CN113355411B - 一种基于lncRNA标记物的肿瘤免疫分型方法 - Google Patents

一种基于lncRNA标记物的肿瘤免疫分型方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一组肿瘤免疫分型的长链非编码RNA(lncRNA)标记物，共包括49个lncRNA。本发明还提供了一种基于上述lncRNA标记物肿瘤免疫分型的方法，该方法将49个lncRNA分组，并联合细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表达量进一步将患者分层聚类分为免疫激活型(Immune‑Active Class)、免疫排除型(Immune‑Exclusion Class)、免疫失调型(Immune‑Dysfunctional Class)和免疫沙漠型(Immune‑Desert Class)四组。本发明的肿瘤免疫亚型分类方法，与预测抗肿瘤免疫治疗的总体存活率和反应性具有极强的相关性，并且具有高度客观性、准确性及重复性的特点。这一分类方法的建立，为恶性肿瘤患者抗免疫治疗的疗效与预后提供预测指标。

Description

一种基于lncRNA标记物的肿瘤免疫分型方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种基于lncRNA标记物的肿瘤免疫分型方法。
背景技术
目前，肿瘤的分型、分级和分期是评价肿瘤生物学行为和诊断最终的三项指标，其中分级和分期主要用于恶性肿瘤生物学行为和预后的评估。
恶性肿瘤的病理分型是以肿瘤细胞与其来源组织的相似或接近于正常组织的程度作为诊断依据。肿瘤的病理学分型是最能反映肿瘤来源组织细胞的生物学行为和形态学特征的重要参数，不同组织类型的肿瘤具有不同的生物学行为和侵袭转移能力。目前，WHO肿瘤分型标准是公认的肿瘤分型方案，通常按照优势成分分型原则进行恶性肿瘤的分型，即以肿瘤主要组织学类型(＞50％的组织结构)进行分型诊断。然而，异质性是恶性肿瘤的重要组织结构特点之一，许多恶性肿瘤(如结直肠癌和胃癌等)均存在不同程度的多方向分化或不同组织学类型并存的现象，肿瘤异质性也决定了恶性肿瘤复杂的临床生物学行为和预后。因此，按照优势成分分型原则进行的WHO肿瘤分型方法无疑会在某种程度上忽视恶性肿瘤的高度异质性的组织学特征，掩盖次要组织类型对肿瘤生物学行为和预后的影响。同时，病理组织学诊断也以受到恶性千差万别的显微镜下形态学表现以及病理医师主观因素判断的影响，不可避免存在一定的分型不一致性。此外，即使相同分型、分级和分期的肿瘤，由于其分子表型的差异，也可能显示出不同的治疗反映和预后。
肿瘤的分级目前采用的是包括分化良好者、分化较低细胞以及介于两者之间的简明三级方案。恶性肿瘤的分级反映了肿瘤的内部特征，对于客观评估肿瘤的分化程度和生物学行为、预后预测具有很大的参考价值。一般来说，肿瘤分级越高，预后越差，但并非完全一致。由于肿瘤组织结构的复杂性和异质性特征，不同类型肿瘤(如腺癌、鳞癌、肾细胞癌、乳腺癌等)均有其不同的结构特征和分级标准，且缺乏定量指标。此外，由于受取材充分程度和对诊断标准、异型性判读的主观性差异影响，均不同程度的影响到肿瘤分级的客观性、精确性和可重复性。
肿瘤的分期是根据原发肿瘤的大小、浸润的深度、范围以及是否累计邻近器官、有误局部和远处淋巴结的转移、有无血源性或者其他远处转移等参数，实质上是反映肿瘤的侵袭转移程度，评价恶性肿瘤侵袭转移范围、病程进展程度、转归和预后的重要指标。TNM分期系统是目前国际上最为通用的分期系统，是反映肿瘤进展、判断预后的最可靠的独立制指标。肉眼及显微镜下对原发肿瘤的大小及浸润范围(T)、局部淋巴结(N)受累情况及远隔脏器、组织中肿瘤转移情况(M)的判读是进行肿瘤TNM分期的三项直接可评价参数。其中，淋巴结检测对于恶性肿瘤分期的精确性具有直接的影响，获得足够的淋巴结是保证分析精确的前提。不同肿瘤的TNM分析中T、N、M判读界值不尽相同，但一般而言，数字越大，病情越晚，预后越差。此外，肿瘤的分期描述的是肿瘤特征的外部参数，不仅取决于肿瘤的组织学类型和分级，还明显受到肿瘤所引发的临床症状出现的早晚、患者的临床耐受性、患者经济情况、医疗保障水平和患者就诊时间等主观和社会因素的影响。
如上所述，传统的肿瘤分型、分级和分期评价方法不仅存在肿瘤异质性、显微镜下形态学表现以及医师对诊断标准、异型性判读的主观性差异的问题，同时还存在其他客观因素和社会因素的问题。这些问题的存在不同程度的影响到肿瘤分级的客观性、精确性和可重复性。随着分子生物学技术的发展，基因测序、荧光原位杂交、免疫组化、Real-timePCR等技术的广泛应用和后基因组学时代的来临，对于肿瘤的认识已经深入到分子水平。同时，基因突变、缺少或过表达以及染色体不稳定、微卫星不稳定等遗传学机制和CpG岛甲基化、蛋白磷酸化等表观遗传学机制得以阐明，一些类肿瘤个性化治疗相关分子靶标先后被发现，抗肿瘤药物已从传统化疗药物向靶向药物、免疫治疗药物等个体化治疗方向发展。而传统的肿瘤分型、分级和分期已经不能满足现有个体化免疫治疗，尤其是目前快速发展的抗肿瘤免疫治疗药物的疗效和预后的预测的需求。
针对以上现有恶性肿瘤描述评价方案中存在缺点和不足，本发明专利建立基于长链非编码RNA(lncRNA)表达量的临床肿瘤免疫亚型分型方法。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一组肿瘤免疫分型的长链非编码RNA(lncRNA)标记物以及基于所述lncRNA的肿瘤免疫分型方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一组肿瘤免疫分型的长链非编码RNA(lncRNA)标记物，包括：ZNF503-AS2、USP3-AS1、UBA6-AS1、RNF217-AS1、RAMP2-AS1、NKLA、LIPE-AS1、LINC01605、HOXB-AS1、FIX、FLG-AS1、BRWD1-AS2、ATP2A1-AS1、ASB16-AS1、AP000251-1、AL513365-2、AL391422-3、AL358472-5、AC113382-1、AC093249-6、AC012636-1、TMEM147-AS1、SLFNL1-AS1、AC002116-2、VOA9D1-AS1、USP2-AS1、TTN-AS1、TMEM254-AS1、SNHG8、SNHG4、SNHG15、SBF2-AS1、PRNCR1、PCAT1、NOP14-AS1、LINC01118、LINC00937、FGD5-AS1、EMC1-AS1、DLGAP1-AS1、CDKN2B-AS1、BVES-AS1、AC107959-4、SCN1A-AS1、MIRLE7BHG、LINC01361、FUT8-AS1、BHLHE40-AS1、AC009961-1。
本发明的长链非编码RNA(lncRNA)标记物在预测抗肿瘤免疫治疗疗效和预后中的应用。
一种基于上述lncRNA标记物肿瘤免疫分型的方法，包括以下步骤：
(1)收集肿瘤患者数据；
(2)筛选与接受免疫治疗患者的生存具有显著相关性的长链非编码RNA(lncRNA)；
(3)对步骤(2)筛选的长链非编码RNA(lncRNA)进行无监督聚类分析，根据聚类值，基于lncRNA表达情况将患者分为2组患者；
(4)联合lncRNA分组和CTL表达量进一步将患者分层聚类分为lncRNA功能型-CTL高表达、lncRNA功能型-CTL低表达、lncRNA无功能型-CTL高表达和lncRNA无功能型-CTL低表达四组；
(5)根据患者lncRNA有功能调节及肿瘤微环境免疫分子表达及对免疫治疗反应率定义为“免疫激活型(Immune-Active Class)”、“免疫驱逐型(Immune-Exclusion Class)”、“免疫失调型(Immune-Dysfunctional Class)”、“免疫沙漠型(Immune-Desert Class)”。。
进一步地，所述步骤(1)中的数据包括肿瘤患者的所有lncRNA基因表达、CTL表达量、肿瘤微环境免疫分子表达和基因表达以及患者生存预后的信息数据。
进一步地，所述步骤(2)中的长链非编码RNA包括以下49种lncRNA：ZNF503-AS2、USP3-AS1、UBA6-AS1、RNF217-AS1、RAMP2-AS1、NKLA、LIPE-AS1、LINC01605、HOXB-AS1、FIX、FLG-AS1、BRWD1-AS2、ATP2A1-AS1、ASB16-AS1、AP000251-1、AL513365-2、AL391422-3、AL358472-5、AC113382-1、AC093249-6、AC012636-1、TMEM147-AS1、SLFNL1-AS1、AC002116-2、VOA9D1-AS1、USP2-AS1、TTN-AS1、TMEM254-AS1、SNHG8、SNHG4、SNHG15、SBF2-AS1、PRNCR1、PCAT1、NOP14-AS1、LINC01118、LINC00937、FGD5-AS1、EMC1-AS1、DLGAP1-AS1、CDKN2B-AS1、BVES-AS1、AC107959-4、SCN1A-AS1、MIRLE7BHG、LINC01361、FUT8-AS1、BHLHE40-AS1、AC009961-1。
进一步地，所述步骤(3)中无监督聚类分析使用R语言CancerSubtypes软件包进行。
进一步地，所述步骤(3)中无监督聚类分析聚类值为聚类值k为2-5；优选聚类值为k＝2。
本发明的有益效果：本发明是第一个在恶性肿瘤免疫治疗中提供基于lncRNA的新型临床肿瘤免疫亚型分类方法，与预测抗肿瘤免疫治疗的总体存活率和反应性具有极强的相关性，并且具有高度客观性、准确性及重复性的特点。这一分类方法的建立，能够极大推动抗肿瘤免疫治疗的应用，为恶性肿瘤患者抗免疫治疗的疗效与预后提供预测指标。
附图说明
图1基于lncRNA临床肿瘤免疫亚型分类方法建立技术路线图。
图2筛选出的49个与患者生存具有显著相关性的lncRNA示意图。
图3lncRNA自动化分层聚类分析结果示意图(其中lncRNA为长的非编码RNAimmune-Functional class为免疫有功能型；immune-nonfunctional class为免疫无功能型；response为治疗反应；no respone为无反应；response为反应；Unknow为不明确；Sex为性别；Female为女性；Male为男性；ECOG-PS为东部合作肿瘤小组的表现状态；Tissue为组织；Bladder为膀胱；Kidney为肾；Liver为肝；Lung为肺；Lymph note为淋巴结；Ureter为输尿管；Other为其他；TCGA subtype为癌症基因组图集分型；Basal/SCC-like为基底鳞状细胞样；Genomically unstable为遗传不稳定；Infiltrated为浸润；Uro A为基底样细胞A；Uro B为基底样细胞B)。
图4基于lncRNA分型的生存曲线分析图(其中overall survival probability总生存率；immune-Functional class为免疫有功能型；immune-nonfunctional class为免疫无功能型；横坐标为生存时间(月份)；No at risk为死亡风险数)。
图5基于lncRNA分组免疫分子表达比较示意图(其中immune-Functional class为免疫有功能型immune-nonfunctional class为免疫无功能型；Immune checkpoints为免疫检查点抑制剂；Human leukocyte antigens为人白细胞抗原；Immune cells为免疫细胞)。
图6基于lncRNA分组免疫分子表达特征热力图(热图中的每一行代表一个免疫分子或一个免疫细胞，每列代表一个患者。颜色表示表达水平；黄色附近的颜色表示高表达，而蓝色附近的颜色表示低表达。与免疫非功能分类相比，免疫功能分类通常以免疫细胞，免疫检查点和人白细胞抗原的较高表达为特征。lncRNA为长的非编码RNA；ECOG-PS为东部合作肿瘤小组的表现状态；TCGA为《癌症基因组图集》；SCC为鳞状细胞癌；HLA为人类白细胞抗原；DC为树突状细胞；NK为自然杀手；Th为助手T；Tcm为中央记忆T细胞；Tem为效应记忆T细胞；pDC为浆细胞样树突状细胞；TFH为T滤泡辅助细胞；TReg为调节细胞。其中lncRNA为长的非编码RNA；immune-Functional class为免疫有功能型；immune-nonfunctional class为免疫无功能型；response为治疗反应；no respone为无反应；response为反应；Unknow为不明确；Sex为性别；Female为女性；Male为男性；ECOG-PS为东部合作肿瘤小组的表现状态；Tissue为组织；Bladder为膀胱；Kidney为肾；Liver为肝；Lung为肺；Lymph note为淋巴结；Ureter为输尿管；Other为其他；TCGA subtype为癌症基因组图集分型；Basal/SCC-like为基底鳞状细胞样；Genomically unstable为遗传不稳定；Infiltrated为浸润；Uro A为基底样细胞A；Uro B为基底样细胞B)。
图7基于lncRNA分组在其他肿瘤的预后价值分析示意图(其中overall survivalprobability总生存率；immune-Functional class为免疫有功能型；immune-nonfunctional class为免疫无功能型；横坐标为生存时间(月份)；No at risk为死亡风险数；Lung squamous cell carcipoma为肺鳞癌；Bladder cancer为膀胱癌；Melanoma为黑色素瘤)。
图8CTL与免疫分子相关性热图。
图9CTL表达量与患者生存预后关系分析图(overall survival probability总生存率；immune-Functional class为免疫有功能型；immune-nonfunctional class为免疫无功能型；横坐标为生存时间(月份)；No at risk为死亡风险数；Lung adenocarcinoma为肺腺癌；Breast cancer为乳腺癌；HER2 positive breast cancer为Her2阳性型乳腺癌；Bladder cancer为膀胱癌；Melanoma为黑色素瘤；High CTL为细胞毒性T淋巴细胞高表达；Low CTL为细胞毒性T淋巴细胞低表达)。图10基于lncRNA-CTL分型中膀胱癌患者生存曲线分析图(其中overall survival probability为总生存率；横坐标为生存时间(月份)；Noat risk为死亡风险数；)。
图11基于lncRNA-CTL分型中膀胱癌患者治疗反应率比较示意图(其中weight为权重；response为反应；no respone为无反应；Immune-Active为“免疫激活型”、Immune-Exclusion为“免疫驱逐型”、Immune-Dysfunctional为“免疫失调型”、Immune-Desert为“免疫沙漠型”)。
图12基于lncRNA-CTL分型中免疫分子表达模式示意图(其中lncRNA为长的非编码RNA；immune-Functional class为免疫有功能型；immune-nonfunctional class为免疫无功能型；response为治疗反应；no respone为无反应；response为反应；Unknow为不明确；Sex为性别；Female为女性；Male为男性；ECOG-PS为东部合作肿瘤小组的表现状态；Tissue为组织；Bladder为膀胱；Kidney为肾；Liver为肝；Lung为肺；Lymph note为淋巴结；Ureter为输尿管；Other为其他；TCGA subtype为癌症基因组图集分型；Basal/SCC-like为基底鳞状细胞样；Genomically unstable为遗传不稳定；Infiltrated为浸润；Uro A为基底样细胞A；Uro B为基底样细胞B；Immune-Active为“免疫激活型”、Immune-Exclusion为“免疫驱逐型”、Immune-Dysfunctional为“免疫失调型”、Immune-Desert为“免疫沙漠型”)。
图13基于lncRNA-CTL分型中分组基因表达模式示意图(其中lncRNA为长的非编码RNA；immune-Functional class为免疫有功能型；immune-nonfunctional class为免疫无功能型；response为治疗反应；no respone为无反应；response为反应；Unknow为不明确；Sex为性别；Female为女性；Male为男性；ECOG-PS为东部合作肿瘤小组的表现状态；Tissue为组织；Bladder为膀胱；Kidney为肾；Liver为肝；Lung为肺；Lymph note为淋巴结；Ureter为输尿管；Other为其他；TCGA subtype为癌症基因组图集分型；Basal/SCC-like为基底鳞状细胞样；Genomically unstable为遗传不稳定；Infiltrated为浸润；Uro A为基底样细胞A；Uro B为基底样细胞B；Immune-Active为“免疫激活型”、Immune-Exclusion为“免疫驱逐型”、Immune-Dysfunctional为“免疫失调型”、Immune-Desert为“免疫沙漠型”)。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例1筛选lncRNA
一、数据来源
348例来自IMvigor 210试验(NCT02951767/NCT02108652，http://research-pub.gene.com/IMvigor210CoreBiologies)的PD-L1抑制剂阿妥珠单抗治疗的膀胱癌患者和70例黑色素瘤患者来自TCGA免疫治疗队列(https://xenabrowser.net/datapages/？cohort＝GDC％20TCGA％20Melanoma％20(SKCM)&removeHub＝https％3A％2F％2Fxena.treehouse.gi.ucsc.edu％3A443)。此外，我们在TCGA中纳入了来自多队列研究的513例肺腺癌(LUAD)患者，493例肺鳞状细胞癌(LUSC)患者，1082例乳腺癌患者，406例膀胱癌患者和457例黑色素瘤患者。每个研究患者数据均包括其所有的LncRNA基因表达、CTL表达量、肿瘤微环境免疫分子表达和基因表达及患者的生存预后信息数据。
二、lncRNA筛选
通过对来自IMvigor210试验的348个接受免疫治疗的膀胱癌患者的421个lncRNA进行单变量Cox回归模型检验，当其P值<0.05时便认为该lncRNA与患者的生存具有显著相关性。由此，我们共筛选出了49个与患者生存具有显著相关性的lncRNA(如图2)。
对上述筛选出的49个lncRNA进行无监督聚类分析(聚类值k为2-5)，最终确定最佳聚类值为k＝2。即我们将筛选出的与生存具有显著相关的49个lncRNA通过无监督层聚类分析，根据lncRNA表达情况将患者分为2组人群(如图3)。
对这无监督聚类为K＝2的两组患者进行生存分析并绘制生存曲线图(如图4)。计算两组患者的生存率可知两组患者整体生存优势具有显著不同(HR＝0.65，95％CI(0.50–0.84)，P＝0.001)。因此，我们将具有良好生存期的新表型称为“免疫功能型”，将具有不良生存期的新表型称为“免疫无功能型”。
统计学方法
无监督聚类分析采用使用R语言CancerSubtypes软件包进行。组间生存分析使用Kaplan-Meier估计方法进行，并与对数秩检验进行了比较。生存率比较根据Cox回归模型，通过危险比(HR)和95％置信区间(Cls)进行。分组分析中，两组间定性变量差异显著性比较采用χ2或Fisher精确检验，两组间连续变量差异显著性比较采用用Wilcoxon秩和检验或Kruskal-Wallis精确检验进行多次比较，使用R语言survminer软件包生成了连续变量的最佳截止值。使用矩阵相关分析和加权线性回归模型来估计与Pearsonρ的相关强度。基因共表达网络采用对标准差>1的基因经过权重共表达网络分析(WGCNA)筛选出每个亚型的差异基因。对于所有分析，P值小于0.05被认为具有统计学意义。所有分析均使用R语言(版本3.6.1)进行统计分析。
三、基于lncRNA分型的免疫分子微环境描述
我们对上述两组患者的微环境免疫分子表达进行统计整理并进行描述(如图5)。通过聚类分析生成热图发现，与免疫无功能型相比，免疫功能型分类组通常以免疫细胞，免疫检查点和人白细胞抗原的较高表达为特征(如图6)。
实施例2lncRNA在泛瘤肿中的验证分析
对我们前述所获取的其他瘤肿患者数据，包括两组黑色素瘤患者(70例和457例)、肺腺癌患者513例、493例肺鳞状细胞癌患、1082例乳腺癌患者和406例膀胱癌患者，对实施例1的过程进行重复验证分析。结果显示，在肺腺癌、膀胱癌和黑色素瘤中具有预后意义(肺腺癌：HR＝0.75，95％CI(0.57-0.99)，P＝0.038；膀胱癌：HR＝0.68，95％CI(0.51-0.92)，P＝0.011；黑色素瘤：HR＝0.62，95％CI(0.47–0.81)，P<0.001)(如图7)。因此，该lncRNA及分型方法对泛瘤种患者的抗肿瘤免疫治疗疗效和预后预测具有意义。
实施例3联合CTL(细胞毒性T淋巴细胞)表达量分型
根据目前研究发现CTL表达与多种免疫分子密切相关，包括多种免疫细胞、免疫检查点和人类白细胞抗原(见图8)。因此，我们尝试对包括膀胱癌、肺腺癌、乳腺癌、Her-2阳性乳腺癌、黑色素瘤等多个肿瘤进行相关生存预后分析，并绘制生存曲线图(如图9)。结果发现，CTL的表达量与患者的预后具有显著相关性，与CTL低表达相比，患者CTL高表达具有显著的生存优势。
由上，我们尝试联合lncRNA分组分型和CTL表达量进一步分层聚类将TCGA队列中的膀胱癌患者深入分为四组，包括lncRNA功能型-CTL高表达、lncRNA功能型-CTL低表达、lncRNA无功能型-CTL高表达和lncRNA无功能型-CTL低表达。在基于lncRNA-CTL分型情况下对患者在此进行生存曲线分析，四组患者的生存优势比较结果具有统计学意义(HR＝0.77，95％CI(0.67–0.88)，P<0.002)，四组的免疫治疗反应率分别为：41.2％，28.1％，20.0％，7.1％(如图10)。具有高免疫渗透性的对免疫疗法敏感的患者具有最大的OS获益，我们将其称为“免疫激活型”。免疫渗透率低的对免疫有功能调节的患者甚至比免疫渗透率高的对免疫无功能调节的患者表现出更好的生存率，后者分别被称为“免疫驱逐型”和“免疫失调型”(如图11)。免疫浸润低的免疫无功能调节类别患者表现出最差的生存率，被称为“免疫沙漠型”。免疫激活型和免疫失调型的特征通常是免疫细胞，免疫检查点和人类白细胞抗原的表达高于免疫驱逐型和免疫沙漠型。由此说明，该分型方法可以较好的预测患者进行免疫治疗后的疗效与预后，具有极大的临床应用价值。
应用基因共表达网络分析进行分型微环境描述
最后，我们通过基因共表达网络分析对我们所建立的基于lncRNA-CTL临床肿瘤免疫亚型分类的四个分型进行免疫分子与基因表达微环境描述。与免疫驱逐型和免疫沙漠型相比，免疫激活型和免疫失调型通常以免疫细胞，免疫检查点和人白细胞抗原的较高表达为特征(如图12)。此外，使用与通过加权基因共表达网络数据分析检测到的每个基于lncRNA-CTL的类别最相关的基因模块，我们发现了这四个类别之间不同的基因表达模式(如图13)。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (2)

1.一组肿瘤免疫分型的长链非编码RNA(lncRNA)标记物，其特征在于，由ZNF503-AS2、USP3-AS1、UBA6-AS1、RNF217-AS1、RAMP2-AS1、NKLA、LIPE-AS1、LINC01605、HOXB-AS1、FIX、FLG-AS1、BRWD1-AS2、ATP2A1-AS1、ASB16-AS1、AP000251-1、AL513365-2、AL391422-3、AL358472-5、AC113382-1、AC093249-6、AC012636-1、TMEM147-AS1、SLFNL1-AS1、AC002116-2、VOA9D1-AS1、USP2-AS1、TTN-AS1、TMEM254-AS1、SNHG8、SNHG4、SNHG15、SBF2-AS1、PRNCR1、PCAT1、NOP14-AS1、LINC01118、LINC00937、FGD5-AS1、EMC1-AS1、DLGAP1-AS1、CDKN2B-AS1、BVES-AS1、AC107959-4、SCN1A-AS1、MIRLE7BHG、LINC01361、FUT8-AS1、BHLHE40-AS1和AC009961-1组成。
2.如权利要求1所述的长链非编码RNA标记物在制备预测抗肿瘤免疫治疗疗效和预后的产品中的应用。
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