CN110496221A

CN110496221A - 抑制dppa3表达的物质在制备预防和治疗癌症的产品中的应用

Info

Publication number: CN110496221A
Application number: CN201910592119.5A
Authority: CN
Inventors: 关新元; 严倩; 李焱
Original assignee: Cancer Prevention Center Of Zhongshan University (affiliated Cancer Hospital Of Zhongshan University Zhongshan University Institute Of Oncology)
Current assignee: Cancer Prevention Center Of Zhongshan University (affiliated Cancer Hospital Of Zhongshan University Zhongshan University Institute Of Oncology); Sun Yat Sen University Cancer Center
Priority date: 2019-01-03
Filing date: 2019-07-02
Publication date: 2019-11-26
Also published as: CN109652546A; CN109652546B

Abstract

本发明中公开了抑制DPPA3或其下位靶点GLI1和MYNC表达的物质在制备预防和治疗癌症的产品中的应用，以及DPPA3下位靶点GLI1和MYNC作为癌症患者预后标志物的应用，为预防和治疗肝癌，特别是原发性肝癌，提供了新的思路。

Description

抑制DPPA3表达的物质在制备预防和治疗癌症的产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物领域，具体地，本发明涉及试剂在制备药物中的用途、DPPA3及其下游靶点作为癌症细胞生物标志物的用途，DPPA3下游靶点作为癌症患者预后标志物的用途靶点和筛选药物的方法。

背景技术

原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我国第四大常见恶性肿瘤，占我国肝癌的90％，死亡率在所有肿瘤中居第2位。由于原发性肝癌起病具有隐匿性高、进展快、侵袭性强、易转移、预后差等特点及其对传统放、化疗技术的不敏感，目前原发性肝癌仍为内外科的难治性疾病。

在肝癌的发生、发展过程中，发现新的癌基因或抑癌基因，研究其产生的作用及引起的生物学特性的改变，不但有助于人们深入了解肝癌发生发展的分子机理，而且有助于鉴定新的肝癌特异的生物标志物和药物靶点，为研发新的肝癌防诊治措施提供重要的理论依据。

肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)的自我更新作用被认为是肿瘤发生、发展、侵袭和转移的根源。肿瘤干细胞在肿瘤组织中存在的数量极少，但其对于肿瘤的治疗及预后意义重大。在肝癌中，目前为止已鉴定出多种肿瘤干细胞特异的细胞表面标志物，如CD133和CD90等。然而，关于肝癌干细胞如何进行自我更新并维持干性的分子机制仍然不明确。因此，探究肝癌干细胞维持其自我更新能力的分子网络，靶向抑制其过程中的关键目标蛋白，可为治疗肝癌及预防复发提供新的策略。

作为母体效应基因，DPPA3特异性在生殖细胞和多能细胞的细胞核内表达，调控卵子形成及早期胚胎发育过程中的DNA甲基化，在早期胚胎发育中具有重要作用。目前，仅有一篇文献报道DPPA3在肿瘤中的作用，其可增强黑色素瘤细胞的转移能力，但具体机制不明确。尚未有研究报道DPPA3是否参与调控肿瘤干细胞自我更新。

发明内容

本发明的目的在于提供抑制DPPA3表达的物质在制备预防和治疗癌症的产品中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

试剂在制备药物中的用途，所述试剂具有以下功能中的至少一种：

a)抑制DPPA3或其下游靶点中至少一种的表达，其中，下游靶点为GLI1和MYCN；

b)促进DPPA3互作基因UHRF1过表达；

所述药物用于下列至少一种：

抑制细胞的增殖；

促进细胞凋亡。

进一步地，所述细胞为肝癌细胞；进一步地，所述肝癌细胞为肝癌干细胞。

进一步地，所述药物用于治疗或预防肝癌；优选地，所述肝癌为原发性肝癌。

进一步地，所述试剂具有促进DPPA3及其下游靶点中至少一种表达的功能，下游靶点为GLI1和MYCN，所述药物用于下列至少一种：

促进细胞的增殖；

抑制细胞凋亡。

标志物作为癌症细胞生物标志物的用途，标志物选自DPPA3、其下游靶点中的至少一种，下游靶点为GLI1和MYCN。

进一步地，所述癌症细胞为肝癌细胞；进一步地，所述肝癌细胞为肝癌干细胞。

标志物作为癌症患者预后标志物的用途，标志物选自DPPA3下游靶点GLI1和MYCN中的任意一种。

进一步地，癌症为原发性肝癌。

一种筛选用于治疗癌症药物的方法，包括：将候选药物与癌细胞进行接触；检测所述接触前后，癌细胞中DPPA3或其下游靶点中至少一种的表达量，其中，所述接触后癌细胞中DPPA3或其下游靶点中至少一种的表达量低于所述接触前癌细胞中DPPA3或其下游靶点中至少一种的表达量，是候选药物为目标药物的指示；

其中，DPPA3下游靶点为GLI1和MYCN；

优选地，所述癌症为肝癌。

本发明的有益效果是：

本发明中公开了DPPA3促进肝癌干细胞自我更新的功能和机制，具体地，DPPA3在肝CSCs中高度表达，与UHRF1相互作用导致DNMT1定位错误，从而诱导DNA去甲基化，激活GLI1/MYNC表达，进而促进肝CSCs的干性。本发明中公开了抑制DPPA3或其下位靶点GLI1和MYNC表达的物质在制备预防和治疗癌症的产品中的应用，以及DPPA3下位靶点GLI1和MYNC作为癌症患者预后标志物的应用，为预防和治疗肝癌，特别是原发性肝癌，提供了新的思路。

附图说明

图1.DPPA3的表达水平与肿瘤分化程度相关。a)No.31和No.28基因模块中肝癌干细胞标记物或调控肿瘤干性的基因的富集；b)q-PCR验证DPPA3在体外肝细胞分化模型各个阶段的表达；c)q-PCR检测DPPA3在不同分化程度的肿瘤组织中的表达；d)DPPA3与CD133、CK19、ALB、G6PC表达量的相关性分析；e)DPPA3在HCC临床样本及配对的非肿瘤组织中的表达情况；f)DPPA3表达阳性与肝细胞癌患者预后、肿瘤分期和AFP水平的相关性；g)10株肝癌细胞系和2株永生化肝细胞中DPPA3阳性细胞率；h)DPPA3与CD133在肿瘤干细胞微球中呈现共表达模式。

图2.DPPA3促进肝癌干细胞自我更新。a)免疫印迹验证DPPA3在细胞系MIHA、97H中的过表达；b)DPPA3促进肿瘤干细胞微球形成；c)XTT检测对照组和过表达DPPA3组细胞对化疗药物顺铂、5-氟尿嘧啶及靶向药索拉菲尼的耐受性；d)细胞凋亡实验证明DPPA3使得细胞抗凋亡能力增加。e)DPPA3促进体内裸鼠移植瘤的生长；f)DPPA3显著增强了肿瘤起始能力和肝CSC比值。

图3.全基因组甲基化测序显示DPPA3调控基因启动子区DNA去甲基化。A)差异甲基化区域(DMR)在基因组不同元件上的分布；B)启动子区不同序列环境下的胞嘧啶平均甲基化水平分布；C)热图显示启动子区CG甲基化水平在DPPA3的影响下降低，即绝大部分发生DNA去甲基化；D)去甲基化的启动子所对应的基因进行信号网络富集分析图。

图4.多组学联合分析显示DPPA3通过上调GLI1影响肿瘤干细胞自我更新。a)GSEA富集分析显示DPPA3与肿瘤分化、干性调控相关；b)转录组测序与甲基化测序联合分析表明有61个基因的启动子区发生去甲基化而上调；c)根据这61个基因的功能进行聚类分析图；d)q-PCR验证GLI1和MYCN基因在体外肝细胞分化模型中的表达；e+f)Huh7细胞中CD133+CSCs和肿瘤细胞球中GLI1和MYCN的表达水平；g+h)GLI1和MYCN的mRNA水平和蛋白水平(i)在过表达DPPA3的肝癌细胞株97H、永生化肝细胞株MIHA和LO2中被上调。在Vec和DPPA3转染细胞中沉默GLI1(j)显著抑制了MYCN表达(k)。

图5.体内外实验表明下调GLI1可抑制DPPA3维持肿瘤干细胞自我更新的功能。敲降GLI1的表达后细胞微球形成减少(a)、ALDH活性降低(b)和索拉非尼诱导的细胞凋亡增加(c)；GLI1抑制剂GANT61治疗使97H和MIHA细胞中GLI1和MYCN的表达均降低(d)；GANT61治疗显著抑制了97H、MIHA以及HCC organoids中微球形成的数量和大小(e)以及ALDH活性(f，g)；GLI1促进了肝癌细胞(h)和HCC organoids(i)中索拉非尼的疗效；体内实验结果显示与对照组相比，GANT61、索拉非尼和两者联合治疗组的肿瘤大小和重量均有所下降。此外，联合治疗组对肿瘤的抑制作用最大(图5j,k)。

图6.DPPA3通过与UHRF1互作导致GLI1启动子区发生DNA去甲基化。a)BioGrid网站预测与DPPA3互作的蛋白；b)免疫共沉淀实验显示DPPA3可与UHRF1直接结合，而不是DNMT1。c)双免疫荧光染色法研究了UHRF1和DNMT1的核定位；d)UHRF1过表达可消除DPPA3诱导的GLI1启动子低甲基化效应。

图7.GLI1/MYCN的激活与临床HCC患者的病情严重程度和预后相关。a)临床样本中检测DPPA3、MYCN、GLI1的mRNA表达分析其相关性；b)TCGA数据库中MYCN和GLI1表达的相关性；免疫组化染色(c)和qRT-PCR(d)结果显示，在过表达DPPA3的HCC细胞的裸鼠异种移植瘤中，GLI1和MYCN均显著升高；e)TCGA数据库中，GLI1在HCC患者肿瘤组织中高表达；f)GLI1表达水平与临床病理分期呈正相关；g)与分化良好的肿瘤相比，分化不良或未分化的肿瘤中GLI1水平上调；h)高表达GLI1的HCC患者预后较差；i)MYCN在HCC患者肿瘤组织中高表达；j)MYCN表达水平升高与临床预后不良相关。

具体实施方式

下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。

本发明中使用的主要研究方法如下：涉及到的主要研究方法：细胞培养、实时荧光定量PCR、免疫印迹、CoIP、转染、肿瘤干细胞成球实验、XTT法检测药物敏感性、流式检测凋亡率和ALDH活性、免疫组化、免疫荧光双染、pull down、皮下成瘤、极端有限稀释分析法、亚硫酸氢盐-基因组测序(BGS)等。

(1)细胞系和HCC临床标本

从中山大学肿瘤中心(广州)接受肝癌肝切除术的患者中收集107对原发性肝癌标本及其邻近非肿瘤组织用于制作TMA。所有HCC患者均签署书面知情同意书，同意其临床标本用于进行医学研究。本研究中使用的样本由中山大学癌症中心的人类研究伦理审查委员会批准。病理检查由病理学家进行。肿瘤分级是根据美国癌症联合委员会(AJCC)/国际癌症控制联盟(UICC)分级系统确定的。本研究采用人永生肝细胞MIHA、LO2和HCC细胞系MHCC-97H、SNU378、H2P、Huh7、Hep3B、MHCC-97L、SNU449、H2M、SNU475、PLC-8024。细胞用添加10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的高糖DMEM培养基培养于37℃含5％CO2的湿化培养箱中。

(2)实时荧光定量PCR

用Trizol分离法提取组织RNA，定量后逆转录为cDNA。设计q-PCR的引物，原则为扩增长度不超过500bp，引物长度不超过30bp。利用ABI公司的7900HT仪器进行荧光定量PCR扩增。反应条件为：95℃预变性30s；两步法扩增：94℃持续5s，60℃持续30s，共40个循环；溶解曲线：95℃持续1min，55℃持续30s，95℃持续30s。基于目的基因和GAPDH扩增曲线得到Ct值，用以下计算公式Folds＝2-ΔΔCt表示实验组目的基因与GAPDH基因表达量的倍比关系。独立重复实验3次。

(3)亚硫酸氢盐-基因组测序

提取高纯度的细胞DNA，需使用蛋白酶K及RNA酶去除污染的蛋白和RNA。使用QIAGEN提供的亚硫酸氢盐转化试剂盒(EpiTect Bisulfite Kit)，对提取出的DNA进行处理，使其序列中未甲基化的胞嘧啶完全转化为尿嘧啶。DNA经过热变性和亚硫酸氢盐转化后，上样到EpiTect分离柱中，按照说明书中的步骤洗去残余的亚硫酸氢钠并洗脱DNA。以此DNA为模板，用预先设计好的引物做PCR，得到的片段做T载体连接后，每组挑取至少8个克隆送公司进行测序。

(4)免疫印迹

用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA定量法测定蛋白浓度。吸取50μg总蛋白，用RIPA裂解液补至20μL，加入等体积蛋白上样buffer煮沸10min，混匀后至于-80℃保存或直接上样。经过不连续SDS-PAGE电泳分离，用湿转法将蛋白转移至PVDF膜，10％脱脂奶粉于室温封闭1小时，TBST洗膜后加入DPPA3一抗(1:1000)，4℃孵育过夜，洗膜后加入HRP标记的二抗，室温孵育1h，洗膜后进行压片曝光，目的蛋白/GAPDH代表相对表达量。独立重复实验3次及以上。对于GST-Pull down实验，利用PCR技术分别扩增DPPA3编码框和UHRF1基因全长,并将其分别插入到表达载体pGEX-4T-1和p3FLAG-CMV-10中，构建出pGST-DPPA3及UHRF1。将pFLAG-UHRF1质粒转染HEK293T细胞，继续培养48小时后收集细胞，其间提前加入MG132抑制蛋白酶体孵育10小时。细胞经NP40裂解后离心收集上清。另一方面pGST-DPPA3转化BL21(DE3)细菌，优化培养条件使GST-DPPA3在细菌培养液中大量表达，接着用GST4Bgel亲合纯化GST-DPPA3，结合有GST-DPPA3蛋白与含FLAG-UHRF1的细胞上清共同孵育后，离心收集GST4Bgel，经洗脱液洗脱后进行蛋白电泳，通过免疫印迹分析。

(5)免疫共沉淀

参照罗氏公司的免疫沉淀试剂盒步骤进行：在细胞裂解液中加入DPPA3抗体4℃孵育过夜。将预处理过的10μl protein A琼脂糖珠加入DPPA3抗体孵育过的细胞裂解液中，4℃孵育1小时，使抗体和protein A琼脂糖珠充分偶联。免疫沉淀反应后，将琼脂糖珠离心至管底，裂解缓冲液彻底冲洗，洗去残留的上清后，加入蛋白上样缓冲液，沸水煮10min，SDS-PAGE后进行免疫印迹分析。

(6)流式细胞仪检测凋亡率和ALDH活性

Annexin V/PI染色法。设置药物浓度为：0.01倍、0.1倍、1倍和10倍血浆高峰浓度。每孔5×105个细胞接种于6孔培养板中。第二天贴壁后，更换为含有化疗药或靶向药的新鲜培养液，37℃培养24、48或72小时；收集细胞，PBS洗涤2次；重悬于100μl含Annexin V-FITC和0.5μg PI的结合缓冲液中；室温避光孵育15min；用PBS洗涤细胞后加入400μl结合缓冲液；流式细胞仪分析，按下列公式计算细胞的凋亡指数：细胞凋亡指数＝(早期凋亡细胞数+晚期凋亡细胞数)/总细胞数×100％。ALDH活性检测根据试剂盒提供的方案(SCR150,Millipore)检测HCC细胞的ALDH活性。细胞悬浮在1ml的添加维拉帕米的AldeRed AssayBuffer中。在试管中加入一定量的AldeRed 588-A试剂，混匀。取500ul细胞悬液，加入DEAB试剂用作对照组。37℃孵育试管30分钟。将所有试管离心，弃上清。用加入了维拉帕米的AldeRed Assay Buffer缓冲液重悬细胞，进行流式细胞分析。

(7)免疫组化

将切下的肿瘤组织进行程序性脱水，之后放在二甲苯中透明以及浸蜡包埋。做成石蜡切片后按照以下步骤进行免疫组化染色：于65℃烘箱中烤片2小时以上，然后置于不同浓度梯度的二甲苯和乙醇中进行脱水；将片子置于99℃抗原修复液中煮45min以暴露抗原表位；之后滴加内源性过氧化物酶阻断剂，室温下孵育10min；用动物非免疫血清进行封闭，室温孵育2小时；洗去封闭液，每张切片滴加DPPA3(1∶100)或者GLI1(1∶100)抗体，于4℃冰箱中孵育过夜。切片加生物素标记的兔抗羊IgG，室温孵育30min。用PBS缓冲溶液进行冲洗，然后加入链霉菌抗生素蛋白－过氧化酶，室温孵育10min。PBS冲洗后滴加新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察。

(8)免疫荧光染色

将细胞种于板上，待汇合度达到80％时取出，用PBS洗三遍。4％多聚甲醛室温固定15min，0.25％Triton室温打孔15min，PBS冲洗，然后用5％BSA室温封闭1个小时，取出后滴加一抗DPPA3(1：100)和UHRF1(1：100)的混合液，4℃孵育过夜。第二天用PBS冲洗后，滴加红色标记抗鼠和绿色标记抗兔的二抗混合液，室温避光孵育1个小时。DAPI染核10min后，PBS冲洗即可封片。

(9)慢病毒介导的过表达和敲降

构建慢病毒介导的DPPA3过表达载体，参照Invitrogen公司产品说明书进行转染，qPCR和免疫印迹法检测确定过表达效果。采用PLL3.7 shRNA vectors和类似的方法构建敲降细胞系。

(10)肿瘤干细胞微球形成

成球能力是肿瘤干细胞体外鉴定的一个重要方法。细胞计数后，重悬于无血清培养基中，按每孔3000个细胞的量，将细胞接种于低黏附板24孔板中。培养基使用1％浓度的甲基纤维素(methyl cellulose)抑制细胞聚集，并添加终浓度为2％B27、6.4μg/ml胰岛素、20ng/ml EGF和10ng/ml bFGF。

(11)XTT法检测药物敏感性

参照顺铂、5-氟尿嘧啶及索拉菲尼的血浆高峰浓度，在各组细胞中分别加入0.01倍、0.1倍、1倍和10倍血浆高峰浓度的化疗药或靶向药，每一种浓度设5个复孔。阴性对照组：仅加细胞不加药；空白调零组：仅加细胞培养液。每孔3×103个细胞接种于96孔培养板中；第二天贴壁后，将化疗药或靶向药按不同浓度加入各孔细胞，继续常规培养72h；加新鲜配制的XTT溶液，选择490nm波长，酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，取每5个重复孔的光吸收值的平均值，计算各种转染细胞在不同浓度药物下的存活率，求出三种药物的IC50值。

(12)动物实验

本发明拟从动物学水平探讨DPPA3对肝癌干细胞自我更新能力的影响，利用极端有限稀释分析法建立小鼠皮下移植瘤模型。在三株HCC细胞系97H、SNU378、H2P及一株永生化正常肝细胞系MIHA中过表达DPPA3，将不同浓度的细胞悬液注射入免疫缺陷型NOD-SCID小鼠背部皮下(左侧注射对照组，右侧注射过表达组)，例如5000，5×104，5×105，5×106个细胞，建立小鼠皮下移植瘤模型。定期用游标卡尺测肿瘤的长径和短径，观察DPPA3对成瘤率及肿瘤大小的影响，利用极端有限稀释分析法(Extreme Limiting Dilution Analysis,ELDA)计算肝癌干细胞分别在对照组和过表达组所占的比例，检测肿瘤细胞的自我更新能力。体内药物治疗试验采用MHCC-97H细胞(4×106)构建5周龄BALB/c裸鼠皮下异种移植瘤。当肿瘤直径达到约4mm时，随机将小鼠分为4组，每组6只:vehicle control组、GANT61组、sorafenib组和两药联合治疗组。索拉非尼溶于DMSO中，在(Sigma Aldrich)中进一步稀释，每日灌胃，将GANT61溶于溶剂(玉米油:乙醇，4:1)中，隔日腹腔注射治疗。每隔2天测量肿瘤体积和体重。肿瘤体积采用0.5×l×w2计算，其中l为肿瘤长度，w为肿瘤宽度。

(13)统计分析

采用SPSS22.0软件，皮尔逊卡方检验是用于分析DPPA3表达与临床病理参数的相关性。生存分析采用Kaplan-Meier和log-rank检验。大多数研究采用独立t检验，数据以3个独立实验的均值±标准差表示。*P<0.05，**P<0.001，***P<0.0001。

实施例1 DPPA3的表达水平与肿瘤分化程度相关

为更加深入、全面地探讨发育相关信号网络与肝癌干细胞自我更新的分子机制，我们建立了体外肝细胞分化模型。将人胚胎干细胞(Human Embryonic Stem Cells，hESCs)逐渐通过化学方法诱导为内胚层、肝祖细胞和早期肝细胞。在肝脏发育的不同阶段，收集相关RNA进行转录组测序，配对肝癌和癌旁肝组织作为对照。为研究肝脏发育过程与肝癌发生发展的关系，我们利用趋势分析软件STEM对这6个阶段(胚胎干细胞、内胚层、肝祖细胞、早期肝细胞、癌旁、肝癌)的转录组数据进行了分析。结果显示共有13种基因表达趋势被显著富集。其中，我们对No.31和No.28基因表达谱(STEM软件将二者归为相同模块)产生了兴趣，因该模块中的基因在肝祖细胞或早期肝细胞阶段的表达丰度显著高于其它阶段。由于组织干细胞与肿瘤干细胞的基因调控网络具有高度相似性，这就提示我们该模块中的基因可能参与到肿瘤干细胞自我更新的调控网络中。例如，肝祖细胞/干细胞标记物，后被鉴定为肝癌干细胞标记物或是调控肿瘤干性的E-cadherin、Claudin-3、Trop-2以及CD133、AFP、DLK1、NOPE均在该模块中被富集出来(图1a)，验证了该模块的准确性。

在该模块基因列表中，排名顶端的发育多能性相关蛋白DPPA3引起了我们的兴趣，其表达丰度在肝祖细胞阶段达到顶峰，是癌旁组织的1369倍(图1b)。接着我们在HCC临床样本中检测DPPA3的表达，发现其表达水平与肝癌的分化程度成反比(图1c)。另外，我们还发现DPPA3的表达水平与肝癌干细胞标记物CD133、CK19的表达呈显著正相关，而与成熟肝脏细胞标记物ALB、G6PC呈显著负相关(图1d)。为了检测DPPA3在HCC临床样本中的表达情况，我们采用107对HCC组织和非肿瘤组织的组织芯片进行免疫组化染色，结果显示，约67.29％(72/107)的HCC标本中检测到DPPA3的表达，而正常肝组织中几乎没有DPPA3的表达，仅有14例(13.1％)染色阳性。DPPA3在分布于肿瘤组织中的癌细胞中表达较强，表达率为0.08％～4.55％。而在正常肝组织中，阳性细胞的比例约为0.025～0.3％(图1e)。临床病理研究显示DPPA3表达阳性与肝细胞癌患者预后差有关，并与晚期肿瘤和高AFP水平显著相关(图1f)。用流式细胞术检测10株肝癌细胞系和2株永生化肝细胞中DPPA3阳性细胞率。DPPA3阳性细胞比例为0.26％～18.7％(图1g)。将肿瘤干细胞体外悬浮培养所成的微球制作成冰冻切片，免疫荧光双染发现DPPA3与CD133在微球中呈现共表达模式(图1h)。以上实验提示，DPPA3的表达水平与肝癌分化程度紧密相关。

实施例2 DPPA3促进肝癌干细胞的自我更新

体外功能实验中，我们利用慢病毒转染的方式在永生化正常肝细胞系MIHA和肝癌细胞系97H中过表达DPPA3(图2a)，发现细胞的悬浮成球能力增强(图2b)，对化疗药物顺铂、5-氟尿嘧啶及靶向药索拉菲尼的IC50值增高(图2c)，抗凋亡能力增加(图2d)。以上体外实验结果提示，DPPA3参与促进肝癌干细胞的自我更新。为了进一步证实DPPA3在体内是否能促进肝细胞间充质干细胞的自我更新，将转染空载体和DPPA3的细胞分别皮下注射到裸鼠的左右背侧(n＝6)。结果显示，转染DPPA3明显促进了裸鼠异种移植瘤的生长(图2e)。接下来，我们将500×、100×、10×和5×10⁴个细胞分别植入NOD/SCID小鼠皮下。在第三个月检查肿瘤的形成，以确定肿瘤的起始能力。转染DPPA3显著增强了肿瘤起始能力和肝CSC比值(图2f)。综上所述，这些数据表明DPPA3在体内和体外都参与了肝癌干细胞干性的调控。

实施例3 DPPA3通过调控GLI1启动子区甲基化促进肝癌干细胞自我更新

全基因组甲基化测序显示DPPA3调控基因启动子区DNA去甲基化

在对照组和过表达DPPA3的细胞系MIHA中，我们做了全基因组甲基化测序(WholeGenome Bisulfite Sequencing，WGBS)和转录组(RNA-seq)测序。WGBS分析结果发现，比较对照组和过表达组，共出现10188个差异甲基化区域(Differentially MethylatedRegion,DMRs)，其中位于启动子区的DMR共有1103个(图3A)。接下来我们分析了启动子区不同序列环境下的胞嘧啶(mC,mCG,mCHG,mCHH)甲基化水平的分布情况，发现过表达组在以上4种序列环境下的甲基化水平均低于对照组(图3B)。热图分析显示绝大部分启动子区CG甲基化水平降低(图3C)，表明DPPA3可通过启动子区去甲基化实现基因表达的开启和上调。将这些受影响的启动子所对应的基因进行通路网络富集分析，结果显示受甲基化调控的基因参与到Hedgehog、ErbB和染色体维持等信号通路中(图3D)。

多组学联合分析显示DPPA3通过上调GLI1影响肿瘤干细胞自我更新

转录组测序GSEA富集分析表明DPPA3参与调控了肿瘤分化、干性维持等过程，并与EpCAM或CK19阳性的肝癌干细胞表达谱高度一致(图4a)。将2306个发生去甲基化的启动子(WGBS)与1927个差异表达基因(RNA-seq)进行交集分析，发现61个基因出现在二者的交集中(图4b)；其中编码蛋白的基因有24个，功能分别与分化、代谢、细胞增殖、DNA损伤、细胞交流、蛋白转运等有关(图4c)。为研究DPPA3如何影响肿瘤干细胞自我更新，我们重点关注与调控分化相关的7个基因。其中，GLI1和MYCN是mRNA和甲基化水平差异最显著的基因，其在体外肝细胞分化模型中的表达如图4d所示，胚胎干细胞阶段表达量最高，其次为肝祖细胞阶段。为了进一步探讨它们在肝CSCs中的活化作用，我们检测了来自Huh7细胞的CD133+CSCs和肿瘤细胞球中GLI1和MYCN的表达水平。我们观察到它们在肝CSCs中高表达(图4e，f)。此外，GLI1和MYCN在过表达DPPA3肝癌细胞株97H、永生化肝细胞株MIHA和LO2中表达被上调，包括mRNA水平(图4g，h)和蛋白水平(图4i)。为了确定DPPA3是否以GLI1依赖的方式促进肝干细胞的干性，shRNA被用于抑制97H和MIHA细胞中GLI1的表达。在Vec和DPPA3转染细胞中沉默GLI1(图4j)显著抑制了MYCN表达(图4k)，证实MYCN是HCC中GLI1的下游靶基因。

体内外实验表明下调GLI1可抑制DPPA3维持肿瘤干细胞自我更新的功能

敲降GLI1的表达后细胞微球形成减少(图5a)、ALDH活性降低(图5b)和索拉非尼诱导的细胞凋亡增加(图5c)，表明GLI1的下调显著损害了DPPA3诱导的肝干细胞干性。接下来，我们检测了GLI1抑制剂(GANT61)是否具有与GLI1敲除类似的作用。给予5μM GANT61治疗3天后，97H和MIHA细胞中GLI1和MYCN的表达均降低(图5d)。GANT61治疗显著抑制了97H、MIHA以及HCC organoids中微球形成的数量和大小(图5e)以及ALDH活性(图5f，g)。综上所述，这些结果表明DPPA3通过激活GLI1促进肝干细胞的干性。

为了研究GLI1在调节DPPA3诱导的索拉非尼耐药中的作用，我们用索拉非尼和GANT61处理过表达DPPA3的肝癌细胞和HCC organoids，结果显示，GLI1促进了肝癌细胞(图5h)和HCC organoids(图5i)中索拉非尼的疗效。鉴于GLI1在调节索拉非尼耐药方面的关键作用，我们使用DPPA3转染的HCC细胞评估了GANT61治疗的疗效及其与索拉非尼在体内的联合作用。对已成瘤的裸鼠进行16天的药物治疗，包括GANT61、索拉非尼或两者联合用药。与对照组相比，GANT61、索拉非尼和联合治疗组的肿瘤大小和重量均有所下降。此外，联合治疗组对肿瘤的抑制作用最大(图5j,k)。

DPPA3通过与UHRF1互作导致GLI1启动子区发生DNA去甲基化

为探讨DPPA3的调控机制，我们利用BioGrid网站对与DPPA3发生互作的蛋白进行检索和预测，并用CytoScape软件实现可视化，结果发现与DPPA3发生互作的蛋白中，有三个蛋白包括UHRF1、UHRF2、DNMT1与DNA甲基化过程相关(图6a)。接着，我们采用免疫共沉淀的方法来检测这3个蛋白是否与DPPA3结合，结果显示表观遗传调控因子UHRF1(Ubiquitin-like,with PHD and RING finger domains 1)为DPPA3的结合蛋白(图6b)。据报道，UHRF1通过招募DNMT1维持DNA甲基化。为了更详细地评估分子机制，我们采用双免疫荧光染色法研究了UHRF1和DNMT1的核定位。有趣的是，我们发现过表达DPPA3后使UHRF1从细胞核隔离到了细胞质(图6c)，且对照细胞(80％以上)中UHRF1和DNMT1共定位的比例明显高于过表达DPPA3的细胞(均低于40％)(图6c)，说明在HCC或肝细胞中，DPPA3干扰了UHRF1-DNMT1的功能。接下来我们研究了UHRF1对DPPA3诱导的DNA低甲基化的影响。对GLI1启动子区进行亚硫酸氢盐基因组测序，结果表明，UHRF1过表达可消除DPPA3诱导的GLI1启动子低甲基化效应(图6d)。综上所述，这些数据提示DPPA3与UHRF1的结合破坏了维持DNA甲基转移酶DNMT1在细胞核中的定位，从而导致DNA去甲基化。

GLI1/MYCN的激活与临床HCC患者的病情严重程度和预后相关

由于GLI1/MYCN是DPPA3在肝CSCs中的两个重要下游靶点，我们接下来研究了它们在HCC中的共表达模式。我们在临床样本中检测其mRNA表达，结果表明，DPPA3表达与GLI1和MYCN呈正相关(图7a)，并且，如同预期，GLI1的表达也与MYCN呈正相关(图7a)。在TCGA数据库中也得到同样的结果(图7b)。免疫组化染色(图7c)和qRT-PCR(图7d)结果显示，在过表达DPPA3的HCC细胞的裸鼠异种移植瘤中，GLI1和MYCN均显著升高。由于GLI1/MYCN高度活化并参与调节肝CSCs，我们进一步探讨了GLI1/MYCN活化与HCC进展的关系。首先，在TCGA数据库中，GLI1在HCC患者肿瘤组织中高表达(图7e)，其表达水平与临床病理分期呈正相关(图7f)。更重要的是，我们注意到，与分化良好的肿瘤相比，分化不良或未分化的肿瘤中GLI1水平上调(图7g)。最后，高表达GLI1的HCC患者预后较差(图7h)。在TCGA数据库中分析MYCN表达时也得到了类似的观察结果，其中表达水平升高与临床预后不良相关(图7i，j)。

Claims

1.试剂在制备药物中的用途，所述试剂具有以下功能中的至少一种：

b)促进DPPA3互作基因UHRF1过表达；

所述药物用于下列至少一种：

抑制细胞的增殖；

促进细胞凋亡。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述细胞为肝癌细胞；进一步地，所述肝癌细胞为肝癌干细胞。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述药物用于治疗或预防肝癌；优选地，所述肝癌为原发性肝癌。

4.试剂在制备药物中的用途，所述试剂具有促进DPPA3及其下游靶点中至少一种表达的功能，下游靶点为GLI1和MYCN，所述药物用于下列至少一种：

促进细胞的增殖；

抑制细胞凋亡。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述细胞为肝癌细胞；进一步地，所述肝癌细胞为肝癌干细胞。

6.标志物作为癌症细胞生物标志物的用途，其特征在于：标志物选自DPPA3、其下游靶点中的至少一种，下游靶点为GLI1和MYCN。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述癌症细胞为肝癌细胞；进一步地，所述肝癌细胞为肝癌干细胞。

8.标志物作为癌症患者预后标志物的用途，其特征在于：标志物选自DPPA3下游靶点GLI1和MYCN中的任意一种。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：癌症为原发性肝癌。

10.一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗癌症，其特征在于，包括：将候选药物与癌细胞进行接触；检测所述接触前后，癌细胞中DPPA3或其下游靶点中至少一种的表达量，其中，所述接触后癌细胞中DPPA3或其下游靶点中至少一种的表达量低于所述接触前癌细胞中DPPA3或其下游靶点中至少一种的表达量，是候选药物为目标药物的指示；

其中，DPPA3下游靶点为GLI1和MYCN；

优选地，所述癌症为肝癌。