRPB#2)肿瘤大小和重量；C为对照组(sh-Ctrl)和SNRPB沉默组(sh-SNRPB#1和sh-SNRPB#2)裸鼠皮下植入分离的肿瘤图像(每组n＝12只小鼠)；*：p<0.05，**：p<0.01；
图8为siRNA沉默SNRPB的卵巢癌细胞株HEY、SKOV3的POLA1mRNA(A)和免疫印迹(B)结果图；
图9为SNRPB介导卵巢癌POLA1pre-mRNA外显子3跳跃；其中，A为针对外显子2和4的特异性RT-PCR引物；B为检测POLA1-201/202和POLA1-207的表达的结果；GAPDH作为内源性对照；
图10为SNRPB蛋白与POLA1mRNA相关性的分析；其中，A为在SNRPB构建的过表达细胞系中使用Flag抗体进行RIP实验获取相应的RNA产物，经逆转录反应后使用qPCR检测POLA1mRNA表达；B为在SNRPB构建的过表达细胞系中使用Flag抗体进行RIP实验获取相应的RNA产物，经过逆转录反应后使用RT-PCR以及琼脂糖凝胶实验检测POLA1mRNA表达；*p<0.05，**p<0.01；
图11为对照组、siRNA沉默POLA1的卵巢癌细胞株HEY和A2780中的POLA1mRNA检测结果；
图12为对照组、siRNA沉默POLA1的卵巢癌细胞株HEY(B)和A2780(A)的相对细胞存活率；
图13为对照组、siRNA沉默POLA1的卵巢癌细胞株HEY(B)和A2780(A)的细胞克隆生成能力结果；
图14为POLA1的敲除部分逆转SNRPB过表达诱导的增殖能力(A)和克隆生成能力(B)结果；*：p<0.05，**：p<0.01；
图15为检测细胞水平上SNRPB通过调控BRCA2外显子3跳跃可变剪接促进卵巢癌的发生的结果；其中，A为卵巢癌细胞SKOV3、OV90、OVCAR8以及OAW28使用不同浓度顺铂溶液作用48小时后获取蛋白，使用westernblot实验检测卵巢癌细胞使用顺铂处理后SNRPB蛋白表达的变化；B为使用siRNA技术干扰卵巢癌细胞系表达，qPCR实验技术检测SNRPB在卵巢癌中的干扰效率；C为在SKOV3和OV90细胞中使用SNRPBsiRNA抑制SNRPB表达的同时使用不同浓度的顺铂溶液作用于相应细胞48小时后，使用MTT实验评价SNRPB干扰后顺铂溶液对卵巢癌细胞的杀伤作用有无变化；D为在SKOV3和OV90细胞中使用SNRPBsiRNA抑制SNRPB表达的同时使用不同浓度的顺铂溶液作用于相应细胞，使用平板克隆形成实验评价SNRPB干扰后顺铂溶液对卵巢癌细胞的杀伤作用有无变化；
图16为使用SNRPBsiRNA在卵巢癌细胞SKOV3中干扰SNRPB表达后获取RNA送安诺优达公司进行RNA-seq，获取数据后使用生物信息学方法分析差异表达基因(筛选条件：|log2FC≥0.58|，p<0.05)，将差异表达基因进行KEGG通路的富集分析发现SNRPB干扰后差异表达基因在同源重组修复通路有明显富集；
图17为在SKOV3细胞中干扰SNRPB表达后绝大多数的同源重组修复基因的热图；其中，si-NC-1、si-NC-2和si-NC-3代表三次重复，序列均如SEQ ID NO.1所示；si-SNRPB-1、si-SNRPB-2和si-SNRPB-3代表三次重复，序列均如SEQ ID NO.2所示；图18为将SNRPB干扰后参与同源重组修复的相关基因和差异性的可变剪接事件(筛选条件：|IncLevelDifference|>0.1，p<0.05)取交集后确定出6个重要基因；
图19为使用TCGA-GTEX数据分析筛选到的6个差异表达基因在卵巢癌和正常卵巢以及输卵管伞组织中的差异表达结果；
图20为基于RNA-seq数据使用Sashimiplot分析发现SNRPB干扰后BRCA2外显子3存在明显的外显子跳跃；
图21为在BRCA2外显子3的位置设计特异性引物使用qPCR检测包含外显子3的BRCA2转录本的表达，在BRCA2外显子2和外显子4的接头位置设计特异性引物检测不包含外显子3(外显子3发生跳跃)的BRCA2转录本的表达结果；
图22为引物设计位置的示意图；
图23为使用westernblot检测SNRPB干扰后包含外显子3的BRCA2转录本的蛋白表达的变化；
图24为BRCA2与SNRPB的相关性分析及顺铂药物实验结果；其中，A-B为使用HEY细胞构建了SNRPB过表达的稳定转染的细胞系，该过表达载体在SNRPBORF序列(去掉了终止密码子)后连接有Flag序列，使用Flag抗体(Sigma，F1804)以及Millipore的RIP试剂盒(17-701)进行RNA免疫共沉淀实验，获取的RNA经过逆转录后使用SNRPB引物进行qPCR和RT-PCR实验的结果；C为在SKOV3细胞中构建SNRPB过表达稳定转染的细胞后使用BRCA2siRNA干扰BRCA2表达后同时使用顺铂溶液处理后使用MTT实验检测顺铂对卵巢癌细胞的杀伤作用有无变化；
图25为SNRPBASO对卵巢癌细胞中SNRPB表达的影响。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
术语解释：
检测SNRPB表达水平的试剂：包括通过免疫印迹方法、免疫组化方法、酶联免疫吸附方法、RT-qPCR检测方法或免疫荧光检测等常用检测方法检测SNRPB含量所需要的试剂。
正如背景技术所介绍的，现有技术中针对SNRPB与卵巢癌的关系以及与卵巢癌发生发展的机制关系尚未见研究。为了明确SNRPB在卵巢癌发生发展的机制，为卵巢癌患者提供更好的治疗，本发明针对SNRPB表达与卵巢癌发生发展的机制进行研究，研究表明SNRPB的高表达与卵巢癌患者的不良预后相关。进一步针对BRCA2调控新策略进行研究，研究表明SNRPB调控BRCA2外显子3跳跃，导致PALB2结合位点的丢失进而造成DNA修复功能缺陷，进一步研究表明SNRPB调控POLA1和BRCA2的可变剪接来促进卵巢癌的发生发展。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
以下实施例中使用的HEY细胞由美国西北大学魏建军实验室惠赠；SKOV3细胞购自中国科学院细胞库；OV90细胞购自美国模式培养物集存库(ATCC)；OVCAR8细胞由华中科技大学马丁院士实验室惠赠；OAW28细胞购自南京科佰生物科技有限公司。
实施例1检测SNRPBmRNA在输卵管伞和卵巢癌组织中的表达水平
分别使用TRIzol(15596018，Invitrogen)提取输卵管伞和卵巢癌组织的mRNA和蛋白质，利用RT-qPCR方法检测SNRPBmRNA水平。选取山东大学齐鲁医院收集的73例输卵管伞组织和143例卵巢癌组织，制作组织芯片，利用免疫组织化学方法检测SNRPB蛋白水平。免疫组化染色采用试剂盒(中杉金桥，货号：PV-9000)进行，具体步骤为：
a.组织芯片二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化；
b.采用EDTA抗原修复液进行抗原修复；
c.过氧化物酶阻断剂(试剂A)孵育10min以阻断内源性过氧化物酶的活性；
d.血清(试剂B)封闭30min；
e.SNRPB抗体(1：500稀释)4℃孵育过夜；
f.生物素标记的二抗(试剂C)室温孵育30min；
g.链霉素抗生物素-过氧化物酶(试剂D)室温反应20min；
h.DAB溶液显色，成熟苏木素复染5min，1％(v/v)盐酸乙醇分色3s，流水返蓝15min；
i.梯度乙醇依次脱水，二甲苯透明5min，中性树胶封片保存，显微镜下明场拍照。
检测结果如图1所示，与对照组输卵管伞组织相比，SNRPB免疫组化H-Score在卵巢癌组织中明显提高。图1中F表明，临床组织样本中，SNRPB在卵巢癌组织中表达明显高于输卵管伞。
实施例2检测SNRPB与卵巢癌临床预后的关系
对图1中F的免疫组织化学结果进行统计分析，将卵巢癌患者分为SNRPB高表达组和SNRPB低表达组，对应这些卵巢癌患者生存信息，统计SNRPB表达水平与卵巢癌患者总生存率的关系，结果如图1中G所示，结果显示，高SNRPB表达水平预示低存活率。
实施例3SNRPB在卵巢癌细胞中的生物学功能
1.siRNA基因沉默
采用siRNA沉默技术对体外培养的卵巢癌细胞株HEY、SKOV3细胞系进行SNRPB表达抑制，并构建过表达SNRPB的卵巢癌细胞株HEY，提取RNA、细胞蛋白，利用qRT-PCR、免疫印迹法对蛋白进行分析验证SNRPB表达量，结果如图2、图3显示，采用siRNA沉默技术对SNRPB表达进行抑制，癌细胞的SNRPB表达水平明显下降，说明siRNA沉默成功；过表达SNRPB的卵巢癌细胞中SNRPB表达水平明显上升，说明过表达成功。
si-NC：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT(SEQ ID NO.1)；
si-SNRPB#1：CAAGCCAAAGAACUCCAAATT(SEQ ID NO.2)；
si-SNRPB#2：GGACCUCCUCCCAAAGAUATT(SEQ ID NO.3)。
具体步骤如下：
a.分别将卵巢癌细胞株HEY、SKOV3细胞系接种于6cm培养皿中，过夜；
b.分别将10μL无RNA酶水溶解的si-SNRPB#1和si-SNRPB#2溶于500μL的Opti-MEM培养基中，并设置对照；将10μL成品Lipo-2000溶解于溶于500μL的Opti-MEM培养基，吹吸均匀后静置5min；
c.分别将对照组、溶解完成的si-SNRPB#1和si-SNRPB#2与溶解完成的Lipo-2000混合，吹吸均匀静置25min；
d.弃细胞培养基，小心将上述液体分别加至细胞培养皿中，并加入1mLOpti-MEM培养基，摇晃均匀，孵箱培养；
e.24h后提取RNA，48h后提取蛋白。
2.细胞增殖实验
分别将对照组、沉默SNRPB、过表达SNRPB的细胞系接种于96孔板中，将处理好的待测细胞铺在96孔培养板中(每孔1×103个)，分别在0h、24h，48h，72h、96h和120h，加入MTT溶液20μL，孵育4h，弃培养基，加入100μL的DMSO溶液溶解结晶，在490nm波长处测量吸光度。利用平板克隆实验检测敲低SNRPB和过表达SNRPB对细胞克隆形成能力的影响。如图4-5所示，敲低SNRPB明显抑制卵巢癌细胞系的增殖能力及克隆形成能力，过表达SNRPB增强卵巢癌细胞系的增殖能力及克隆形成能力。
3.Transwell实验
Transwell小室用于细胞迁移能力分析，包被基质胶Transwell小室用于侵袭能力分析，孔径为0.8μm。将上述对照组、沉默SNRPB以及过表达SNRPB的细胞系重悬于无血清的培养基中，接种于小室(3×104cells/well)，根据细胞特点培养相应的时间。用棉签除去小室上层未穿过孔的细胞，下层穿膜细胞用甲醇固定15min，用0.1％结晶紫染色20min后在显微镜下观察。随机观察5个视野并计数穿膜细胞的数量。如图6所示，敲低SNRPB明显抑制卵巢癌细胞系的侵袭迁移能力，过表达SNRPB增强卵巢癌细胞系的侵袭迁移能力。
4.小鼠皮下成瘤实验
通过将上述对照组、沉默SNRPB的卵巢癌细胞系接种于小鼠皮下，构建皮下成瘤模型，观察小鼠成瘤的大小和重量。如图7所示，敲低SNRPB明显抑制卵巢癌细胞系的皮下成瘤能力。
实施例4检测细胞水平上SNRPB通过调控POLA1可变剪接促进卵巢癌的恶性生物学行为
在HEY和SKOV3细胞系中，敲低SNRPB(方法同实施例3)，利用q-RTPCR和WesternBlot检测POLA1表达水平。如图8所示，敲低SNRPB，POLA1RNA和蛋白水平均下降。如图9所示，SNRPB介导卵巢癌POLA1pre-mRNA外显子3跳跃。通过设计针对外显子2和4的特异性RT-PCR引物，检测POLA1-201/202和POLA1-207的表达。GAPDH作为内源性对照。另外通过RIP-qPCR分析、RT-PCR分析验证SNRPB蛋白与POLA1mRNA的相关性，结果如图10所示。
实施例5POLA1在卵巢癌细胞中的生物学功能
细胞增殖实验及Transwell实验同实施例3，如图11所示，在HEY和A2780细胞系中，敲低POLA1，利用q-RTPCR检测POLA1表达水平。
si-NC：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT(SEQ ID NO.1)；
si-POLA1#1：UGGACAAGUCUACAGCUUUAUCUGC(SEQ ID NO.4)；
si-POLA1#2：UAGAAUGUCACCUAGCAGACCAUCC(SEQ ID NO.5)。
如图12、图13所示，敲低POLA1明显抑制卵巢癌细胞系的增殖能力及克隆形成能力。在对照组及过表达SNRPB组构建沉默POLA1细胞系，通过拯救实验显示POLA1的敲除部分逆转了SNRPB过表达诱导的增殖和克隆生成能力，如图14所示。
实施例6检测细胞水平上SNRPB通过调控BRCA2外显子3跳跃可变剪接促进卵巢癌的发生
分别对卵巢癌细胞系SKOV3、OV90、OVCAR8以及OAW28使用不同浓度顺铂溶液(0、1和2μg/mL)作用48小时后获取蛋白，使用westernblot实验检测卵巢癌细胞使用顺铂处理后SNRPB蛋白表达的变化，结果如图15中A所示。采用siRNA沉默技术对体外培养的卵巢癌细胞株OVCAR8和OV90细胞系进行SNRPB表达抑制，提取RNA，如图15中B所示。
细胞增殖实验同实施例3，分别将对照组、沉默SNRPB的SKOV3和OV90细胞系接种于96孔板中，使用SNRPBsiRNA抑制SNRPB表达的同时使用不同浓度的顺铂溶液(0、1、2、3和4μg/mL)作用于相应细胞，评价SNRPB干扰后顺铂溶液对卵巢癌细胞的杀伤作用有无变化；利用平板克隆实验评价SNRPB干扰后顺铂溶液对卵巢癌细胞的杀伤作用有无变化。如图15中C和D所示，敲低SNRPB后加入顺铂溶液，细胞增殖和克隆形成能力明显下降，顺铂溶液对卵巢癌细胞的杀伤作用明显增强。
使用SNRPBsiRNA在卵巢癌细胞SKOV3中干扰SNRPB表达后获取RNA送安诺优达公司进行RNA-seq，获取数据后使用生物信息学方法分析差异表达基因。KEGG通路富集分析发现SNRPB干扰后差异表达基因在同源重组修复通路有明显富集，绝大多数的同源重组修复基因均出现明显下调，结果如图16-17所示。将SNRPB干扰后参与同源重组修复的相关基因和差异性的可变剪接事件取交集后确定6个重要基因，使用TCGA-GTEX数据分析筛选到的6个差异表达基因在卵巢癌和正常卵巢以及输卵管伞组织中的差异表达，结果如图18-19所示。基于RNA-seq数据使用Sashimiplot分析发现SNRPB干扰后BRCA2外显子3存在明显的外显子跳跃，如图20所示。
在BRCA2外显子3的位置设计特异性引物使用qPCR检测包含外显子3的BRCA2转录本的表达，在BRCA2外显子2和外显子4的接头位置设计特异性引物检测不包含外显子3(外显子3发生跳跃)的BRCA2转录本的表达。使用siRNA干扰SNRPB表达后获取相应蛋白，选择特异性的BRCA2抗体(Abcam，ab216972)可靶向外显子3所在肽段，使用westernblot检测SNRPB干扰后包含外显子3的BRCA2转录本的蛋白表达的变化，如图21-23所示。
实施例7BRCA2与SNRPB的相关性分析及顺铂药物实验
细胞增殖实验同实施例3，如图24所示，在HEY细胞系中，构建了SNRPB过表达的稳定转染的细胞。该过表达载体在SNRPBORF序列(去掉了终止密码子)后连接有Flag序列，使用Flag抗体(Sigma，F1804)以及Millipore的RIP试剂盒(17-701)进行RNA免疫共沉淀实验，获取的RNA经过逆转录后使用SNRPB引物进行qPCR和RT-PCR实验验证SNRPB蛋白与BRCA2mRNA的相关性，结果如图24中A和B所示。在对照组及过表达SNRPB组构建沉默BRCA2细胞系，分别使用顺铂溶液(0、1、2、3和4μg/mL)作用于相应细胞48小时后，MTT实验检测顺铂对卵巢癌细胞的杀伤作用，显示BRCA2的敲除部分逆转了顺铂对SNRPB过表达诱导的杀伤能力减弱，如图24中C所示。
si-NC：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT(SEQ ID NO.1)；
siBRCA2：GAAGAAUGCAGGUUUAAUATT(SEQ ID NO.6)。
实施例8SNRPBASO成功下调卵巢癌细胞中SNRPB的表达
SNRPBASO及对照由上海吉玛基因设计合成，具体序列如下：SNRPB-ASO-1：TAAACCAGTTTCATAGGCC(SEQ ID NO.7)；SNRPB-ASO-2：TAAGAAACAAACAGGTCTG(SEQ IDNO.8)；ASO-NC:GCGUATTATAGCCGATTAAC(SEQ ID NO.9)。瞬时转染实验同实施例3中siRNA基因沉默，提取总RNA后进行逆转录反应，使用qPCR技术检测使用ASO-NC及SNRPB-ASO后SNRPB的干扰效率的变化，结果发现SNRPBASO与SNRPBsiRNA有类似的抑制SNRPB表达的作用(图25)。
以下是抗体信息：SNRPB(Proteintech，16807-1-AP或者Invitrogen，MA5-13449)，β-actin(Sigma，A5441)，POLA1(SantaCruz，sc-373884)，BRCA2(Abcam，ab216972)，Flag(Sigma，F1804)。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种卵巢癌的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为SNRPB。
2.检测SNRPB表达水平的试剂在制备卵巢癌诊断和/或预后判断产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂盒或试剂。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述诊断包括预后判断。
5.一种卵巢癌诊断和/或预后判断产品，其特征在于，包括检测SNRPB表达水平的试剂。
6.一种降低SNRPB表达水平的物质在制备预防和/或治疗卵巢癌的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂为反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述卵巢癌为高级别浆液性卵巢癌。
9.一种预防和/或治疗卵巢癌的药物，其特征在于，包括降低SNRPB表达水平的试剂。
10.一种降低SNRPB表达水平的物质在制备提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性的药物中的应用。
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