CN112725449B - circ0058792的siRNA抑制剂在制备治疗肾透明细胞癌的药物中的应用 - Google Patents

circ0058792的siRNA抑制剂在制备治疗肾透明细胞癌的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及circ0058792的siRNA抑制剂在制备治疗肾透明细胞癌的药物中的应用，本发明还包括检测circ0058792的表达量的试剂在制备评估肾癌预后生存的试剂盒中的应用。本发明通过实验：构建干扰RNA质粒并进行转染等分子生物学手段改变circRNA在ccRCC细胞内的表达水平，检测干扰circRNA后ccRCC细胞增殖、细胞凋亡周期、迁移侵袭等肿瘤细胞生物学表型，实验结果表明：circ0058792对肾癌细胞增殖有促进作用、hsa_circ_0058792siRNA可降低A498、ACHN细胞中hsa_circ_0058792的表达水平，为肾癌的治疗提供一种新的治疗方法。

Description

circ0058792的siRNA抑制剂在制备治疗肾透明细胞癌的药物 中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体地说，是circ0058792的siRNA抑制剂在制备治疗肾透明细胞癌的药物中的应用。
背景技术
肾癌是最常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤之一，全球每年有40万人被诊断为肾癌，17.5万人死于肾癌，而且发病率还在不断上升。肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)约占所有肾脏恶性肿瘤的90％，许多慢性疾病，包括慢性肾脏疾病和未能良好控制的高血压，都容易发展成RCC。RCC又细分为几个亚型，最常见的是透明细胞肾癌(clear cell renalcell carcinoma，ccRCC)，占肾细胞癌的75％。肾癌起病常常隐匿，ccRCC具有隐匿性，早期不会引起特定的体征或症状，在初次确诊时，约有三分之一的患者有远处转移。由于ccRCC对传统的放疗或化疗不敏感，而且靶向治疗通常比较昂贵，目前RCC的标准治疗仍然是手术，尽管手术切除治疗有所发展，但肾细胞癌的预后仍然较差，5年生存率为5％～10％。更重要的是，近20％至40％的肾细胞癌患者在手术后出现复发和转移，因此研究肾癌发生、发展的机制，同时寻求肾癌的有效治疗靶点有十分重要的意义。
环状RNA(circular RNA,circRNA)是新近发现的非编码RNA，与多种致命性疾病有密切关联。(国自然)我们前期通过circRNA微阵列芯片、qPCR验证发现circ0058792表达量与肾癌的病理分级、临床分期、淋巴结转移等预后相关因素密切相关。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指生物体内由双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默现象，是一种dsRNA分子在mRNA水平上封闭相关基因表达的过程。然而，体外合成的长链双链RNA会产生细胞毒反应，而小干扰RNA(small interferenceRNA,siRNA)可避免该毒性反应。研究发现，体外合成的siRNA与内源性siRNA一样，能够发挥分解靶mRNA特异性沉默靶基因的功能。肿瘤机制研究的深入和生物学技术的发展，基因沉默技术也在人类基因功能研究和药物靶点鉴定等方面备受青睐，具有潜在临床应用价值。本研究应用RNAi技术沉默环状RNA circ0058792基因，通过实验观察人肾癌细胞ACHN、A498细胞中circ0058792的表达情况，在细胞和动物水平干扰circ0058792的表达，观察其在肾癌细胞株增殖、侵袭迁移等表型的变化，以及裸鼠成瘤观察裸鼠大小和体积的变化，以期为circ0058792作为肾癌治疗靶点提供新的理论依据。
关于本发明circ0058792的siRNA抑制剂在制备治疗肾透明细胞癌的药物中的应用目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种肾透明细胞癌的诊断标志物及其应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
第一方面，本发明提供了检测circ0058792表达量的试剂在制备评估肾透明细胞癌预后生存的试剂盒中的应用。
进一步地，所述的circ0058792表达量与肾透明细胞癌病程呈正相关关系。
进一步地，所述的预后生存包括病理分级、临床分期和淋巴结转移。
优选地，所述试剂盒检测的标本为新鲜组织肿瘤标本。
第二方面，本发明提供了circ0058792的抑制剂在制备治疗肾透明细胞癌的药物中的应用。
第三方面，本发明提供了circ0058792的siRNA抑制剂在制备治疗肾透明细胞癌的药物中的应用。
第四方面，本发明提供了circ0058792的siRNA抑制剂在制备抑制肾透明细胞癌细胞增殖、肾透明细胞癌细胞迁移和侵袭的药物中的应用。
优选地，所述的抑制剂选自小分子化合物或生物大分子。
本发明优点在于：
本发明首次通过实验研究发现了circ0058792可作为肾细胞透明癌诊断标志物，以及可用于评估该疾病病理分级、临床分期以及淋巴结转移，为该类患者提供了一种新的预后生存评估方法，进而为该类患者的治疗提供了一种新的有效治疗方法，减少了该类患者的治疗成本且提高了该类患者的生存率，有很好的应用前景。
附图说明
附图1是A498及ACHN转染结果，图1A是A498转染结果：从左到右分别是明场图，荧光图和融合图；图1B是ACHN转染结果：从左到右分别是明场图，荧光图和融合图。
附图2是表明三条siRNA干扰效率柱状图：三条的干扰效率都达70％以上。
附图3是干扰circ0058792对ACHN及A498细胞增殖能力的影响：转染siRNA质粒后明显抑制细胞增殖。
附图4是circ0058792 siRNA组EDU肾细胞癌细胞株阳性细胞数与对照组比较明显下降。
附图5是circ0058792 siRNA组EDU肾细胞癌细胞株增殖阳性细胞比例与对照组比较明显下降。
附图6是敲低circ0058792对A498细胞迁移能力的影响：转染siRNA质粒后，细胞的迁移能力明显下降。
附图7是敲低circ0058792对ACHN细胞迁移能力的影响：转染siRNA质粒后，细胞的迁移能力明显下降。
附图8是在A498细胞株转染过表达质粒后，过表达circ0058792显著提高肾癌细胞侵袭能力。
附图9是在ACHN细胞株转染过表达质粒后，过表达circ0058792显著提高肾癌细胞侵袭能力。
附图10是将circ0058792 siRNA质粒及对照空质粒的ACHN细胞分别注入裸鼠皮下，制备模型，观察其体内成瘤效果，将动物分为NC，siRNA组，观察沉默circ0058792对肿瘤生长的影响，发现干扰组瘤体重量明显减小。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一、方法
1、我们使用构建干扰RNA质粒并进行转染等分子生物学手段改变circRNA在ccRCC细胞内的表达水平，检测干扰circRNA后ccRCC细胞增殖、细胞凋亡周期、迁移侵袭等肿瘤细胞生物学表型，具体方法如下：
(1)设计干扰circ0058792的靶点序列，比较选定如下序列为目标序列：
Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染：Circ0058792 siRNAs(5’-GACGATGCCTTCGTGAACA-3’)(SEQ ID NO.1)，接着进行转染，转染前1日，将细胞接种于12孔板中，置于37℃，5％CO2孵箱中培养箱。次日弃上清，用PBS洗细胞2次，加入无血清培养基。将circ0058792Lipofectamine 3000按1:3的比例混合，转染靶细胞。转染6h后，更换含10％新生牛血清的DMEM培养液，继续培养，转染后于倒置荧光显微镜下观察GFP表达情况，判断转染效率。
(2)CCK8检测circ0058792 siRNA对细胞增殖能力的影响：
实验分组：a.A498+siRNANC；b.A498+hsa_circ_0058792；c.ACHN+siRNANC；d.ACHN+hsa_circ_0058792。将细胞悬液稀释后均匀铺板于96孔板中，每孔100μL，细胞密度为2000-3000个/孔，放回细胞培养箱中继续培养过夜。待细胞贴壁后每孔分别于24h，48h，72h，96h，120h后，在相应的孔100μL培养液中加入CCK8试剂后轻柔拍打以充分混匀。37℃孵育2h后，450nm测定吸光度(OD450)；数据处理和统计分析：用酶标仪测定吸光度(OD)，设定波长为450nm。细胞增殖率计算公式为：(实验组吸光度-空白对照组吸光度)/(对照组24h吸光度-空白对照组24h吸光度)×100％。
(3)EDU检测circ0058792 siRNA对细胞增殖能力的影响：
细胞首先使用PBS稀释至3.7％的甲醛固定，然后使用0.5％的Triton X-100渗透步骤固定。检测步骤如下：向每孔中加入200uL PBS(固定液)中3.7％的甲醛。在室温孵育15分钟。取出固定液，用每孔含3％BSA的200uLPBS洗涤细胞2次。除去洗涤液，在PBS(渗透溶液)中加入0.5％Triton X-100 200uL。室温孵育20分，用含3％BSA的200uL PBS洗涤细胞两次。进入荧光EdU检测步骤。每孔加入100μL反应液。轻轻摇晃，使反应混合物均匀分布。在室温下避光孵育30分钟。去除反应混合物，用含3％BSA的200uL PBS洗涤细胞三次。每孔加入100μl 1*Hoechst33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30min后，弃染色反应液；每孔每次加入100μl PBS清洗1～3次，染色结束后即刻观测图像及分析。
(4)Transwell检测肾癌细胞株ACHN、A498细胞的迁移和侵袭能力：
对于Matrigel-Transwell试验，将Transwell室与Matrigel预涂，以评估入侵能力，并评估迁移，不用加Matrigel。简单地说，在无血清培养基中制备了含有5×105细胞/ml的细胞悬液。将大约700μl完整的培养基加入下室中。细胞孵育24小时用拭子轻轻擦拭室内，取出非移动细胞。此外，将膜固定后用400μl 1％结晶紫染色溶液染色，室温孵育10分钟。拍照，并在至少三个不同的视野中计算细胞数。
2、制备裸鼠皮下荷瘤模型
(1)选用SPF级的雄性裸鼠，6周龄。分别消化离心收集circ0058792过表达稳转细胞和对照稳转的细胞。用PBS清洗重悬细胞后计数，稀释细胞悬液浓度至3×106个/ml。用1ml医用无菌注射器吸取细胞悬液100μl。按照1:1的体积比与基质胶混匀后，按每次3×106个细胞量注射在裸鼠后侧背部。针对circ0058792敲减实验，待观察荷瘤成功后开始进行瘤内siRNA注射。每只裸鼠的siRNA注射量为50μl，一周三次，至5周末结束。而针对circ0058792过表达实验则无需额外处理。
(2)观测项目：待裸鼠成功荷瘤后第二天开始，每隔一天用测量成瘤的长径(L)及短径(W)，肿瘤体积V＝0.5×LW2，并根据结果绘制肿瘤生长变化曲线。并观察裸鼠一般生存情况，有无出现恶病质。
(3)样本采集和处理：5周后，颈椎脱臼法处死裸鼠，解剖分离皮下成瘤，测量瘤体大小并拍照分析。皮下成瘤组织予福尔马林固定，石蜡包埋，用于后续实验研究。
二、结果
(1)构建siRNA敲低质粒，RCR检测干扰circ0058792转染A498、ACHN细胞的干扰效率，采用FAM标记的siRNA转染肾癌细胞株ACHN、A498以检测siRNA的转染效率，于倒置荧光显微镜下观察，可见绿色荧光siRNA的荧光散布在分布于ACHN、A498细胞内部。说明细胞转染效果良好，适合于后续的相关实验(图1A-1B)。我们使用广州锐博公司设计的3条特异性siRNA干扰片段及对照序列列分别转染ACHN、A498两株肾癌细胞系(表1)，结果显示，序列为5’-TCTTCCAGGACGATGCCTT-3’(SEQ ID NO.2)的siRNA-1沉默效应最突出(P<0.01，图2)，因此，选择此序列为后续的干扰实验使用。
表1三条针对circ0058792的干扰序列
Figure BDA0002910122520000051
(2)CCK8检测hsa_circ_0058792对细胞增殖能力的影响
采用CCK-8细胞增殖实验观察ACHN、A498两株肾癌细胞转染siRNA后的影响，铺至96孔板，分别于1day，2days，3days、4days、5days，5个时间点检测吸光度来反映细胞的增殖情况，发现circ0058792抑制组较对照组细胞的增殖能力明显下降且差异具有统计学意义(P<0.0001，图3)，说明circ0058792对肾癌细胞增殖有促进作用。
(3)EDU检测circ0058792对肾癌细胞株增殖能力的影响
通过在A498和ACHN细胞株中转染has_circ_0058792 siRNA和siRNANC，发现siRNA组较对照相比，A498、ACHN has_circ_0058792 siRNA组中EDU阳性细胞数较对照组明显降低(P＜0.01)，且A498更明显，差异具有统计学意义(P<0.05))。说明circ0058792对细胞的增殖有促进作用。如图4及图5。
(5)circ0058792对肾癌细胞A498、ACHN迁移和侵袭能力的影响
通过tranwell法检测circ0058792对肾癌细胞株ACHN、A498迁移及侵袭能力的影响。Transwell法测定肾癌细胞株A498、ACHN的迁移结果如图6-7所示，与siRNANC组相比，干扰circ0058792组细胞迁移数明显低于对照组(P＜0.05)，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
Matrigel-transwell侵袭实验检测circ0058792对肾癌细胞系A498、ACHN侵袭能力的影响如图8-9所示，通过计数穿过基底膜的细胞数进行侵袭结果的差异性分析，发现hsa_circ_0058792 siRNA A498及ACHN细胞穿过小室膜的细胞数量较对照组明显减少(P＜0.01)，差异具有统计学意义。因此，我们认为抑制hsa_circ_0058792表达可明显抑制肾透明细胞癌细胞系ACHN及A498的侵袭能力。Transwell实验结果表明，和对照细胞相比，hsa_circ_0058792 siRNA降低A498、ACHN细胞中hsa_circ_0058792的表达水平，显著促进ACHN细胞的迁移水平。
(6)我们将转染circ0058792 siRNA及对照空质粒的ACHN细胞分别注入裸鼠皮下，制备裸鼠皮下荷瘤模型，观察其体内成瘤效果，将动物分为control、NC，siRNA组，观察沉默circ0058792对肿瘤生长的影响。我们发现circ0058792 siRNA能够显著地抑制裸鼠皮下荷瘤的生长(图10)。
三、结论
综上所述，通过体内体外两部分实验证实了circ0058792对于肾癌细胞株增殖、迁移、侵袭以及凋亡的促进作用。因此，本发明可用于临床对ccRCC的治疗及干预，具有重要推广意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市同济医院；上海市第一人民医院
<120> circ0058792的siRNA抑制剂在制备治疗肾透明细胞癌的药物中的应用
<130> /
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gacgatgcct tcgtgaaca 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcttccagga cgatgcctt 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caggacgatg ccttcgtga 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cacgatgcct tcgtgaaca 19

Claims (2)

1.circ0058792 的siRNA抑制剂在制备治疗肾透明细胞癌的药物中的应用。
2.circ0058792 的siRNA抑制剂在制备抑制肾透明细胞癌细胞增殖、肾透明细胞癌细胞迁移和侵袭的药物中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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"Construction of circRNA-based ceRNA network to reveal the role of circRNAs in the progression and prognosis of metastatic clear cell renal cell carcinoma";Xiyi Wei等;<Aging>;20201215;第24198页右栏第1段，表5，图2B、2D *

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