CN105582536B

CN105582536B - Agpat9基因在制备治疗肝癌药物、诊断及预后评估试剂中的应用

Info

Publication number: CN105582536B
Application number: CN201511033481.7A
Authority: CN
Inventors: 王辉云; 买世娟; 王梦鹤; 袁林静; 李品东
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-12-30
Filing date: 2015-12-30
Publication date: 2019-12-10
Anticipated expiration: 2035-12-30
Also published as: CN105582536A

Abstract

本发明公开了AGPAT9基因在制备治疗肝癌药物、诊断及预后评估试剂中的应用。发明人的体内外实验结果证实AGPAT9在肝癌中起着促癌促转移的作用。因此，可以合成或制作此基因的抑制物，作为肝癌潜在的靶向治疗药物；由于该基因在肝癌中有DNA扩增和mRNA及蛋白表达升高，故可制作检测该基因DNA变异和表达变化的试剂盒以用于诊断肝癌；由于该基因表达的降低与病人预后密切相关，故检测其表达水平变化的试剂盒也可用于其预后的评估，以指导临床的治疗。

Description

AGPAT9基因在制备治疗肝癌药物、诊断及预后评估试剂中的应用

技术领域

本发明涉及基因在抗肿瘤药物制备和诊断试剂盒生产的应用领域，具体涉及AGPAT9基因在制备治疗肿瘤特别是肝癌的药物和生产肿瘤诊断试剂盒中的应用。

背景技术

原发性肝细胞肝癌(简称肝癌)是一种常见肿瘤，其发病率在全世界范围内排第五，每年大概有100万人新发肝癌；肝癌的死亡率在肿瘤致死率中位列第三，每年因为肝癌而死亡的人口在70万左右。肝癌的分布具有明显的地区差异，我国属于高发地区，每年肝癌的死亡病例约为30万。研究显示，近二十年来肝癌的发病率在我国呈上升趋势，其在九大恶性肿瘤死亡率的排名中已从第三位上升到第二位。由于肝癌发病隐匿，病人首诊往往已属中晚期且伴有肝硬化，手术切除率仅为5％～10％。尽管肝癌的临床研究在近十多年中已取得长足的进展，但肝癌五年生存率仍非常低而且复发率高，术后5年复发率仍高达60％以上。肝细胞癌的高发病率、高死亡率及其逐年增高的趋势，已成为一个极其严重的国际卫生问题。由此可见，单靠临床研究来提高肝癌病人的生存率和降低复发率是不够的。

近年来随着分子生物学技术的发展，分子靶向治疗成为肝癌治疗的新方向。分子靶向治疗药物通过特异性阻断干预关键基因和重要的信号传导通路发挥抑癌作用，具有特异性强，疗效显著，不良反应小等优点，为肝癌临床诊断、治疗和预后提供了崭新的方法和手段。因此，采用先进的分子生物学技术，通过深入了解肝癌发生发展的分子机制，筛选、鉴定出重要的靶分子，为开发肝癌靶向治疗药物，以及肝癌的基因早期诊断、基因个性化治疗和预后评估提供理论基础，从而可望提高肝癌病人的生存率。

AGPAT9基因，全名叫1-acylglycerol-3-phosphate-O-acyltransferase 9，在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)基因库的登录号为NM_032717.4，位于人类染色体4q21.23，是溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)家族成员之一。AGPAT9基因于2003年从肺癌转移相关基因中分离鉴定，之后的研究证实其与肺癌组织的恶性表型密切相关。AGPAT9基因的表达和功能研究在其它肿瘤中尚未见报道。

肝癌和肺癌的发病机制及肿瘤相关基因变化有较大差异。一般而言，用于肺部肿瘤的研究结论在肝癌中并不适用。现阶段，未有研究表明AGPAT9基因与肝癌相关。

发明内容

本发明的目的在于提供AGPAT9基因在制备治疗肝癌药物、诊断及预后评估试剂中的应用。

发明人在肿瘤研究中发现，AGPAT9基因在肝癌中发生了高频率的遗传变异－－DNA扩增，基因转录的mRNA和蛋白明显升高，结合临床资料分析发现，其表达高低与病人预后密切相关。

发明人对AGPAT9基因进行了体外细胞功能学的研究，将靶向抑制AGPAT9基因的siRNA转染到Hep-3B细胞中瞬时敲降AGPAT9蛋白的表达之后，其生长速度、克隆形成能力及细胞侵袭能力等均显著下降，并且该基因能使细胞阻滞于G0/G1期。构建AGPAT9 shRNA载体并转染具有高致瘤性和转移能力的MHCC-97H肝癌细胞系中，建立稳定敲降AGPAT9的细胞系。动物实验研究结果发现，敲降AGPAT9可显著降低裸鼠皮下移殖瘤形成的数目和大小；细胞经尾静脉注射入裸鼠体内后，结果发现敲降AGPAT9可显著降低肺转移灶形成。因此，发明人的体内外实验结果证实AGPAT9在肝癌中起着促癌促转移的作用。因此，可以合成或制作此基因的抑制物，作为肝癌潜在的靶向治疗药物；由于该基因在肝癌中有DNA扩增和mRNA及蛋白表达升高，故可制作检测该基因DNA变异和表达变化的试剂盒以用于诊断肝癌；由于该基因表达的降低与病人预后密切相关，故检测其表达水平变化的试剂盒也可用于其预后的评估，以指导临床的治疗。

通过检测肝癌病人中AGPAT9基因的DNA扩增和表达情况，发现AGPAT9基因发生了高频率的DNA扩增，而且其mRNA和蛋白的表达也明显升高，因此，二者均可作为肝癌的诊断标志；该基因mRNA和蛋白的表达水平与肝癌的预后明显相关，即可作为诊断之用也可作为其预后的评价指标。同时，对AGPAT9基因进行细胞功能学的研究，发现干扰AGPAT9基因表达后，肝癌细胞生长速度减慢、细胞周期阻滞、克隆形成能力和细胞侵袭能力等均显著下降；动物实验证实裸鼠移殖瘤的形成和肺转移灶均显著减少。因此，该基因的细胞生物学功能研究为制备基因药物和靶向药物提供了依据。本发明不仅在基因遗传、转录(mRNA)和翻译(蛋白)三个水平上也在细胞生物学功能方面为制备治疗肿瘤的新药物和诊断及预后评估试剂盒的开发提供了基础。

附图说明

图1是27例肝癌组织AGPAT9基因的拷贝数变化情况；

图2是51对肝癌组织和癌旁组织AGPAT9基因mRNA水平的表达情况；

图3是AGPAT9蛋白表达与226例肝癌患者预后的关系；

图4是Western blot验证在肝癌细胞系中的AGPAT9敲降效果；

图5是肝癌细胞中AGPAT9表达受siRNA抑制后，细胞增殖速度变慢；

图6是肝癌细胞中AGPAT9表达受siRNA抑制后，细胞的G1期细胞比例增加，G2/M期细胞比例减少显著下调，提示细胞周期阻滞；

图7是肝癌细胞中AGPAT9表达受siRNA抑制后，细胞的克隆形成能力降低；

图8是肝癌细胞中AGPAT9表达受siRNA抑制后，细胞的侵袭能力降低；

图9是肝癌细胞MHCC-97H稳定敲降AGPAT9表达后，细胞注射于裸鼠皮下，形成的移殖瘤数目和大小显著减少；

图10是肝癌细胞MHCC-97H稳定敲降AGPAT9表达后，细胞经尾静脉注射后，在裸鼠体内的转移能力降低。

具体实施方式

下面结合实验数据，进一步说明本发明的技术方案。

实时荧光定量PCR(qPCR)检测AGPAT9基因DNA拷贝数

提取肝癌及癌旁组织DNA，实时定量PCR方法扩增AGPAT9基因片段，采用的引物序列见表1：本实验所需的探针，引物由广州英俊公司合成。qPCR试剂盒购自美国Invitrogen公司。

表1：检测AGPAT9DNA拷贝数变化所使用的引物

引物采用引物设计软件Primer Premier5.0设计，引物设计确保跨内含子，以避免残留mRNA的干扰。在NCBI网站上对所有引物序列进行BLAST比对，确定引物序列不与人类其他基因同源。

定量PCR扩增体系的组成如表2所示。

表2：定量PCR扩增体系成份

扩增反应包括：95℃变性30秒，60℃退火及延伸1分钟，共45个循环反应。应用ABIPRISM7900Sequence Detector序列检测系统对反应产物进行实时定量测定和融解曲线分析，分别设2个复孔。内参用Line-1，以标准曲线法算出内参及目的基因的相对表达值(倍比稀释正常人血gDNA,定量PCR扩增后，以CT值来计算标准曲线)，以内参作为基准进行校正，得出目的基因与内参的比值R。2份正常人粒细胞提取genomic DNA作为正常对照标本。以正常对照标本中目的基因与内参的比值R的平均数作为基准，进行标准化。以正常对照标本中拷贝数的1.5倍作为正常拷贝数的变动范围。如大于正常对照标本中拷贝数的1.5倍，则该标本拷贝数扩增；如小于正常对照标本中拷贝数的1.5倍，则该标本拷贝数丢失(图1)。图1中，Y轴表示肿瘤组织DNA拷贝数与正常人genomic DNA拷贝数的比值，以2的指数来表示Y轴上的刻度，蓝色线表示比值大于2的0.585次方，换算后即为3倍，X轴表示实际编号，本实验设3个平行复孔。

qRT-PCR检测AGPAT9基因mRNA水平表达

提取组织总RNA，采用Promega公司的逆转录反应试剂盒，Oligo(dT)作为随机引物进行逆转录反应，qPCR扩增体系如表3所示。

表3：AGPAT9qPCR扩增体系成份

所用引物，均为跨内含子引物，采用引物设计软件Primer Premier5.0设计。在NCBI网站上对所有引物序列进行BLAST比对，确定引物序列不与人类其他基因同源。具体的定量PCR引物序列如表4所示。

表4：定量PCR引物序列

AGPAT9特异性扩增反应包括：95℃变性30秒，60℃退火及延伸1分钟，共45个循环反应。应用ABI PRISM 7900Sequence Detector序列检测系统对反应产物进行实时定量测定和融解曲线分析，分别进行三次平行实验。内参用GAPDH，以threshold cycle(CT)法进行表达水平的比较，用以下公式计算：2^-ΔΔCT(ΔΔCT＝肿瘤ΔCT–癌旁ΔCT)，每个ΔCT＝ΔCT(AGPAT9)–ΔCT(GAPDH)。以10对癌旁肝组织的倍数变化平均值为1.0，进行标准化(图2)。

肝癌组织中AGPAT9蛋白表达及其对病人的预后评价

实验操作如下：

1)石蜡切片常规脱蜡、水化：

2)抗原修复：玻片放入枸橼酸钠(1mM，pH 6.0)的抗原修复液盒子里，微波加热至溶液沸腾，25分钟；自然冷却后，PBS 15min×3次；

3)阻断肝组织内源性过氧化物酶的活性：滴加3％过氧化氢去离子水，室温避光孵育30分钟，以PBS浸泡15分钟洗片×3次；

4)一抗孵育：滴加100μl AGAPT9抗体工作液(Sigma，1:100)，置于湿盒中，4℃孵育过夜；PBS清洗15分钟洗片×3次；

5)二抗孵育：滴加100μl特异性二抗工作液于组织上，湿盒内室温孵育60分钟；PBS清洗15分钟洗片×3次；

6)曝光：滴加显色剂DAB工作液100μl，显色完全后，用蒸馏水冲洗终止显色；

7)苏木素复染10分钟，1％盐酸酒精浸泡10秒进行分化，水洗30分钟返蓝；

8)多级酒精(70％～100％)脱水，每级15分钟；置二甲苯中透明，10分钟×1次；镜下观察结果；

9)结果判定和阈值设定:凡细胞中出现明显的棕黄色颗粒为阳性细胞；评分方法如下：细胞染色强度评分：0-(无染色)，1+(弱染色)，2+(中染色)，3+(强染色)肿瘤细胞阳性率评分：0(0～9％)，1(10％～25％)，2(26％～50％)，3(51％～100％)；将染色强度评分和阳性细胞率评分的乘积作为该切片评分值；设定评分≤3为低表达，>3为高表达；

10)采用SPSS 17.0统计学软件包及Graph-pad prism 5.0软件处理和分析实验数据和制图，AGPAT9免疫组化评分和预后指标间关系采用χ²检验及Pearson等级相关进行分析，用Kaplan-Meier生存曲线和Cox比例风险回归模型进行生存分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。以P<0.05确定为差异具有显著性，双侧检验(图3)。

从图3可以看出，肝癌组织中的AGPAT9蛋白表达量对患者的总生存期(图3A)和无疾病生存期(图3B)有显著影响。

AGPAT9基因敲降细胞的建立

Lipofectamine RNAi MAX试剂化学法瞬时干扰Hep-3B细胞株AGPAT9表达：

加入AGPAT9干扰序列及空白随机序列(表5)与Lipofectamine RNAi MAX混合后加入细胞中，37℃培养6小时。弃去上述培养液，加含血清的培养基继续培养48小时。WesternBlot验证AGPAT9蛋白的敲降效率(图4)。

表5：所使用的AGPAT siRNA序列

AGPAT9稳定敲降肝癌细胞株的建立：

将AGPAT9 siRNA-264序列克隆到pSUPER.Retro.Puro载体(OligoEngine,USA)上，构建针对人AGPAT9基因逆转录病毒介导的RNA干扰表达载体pSUPER.Retro.Puro-shRNA并包装成逆转录病毒，在Polybrene(8mg/ml，Sigma)介导下感染MHCC-97细胞，表达空载体的病毒液作为对照。

从图4可以看出，肝癌细胞系Hep-3B和MHCC-97H分别瞬时转染AGPAT9 siRNA和稳定转染shAGPAT9后，AGPAT9蛋白的表达均显著下调。

细胞增殖检测：

将敲降AGPAT9基因的肝癌细胞及阴性对照细胞，接种于96孔细胞培养板，接种密度为每孔1000个细胞，培养7天。每天取细胞进行细胞生长活力(MTT)测定，每天测3个复孔，连续测定7天后，根据MTT吸光度值画出生长曲线。敲降AGPAT9肝癌细胞生长显著减慢，结果见图5。

从图5可以看出，肝癌细胞中AGPAT9表达受siRNA抑制后，细胞增殖速度变慢。*P<0.05，**P<0.01。

流式细胞仪检测细胞周期：

收集细胞，生理盐水洗涤两遍，75％酒精-20℃固定过夜。每组三个重复。PBS洗涤两遍固定过的细胞，200ml PBS重悬，加入RNA酶A 20μl于37℃消化30min。用400目筛网过滤，将细胞转入流式细胞仪上样管中，加入400ml PI溶液，混匀后4℃避光孵育30min。流式细胞仪检测细胞DNA含量，分析细胞周期。独立性实验重复3次，并计算细胞周期百分率平均值(图6)。

从图6可以看出，肝癌细胞中AGPAT9表达受siRNA抑制后，细胞的G1期细胞比例增加，G2/M期细胞比例减少显著下调，提示细胞周期阻滞。

平板克隆形成实验：

将敲降AGPAT9的肝癌细胞以及空载体阴性对照细胞，接种于6孔细胞培养板，接种密度为每孔500个细胞，一个细胞做3个复孔，培养约10天，直至细胞克隆直径大于1mm。PBS洗两次后，75％乙醇固定细胞，用0.5％结晶紫染色。用水洗掉多余的结晶紫后，晾干，直接对每孔细胞计数。敲降AGPAT9肝癌细胞克隆形成能力显著减弱，结果见图7。

从图7可以看出，肝癌细胞中AGPAT9表达受siRNA抑制后，细胞的克隆形成能力降低。

细胞体外侵袭实验

采用BD公司的Transwell体外浸润模型，在BD公司培养小室上层底部接种200μl细胞(含人工基质Matrigel胶)，下层加入2ml完全培养基，每组三个复孔，37℃5％CO2培养48h。取出小室，用棉签轻轻擦净小室内的细胞，95％酒精固定30min，3％结晶紫染色30min，洗净后于光学显微镜下观察。于20倍目镜下固定取上下左右边缘及中心五个视野计数穿膜细胞数,取各视野的平均数表示肿瘤细胞的侵袭能力(图8)。

从图8可以看出，肝癌细胞中AGPAT9表达受siRNA抑制后，细胞的侵袭能力降低。

裸鼠皮下成瘤实验

待AGPAT9稳定敲降的MHCC-97H细胞及其空载体对照细胞生长至70～80％汇合时，消化细胞，制成单细胞悬液；取4-6周龄的Balb/c裸鼠，在其腋背交界皮下接种细胞，细胞接种3X10⁶/个，每种细胞接种6只裸鼠；待肿瘤形成后每三天测量一次肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线(图9)；4-6周后处死、解剖裸鼠，取出肿瘤组织，10％福尔马林固定包埋制成石蜡组织切片观察病理形态。

从图9可以看出，肝癌细胞MHCC-97H稳定敲降AGPAT9表达后，细胞注射于裸鼠皮下，形成的移殖瘤数目和大小显著减少。

裸鼠肿瘤转移实验：

AGPAT9稳定敲降的MHCC-97H细胞及其空载体对照细胞制成110⁶/ml的单细胞悬液，取100ul注射到5周龄的雄性裸鼠尾静脉，每组10只小鼠，注射8周后处死、解剖小鼠，取出肺组织用10％福尔马林固定，石蜡包埋，在多个切面制作切片，HE染色，镜下计数转移性结节，计算不同组细胞的肺转移结节形成平均数(图10)。

从图10可以看出，肝癌细胞MHCC-97H稳定敲降AGPAT9表达后，细胞经尾静脉注射后，在裸鼠体内的转移能力降低。

发明人的研究发现，肝癌组织中AGPAT9基因发生高频率的DNA扩增，mRNA和蛋白表达均显著上升。本发明公开了一种原发性肝细胞癌诊断试剂盒及其制备方法与应用，该试剂盒可以快速、准确地进行AGPAT9的检测，从而可以对原发性肝细胞癌做出快速的辅助诊断，具有重要的临床应用价值。本发明包括采用荧光定量PCR方法检测AGPAT9基因DNA拷贝数和mRNA表达量，采用免疫组化方法检测AGPAT9蛋白表达量。基于AGPAT9基因DNA拷贝数或AGPAT9蛋白表达量的检测试剂盒操作简单、试剂稳定、重复性好、特异性强、敏感性高、操作简单，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景。

联合诊断：

长期以来，AFP(甲胎蛋白)作为原发性肝癌的诊断指标，为临床做出了重大的贡献。但是，AFP的敏感性是有限的；特别是近年来，AFP阴性的肝癌患者有上升趋势，因此，寻找AFP之外的肿瘤早期标志物是当务之急。由于肝细胞癌具有较高的异质性，同时检测2种或以上的肿瘤生物标记物被认为是肿瘤早期诊断的较好选择。发明人的研究发现，在426例肝癌患者中，有161例为血清AFP阴性，然而，其中有83例(51.6％，83/161)为AGPAT9高表达。这一结果提示发明人，在AFP阴性肝癌患者中，AGPAT9也许是一个较好的检测指标。AGPAT9与经典标志物AFP两者联合检测原发性肝细胞癌，可大大提高肝癌的早期诊断率，弥补单纯检测AFP的不足。

AGPAT9蛋白表达与肝癌患者的术后转移率，总生存风险和无疾病生存风险密切相关。Cox回归分析证实AGPAT9蛋白表达是肝癌患者的独立预后因素。因此，基于AGPAT9蛋白表达该试剂盒还可用于肝癌患者的预后评估和监测肿瘤转移。

靶向AGPAT9基因的siRNA可抑制肝癌细胞的体内外致瘤和转移能力，抑制AGPAT9酶活性的抑制剂可通过抑制其产物磷脂酸的产生抑制其促癌作用，为开发肝癌新的靶向治疗药物提供了理论依据。

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Claims

1.抑制AGPAT9基因表达或翻译的试剂在制备治疗肝癌药物中的应用，所述抑制AGPAT9基因表达或翻译的试剂为AGPAT9基因启动子抑制剂、AGPAT9基因的siRNA。

2.在体内使AGPAT9蛋白活性降低或失活的试剂在制备治疗肝癌药物中的应用，所述在体内使AGPAT9蛋白活性降低或失活的试剂选自AGPAT9蛋白抗体、AGPAT9酶活性抑制剂。