CN108884494A - 转移性疾病中循环肿瘤细胞的单细胞基因组图谱分析以表征疾病异质性 - Google Patents
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Abstract
本披露提供了一种检测癌症患者中疾病的异质性的方法，该方法包括(a)进行直接分析，其包括针对获自该患者的血液样本中的有核细胞的免疫荧光染色和形态表征以确认和计数循环肿瘤细胞(CTC)；(b)从该样本中分离该CTC；(c)单独表征基因组参数以生成该CTC中每一种的基因组图谱，以及(d)基于该图谱确定该癌症患者中疾病的异质性。在一些实施方式中，该癌症是前列腺癌。在一些实施方式中，该前列腺癌是激素难治性的。
Description
本申请要求2016年6月2日提交的美国临时申请号62/344,703以及2016年1月6日提交的美国临时申请号62/275,659的权益，所述申请其各自的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明一般涉及癌症诊断领域，并且更具体地涉及用于循环肿瘤细胞(CTC)的单细胞基因组图谱分析以表征疾病异质性的方法。
背景技术
在连续的癌症疗法之后，出现多个癌细胞亚群，每个亚群具有可能赋予耐药性或易感性的不同遗传畸变。组织活检可能无法检测到这些亚群，但血液的液体活检可以帮助识别这些重要的肿瘤细胞，并表征患者的肿瘤如何随着时间的推移已演变。单细胞基因组图谱分析是一项用于研究癌症的进化和多样性以及了解罕见细胞在肿瘤进展中的作用的强大新工具。克隆多样性注定将在侵袭、转移和抵抗疗法的进化中发挥重要作用。
在美国(US)，前列腺癌是最常诊断的实体器官恶性肿瘤，并且仍然是美国男性中癌症死亡的第二主因。仅在2014年，预计的前列腺癌发病率为233,000例，其中29,480位男性死亡，这使得转移性前列腺癌疗法确实成为未满足的医疗需求。Siegel等人,2014.CACancer J Clin.2014；64(1):9–29。来自欧洲的流行病学研究显示可比数据，其中2012年估计发病率为416 700例新病例，占男性癌症诊断的22.8％。总共预计有92 200例特定的前列腺癌死亡，使其成为男性最有可能2862致死的三种癌症之一，其中死亡率为9.5％。
尽管使用化学或手术去势对前列腺癌的荷尔蒙疗法已经证明是成功的，但大多数患者最终还是会进展至转移并显示出对进一步激素操纵的抵抗性的疾病阶段。这被称为转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)。然而，尽管如此命名，还是有证据表明在mCRPC中可以持续存在雄激素受体(AR)介导的信号传导和基因表达，即使在面对去势的雄激素水平时也是如此。这可能部分归因于与雄激素合成的酶的上调，AR的过度表达或伴随着各种甾体配体的混杂识别的突变AR的出现。在20-30％的mCRPC中发现的雄激素受体(AR)-基因扩增的进展被认为是激素剥夺疗法的结果，并且是治疗失败的主要原因。对mCRPC患者的治疗仍然是一个重大的临床挑战。研究进一步阐明了PI3K-AKT-mTOR和雄激素受体(AR)信号轴(signaling axis)之间的直接联系，揭示了激素抵抗进展过程中这些途径之间的动态相互作用。PTEN是人前列腺癌中最常被删除/突变的肿瘤抑制基因之一。作为PI3K/AKT/mTOR途径的脂质磷酸酶和负调节因子，PTEN控制着许多细胞过程，包括存活、生长、增殖、代谢、迁移和细胞结构。PTEN缺失可以用作前列腺癌的诊断和预后生物标志物，以及预测患者对新兴的PI3K/AKT/mTOR抑制剂的响应。
在2004年之前，没有任何治疗证明可以提高mCRPC男性患者的存活率。用米托蒽醌，用泼尼松或氢化可的松对患者的治疗仅仅是为了减轻疼痛并改善生活质量，但在总生存期(OS)方面没有益处。2004年，两项主要的3期临床试验TAX 327和SWOG(西南肿瘤组织)9916的结果确立了(多西他赛)作为mCRPC患者的主要化学治疗选择。已经针对mCRPC研究了利用雄激素受体(AR)靶向疗法、化学疗法、联合疗法和免疫疗法的额外激素治疗，并且最近的结果为这个难以治疗的患者群提供了额外的选择。随着仅在过去5年中测试和批准用于治疗转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)患者的新型药剂的指数增长的出现，已经出现了关于这些药剂的最佳排序或组合的问题。在最佳排序方法方面帮助指导临床医生的指南有几条，而且大多数可就症状的存在或缺乏、表现状态以及疾病负担做出评估，以帮助确定这些药剂的最佳排序。Mohler等人,2014,J Natl Compr Canc Netw.2013；11(12):1471–1479；Cookson等人,2013,J Urol.2013；190(2):429–438。目前，批准的治疗方法包括紫杉烷类细胞毒性剂，如(多西他赛)和(卡巴他赛)，以及抗雄激素激素治疗药物，如(arbiterone，阻止雄激素产生)或(恩杂鲁胺，一种雄激素受体(AR)抑制剂)。
临床医生面临的挑战是决定施用这些疗法的最佳顺序以向患者提供最大的益处。对先醋酸阿比特龙后恩杂鲁胺或者先恩杂鲁胺后醋酸阿比特龙的依次使用的响应较不频繁且持续时间较短。基于紫杉烷的化学疗法是否比第二抗雄激素的激素疗法更有益是一个关键问题。然而，治疗失败仍然是基于患者对各种疗法的异质响应以及来自每种药剂的交叉抗性的重大挑战。Mezynski等人,Ann Oncol.2012；23(11):2943–2947；Noonan等人,AnnOncol.2013；24(7):1802–1807；Pezaro等人,Eur Urol.2014,66(3):459–465。此外，患者可能会错过从被证明可提供总体生存获益的每种药物中获得实质性益处的治疗窗。因此，确认最有可能从目标疗法中受益的目标人群的更好方法仍然是一个重要目标。
聚ADP-核糖聚合酶(PARP)抑制剂(PARPi)已经在mCRPC、乳腺、卵巢癌症患者和其他具有种系BRCA突变的癌症患者中，并且最近在具有体细胞失活的同源重组(HR)DNA修复途径突变的患者中证实有效(Mateo等人,NEJM,2015；373(18):1697-708；Robinson等人,Cell,2015；161(5):1215-28；Balmana等人,Ann Oncol.2014,25:1656–63；Del Conte等人,Br J Cancer,2014,111:651–9)。目前检测HR缺陷(HRD)的方法需要根据新鲜或存档肿瘤活检进行基因组分析，以检测指示HRD的失活突变或基因组瘢痕(LST、NtAI或LOH)(Abkevich等人,Br J Cancer,2012Nov 6,107(10):1776-82)。HRD基因组生物标志物在10-20％的患者群体中普遍存在(Marquard等人,Biomark Res.2015年5月1日,3:9)。
最近还已经在阐明HRD基因型与对铂药剂的敏感性之间的关系方面取得了重大进展。一项回顾性分析汇总了来自PrECOG 0105、顺铂-1和顺铂-2试验的样本，其显示MyriadHRD评分与三阴性乳腺癌(TNBC)中新佐剂铂药剂的完全病理反应高度相关(Telli等人Clinical cancer research:An Official Journal of the American Association forCancer Research.2016)。在佐剂(Vollebergh等人Breast Cancer Res.2014,16(3):R47)和转移性(Isakoff等人J.Clinical Oncol.,2015,33(17):1902-9)设置中，显示相比TNBC和激素受体阳性乳腺癌的其他队列，HRD与铂剂的有利结果高度相关。
由于活检材料的不可获得性/不可用性(即骨转移)以及存档的原发性肿瘤样本与新鲜活检的不良相关性，根据实体肿瘤活检来测量HRD可能是有问题的(Punnoose等人,BrJ Cancer.2015Oct 20；113(8):1225-33)。存档和新鲜活检之间的低一致性主要归因于响应于先前的治疗干预，时间克隆演变导致肿瘤内和细胞间高度异质性，从而导致空间异质性并且最终导致多克隆疾病的欠取样。
循环肿瘤细胞(CTC)代表癌症诊断中的显着进步，而其非侵入性测量甚至使其更具吸引力。Cristofanilli等人,N Engl J Med 2004,351:781-91。从原发性肿瘤或其转移部位释放的CTC具有关于该肿瘤的生物学的重要信息。历史上，血流中CTC的水平极低，再加上其表型未知，这严重阻碍了它们的检测并限制了它们的临床效用。为了利用它们的信息，最近已经出现了各种用于CTC的检测、分离和表征的技术。CTC有可能提供一种在治疗过程中实时评估进展性癌症的非侵入性手段，并进一步地，通过监测治疗响应中出现的表型生理和遗传变化来帮助指导治疗。在大多数晚期前列腺癌患者中，原发性肿瘤已被移除，并且预期CTC由转移酶脱落的细胞组成，从而提供“液体活检”。虽然CTC通常定义为EpCAM/细胞角蛋白阳性(CK+)细胞，CD45-，但在形态学上截然不同，最近的证据表明存在其他CTC候选群体，包含EpCAM/细胞角蛋白阴性(CK-)细胞或比传统CTC更小的细胞。这些关于CTC群体异质性的研究结果表明，无富集CTC平台有利于基于阳性选择技术，该技术根据大小、密度或EpCAM阳性分离CTC，容易忽视重要CTC亚群。
CRPC对患有这种晚期形式的前列腺癌的患者和管控这些患者的临床医生都提出了严重的挑战。临床医生通常面临的问题是提供对导致疾病恶化的机制的全面诊断和评估，以努力指导适当和个体化的治疗。通过确认适当的治疗和预后指标，靶向疗法的潜在临床益处得以增加，并且临床医生能够更好地控制CRPC，改善患者的生活质量，并增强临床效果。需要了解个别CTC中的亚克隆CNV驱动基因改变的频率和基因组不稳定性，结合细胞表型，以使得能够更准确地观察异源疾病，预测治疗响应并确认新型的抗性机制。需要对抗雄激素的激素疗法和基于紫杉烷的化学疗法敏感的预测性生物标志物，每次需要决定选择疗法时，可以在个体患者中评估该生物标志物。本发明解决了这种需要并提供了相关的优点。
发明概述
本发明提供了一种检测癌症患者中疾病的异质性的方法，该方法包括(a)进行直接分析，其包括针对获自该患者的血液样本中的有核细胞的免疫荧光染色和形态表征以确认和计数循环肿瘤细胞(CTC)；(b)从该样本中分离该CTC；(c)单独表征基因组参数以生成该CTC中每一种的基因组图谱，以及(d)基于该图谱确定该癌症患者中疾病的异质性。在一些实施方式中，该癌症是前列腺癌。在一些实施方式中，该前列腺癌是激素难治性的。
本发明提供了一种检测癌症患者中疾病的表型异质性的方法，该方法包括(a)进行直接分析，其包括针对获自该患者的血液样本中的有核细胞的免疫荧光染色和形态表征以确认和计数循环肿瘤细胞(CTC)；(b)检测每种所述CTC的多种形态学和蛋白质表达特征的存在以确认CTC亚型，以及(c)基于所述CTC亚型的数目确定该癌症患者中疾病的表型异质性。在一些实施方式中，高表型异质性确认对雄激素受体靶向疗法有抗性的患者。在一些实施方式中，高表型异质性与对基于紫杉烷的化学疗法的抗性无关。在一些实施方式中，该方法进一步包括检测由大核、高核熵和频繁核仁表征的CTC亚型。在相关的实施方式中，检测由大核、高核熵和频繁核仁表征的该CTC亚型的流行，其中所述流行与雄激素受体靶向疗法和基于紫杉烷的化学疗法的不良结果相关。
在一些实施方式中，有核细胞的该免疫荧光染色包括广谱细胞角蛋白、分化簇(CD)45、二脒基-2-苯基吲哚以及二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)。
在一些实施方式中，该基因组参数包括拷贝数变异(CNV)标签。在一些实施方式中，该CNV标签包括基因扩增或删除。在一些实施方式中，该基因扩增包括AR基因的扩增。在一些实施方式中，该删除包括磷酸酶和张力蛋白同源物基因(PTEN)的缺失。在一些实施方式中，该CNV标签包括与雄激素非依赖性细胞生长相关的基因。
在一些实施方式中，该基因组参数包括基因组不稳定性。在一些实施方式中，该基因组不稳定性通过测量大规模转换(LST)来表征。在一些实施方式中，该基因组不稳定性通过测量基因组改变百分比(PGA)来表征。
本发明进一步提供了一种基于癌症患者中循环肿瘤细胞(CTC)的表型分析来确定LST评分的方法，该方法包括(a)进行直接分析，其包括针对获自该患者的血液样本中的有核细胞的免疫荧光染色和形态表征以确认和计数CTC；(b)检测每种所述CTC的多种形态学和蛋白质表达特征的存在以确认CTC亚型，以及(c)基于一个或多个CTC亚型的频率确定该癌症患者的LST评分。在一些实施方式中，该特征选自表1中列出的特征。在一些实施方式中，该特征包含N/C比率、核&细胞质循环度(circularity)、核熵、CK表达和激素受体表达，例如AR表达。在一些实施方式中，该特征包括核面积、核凸面积、核斑点、核主轴、细胞质面积、细胞质凸面积、细胞质短轴、AR表达、细胞质主轴。在一些实施方式中，该癌症是前列腺癌。在一些实施方式中，该前列腺癌是转移性激素抗性前列腺癌(mCRPC)。
在一些实施方式中，高LST评分进一步预测对ARS疗法的抗性。在进一步的实施方式中，高LST评分预测对PARPi+ARS疗法的响应和/或敏感性。在另外的实施方式中，高LST评分预测对铂基药剂治疗的响应。在一些实施方式中，在随访样本中检测到的高LST评分预测疾病进展、疾病复发和/或获得性抗性。在最初响应于ARS疗法的患者中，随访样本中的高LST评分预测获得性抗性和疾病进展。在最初响应于PARPi+ARS疗法的患者中，随访样本中的高LST评分预测疾病复发和/或进展。
根据发明详述，以及根据权利要求书，本发明的其他特征和优点将是显而易见的。
附图说明
图1A示出了对标准Epic CTC分析过程的描述。使用多参数数字病理学算法分析图像以检测CTC候选者并定量蛋白质生物标志物表达水平。CTC分类显示在基于网络的报告中，并由经过培训的技术人员确认。图1B显示了对CTC恢复和基因组图谱分析工作流程的描述。单个细胞分离、进行全基因组扩增，以及NGS文库制备。在Illumina NextSeq 500上执行测序。
图2提供了执行的生物信息学分析的图。对原始FASTQ文件进行评估并进行质量过滤。读数与hg 38参考基因组(UCSC)比对，去除PCR重复，并通过MAPQ得分30过滤。对过滤后读数>250K的样本进行拷贝数改变的分析。过滤后的比对文件用Epic的拷贝数管道(Epic’sCopy Number Pipelines)进一步分析。一条管道用于使用1M bp窗口估算基因组不稳定性，而另一条用于基因特异性拷贝数测量。1LST：至少10Mb的邻近区域之间的染色体断裂的数目。2PGA：携带拷贝数改变(扩增或删除)的患者的基因组百分比。
图3A-3D示出了单个细胞中的拷贝数变异(CNV)。分别从LNCaP、PC3和VcaP(图3A-3C)中分离单个细胞并通过全基因组测序对其进行拷贝数变异的分析。扩增和删除可以在重复中可再现地观察。还示出了每种细胞系的代表性图像。细胞用CK混合物、AR、CD45和DAPI染色。此处示出了每种细胞系的5个重复，以证明可再现性。图3D中描述了来自每种细胞系的已知基因组改变。用Circos生成绘图：Krzywinski,M.等人Circos:an InformationAesthetic for Comparative Genomics.Genome Res(2009)19:1639-1645。
图4A-4B示出了CNV并且图4C-4D示出了基因组不稳定性测量。图4A示出了3种代表性细胞系和健康供体白细胞(WBC)对照中AR的log2基因组拷贝数的比较。VCaP含有AR的扩增，而LNCaP和PC3保持有AR的2个拷贝。图4B示出了3种代表性细胞系和健康供体WBC对照中PTEN的log2基因组拷贝数的比较。证实了PC3纯合PTEN的缺失，在具有显着z-分数的许多细胞中观察到LNCaP杂合PTEN的缺失。图4C示出了3种代表性细胞系和健康供体WBC对照中的断点#(LST)的比较。与LNCaP(wt p53和杂合PTEN缺失)和WBC对照相比，在PC3(PTEN无效，p53突变体)和VCaP(p53突变体)中检测到的断点数量更多。图4D示出了在3种代表性细胞系和健康供体WBC对照中改变的基因组的％的比较。PC3示出了最高的改变百分比，揭示了可能由PTEN和p53两者的缺失导致的遗传不稳定性和多倍性。
图5示出了用于通过形态学/蛋白质化学(面部识别)按单细胞水平分离和分析CTC的“无细胞选择”平台的示意图。
图6示出了在确定CTC的蛋白质和形态特征之后，在患者样本中确认的每个CTC上测量一系列单个细胞特征，包含核面积以及表中列出的其他特征。
图7示出了右侧的热图，其中15个细胞类型由y轴上的颜色和x轴上的各个特征限定。红色反映了动态范围低端(即小核面积)的特征，而绿色反映了动态范围高端(即大核面积)的特征。
图8示出了基于每个决策点上细胞的异质或多样程度对患者进行排序。
图9示出了mCRPC群体的人口统计学特征。
图10示出了15种不同的表型CTC类别的频率因治疗线而不同，并且随时间变化更加不均匀。红色表示过度表达或更多样化的细胞类型的流行。每列表示患者，使得具有许多垂直红色切片的列具有更高的表型异质性。
图11示出了较高的香农指数显示按治疗线的更大的多样性(异质性)，特别是中位数的增加，以及第3和第4治疗线中更少更低的指数评分。
图12A示出了高CTC表型异质性预测AR疗法但不是紫杉烷疗法的进展和存活时间较短。图12B示出了基于异质性的AR Tx的结果。
图13示出了在多变量模型中，高CTC表型异质性预测紫杉烷相比AR Tx具有更好的结果。在单变量和多变量分析中研究了先前显示为存活预后的一系列因素-仅示出了多变量。预测对紫杉烷的敏感性相比AR疗法有高异质性。
图14示出了CTC亚型(K型)的流行预测不依赖于AR状态的ARTx和紫杉烷的不良结果。一种特殊的数学定义的细胞类型，K型具有大核、大范围的核尺寸和突出的核仁-其与这两类药物的抗性相关。
图15示出了将CTC扩增，制备用于测序，测序后进行信息学以评估克隆性和扩增/删除的过程的示意图。
图16示出了单细胞CTC测序预示克隆多样性和系统发育疾病谱系。
图17示出了单个CTC CNV图谱预示克隆多样性和系统发育疾病谱系。
图18示出了单个CTC测序还可以预示第二线后紫杉烷患者中克隆多样性的缺乏，该患者可能不会考虑进行ARTx。这个患者对恩杂鲁胺有响应。
图19示出了CTC表型异质性与基因组异质性相关。
图20A示出了细胞类型K基因组学的实例，其特征在于频繁的CNV、大量的断点和伴随的由大核、高核熵和频繁核仁表征的表型。图20B示出了与所有其他CTC表型相比的细胞类型K的基因组不稳定性。
图21示出了高表型异质性是AR-V7阴性患者中的信息生物标志物。
图22示出了在第一线治疗之前来自患者的显示同源基因组图谱的6个CTC中的低表型CTC异质性。
图23示出了利用基于CTC蛋白和形态学特征的无监督分析确认的15种数学CTC表型亚型的热图。
图24A-24O分别描绘了15种细胞类型A-O的选定特征。某些CTC表型亚型预示了患者的生存期。
图25示出了通过CTC计数和15种CTC表型亚型预测ARS(n＝150个样本)的180天死亡情况。良好的预后因子包含细胞类型E(簇5)、K(簇11)和O(簇15)。
图26示出了一些CTC表型亚型(细胞类型E、K和N)预测mCRPC患者对AR靶向疗法的响应。
图27示出了预测对紫杉烷疗法的响应的CTC表型亚型(细胞类型G、K和N)。
图28示出了簇11(细胞类型K)具有大核、高核熵和频繁核仁。
图29示出了多种细胞类型(细胞类型G、K和M)预测基因组不稳定性(LST)。鉴于增加的基因组不稳定性，这些特殊亚型可能对DNA损伤药物敏感，例如铂基化疗剂(即卡铂、顺铂)；或靶向同源重组缺陷的靶向治疗剂，包含聚ADP-核糖聚合酶(PARP)抑制剂、DNA-PK抑制剂和靶向ATM途径的治疗剂。
图30示出了被发现可预测CTC基因组不稳定性的五种形态学和蛋白质表达特征。前四个特征与基因组不稳定性正相关而最后一个特征则是负相关。
图31示出了CK(-)CTC具有较高的基因组不稳定性发生率并且可预测基因组不稳定性。
图32示出了蛋白质和形态学特征可以高精度地预测CTC基因组不稳定性。Y轴显示实际LST(n个断点)以及X轴显示预测的不稳定性(稳定对不稳定)。预测有高基因组不稳定性的CTC可能对DNA损伤药物敏感，例如铂基化疗剂(即卡铂、顺铂)；或靶向同源重组缺陷的靶向治疗剂，包含PARP抑制剂、DNA-PK抑制剂和靶向ATM途径的治疗剂。
图33示出了表型异质性可预测总生存期和对AR靶向疗法的响应。
图34示出了CTC表型异质性可预测基因型异质性。高表型异质性代表多个基因组克隆的可能性是低表型异质性的40倍。
图35示出了CTC基因组不稳定性可预测mCRPC患者的总生存期。
图36示出了CTC基因组不稳定性可预测mCRPC患者对紫杉烷疗法的响应。
图37A-37C示出了作为基因组不稳定性的替代物测量的大规模状态转换(LST)和基因组改变百分比(PGA)。LST：至少10Mb的邻近区域之间的染色体断裂的数目。Popova等人,Cancer Res.72(21):5454-62(2012)。PGA：携带拷贝数改变(扩增或删除)的患者的基因组百分比。Zafarana等人,Cancer 2012Aug；118(16):4053(2012)。实例：高LST(27)和高PGA(23％)。
图38示出了描绘每个成像特征(沿着y轴)的相关系数的值以预测aLST的图表。较接近0的相关系数表示与aLST没有呈正/负趋势的特征。值>>0或<<0表示与aLST呈强烈正或负趋势的特征，因此可能更能预测aLST。
图39示出了来自具有种系BRCA2突变或其他HRD(同源重组缺陷)途径基因有害突变的mCRPC患者的CTC通常具有高得多的LST得分，在我们的研究中观察到中位数得分超过40。下图示出了三个BRCA2或HRD突变体(Mt)样本(CR.1、H_PR.1和H_PR.2)相比其余样本具有最高的LST。具有高LST评分(中位数LST>30)的mCRPC患者对PARPi+ARS(AR信号抑制剂，包含阿比特龙和恩杂鲁胺)疗法响应良好，具有完全的响应或>90％的响应。CR：完全的响应；H_PR：>90％的响应；PR：>50％的响应；SD：疾病稳定；xPD：进展。
图40示出了具有高LST评分(中位数LST>30)的mCRPC患者唯独对ARS疗法有抗性。
图41A-41B示出了对PARPi+ARS疗法有抗性而共同出现AR增益和PTEN损失的两名患者的热图。在30名mCRPC患者的队列中，有两名患者同时出现AR增益和PTEN丢失。这两名患者均对PARPi+ARS疗法有抗性。
图42A-42E示出了对于用PARPi+ARS治疗的mCRPC患者，在该患者对疗法有响应的时间点，随访抽血CTC不具有高LST CTC。这表明高LST CTC对疗法敏感，并且可以用作响应标记物。图42A至42E对应于五个患者实例。
图43A-43B示出了对于用PARPi+ARS治疗的mCRPC患者，在该患者疾病进展的时间点，随访抽血CTC确实具有高LST CTC。这表明高LST CTC是疾病进展或复发的指标。参见以下两个患者实例。图43A，患者120109-084对PARPi+ARS具有短期响应，并且当采集随访(“进行性疾病”)样本时疾病复发。图43B，患者210109-168对PARPi+ARS疗法没有响应，并且在第12和16周采集了两个抽血样本。
图44示出了对于单独用ARS治疗的mCRPC患者，在该患者对疗法有响应的时间点，随访抽血CTC仍然具有高LST CTC。这表明高LST CTC对ARS疗法不敏感。可能需要其他疗法(例如PARPi)或与PARPi联合的疗法。
图45A-45B示出了具有高基因组瘢痕(genomic scarring)形成(例如LST和LOH)的细胞系更可能是PARPi敏感的。2个BRCA突变且PARPi敏感性TNBC细胞系(HCC1395和MB436)具有比BRCA野生型PTEN和TP53突变TNBC细胞系(MB231)高得多的LST评分(图45A)和LOH评分(图45B)。
图46示出了LST与表型细胞类型相关。细胞类型B、D、E、G、K、L、M和O具有比其他细胞类型更高的LST。
图47A-47C证明了LST可以通过使用CTC表型特征(包含N/C比率、核&细胞质循环度、核熵、CK表达和AR表达)的回归算法预测。AR表达数据是优选的，但在预测模型中是可选的。LST预测模型在独立的前列腺和乳腺癌队列上进行测试，准确度为78％。按患者水平，在确定患者LST分类(高或低)时，aLST和pLST之间的一致率为95％(38个样本中有36个一致)。高LST患者被定义为患有至少四个CTC且pLST>0.37或aLST>8的患者。图47A示出了通过测序(x)的实际LST评分与通过算法(y)的预测LST(pLST)评分的对比。图47B示出了具有宽范围LST的细胞图像的实例。这些图中的aLST和pLST两者都是log10转化并且Z标度归一化的(图47C)。
图48A-48B示出了具有高pLST的患者对AR靶向疗法具有抗性。在具有高LST的第一线mCRPC患者中，43％(6/14)的患者对AR靶向疗法有响应。在同时具有基线和随访样本(<18周)的7名患者中，高pLST的数量从基线中的35个细胞上升至随访样本中的122个(320％)。参见来自两个独立mCRPC队列的实例数据。
图49示出了最初对AR靶向疗法有响应的具有低pLST的患者可能在随访样本中检测到高pLST CTC，这表明有疾病进展和获得性抗性。
图50A-50B示出了具有高pLST的患者对PARPi+ARS疗法响应良好。图50A示出了，在具有高LST的第一线mCRPC患者中，88％(15/17)患者对PARPi+AR靶向疗法有响应。图50B示出了，在具有基线和随访样本(<18周)的20名患者中，高pLST的数量从基线中的635个细胞下降至随访样本中的33个(下降95％)。
图51示出了具有高pLST的患者对PARPi+ARS疗法有响应，并且随着时间的推移，高pLST CTC群体落入随访样本范围内。这表明pLST可用作监测药物响应的生物标志物。
图52A-52B示出了具有高pLST的mCRPC患者对铂基药剂治疗有响应。图52A示出了来自具有96％基线CTC作为高pLST的一个第10线mCRPC患者的细胞图像，并且该患者对卡铂疗法有响应(12周PSA变化：-50.1％)。图52B示出了来自具有4.3％基线CTC作为高pLST的一个第8线mCRPC患者的细胞图像，并且该患者对卡铂疗法没有响应(12周PSA变化：+2.1％)。
图53示出了在总生存期分析中具有高pLST的患者对紫杉烷疗法具有抗性。有利组包含<6个高pLST CTC的患者而不利组包含>＝66个高pLST CTC的患者。
图54A示出了具有细胞形态特征的pResist与表型细胞类型之间的相关性。图54B示出了高低pResist细胞对比的细胞图像的实例。分类器中使用的最重要的特征包含核面积、核凸面积、核斑点、核主轴、细胞质面积、细胞质凸面积、细胞质短轴、AR表达、细胞质主轴。细胞类型K、C和M具有比其他细胞类型更高的pResist。
图55示出了许多pResist细胞是CK-CTC，这表明了它们的EMT起源。
图56A-56B描绘了纵向研究，其示出了在仅ARS或PARPi+ARS患者中，所有患者的pResist细胞均呈向上趋势。
发明详述
本披露部分地基于以下发现：整合的单细胞全基因组CNV分析提供
跨越多个重复的可再现的拷贝数图谱，并确认了已知的局灶性CNV事件(包含AR扩增和PTEN缺失)的存在。本披露进一步部分地基于以下发现：全基因组拷贝数分析可以用于通过测量LST和PGA来可再现地表征基因组不稳定性。如本文所披露的，与野生型(LNCaP)相比，在p53突变细胞系(PC3&VCaP)中检测到基因组不稳定性最高。了解个别CTC中的亚克隆CNV驱动基因改变的频率和基因组不稳定性，结合细胞表型，可以使得能够更准确地观察异源疾病，潜在的治疗响应并确认新型的抗性机制。
本发明进一步基于罕见CTC亚型的确认，即使仅构成总CTC群体的一小部分，该罕见CTC亚型也预测较短的总生存期和药物抗性。如下面进一步描述的，本发明的方法进一步部分地基于通过人工智能算法对罕见CTC亚型的惊人确认，该算法基于20个离散的形态学和蛋白质表达特征对CTC进行分类，并且在患者子集中发现。在血液中含有这种类型的CTC的患者的医疗记录中，所有的疗法对他们普遍无效而且他们经历了更短的总生存期。如本文所例示的，这种CTC亚型的后续基因组测序发现细胞共享与其他CTC不同的基因组特征，这证实了可通过视觉分析推断CTC的基因组特征。
肿瘤内异质性的增加与对疗法的内在抗性和不良后果相关。已示出了CTC反映转移性患者中的异质性疾病和活性转移性肿瘤群体。本文中列示了在逐个细胞的基础上对CTC中的异质性的分析，并且令人惊讶地发现，异质性是能够更好地对可用疗法进行排序的治疗管控中决策点上的敏感预测性生物标志物。本文所述的非富集CTC分析平台通过允许异质CTC群体的单细胞分辨率和准确的基因组图谱分析来实现本发明的方法。为了表征肿瘤内异质性，使用非富集CTC分析平台执行循环肿瘤细胞(CTC)的单细胞全基因组拷贝数分析。
在掺入血液中以模拟患者样本的个体前列腺癌细胞中检测到治疗敏感性(例如分别针对PI3K抑制剂或AR-靶向疗法的PTEN删除或雄激素受体(AR)扩增)的标记(实施例1)。除了检测局灶性可操作改变之外，还通过测量大规模转换(LST)和基因组改变％(PGA)来表征基因组不稳定性。
如本文所示，按单细胞水平的分析使得能够以不同方式探索异质性。表型或细胞异质性测量从单个克隆中出现的肿瘤细胞中的形态学和逐个细胞基因表达的变化，并且可以检测谱系转换(致瘤性)，例如，雄激素受体(AR)表达的丧失和TMPRSS2:ERG基因融合的检测。iGenotypic异质性检测具有从单个起始树干病变演变而来的不同突变图谱的肿瘤中的单个区域。按单细胞水平的CTC分析的重要应用是指导靶向疗法。如本文所例示的，通过测序和比较多个单细胞，有可能构建肿瘤的克隆亚结构的系统发育树和热图。这些发育树使得能够确认该树的“树干”中的创始突变，这些始祖突变是理想的治疗靶标，因为它们发生在肿瘤进化的早期并且遗传给肿瘤中的所有细胞。替代性地，这些树可以用于设计联合疗法以独立地靶向多个肿瘤亚群。
遗传致瘤性是癌症的使能特征之一，其中多种癌症印记的获得取决于肿瘤细胞的基因组中的一系列改变。这种致瘤性由当时积极选择的其他体细胞突变的持续积累所致。这种高度的遗传变异性为进化优化过程提供了现成的基础，因为亚克隆争夺资源并适应外部压力，如癌症疗法。因此，癌症进展基本上是突变多样化和克隆选择的过程，并且肿瘤由异质亚群组成。本发明的方法允许按单细胞水平进行分析并且能够确认亚克隆群体。
本文描述的方法使得能够通过形态学和蛋白质特征表征转移性癌症患者的血液中的CTC。如本文所例示的，通过荧光显微术并采用细胞分割和特征提取算法测量的这些特征可以为每个确认的细胞形成多个生物标志物。提供的实例显示利用这些特征来表征来自221个转移患者的>9000个CTC，以执行特征集的无监督聚类。这些特征通过主要组分减少，然后聚类成独特的多维子类型。本发明进一步提供了CTC亚型，其是针对常用治疗剂(醋酸阿比特龙、恩杂鲁胺、多西紫杉醇和卡比沙星)的预测抗性和较差存活率的生物标志物。通过测量CTC基因组内的大规模转换(LST)，这种细胞类型的单细胞基因组测序确认了该细胞与其他CTC亚型相比具有增加的基因组不稳定性。鉴于增加的基因组不稳定性，这种特殊亚型对DNA损伤药物敏感，例如铂基化疗剂(即卡铂、顺铂)；或靶向同源重组缺陷的靶向治疗剂，包含PARP抑制剂、DNA-PK抑制剂和靶向ATM途径的治疗剂。先前发现敏感性生物标志物的方法重视对来自患者的组织进行基因组测序以发现HRD基因组学，而本方法赋予了利用数字病理学算法和避免测序的能力。
本文所述的方法和所附实施例证明了单个CTC表型和基因组表征是可行的并且可用于评估患者中的肿瘤异质性。高表型异质性确认了队列中的患者，该患者在阿比特龙&恩杂鲁胺而非紫杉烷化学疗法后死亡风险增加并且具有基因组异质性(多克隆)的可能性超过40倍。如本文所例示的，CTC聚类确认了对ARS和紫杉烷疗法均具有抗性并且基因组不稳定性(高LST断点)增加的CTC亚型。本发明提供了一种非侵入性液体活检，其能够表征来自患有转移性癌症的患者的个体细胞，并且可以用于指导治疗选择。
本披露内容进一步部分地基于LST与表型CTC类型相关的发现。如本文所述，可以通过使用CTC表型特征(包含N/C比率、核&细胞质循环度、核熵、CK表达和激素受体表达)的回归算法预测LST。具体地，分类器中使用的最重要的表型特征包含核面积、核凸面积、核斑点、核主轴、细胞质面积、细胞质凸面积、细胞质短轴、AR表达、细胞质主轴。在一些实施方式中，CTC表型特征用于确定高LST分数对低LST分数。形态学和蛋白质表达特征在本文中统称为“表型特征”。
如本文所述，mCRPC患者中的高LST评分预测对ARS(AR信号抑制剂，包含阿比特龙和恩杂鲁胺)疗法的抗性，包含对ARS疗法的新生抗性以及获得性抗性，其中最初的低LST评分对应于对ARS疗法的响应。如本文所例示的，高LST CTC对ARS疗法不敏感。具体地，如本文所述，在患者对疗法有响应的时间点进行的随访抽血中，用ARS疗法治疗的mCRPC患者仍然具有高LST CTC。
如本文进一步所述的，mCRPC患者中的高LST评分预测对PARPi+ARS疗法的响应。还如本文所述的，mCRPC患者中的高LST评分预测对铂基药剂治疗，例如卡铂疗法的响应。
如本文所披露的，高LST评分预测对PARPi+ARS疗法的敏感性，并且高LST CTC可用作本发明方法中的响应标记。如本文所例示的，用PARPi+ARS治疗的对疗法有响应的mCRPC患者在随访抽血中没有高LST CTC。如本文进一步所述的，高LST CTC是疾病进展或复发的指标。如本文所例示的，在疾病进展的时间点，用PARPi+ARS治疗的mCRPC患者的随访抽血CTC确实具有高LST CTC。
本发明提供了一种基于癌症患者中循环肿瘤细胞(CTC)的表型分析确定LST评分的方法，该方法包括(a)进行直接分析，其包括针对获自该患者的血液样本中的有核细胞的免疫荧光染色和形态表征以确认和计数CTC；(b)检测每种所述CTC的多种形态学和蛋白质表达特征的存在以确认CTC亚型，以及(c)基于一个或多个CTC亚型的频率确定该癌症患者的LST评分。在一些实施方式中，该特征选自表1中列出的特征。在一些实施方式中，该特征包含N/C比率、核&细胞质循环度、核熵、CK表达和AR表达。在一些实施方式中，该特征包含核面积、核凸面积、核斑点、核主轴、细胞质面积、细胞质凸面积、细胞质短轴、AR表达、细胞质主轴。
在一些实施方式中，高LST评分进一步预测对ARS疗法的抗性。在进一步的实施方式中，高LST评分预测对PARPi+ARS疗法的响应和/或敏感性。在另外的实施方式中，高LST评分预测对铂基药剂治疗的响应。在一些实施方式中，在随访样本中检测到的高LST评分预测疾病进展、疾病复发和/或获得性抗性。在最初响应于ARS疗法的患者中，随访样本中的高LST评分预测获得性抗性和疾病进展。在最初响应于PARPi+ARS疗法的患者中，随访样本中的高LST评分预测疾病复发和/或进展。
本发明提供了一种检测癌症患者中疾病的表型异质性的方法，该方法包括(a)进行直接分析，其包括针对获自该患者的血液样本中的有核细胞的免疫荧光染色和形态表征以确认和计数循环肿瘤细胞(CTC)；(b)检测每种所述CTC的多种形态学和蛋白质表达特征的存在以确认CTC亚型，以及(c)基于所述CTC亚型的数目确定该癌症患者中疾病的表型异质性。在一些实施方式中，高表型异质性确认对雄激素受体靶向疗法有抗性的患者。在一些实施方式中，高表型异质性与对基于紫杉烷的化学疗法的抗性无关。在一些实施方式中，该方法进一步包括检测由大核、高核熵和频繁核仁表征的CTC亚型。在相关的实施方式中，检测由大核、高核熵和频繁核仁表征的该CTC亚型的流行，其中所述流行与雄激素受体靶向疗法和基于紫杉烷的化学疗法的不良结果相关。
本发明提供了一种检测癌症患者中疾病的异质性的方法，该方法包括(a)进行直接分析，其包括针对获自该患者的血液样本中的有核细胞的免疫荧光染色和形态表征以确认和计数循环肿瘤细胞(CTC)；(b)从该样本中分离该CTC；(c)单独表征基因组参数以生成该CTC中每一种的基因组图谱，以及(d)基于该图谱确定该癌症患者中疾病的异质性。在一些实施方式中，该癌症是前列腺癌。在一些实施方式中，该前列腺癌是激素难治性的。
在一些实施方式中，有核细胞的该免疫荧光染色包括广谱细胞角蛋白、分化簇(CD)45、二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和激素受体，例如但不限于雄激素受体(AR)、雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)或人表皮生长因子受体2(HER2)。本领域技术人员理解，包含前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌和乳腺癌在内的各种癌症具有与特定激素受体表达相关的亚型，并且可以基于特定癌症选择激素受体。
在一些实施方式中，有核细胞的该免疫荧光染色包括广谱细胞角蛋白、分化簇(CD)45、二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和雄激素受体(AR)。
在一些实施方式中，该基因组参数包括拷贝数变异(CNV)标签。在一些实施方式中，该CNV标签包括基因扩增或删除。在一些实施方式中，该基因扩增包括AR基因的扩增。在一些实施方式中，该删除包括磷酸酶和张力蛋白同源物基因(PTEN)的缺失。在一些实施方式中，该CNV标签包括与雄激素非依赖性细胞生长相关的基因。
在一些实施方式中，该基因组参数包括基因组不稳定性。在一些实施方式中，该基因组不稳定性通过测量大规模转换(LST)来表征。在一些实施方式中，该基因组不稳定性通过测量基因组改变百分比(PGA)来表征。
在一些实施方式中，基于该图谱确定该癌症患者中疾病的异质性确认疾病的新机制。
在一些实施方式中，基于该图谱确定该癌症患者中疾病的异质性预测对治疗的积极响应。
在一些实施方式中，基于该图谱确定该癌症患者中疾病的异质性预测对治疗的抗性。
必须注意，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非内容另外明确指明，否则单数形式“一种”、“一个”和“该”包含复数指代。因此，例如，对“生物标志物”的提及包含两种或更多种生物标志物等等的混合物。
术语“约”，特别是关于给定的量时，意在涵盖正或负百分之五的偏差。
如在包含所附权利要求书的本申请中所使用的，除非内容另外明确指明，否则单数形式“一种”、“一个”和“该”包含复数指代，并且可与“至少一个”和“一个或多个”可互换使用。
如本文中所用，术语“包括”、“包含”、“含有”及其任何变型旨在涵盖非排他性囊括，以便包括、包含或含有元素或元素列表的过程、方法、方法限定的产品或物质的组合物不仅包含那些元素，而且可以包含这样的过程、方法、方法限定的产品或物质的组合物中没有明确列出的或者并非其固有的其他元素。
如本文中所用，在液体活检样本的上下文中使用的术语“提供”意在涵盖获得该样本的任何和全部手段。该术语在实践所要求保护的方法的情况下涵盖导致该样本的存在的所有直接和间接手段。
如本文中所用，术语“患者”优选指人类，但也涵盖其他哺乳动物。注意，如本文中所用，术语“生物体”、“个体”、“对象”或“患者”被用作同义词并且可互换使用。
如本文所述的组合物和方法中所使用的，术语“癌症”是指或描述了哺乳动物的生理状况，其典型特征在于细胞生长不受调节。在一个实施方式中，该癌症是上皮癌。在一个实施方式中，该癌症是前列腺癌。在本文所述的方法和组合物的各种实施方式中，该癌症可以包含但不限于乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、脑癌、食道癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、黑素瘤和多药耐药性癌症；或其亚型和分期(phase)。在另一个替代实施方式中，该癌症是“早期”癌症。在又一个实施方式中，该癌症是“晚期”癌症。如本文中所用，术语“肿瘤”是指恶性或者良性的所有肿瘤细胞生长和增殖，以及所有的癌前细胞和组织和癌细胞和组织。该癌症可以是淋巴增殖性癌症，例如前体B淋巴母细胞性白血病/淋巴母细胞性淋巴瘤、滤泡性B细胞非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤前体T细胞淋巴母细胞性白血病/淋巴母细胞性淋巴瘤、未成熟T细胞的赘生物、外周胸腺后T细胞的赘生物、T细胞幼淋巴细胞白血病、外周T细胞淋巴瘤、未明确的间变性大细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多毛细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、前体T淋巴母细胞性白血病/淋巴母细胞性淋巴瘤、T细胞幼淋巴细胞性白血病、血管免疫母细胞性淋巴瘤或结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤。
如本文中所用，术语“循环肿瘤细胞”或“CTC”意在涵盖存在于生物样本中且与癌症有关的任何罕见细胞。可以以单个细胞或以CTC簇的形式存在的CTC通常是从患者的循环中发现的浓度非常低的实体瘤中脱落的上皮细胞。
如本文中所用，“传统的CTC”是指细胞角蛋白阳性、CD45阴性的，包含DAPI核并且在形态上不同于周围白血细胞的单个CTC。
如本文中所用，“非传统的CTC”是指至少在一个特征上不同于传统CTC的CTC。
从广义上讲，生物样本可以是含有CTC的任何样本。样本可以包括体液，如血液；细胞制剂的可溶部分或培养有细胞的培养基的等分试样；从细胞中分离或提取的染色体、细胞器或膜；在溶液中或与底物结合的基因组DNA、RNA或cDNA；一种细胞；组织；组织印迹；指纹；多种细胞；皮肤等。获自对象的生物样本可以是含有细胞的并且包含任何其中可以检测到CTC的材料的任何样本。样本可以是，例如全血、血浆、唾液或其他含有细胞的体液或组织。
在具体的实施方式中，该生物样本是血液样本。如本文所述，样本可以是全血，更优选是外周血或外周血细胞部分。如本领域技术人员将理解的，血液样本可以包含但不限于T细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、血小板和微泡(例如外来体和外来体样囊泡)的血液的任何部分或组分。在本披露的上下文中，包含在血液样本中的血细胞涵盖任何有核细胞并且不限于全血的组分。因此，血细胞包含，例如白细胞(WBC)以及包含CTC的罕见细胞。
本披露的样本可以各自含有通过本领域熟知的方法(如FACS、免疫组织化学)可区分的多个细胞群和细胞亚群。例如，血液样本可以含有非有核细胞群，例如红细胞群(如4-5百万/μl)或血小板群(150,000-400,000个细胞/μl)，以及有核细胞群，例如WBC群(如4,500–10,000个细胞/μl)、CEC群或CTC群(循环肿瘤细胞；如2-800个细胞/μl)。WBC可以含有例如嗜中性粒细胞(2,500-8,000个细胞/μl)、淋巴细胞(1,000-4,000个细胞/μl)、单核细胞(100-700个细胞/μl)、嗜酸性粒细胞(50-500个细胞/μl)、嗜碱性粒细胞(25–100个细胞/μl)等的细胞亚群。本披露的样本是非富集样本，即它们不富集有任何特定的有核细胞群或亚群。例如，非富集血液样本不富集有CTC、WBC、B细胞、T细胞、NK细胞、单核细胞等。
在一些实施方式中，该样本是获自健康对象或基于已知的临床既定标准(包含，例如年龄、种族、家族和病史)被认为处于癌症或现有癌症转移高危的对象的血液样本。在一些实施方式中，该血液样本来自基于组织或液体活检和/或手术或临床依据被诊断患有癌症的对象。在一些实施方式中，该血液样本获自显示出癌症的临床表现和/或本领域中熟知的或者呈现特定癌症的任何已知风险因素的患者。在一些实施方式中，该癌症是膀胱癌，例如膀胱尿路上皮癌。
如本文在生成CTC数据的情况中所使用的，术语直接分析意指与在检测之前使该样本富集CTC之后相反，在该样本中存在所有周围有核细胞的背景下检测CTC。在一些实施方式中，该方法包括提供包含CTC和至少200个周围白血细胞(WBC)的视野的显微术。
本披露的基本方面是所披露的方法关于CTC检测的无与伦比的鲁棒性(robustness)。本文披露的关于CTC的罕见事件检测基于直接分析，即非富集有群体，其涵盖在周围的非罕见事件的背景下确认罕见事件。根据所披露的方法对该罕见事件的确认固有地将周围事件识别为非罕见事件。考虑到周围非罕见事件并确定非罕见事件的平均值(例如非罕见事件的平均细胞尺寸)，这通过消除噪声允许对检测方法的校准。结果是所披露的方法的鲁棒性不能用不基于直接分析的方法实现，而是将富集的群体与罕见事件的固有扭曲的背景相比较。本文披露的直接分析方法的鲁棒性使得实现了CTC(包含本文所述的CTC亚型)的表征，其允许确认不能用其他CTC检测方法实现的表型和异质性，并且在请求保护的方法的背景下实现生物标志物的分析。
在一些实施方式中，本文披露的方法可以进一步涵盖个体患者风险因素和成像数据，其包含本领域中已知和使用的任何形式的成像模态，例如但不限于，通过X射线计算机断层摄影术CT)、超声波、正电子发射断层扫描(PET)、电阻抗断层扫描和磁共振(MRI)。应该理解，本领域技术人员可以基于各种已知标准选择成像模态。如本文所述，本发明的方法可以涵盖一个或多个成像数据。在本文披露的方法中，一种或多种个体风险因素可以选自年龄、种族、家族史。应该理解，本领域技术人员可以基于各种已知的标准选择额外的个体风险因素。如本文所述，本发明的方法可以涵盖一种或多种个体风险因素。相应地，生物标记可以包含成像数据、个体风险因子和CTC数据。如本文所述，生物标记还可以包含但不限于包括如下的生物分子：核苷酸、核酸、核苷、氨基酸、糖、脂肪酸、类固醇、代谢物、肽、多肽、蛋白质、碳水化合物、脂质、激素、抗体、用作生物大分子的替代物的相关区域及其组合(如糖蛋白、核糖核蛋白、脂蛋白)；以及生物分子的部分或片段。
CTC数据可以包含形态、遗传、表观遗传特征和免疫荧光特征。如本领域技术人员将理解的，生物标记可以包含生物分子或生物分子的片段，其变化和/或检测可以与癌症，与其他可测量特征以单独或相组合地形式相关联。可以呈现为单个细胞或CTC簇的CTC通常是从实体瘤中脱落的上皮细胞，并且在对象的循环中以非常低的浓度存在。相应地，血样中CTC的检测可以被称为罕见事件检测。血细胞群中的CTC具有小于1:1,000的丰度，例如小于1:5,000、1:10,000、1:30,000、1:50:000、1:100,000、1:300,000、1:500,000或1:1,000,000的丰度。在一些实施方式中，该细胞群中的CTC具有1:50:000至1:100,000的丰度。
本披露的样本可以通过任何手段(包含，例如通过实体组织活检或流体活检)获得(参见，例如Marrinucci D.等人,2012,Phys.Biol.9 016003)。简而言之，在具体的实施方式中，过程可以涵盖裂解并去除7.5mL血液样本中的红细胞，将剩余的有核细胞沉积在专用显微镜载片上，其中每片容纳相当于大致0.5mL的全血。血液样本可以提取自任何已知的包含血细胞或其组分的来源，例如静脉、动脉、外周、组织、髓，以及诸如此类。该样本可以使用熟知的常规临床方法(例如，用于绘制和处理全血的程序)进行处理。在一些实施方式中，将血液样本抽吸入可以含有EDTA或Streck无细胞DNATM的抗凝血性采血管(BCT)。在其他实施方式中，将血液样本抽吸入管(Veridex)。在进一步处理之前，血液样本可以进一步储存长达12小时、24小时、36小时、48小时或60小时。
在一些实施方式中，本披露的方法包括获得该血液样本的白细胞(WBC)计数的初始步骤。在某些实施方式中，该WBC计数可以通过使用WBC装置(瑞典恩厄尔霍尔姆的Hemocue)获得。在一些实施方式中，该WBC计数用来确定每个载片上有核细胞的一致加载体积的涂布所需的血液量并反算每血液体积的CTC的当量。
在一些实施方式中，本披露的方法包括裂解该血液样本中红细胞的初始步骤。在一些实施方式中，该红细胞，例如通过向该血液样本中加入氯化铵溶液来裂解。在某些实施方式中，在红细胞裂解之后使血液样本离心，并将有核细胞重悬，例如在PBS溶液中。
在一些实施方式中，来自样本(例如血液样本)的有核细胞作为单层沉积在平面载体上。该平面载体可以是任何材料，例如任何荧光透明的材料，任何有助于细胞附着的材料，任何有助于容易去除细胞碎片的材料，任何厚度<100μm的材料。在一些实施方式中，该材料是薄膜。在一些实施方式中，该材料是载玻片。在某些实施方式中，该方法涵盖将来自该血液样本的有核细胞作为单层沉积在载玻片上的初始步骤。该载玻片可以经涂覆以允许最大程度地保留活细胞(参见，例如Marrinucci D.等人,2012,Phys.Biol.9 016003)。在一些实施方式中，将约50万、100万、150万、200万、250万、300万、350万、400万、450万或500万个有核细胞沉积在该载玻片上。在一些实施方式中，本披露的方法包括将约3百万个细胞沉积到该载玻片上。在另外的实施方式中，本披露的方法包括将约2百万至约3百万个细胞沉积在该载玻片上。在一些实施方式中，在本披露的方法完成之后，该载玻片和固定的细胞样本可用于进一步处理或实验。
在一些实施方式中，本披露的方法包括确认该非富集血液样本中的有核细胞的初始步骤。在一些实施方式中，该有核细胞用荧光染色剂确认。在某些实施方式中，该荧光染色剂包含核酸特异性染色剂。在某些实施方式中，该荧光染色剂是二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)。在一些实施方式中，有核细胞的免疫荧光染色包括广谱细胞角蛋白(CK)、分化簇(CD)45和DAPI。在本文进一步描述的一些实施方式中，CTC包括相比周围有核细胞的区别性免疫荧光染色。在一些实施方式中，CTC的该区别性不同免疫荧光染色包括DAPI(+)、CK(+)和CD45(-)。在一些实施方式中，CTC的确认进一步包括比较广谱细胞角蛋白荧光染色与周围有核细胞的强度。在一些实施方式中，该CTC数据通过荧光扫描显微术生成以检测血液样本中有核细胞的免疫荧光染色。Marrinucci D.等人,2012,Phys.Biol.9016003)。
在具体的实施方式中，所有有核细胞被保留，并用靶向细胞角蛋白(CK)的单克隆抗体、专门存在于上皮细胞中的中间丝、靶向常见白细胞抗原CD45的泛白细胞特异性抗体和核染色剂DAPI进行免疫荧光染色。有核血细胞可以在多个荧光通道中成像，以产生保留了细胞核轮廓和细胞质分布的细胞学细节的高质量且高分辨率的数字图像。虽然周围WBC可以用该靶向CD45的泛白细胞特异性抗体确认，但CTC可以被确认为DAPI(+)、CK(+)和CD45(-)。在本文所述的方法中，该CTC包括相比周围有核细胞的区别性免疫荧光染色。
在进一步的实施方式中，该CTC数据包含也被称为高清CTC(HD-CTC)的传统CTC。传统的CTC是CK阳性的、CD45阴性的，含有完整的DAPI阳性细胞核，没有可识别的凋亡改变或受破坏的外观，并且在形态上不同于周围白细胞(WBC)。DAPI(+)、CK(+)和CD45(-)强度在如前所述的HD-CTC计数过程中可以归类为可测量的特征。Nieva等人,Phys Biol 9:016004(2012)。本文披露的方法所采用的无富集的直接分析导致高灵敏度和高特异性，同时增添了高分辨率细胞形态学以使得能够对已知为异质性的CTC群体进行详细的形态学表征。
虽然可以将CTC确认为包括DAPI(+)、CK(+)和CD45(-)细胞，但本发明的方法可以用本领域技术人员选择用于生成CTC数据和/或确认CTC和CTC簇的任何其他生物标志物来实施。本领域技术人员知道如何选择形态特征、生物分子或生物分子的片段，其变化和/或检测可以与CTC相关联。分子生物标志物包含但不限于包括如下的生物分子：核苷酸、核酸、核苷、氨基酸、糖、脂肪酸、类固醇、代谢物、肽、多肽、蛋白质、碳水化合物、脂质、激素、抗体、用作生物大分子的替代物的相关区域及其组合(如糖蛋白、核糖核蛋白、脂蛋白)。该术语还涵盖生物分子的部分或片段，例如蛋白质或多肽的肽片段。
本领域技术人员将会理解，可以使用许多方法来生成CTC数据，包含基于显微术的方法，包含荧光扫描显微术(参见，如Marrinucci D.等人,2012,Phys.Biol.9016003)；测序方法；质谱方法，如MS/MS、LC-MS/MS、多响应监测(MRM)或SRM和产物离子监测(PIM)；还包含基于抗体的方法，如免疫荧光、免疫组织化学、免疫测定，如Western印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀、放射免疫测定、斑点印迹和FACS。免疫测定技术和方案通常是本领域技术人员已知的(Price和Newman,Principles and Practice of Immunoassay,第二版,Grove’s Dictionaries,1997；以及Gosling,Immunoassays:A Practical Approach,Oxford University Press,2000)。可以使用各种免疫测定技术，包含竞争性和非竞争性免疫测定法(Self等人,Curr.Opin.Biotechnol.,7:60-65(1996),还参见John R.Crowther,The ELISA Guidebook,第一版,Humana Press 2000,ISBN 0896037282以及,An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques,Chard T编辑,ElsevierScience 1995,ISBN 0444821198)。
本领域已知且未具体描述的标准分子生物学技术通常遵循Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NewYork(1989)，以及Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wileyand Sons,Baltimore,Md.(1989)以及Perbal,A Practical Guide to MolecularCloning,John Wiley&Sons,New York(1988),以及Watson等人,Recombinant DNA,Scientific American Books,New York以及Birren等人(编辑)Genome Analysis:ALaboratory Manual Series,1-4卷Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998)。聚合酶链式反应(PCR)通常可以按照PCR方案进行：A Guide to Methods andApplications,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)。如果分辨率足以确认本发明的所述生物标志物，则任何能够确定特定样本的DNA拷贝数图谱的方法都可用于根据本发明的分子图谱分析。本领域技术人员知道并能够使用许多不同的平台来以足以确认本发明的所述一种或多种生物标志物的拷贝数的分辨率评估全基因组拷贝数变化。
原位杂交测定法是熟知的并且通常描述于Angerer等人,Methods Enzymol.152:649-660(1987)。在原位杂交测定中，将细胞，例如来自活检的细胞，固定到固体载体，通常是载玻片上。如果要探测DNA，会用热或碱使该细胞变性。然后使该细胞在中等温度下与杂交溶液接触以允许标记过的特异性探针退火。该探针优选用放射性同位素或荧光报道分子标记。FISH(荧光原位杂交)使用荧光探针，其仅结合序列的那些与其有高度序列相似性的部分。
FISH是用于检测和定位细胞中特定多核苷酸序列的细胞遗传学技术。例如，FISH可以用于检测染色体上的DNA序列。FISH也可以用于检测和定位组织样本内的特定RNA，例如mRNA。在FISH中使用荧光探针，其结合与其有高度序列相似性的特定的核苷酸序列。可以使用荧光显微术来查明该荧光探针是否结合以及在哪里结合。除了检测特定的核苷酸序列，例如易位、融合、断裂、重复和其他染色体异常之外，FISH还可以帮助定义细胞和组织内特定基因拷贝数和/或基因表达的空间-时间模式。
核酸测序技术是适于基因表达分析的方法。这些方法的基本原理是，样本中检测到cDNA序列的次数与对应于该序列的RNA的相对表达直接相关。这些方法有时用术语数字基因表达(DGE)来指代以反映所得数据的离散数字属性。应用这一原理的早期方法是基因表达系列分析(SAGE)和大规模平行标签测序(MPSS)。参见，例如S.Brenner,等人,NatureBiotechnology 18(6):630-634(2000)。最近，“下一代”测序技术的出现使得DGE更简单，通量更高，价格更实惠。因此，更多的实验室能够利用DGE来筛选比以前可能的更多的个体患者样本中更多基因的表达。参见，例如J.Marioni,Genome Research 18(9):1509-1517(2008)；R.Morin,Genome Research 18(4):610-621(2008)；A.Mortazavi,Nature Methods5(7):621-628(2008)；N.Cloonan,Nature Methods 5(7):613-619(2008).J.Marioni，Genome Research 18(9)：1509-1517(2008)；R.Morin，Genome Research 18(4)：610-621(2008)；A.Mortazavi，Nature Methods 5(7)：621-628(2008)；N.Cloonan，Nature Methods5(7)：613-619(2008)。
本领域技术人员将进一步理解，可以使用本领域已知的任何类别的标志物特异性结合试剂来检测生物标志物的存在或不存在，包含，例如抗体、适体、融合蛋白(如包含蛋白质受体或蛋白质配体组分的融合蛋白)或生物标志物特异性小分子结合物。在一些实施方式中，CK或CD45的存在或不存在由抗体决定。技术人员将进一步理解，可以通过评估生物标志物的染色体基因座处的染色体拷贝数变化来测量生物标志物的存在或不存在。基因组生物标志物可以通过任何技术，例如(作为举例)比较基因组杂交(CGH)或通过细胞系(如癌细胞)的单核苷酸多态性阵列(基因分型微阵列)来确认。除了使用诸如qPCR或原位杂交之类的技术进行进一步分析之外，生物信息学方法还可以使用针对扩增和删除的适当拷贝数阈值来确认区分细胞系群并指示生物标志物的染色体畸变区域。用于检测染色体DNA拷贝数变化的核酸检测方法包含：(i)对完整组织或细胞样本的原位杂交检测，(ii)对提取自组织样本的染色体DNA的微阵列杂交检测，以及(iii)提取自组织样本的染色体DNA的聚合酶链式反应(PCR)或其他扩增法。使用核酸的任何这些形式的合成类似物(如肽核酸)的检测也可以使用。
该生物标志物可以使用可检测标记的基于核酸的探针(例如脱氧核糖核酸(DNA)探针或蛋白质核酸(PNA)探针)或经设计/选择以与经设计的特异性染色体靶杂交的未标记引物，通过杂交检测来检测。该未标记引物，例如通过聚合酶链式反应(PCR，其中在引物结合后，聚合酶扩增靶核酸序列用于随后的检测)用于扩增检测。用于PCR或其他扩增检测的检测探针优选是荧光的，并且还更优选地是可用于“实时PCR”的检测探针。荧光标记还优选用于原位杂交，但也可以使用杂交技术中常用的其他可检测标记，例如酶促标记、显色标记和同位素标记。有用的探针标记技术描述于Molecular Cytogenetics:Protocols andApplications,Y.-S.Fan,编辑,第二章,“Labeling Fluorescence In SituHybridization Probes for Genomic Targets”,L.Morrison等人,21-40页,HumanaPress,.COPYRGT.2002，通过引入并入本文。在通过微阵列分析检测该基因组生物标志物时，应用这些探针标记技术来标记来自患者样本的染色体DNA提取物，然后将其与微阵列杂交。
在其他实施方式中，生物标志物蛋白质可以通过免疫学手段或其他蛋白质测定法来检测。可用于本发明以测量生物标志物水平的蛋白质测定方法可以包括(i)涉及标记的抗体或蛋白质与表达的生物标志物的结合的免疫测定方法，(ii)确定表达的生物标志物的质谱法，以及(iii)针对表达的生物标志物的基于蛋白质组的测定或“蛋白芯片”测定。有用的免疫测定方法包含使用本领域已知的任何形式进行的溶液相测定，例如但不限于ELISA形式、夹心形式、竞争性抑制形式(包括正向或反向竞争抑制测定)或荧光极化形式，以及固相测定，如免疫组织化学(称为“IHC”)。
本披露的抗体特异性结合生物标志物。该抗体可以使用本领域已知的任何合适的方法来制备。参见，例如Coligan,Current Protocols in Immunology (1991)；Harlow&Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(1988)；Goding,Monoclonal Antibodies: Principles and Practice(第二版，1986)。该抗体可以是天然的或者全部或部分合成产生的任何免疫球蛋白或其衍生物。其所有的保持特异性结合能力的衍生物也包括在该术语中。该抗体具有与免疫球蛋白结合结构域同源或大部分同源的结合结构域，并且可以来自天然来源；或者部分或全部合成产生。该抗体可以是单克隆或多克隆抗体。在一些实施方式中，抗体是单链抗体。本领域普通技术人员将理解，抗体可以以多种形式(包含，例如人源化、部分人源化、嵌合、嵌合人源化等)中的任何形式提供。该抗体可以是抗体片段，包含但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、Fv、dsFv双抗体，以及Fd片段。该抗体可以通过任何方式产生。例如，该抗体可以通过完整抗体的片段化来酶促或化学产生和/或其可以由编码部分抗体序列的基因重组产生。该抗体可以包括单链抗体片段。替代地或附加地，该抗体可以包括，例如通过二硫键连接在一起的多条链，以及获自这样的分子的任何功能片段，其中这样的片段保留了亲本抗体分子的特异性结合特性。由于其尺寸较小，作为整个分子的功能组分，抗体片段可以提供优于完整抗体的优点以用于某些免疫化学技术和实验应用中。
当在本发明的方法中生成CTC数据时，可以在本文所述的方法中使用可检测标记来直接或间接检测该生物标志物。可以使用多种可检测标记，其中标记的选择依据所需的灵敏度、与该抗体缀合的便宜性、稳定性要求以及可用的仪器和处置条款。本领域技术人员熟悉基于本发明的方法中该生物标志物的测定检测来选择合适的可检测标记。合适的可检测标记包含但不限于荧光染料(例如荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、Oregon GreenTM、罗丹明、德克萨斯红、四罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)、Cy3、Cy5、Alexa647、Alexa555、Alexa488)、荧光标志物(如绿色荧光蛋白(GFP)、藻红蛋白等)、酶(如萤光素酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、纳米颗粒、生物素、地高辛、金属，以及诸如此类。
对于基于质谱学(mass-sectrometry)的分析，使用同位素试剂(如同位素编码的亲和标签(ICAT))的差异标签或使用等压标签试剂iTRAQ(Applied Biosystems,FosterCity,Calif.)的更近期的变体，继之以多维液相色谱(LC)和串联质谱(MS/MS)分析可以为实施本披露的方法提供进一步的方法论。
使用化学发光抗体的化学发光测定法可以用于对蛋白质的灵敏的非放射性检测。用荧色物标记的抗体也可能是合适的。荧色物的实例包含但不限于DAPI、荧光素、Hoechst33258、R-藻蓝蛋白、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、罗丹明、德克萨斯红和丽丝胺。间接标记包含本领域熟知的各种酶，例如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、尿素酶，以及诸如此类。使用适于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶的底物的检测系统为本领域所熟知。
来自直接或间接标记的信号可以，例如使用显微镜(例如荧光显微镜或荧光扫描显微镜)进行分析。替代地，分光光度计可用来检测显色底物的颜色；辐射计数器可用来检测辐射，例如γ计数器用于检测125I；或荧光计可用来在特定波长的光的存在下检测荧光。如果需要，用于实施本披露的方法的测定法可以自动化或者由机器人执行，并且来自多个样本的信号可以同时检测。
在一些实施方式中，该生物标志物是免疫荧光标志物。在一些实施方式中，该免疫荧光标志物包括对上皮细胞特异性的标志物。在一些实施方式中，该免疫荧光标志物包括对白细胞(WBC)特异性的标志物。在一些实施方式中，该免疫荧光标志物中的一种或多种包括CD45和CK。
在一些实施方式中，有核细胞(如CTC或WBC)中免疫荧光标志物的存在或不存在导致区别性免疫荧光染色模式。CTC和WBC的免疫荧光染色模式可能因检测相应细胞中上皮细胞还是WBC标志物而不同。在一些实施方式中，确定一种或多种免疫荧光标志物的存在或不存在包括使用，例如明显地确认WBC的CD45的免疫荧光染色，比较CTC的区别性免疫荧光染色与WBC的区别性免疫荧光染色。还有其他的与WBC的各种亚群结合的可检测标志物或可检测标志物的组合。这些可以以各种组合的形式使用，包含与CD45的免疫荧光染色组合或作为其替代。
在一些实施方式中，CTC包括与周围的有核细胞不同的形态特征。在一些实施方式中，该形态特征包括细胞核大小、细胞核形状、细胞大小、细胞形状；和/或细胞核与细胞质的比率。在一些实施方式中，该方法进一步包括通过细胞核细节、细胞核轮廓、细胞核的存在或不存在、细胞质的质量、细胞质的数量、免疫荧光染色模式的强度来分析该有核细胞。本领域的普通技术人员理解，本披露的该形态特征可以包含可以确定并与CTC的检测相关联的细胞的任何特性、性质、特征或方面。
CTC数据可以用本领域已知的任何微观方法来生成。在一些实施方式中，该方法通过荧光扫描显微术进行。在某些实施方式中，显微方法提供CTC及其周围WBC的高分辨率图像(参见，例如Marrinucci D.等人,2012,Phys.Biol.9 016003))。在一些实施方式中，通过荧光扫描显微镜扫描用来自样本(如非富集血液样本)的单层有核细胞涂覆的载片，并且记录来自免疫荧光标志物和核染色物的荧光强度以允许测定每个免疫荧光标志物的存在或不存在以及评估该有核细胞的形态。在一些实施方式中，显微数据收集和分析以自动方式进行。
在一些实施方式中，CTC数据包含对一种或多种生物标志物(例如CK和CD45)的检测。如果生物标志物在所使用的相应检测方法的背景噪声以上是可检测到的(例如是该背景的2倍、3倍、5倍或10倍；例如相比背景2σ或3σ)，则其被认为“存在”于细胞中。在一些实施方式中，如果生物标志物在所用的检测方法的背景噪音以上是不可检测到的，则认为其是“不存在的”(例如，是背景信号的<1.5倍或<2.0倍；例如相比背景<1.5σ或<2.0σ)。
在一些实施方式中，有核细胞中免疫荧光标志物的存在或不存在通过选择荧光扫描过程期间的暴露时间来确定，使得所有免疫荧光标志物在视野中在WBC上达到预设的荧光水平。在这些条件下，CTC特异性免疫荧光标志物即使不存在于WBC上，在该WBC内作为具有固定高度的背景信号也是可见的。此外，CTC上不存在的WBC特异性免疫荧光标志物在该CTC内作为具有固定高度的背景信号是可见的。如果一种细胞针对相应的免疫荧光标志物的荧光信号显着高于固定的背景信号(例如，是该背景的2倍、3倍、5倍或10倍；例如相比背景2σ或3σ)，则认为该细胞对于该标志物是阳性的(即该标志物被认为是存在的)。例如，有核细胞针对CD 45的荧光信号显着高于背景信号，则该细胞被认为是CD 45阳性(CD 45+)的。如果一种细胞针对相应免疫荧光标志物的荧光信号不显着高于背景信号(例如，是背景信号的<1.5倍或<2.0倍；例如，相比背景<1.5σ或<2.0σ))，则该细胞被认为对于该标志物是阴性的(即该标志物被认为是不存在的)。
通常，每个显微镜视野都含有CTC和WBC。在某些实施方式中，该显微镜视野示出了至少1、5、10、20、50或100个CTC。在某些实施方式中，该显微镜视野示出的WBC是CTC的至少10、25、50、100、250、500或1,000倍。在某些实施方式中，该显微镜视野包括由至少10、50、100、150、200、250、500、1,000或更多个WBC包围的一个或多个CTC或CTC簇。
在本文所述的方法的一些实施方式中，该CTC数据的生成包括对存在于该血液样本中的CTC的计数。在一些实施方式中，本文所述的方法涵盖检测至少1.0个CTC/mL血液、1.5个CTC/mL血液、2.0个CTC/mL血液、2.5个CTC/mL血液、3.0个CTC/mL血液、3.5个CTC/mL血液、4.0个CTC/mL血液、4.5个CTC/mL血液、5.0个CTC/mL血液、5.5个CTC/mL血液、6.0个CTC/mL血液、6.5个CTC/mL血液、7.0个CTC/mL血液、7.5个CTC/mL血液、8.0个CTC/mL血液、8.5个CTC/mL血液、9.0个CTC/mL血液、9.5个CTC/mL血液、10个CTC/mL血液或更多。
在本文所述的方法的一些实施方式中，该CTC数据的生成包括检测CTC(包含非传统CTC)的不同亚型。在一些实施方式中，本文所述的方法涵盖检测至少0.1个CTC簇/mL血液、0.2个CTC簇/mL血液、0.3个CTC簇/mL血液、0.4个CTC簇/mL血液、0.5个CTC簇/mL血液、0.6个CTC簇/mL血液、0.7个CTC簇/mL血液、0.8个CTC簇/mL血液、0.9个CTC簇/mL血液、1个CTC簇/mL血液、2个CTC簇/mL血液、3个CTC簇/mL血液、4个CTC簇/mL血液、5个CTC簇/mL血液、6个CTC簇/mL血液、7个CTC簇/mL血液、8个CTC簇/mL血液、9个CTC簇/mL血液、10个簇/mL或更多。在具体的实施方式中，本文所述的方法包括检测至少1个CTC簇/mL血液。
在一些实施方式中，所披露的方法涵盖预测模型的使用。在进一步的实施方式中，所披露的方法涵盖将可测量特征与参考特征进行比较。如本领域技术人员可以理解的，这种比较可以是与该参考特征的直接比较或者已经将该参考特征合并到该预测模型中的间接比较。在进一步的实施方式中，分析可测量值涵盖以下的一种或多种：线性判别分析模型、支持向量机分类算法、递归特征消除模型、微阵列模型的预测分析、逻辑回归模型、CART算法、柔性树算法(flex tree algorithm)、LART算法、随机森林算法、MART算法、机器学习算法、惩罚回归方法或其组合。在具体的实施方式中，分析包括逻辑回归。在另外的实施方式中，确定被表达为风险分数。
分析分类过程可以使用各种统计分析方法中的任何一种来操作定量数据并提供对样本的分类。有用的方法的例子包括线性判别分析、递归特征消除、微阵列的预测分析、逻辑回归、CART算法、柔性树算法、LART算法、随机森林算法、MART算法、机器学习算法和本领域技术人员已知的其他方法。
分类可以根据设定用于确定样本属于给定类别的概率的阈值的预测建模方法进行。该概率优选为至少50％；或者至少60％；或者至少70％；或者至少80％；或者至少90％；或者更高。分类还可以通过确定所获得的数据集与参考数据集之间的比较是否产生统计学显着性差异来进行。如果是，则从中获得该数据集的样本被分类为不属于该参考数据集类别。相反，如果这样的比较与该参考数据集在统计学上没有显着差异，则从中获得该数据集的样本被分类为属于该参考数据集类。
模型的预测能力可以根据其提供质量度量，例如AUROC(ROC曲线下面积)或特定值或值范围的准确度的能力来评估。所述曲线下面积测量值可用于比较整个数据范围内分类器的准确度。具有较大AUC的分类器具有更大的在两组相关的组之间正确分类未知数的能力。ROC分析可以用于在各种临床情况下选择最佳阈值，从而平衡特异性和敏感性之间存在的内在折衷(inherent tradeoff)。在一些实施方式中，期望的质量阈值是预测模型，其将以至少约0.7、至少约0.75、至少约0.8、至少约0.85、至少约0.9、至少约0.95或更高的准确度进行样本分类。作为替代的措施，期望的质量阈值可以指代预测模型，其将以至少约0.7、至少约0.75、至少约0.8、至少约0.85、至少约0.9或更高的AUC进行样本分类。
如本领域已知的，预测模型的相对灵敏度和特异性可以经调整以支持特异性度量或灵敏性度量，其中这两个度量具有反比关系。上述模型中的限值可以依据正在执行的测试的具体要求，经调整以提供选定的灵敏性或特异性水平。灵敏性和特异性之一或二者可以是至少约0.7、至少约0.75、至少约0.8、至少约0.85、至少约0.9或更高的值。
原始数据可以通过通常以一式三份或多种一式三份，测量每个可测量特征或生物标志物的值进行初始分析。可以对该数据进行操作，例如，可以使用标准曲线对原始数据进行转换，并将三次测量的平均值用于计算每位患者的平均值和标准偏差。这些值可以在用于模型之前被转换，例如，对数转换、Box-Cox转换(Box和Cox,Royal Stat.Soc.,B系列26:211-246(1964)。然后将该据输入到预测模型中，其将根据状态对该样本进行分类。所得到的信息可以传达给患者或医疗保健提供者。在一些实施方式中，该方法具有>60％、>70％、>80％、>90％或更高的特异性。
如本领域技术人员将理解的，分析分类过程可以使用各种统计分析方法中的任何一种来操作该定量数据并提供对该样本的分类。有用的方法的例子包含但不限于线性判别分析、递归特征消除、微阵列的预测分析、逻辑回归、CART算法、柔性树算法、LART算法、随机森林算法、MART算法和机器学习算法。
在另一个实施方式中，本披露内容提供了用于测量生物标志物水平的试剂盒，其包括含有至少一种标记的探针、蛋白质或特异性结合样本中至少一种表达的生物标志物的抗体的容器。这些试剂盒还可以包含具有用于测定的其他相关试剂的容器。在一些实施方式中，试剂盒包括含有用于结合生物标志物的标记的单克隆抗体或核酸探针和至少一种校准物组合物的容器。该试剂盒可以进一步包括检测该可检测标记(例如酶或底物)所必需的组分。该试剂盒还可以含有可以进行测定并与测试样本进行比较的对照样本或一系列对照样本。该试剂盒的每个组件都可以封装在单独的容器内，并且各种容器全部可以含在单个包装件内，并附带用于解释使用该试剂盒进行的测定的结果的说明书。
根据前面的描述，将显而易见的是，可以对本文所述的发明进行变更和修改，以将其用于各种用法和条件。这些实施方式也在以下权利要求书的范围内。
本文变量的任何定义中的元素列表的叙述包含将所述变量定义为所列元素的任何单个元素或组合(或子组合)。本文实施方式的叙述包含实施方式作为任何单个实施方式或与任何其他实施方式或其部分进行组合。
本说明书中提及的所有专利和出版物均通过引用并入本文，如同将每个独立的专利和出版物具体且单独地指示为通过引用并入。
以下实施例是作为说明而非限制提供的。
实施例
实施例1
如先前报道的，使用Epic Sciences Platform对CTC进行样本评估。Marrinucci等人Phys Biol 9:016003,2012Marrinucci Physiol Biol 9：016003,2012。Epic CTC收集和检测过程流程如下：(1)将来自血液样本的血液裂解有核细胞置于载片上；(2)将载片储存在-80℃生物储存库中；(3)用CK、CD45、DAPI和AR将载片染色；(4)扫描载片；(5)运行多参数数字病理学算法，以及(6)通过软件和人类读取来确认CTC&对生物标志物的表达进行定量。在随后的CTC恢复和基因组图谱分析工作流程中，单个细胞被分离，经受全基因组扩增，以及NGS文库制备。在Illumina NextSeq 500上进行测序。
血液样本经受溶血、离心、重悬并涂覆于载片上，接着是-80℃储存。在分析之前，将载片解冻，通过免疫荧光(广谱细胞角蛋白、CD45、DAPI)标记，并通过自动荧光透视法成像，然后由病理学家培训的技术人员手动验证(MSL)。Marrinucci等人Phys Biol 9:016003,2012。如前所述，DAPI(+)、CK(+)和CD45(-)强度在CTC计数期间被归类为特性。
更具体地，外周血液样本被收集在无细胞DNA BCT(美国内布拉斯加州奥马哈的Streck)中并在环境温度下立即运送至Epic Sciences(美国加州圣地亚哥)。在收到之后，如前所述(Marrinucci等人Hum Pathol 38(3):514-519(2007)；Marrinucci等人ArchPathol Lab Med 133(9):1468-1471(2009)；Mikolajczyk等人J Oncol 2011:252361.(2011)；Marrinucci等人Phys Biol 9(1):016003(2012)；Werner等人J Circ Biomark 4:3(2015))，将红细胞裂解并将有核细胞分配到显微镜载玻片上，以及储存于-80℃直至染色。根据样本的白细胞计数和所使用的RBC裂解后细胞悬浮液的体积计算每个载片上涂覆的血液的毫升当量。如所述(Marrinucci等人，2007，同上；Marrinucci等人，2009,同上；Mikolajczyk等人，2011,同上；Marrinucci等人，2012,同上；Werner等人，2015，同上)的，通过免疫荧光确认循环肿瘤细胞。在随后的CTC恢复和基因组图谱分析工作流程期间，单个细胞被分离，经受全基因组扩增，以及NGS文库制备。在Illumina NextSeq 500上进行测序。
图1至4以及相应的附图说明描述了更多的实验细节。
实施例2.单个CTC表征确认了作为mCRPC患者中对雄激素受体信号传导指导疗法(AR Tx)的抗性机制的表型和基因组异质性。
已经提出作为敏感性生物标志物的肿瘤异质性(多样性)。这个实施例证明了在逐个细胞的基础上将CTC中的异质性作为旨在更好地对可用的疗法进行排序的管控中决策点上的敏感预测性生物标志物进行分析。
最初的重点是按表型(面部识别)或细胞水平表征CTC，包含从单个克隆中出现的细胞的形态和蛋白质表达的变化(谱系转换或致瘤性)，例如具有TMPRSS2-ERG融合的AR+→AR-神经内分泌。
使用“无细胞选择”平台分离CTC，并通过形态学/蛋白质化学(面部识别)按单细胞水平进行分析(图5)。无细胞选择使得能够表征任何罕见的细胞类型：包含CK-、小细胞凋亡和CTC簇。
在CTC的蛋白质和形态学特征之后，在患者样本中确认的每个CTC上测量一系列单个细胞特征，包含核面积以及表1中列出的其他特征(图6)。
表1.蛋白质生物标志物和数字病理学特征
分别记录了20个蛋白质和形态学特征，类似于针对基因表达所做的；并且执行了对>9000个CTC的无监督分析，其中确定了主要组分或关键特征然后聚类(图7)。这导致了限定15种不同的CTC表型的数学分组。图7示出了右侧的热图，其中15种细胞类型由y轴上的颜色和x轴上的各个特征限定。红色反映动态范围低端(即小核面积)的特征，而绿色反映动态范围高端(即大核面积)的特征(图7)。图23还示出了描绘利用基于CTC蛋白和形态学特征的无监督分析所确认的15种数学CTC表型亚型的热图。图24中小图A-O描绘了15种细胞类型的选定特征。某些CTC表型亚型预示患者的生存期。图25示出了通过CTC计数和15种CTC表型亚型预测ARS(n＝150个样本)的180天死亡情况。良好的预后因子包含细胞类型E(簇5)、K(簇11)和O(簇15)。如图26所示，一些CTC表型亚型(细胞类型E、K和N)预测mCRPC患者对AR靶向疗法的响应。图27描绘了预测对紫杉烷疗法的响应的CTC表型亚型(细胞类型G、K和N)。分别记录了20个蛋白质和形态学特征，类似于针对基因表达所做的；并且执行了对>9000个CTC的无监督分析，其中确定了主要组分或关键特征然后聚类(图7)。这导致了限定15种不同的CTC表型的数学分组。图7示出了右侧的热图，其中15种细胞类型由y轴上的颜色和x轴上的各个特征限定。红色反映动态范围低端(即小核面积)的特征，而绿色反映动态范围高端(即大核面积)的特征(图7)。图23还示出了描绘利用基于CTC蛋白和形态学特征的无监督分析所确认的15种数学CTC表型亚型的热图。图24中小图A-O描绘了15种细胞类型的选定特征。某些CTC表型亚型预示患者的生存期。图25示出了通过CTC计数和15种CTC表型亚型预测ARS(n＝150个样本)的180天死亡情况。良好的预后因子包含细胞类型E(簇5)、K(簇11)和O(簇15)。如图26所示，一些CTC表型亚型(细胞类型E、K和N)预测mCRPC患者对AR靶向疗法的响应。图27描绘了预测对紫杉烷疗法的响应的CTC表型亚型(细胞类型G、K和N)。每种细胞类型都有独特的形态模式。例如，如图28所示，簇11(细胞类型K)具有大核、高核熵和频繁核仁。多种细胞类型(细胞类型G、K和M)可预测基因组不稳定性(LST)(图29)。鉴于增加的基因组不稳定性，这些特殊亚型可能对DNA损伤药物敏感，例如铂基化疗剂(即卡铂、顺铂)；或靶向同源重组缺陷的靶向治疗剂，包含PARP抑制剂、DNA-PK抑制剂和靶向ATM途径的治疗剂。
在管控中的决策点获得放血样本：由治疗医师选择疗法。在决策点收集221名mCRPC患者的护理标准。在A、E或T之前进行基线抽血。然后是PSA、药物时间、无放射学进展(rPFS)&总生存期(OS)。对9225个CTC进行确认和表型表征。通过全基因组CNV对来自31名患者的741个CTC进行克隆性和基因扩增/删除的研究。根据每个决策点上细胞异质或多样程度对患者进行排名(图8)。图9示出了mCRPC群体的人口统计学特征。15种不同的表型CTC类别的频率因治疗线而不同，并且随时间变化更加不均匀(图10)。在图10中，红色表示过度表达或更多样化的细胞类型的流行。每列表示患者，使得具有许多垂直红色切片的列具有更高的表型异质性。
对于每个患者样本，计数观察到的不同细胞类型的数量，并通过计算香农指数来量化CTC异质性。香农指数广泛用于生态学以基于生态系统中存在的不同物种的数量来量化生态系统的多样性。当生态系统中存在的不同物种的数量增加或均匀度增加时(即当每个物种在生态系统中存在相似数量的实体时)，香农指数值则增加。当所有物种都存在并且它们以相同的数量存在时，香农指数最大化，而当仅存在1个物种时最小化。因此，低香农指数值表明由于样本中发现的CTC的均匀性，患者具有低异质性，并且高香农指数值表明由于具有存在的所有类型的CTC，患者具有高异质性。如图11所示，较高的香农指数显示按治疗线的更大的多样性(异质性)，特别是中位数的增加，以及第3和第4治疗线中更少更低的指数评分。高CTC表型异质性预测AR疗法但不是紫杉烷疗法的进展和存活时间较短(图12A)。图12B示出了基于异质性的AR Tx的结果。
在多变量模型中，高CTC表型异质性预测紫杉烷相比AR Tx具有更好的结果。在单变量和多变量分析中研究了先前显示为存活预后的一系列因素-仅示出了多变量(图13)。预测对紫杉烷的敏感性相比AR疗法有高异质性(图13)。图14示出了CTC亚型(K型)的流行预测不依赖于AR状态的ARTx和紫杉烷的不良结果。一种特殊的数学定义的细胞类型，K型具有大核、大范围的核尺寸和突出的核仁-其与这两类药物的抗性相关。
认识到可用的疗法不能根除肿瘤内的“所有细胞”之后，检查了患者样本中CTC的基因型异质性(具有从单个起始树干病变演变而来的不同突变图谱的肿瘤中的单个区域)。在表型测量CTC后，移除盖玻片，吸出单个CTC并放入单个管中。将CTC扩增，制备用于测序(图15)。测序后进行信息学以评估克隆性和扩增/删除(图15)。
单细胞CTC测序告知克隆多样性和系统发育疾病谱系。分别分析了每个患者样本。单个CTC基因组CNV图分别与患者样本中的其他CTC对比着绘制。基于大的基因组变异和至少2个CTC(例如来自具有或不具有染色体5q缺失的同一患者的两个细胞或者来自具有或不具有AR扩增的患者的两个克隆)中已知的驱动子改变的局部扩增或删除来表征克隆性(图16)。
单CTC CNV图谱告知克隆多样性和系统发育疾病谱系。在获自个体患者23个细胞中8个是相对平直的，7个具有多个改变，而变化则是不同的：5个在一条具有第二个变化的路径上有多个改变，2个在另一条路径上有多个改变，并且1个(图17)。这项分析提供了3个重要的价值：第一，组织/cfDNA分析在解析亚克隆时会遇到巨大困难。第二，克隆进化发生在不同细胞从早期病变分支而来的情况下，这允许随时间监测患者以了解哪些亚克隆改变具有特异性药物敏感性/抗性，并最终允许预测对新药物疗法或组合的响应的加权平均值。第三，理解单个细胞内不同改变的共同发生可能有助于我们告知途径的利用情况(即，它们在相同细胞还是不同细胞中具有AR扩增和PTEN删除可能影响很大)。
单个CTC测序还可以告知第二线后紫杉烷患者中克隆多样性的缺乏，该患者可能不会考虑进行ARTx。这个患者对恩杂鲁胺有响应(图18)。如图19所示，CTC表型异质性与基因组异质性相关。图20A示出了细胞类型K基因组学的实例，其特征在于频繁的CNV、大量的断点和伴随的由大核、高核熵和频繁核仁表征的表型。图20B示出了与所有其他CTC表型相比的细胞类型K的基因组不稳定性。图21示出了高表型异质性是AR-V7阴性患者中的信息生物标志物。图22示出了在第一线治疗之前来自患者的显示同源基因组图谱的6个CTC中的低表型CTC异质性。
图23示出了利用基于CTC蛋白和形态学特征的无监督分析确认的15种数学CTC表型亚型的热图。
使用监督聚类分析，发现5种形态学和蛋白质表达特征可预测CTC基因组不稳定性。前四个特征与基因组不稳定性正相关而最后一个特征则是负相关(图30)。
如图31所示，CK(-)CTC具有较高的基因组不稳定性发生率并且可预测基因组不稳定性。
以下基因的扩增可预测基因组不稳定性：ACADSB、AR、BRAF、CCDC69、ETV1、EZH2、KRAS、NDRG1、PTK2、SRCIN1、YWHAZ。以下基因的删除可预测基因组不稳定性：ABR、ACADSB、BCL2、CCDC6、CDKN2B-AS1、CXCR4、KLF5、KRAS、LOC284294、MAP3K7、MTMR3、PTEN、PTK2B、RB1、RBPMS、RND3、SMAD4、SNX14、WWOX、ZDHHC20。
基于蛋白质和形态学特征开发了分类器用于以高准确度预测CTC基因组不稳定性。在图32中，Y轴显示实际LST(n个断点)以及X轴显示预测的不稳定性(稳定对不稳定)。预测有高基因组不稳定性的CTC可能对DNA损伤药物敏感，例如铂基化疗剂(即卡铂、顺铂)；或靶向同源重组缺陷的靶向治疗剂，包含PARP抑制剂、DNA-PK抑制剂和靶向ATM途径的治疗剂。
图33示出了表型异质性可预测总生存期和对AR靶向疗法的响应。图34示出了CTC表型异质性可预测基因型异质性。高表型异质性代表多个基因组克隆的可能性是低表型异质性的40倍。图35示出了CTC基因组不稳定性可预测mCRPC患者的总生存期。图36示出了CTC基因组不稳定性可预测mCRPC患者对紫杉烷疗法的响应。
基因组不稳定性.作为基因组不稳定性的替代物测量的LST和PGA。LST：至少10Mb的邻近区域之间的染色体断裂的数目。Popova等人,Cancer Res.72(21):5454-62(2012)。PGA：携带拷贝数改变(扩增或删除)的患者的基因组百分比。Zafarana等人,Cancer2012Aug；118(16):4053(2012)。实例：高LST(27)和高PGA(23％)(图37A-37C)。
实施例3：液体活检HRD+标签的开发
这个实施例证明了基于CTC的方法的开发，该方法用以检测在治疗前的关键临床决策点上从简单外周抽血中分离的循环肿瘤细胞(CTC)中的HRD。通过对由测序的>600个单个CTC检测到的HRD基因组改变(LST)进行训练，使用多参数高内涵图像分析算法以基于与这些改变相关的细胞和核形态特征来确定单个CTC的HRD状态。基于在异质和同质疾病状态下具有HRD+表型的CTC的亚克隆流行，这项测试可以按细胞水平以78％的准确度和86％的特异性预测HRD基因组学。利用患者评分指南按患者水平将HRD+表型准确度提高至95％。
Epic Sciences HRD+标签流行和临床有效性：在168和86名mCRPC患者的验证队列中，分别在32％&37％的患者中检测到所开发的HRD标签。与最近报道的在类似队列内的HRD相关基因组改变的10-20％流行相比，后续系统治疗线中患者的标记流行增加(第1线25％、第4线41％)。与HRD-患者相比，确认为HRD+的患者在AR Tx(HR＝9.83，p<0.0001)和紫杉烷类(HR＝3.31，p＝0.001)方面具有更差的OS。
Epic Sciences HRD+标签预测在mCRPC中的PARPi和铂疗法响应：在随机化AR Tx对AR Tx+PARPi的前瞻性II期临床试验中，HRD+患者在AR Tx+PARPi臂组中在总体响应率(ORR，>50％PSA下降)方面有统计学显著改善(88％对42％)。此外，AR Tx臂组的患者表现出HRD+CTC从基线到治疗中抽血的320％的增加。AR Tx+PARPi臂组患者表现出HRD+CTC从基线到治疗中抽血的95％的减少。早期数据证实HRD+标签也预测铂化疗敏感性的ORR以及HRD+CTC从基线到利用铂化疗的治疗抽血期间的类似减少。
Epic Sciences PARPi抗性标签：除了HRD+CTC生物标志物标签之外，EpicSciences还开发了用于预测对PARPi的初级抗性的标签。PARPi抗性标签确认了与上皮致瘤性和AR/PI3K相互反馈相关的特定CTC表型，其表现出对联合疗法AR Tx+PARPi的抗性。EpicSciences的CTC HRD敏感性和PARPi抗性标签是在稳健的临床兼容平台上进行的非侵入性替代测试，其可在不到5天的时间内完成，其中相关的COGS显著减少。mCRPC患者中EpicSciences HRD+CTC标记的较高流行，以及基于PARPi响应和抗性标记对患者进行分层的能力使其成为指导实践和整个临床试验中临床决策的有用工具。
简言之，收集血液样本，裂解红细胞并将剩余的有核细胞(可包含白细胞和CTC)沉积在载玻片上。对于每个样本，根据样本体积和WBC计数，最多创建12个重复载玻片。使用靶向多种细胞角蛋白(CK)、CD45和N-末端AR表达的抗体混合物，通过IF对2个重复载玻片染色。DAPI染色用于限定核面积和背景。采用利用荧光和形态学特征的算法确认CTC，确认出具有是CTC的高概率的异常细胞。训练有素的读者基于标记表达和形态分类CTC。可报告的值包含CTC/mL、AR+/-CTC/mL、CK+/-CTC/mL、凋亡CTC/mL和CTC簇/mL。
在CTC分类后，确认的CTC经历单细胞数字病理学分割，其中产生并记录细胞核(DAPI)、细胞质(CK)和AR的齐整(clear)区段。在患者血液样本中对所有确认的CTC进行自动细胞分割，然后训练读取者(reader)确认片段。单细胞特征提取操作提取20个定量特征和2个分类特征。它们包含：
定量特征：(1)蛋白质特征：AR蛋白质表达、CK蛋白质表达；(2)形态特征：核面积(um2)、细胞质面积(um2)、核凸面积(um2)、细胞质凸面积(um2)、核主轴(um)、细胞质主轴(um)、核短轴(um)、细胞质短轴(um)、核循环度、细胞质循环度、核密实度、细胞质密实度、核熵、核与细胞质凸面积比、核仁、CK斑点和核斑点。
定性特征：CK+或CK-，AR+或AR-。
在单细胞特征提取后，对单个CTC进行NGS测序。
全基因组CNV分析：基于数学算法将非凋亡的单个CTC重新定位在载玻片上，所述数学算法将在扫描程序期间计算的原始CTC位置(x和y坐标)转换成兼容的新的x，y参考集，其中用尼康TE2000倒置免疫荧光显微镜用于细胞捕获。使用Eppendorf TransferMan NK4显微操纵器捕获单细胞。使用1μL的TE缓冲液将细胞沉积到单独的0.2mL PCR管中并且如前所述，立即通过添加1.5μL的高pH裂解缓冲液裂解。将含有单个细胞的管朝下旋转并在干冰上冷冻直至进一步处理。使用SeqPlex Enhanced(Sigma)，根据制造商的说明书稍作修改，进行单细胞全基因组扩增(WGA)。通过UV/Vis测定WGA后的DNA浓度。根据制造商的推荐稍作修改，使用Illumina(NEB)的NEBNext Ultra DNA文库制备试剂盒，由100ng的WGA DNA构建NGS文库。在NGS文库制备后，通过PicoGreen(ThermoFisher Scientific)和片段分析仪(Advanced Analytical)测定文库浓度和大小分布。汇总了来自每个文库的等纳摩尔浓度并使用Rapid Run Paired-End 2x150(PE 2x150)在Illumina NextSeq 500上测序。
使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA,http://bio-bwa.sourceforge.net)将原始测序数据(FASTQ)与来自UCSC(http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/)的hg38人参考基因组进行比对。将比对文件(BAM)进行质量(MAPQ 30)过滤，以仅保留相对参考序列具有一个或仅仅几个“良好”命中的读数。使用两个单独的管道进一步处理过滤过的比对文件(图1)。为了由单细胞WGA DNA生成CNV分析对照基因组，从不具有血液病的不同人类成年男性个体收集15个WBC并用作通用参考。对于每个样本，每箱的读数计数(每箱的窗口大小在两个管道之间变化，见下文)按比例归一化以使总读数计数达到100万。然后计算每个箱的这些对照的归一化读数的中位数、平均值和标准偏差(sd)以供进一步使用。
分析管道1用于基因组不稳定性估算。将Hg38人类基因组分成100万个碱基对的～3000个箱，并在每个箱内为每个样本进行读数计数。对于每个样本，每箱的读数计数按比例归一化以使总读数计数达到100万，然后对每个箱进行GC含量调整[34]。使用WBC对照的每个箱读数计数的中位数来排除来自下游分析的低覆盖箱(<100个读数)。在Log2转化后计算并报告测试样本和WBC对照之间的比率。使用R Bioconductor包DNA拷贝预测染色体片段，其发现了DNA拷贝数有改变的断点。LST计算为至少10Mb的邻近区域之间的染色体断裂的数目，并且PGA计算为携带拷贝数改变(扩增截止值：>0.4；删除截止值：<-0.7)的患者的基因组百分比。
LST的表型预测(pLST)：
对608名患者CTC的训练组进行了定量和定性数字病理学特征分析。经由图像分析并经由测序按顺序处理了CTC。利用以下技术开发了多变量分类器。
图像分析获得了每个CTC(X1,X2,…,Xp)的p蛋白/形态特征。测序获得了每个CTC的“实际”LST数目(aLST)。接下来，训练多变量线性回归算法以在给定来自成像的一系列蛋白质/形态学特征(aLST～X1+X2+…+Xp)的情况下预测aLST。在训练之后(以及在对新测试数据进行预测时)，算法在给定来自每个CTC的成像的一系列蛋白质/形态学特征(X1,X2,…,Xp)的情况下输出预测的LST数目(术语‘pLST’)。在训练或测试之前，常用的数据变换和归一化技术用于使用aLST将成像特征(X1,X2,…,Xp)线性化。应用于训练集的任何归一化都在测试集上完成。为了评估特征重要性，使用的一种技术是在单变量基础上评估每个成像特征(X1,X2,…,Xp)与aLST的相关程度。首先，对于每个成像特征，计算与aLST的皮尔逊相关系数。相关系数>>0表示与aLST呈强烈正趋向的特征(例如，X的较大值导致aLST的较大值)。相关系数<<0表示与aLST呈强烈负趋向的特征(例如，X的较低值导致aLST的较大值)。接近0的相关系数表示不以任何方式趋向aLST的特征(因此可能不会预测aLST)。取每个特征的相关系数的绝对值以将与aLST有强预测关联(正或负)的特征和与aLST有较弱的预测关联的特征分类。这在图38中有显示。对独立的患者mCRPC队列进行pLST分析，该患者在刚要开始AR靶向疗法(经由cyp17抑制剂、阿比特龙或AR抑制剂、恩杂鲁胺)或紫杉烷化学疗法(多西他赛或卡巴他赛)之前抽血。包含不同水平的pLST+细胞的算法导致患者的结果比那些标记物阴性的患者更差。
本文变量的任何定义中的元素列表的叙述包含将所述变量定义为所列元素的任何单个元素或组合(或子组合)。本文实施方式的叙述包含实施方式作为任何单个实施方式或与任何其他实施方式或其部分进行组合。
本说明书中提及的所有专利和出版物均通过引用并入本文，如同将每个独立的专利和出版物具体且单独地指示为通过引用并入。
Claims (27)
1.一种检测癌症患者中疾病的异质性的方法，该方法包括：
(a)进行直接分析，其包括针对获自该患者的血液样本中的有核细胞的免疫荧光染色和形态表征以确认和计数循环肿瘤细胞(CTC)；
(b)从所述样本中分离该CTC；
(c)单独表征基因组参数以生成该CTC中每一种的基因组图谱，以及
(d)基于所述图谱确定该癌症患者中疾病的异质性。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症是前列腺癌。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述前列腺癌是激素难治性的。
4.如权利要求1所述的方法，其中有核细胞的该免疫荧光染色包括广谱细胞角蛋白、分化簇(CD)45和二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述基因组参数包括拷贝数变异(CNV)标签。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述拷贝数变异(CNV)标签包括基因扩增或删除。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述CNV标签包括与雄激素非依赖性细胞生长相关的基因。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述删除包括磷酸酶和张力蛋白同源物基因(PTEN)的缺失。
9.如权利要求6所述的方法，其中所述基因扩增包括AR基因的扩增。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述基因组参数包括基因组不稳定性。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述基因组不稳定性通过测量大规模转换(LST)来表征。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述基因组不稳定性通过测量基因组改变百分比(PGA)来表征。
13.如权利要求1所述的方法，其中高异质性确认对雄激素受体靶向疗法有抗性的患者。
14.如权利要求1所述的方法，其中CTC之间的高度多样性与对基于紫杉烷的化学疗法的抗性无关。
15.一种检测癌症患者中疾病的表型异质性的方法，该方法包括(a)进行直接分析，其包括针对获自该患者的血液样本中的有核细胞的免疫荧光染色和形态表征以确认和计数循环肿瘤细胞(CTC)；(b)检测每种所述CTC的多种形态学和蛋白质表达特征的存在以确认CTC亚型，以及(c)基于所述CTC亚型的数目确定该癌症患者中疾病的表型异质性。
16.如权利要求1所述的方法，其中高表型异质性确认对雄激素受体靶向疗法有抗性的患者。
17.如权利要求1所述的方法，其中CTC之间的高表型异质性与对基于紫杉烷的化学疗法的抗性无关。
18.如权利要求14所述的方法，该方法进一步包括检测由大核、高核熵和频繁核仁表征的CTC亚型。
19.权利要求14的方法，该方法进一步包括检测所述CTC亚型的流行，其中所述流行与雄激素受体靶向疗法和基于紫杉烷的化学疗法的不良结果相关。
20.一种基于癌症患者中循环肿瘤细胞(CTC)的表型分析来确定LST评分的方法，该方法包括(a)进行直接分析，其包括针对获自该患者的血液样本中的有核细胞的免疫荧光染色和形态表征以确认和计数CTC；(b)检测每种所述CTC的多种形态学和蛋白质表达特征的存在以确认CTC亚型，以及(c)基于一个或多个CTC亚型的频率确定该癌症患者的LST评分。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述癌症是前列腺癌。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述前列腺癌是激素难治性的。
23.如权利要求20所述的方法，其中有核细胞的该免疫荧光染色包括广谱细胞角蛋白、分化簇(CD)45和二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)。
24.如权利要求20所述的方法，其中所述特征选自表1中列出的特征。
25.如权利要求20所述的方法，其中所述特征选自核/细胞质比率、核&细胞质循环度、核熵、CK表达和AR表达。
26.如权利要求20所述的方法，其中所述特征选自核面积、核凸面积、核斑点、核主轴、细胞质面积、细胞质凸面积、细胞质短轴、激素受体表达和细胞质主轴。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述激素受体是雄激素受体(AR)。
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