CN108236724A - 长链非编码rna在制备抑制肿瘤细胞转移的制剂中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因技术领域，涉及长链非编码RNA BC009639及其在制备抑制肿瘤细胞转移的制剂中的用途，本申请中利用基因芯片在一对具有不同转移潜能的肺癌细胞株中筛选并验证了可能与肿瘤转移密切相关的长链非编码RNA BC0009639，划痕实验和Transwell实验表明其能够抑制肿瘤细胞的迁移，MTT实验表明其能够抑制细胞的增殖能力；实验结果证实所述的长链非编码RNA BC009639能够抑制肿瘤细胞的迁移，以及抑制细胞的增殖能力，能够抑制肿瘤细胞的转移；该长链非编码RNA BC0009639的序列与IMPAD1 mRNA序列的3‘UTR密切相关，其的表达受到藤黄酸的影响，并与肿瘤细胞的生存率负相关。本发明为探明长链非编码RNA在生物体的作用机制以及与临床疾病的关联和针对治疗提供了基础理论依据和研究数据。

Description

长链非编码RNA在制备抑制肿瘤细胞转移的制剂中的用途

技术领域

本发明属于基因技术领域，具体涉及长链非编码RNA BC009639及其在制备抑制肿瘤细胞转移的制剂中的用途，该长链非编码RNA BC009639能够抑制肿瘤细胞的迁移，以及抑制细胞的增殖能力，能够抑制肿瘤细胞的转移；该长链非编码RNA BC0009639的序列与IMPAD1 mRNA序列的3‘UTR密切相关，其的表达受到藤黄酸的影响，并与肿瘤细胞的生存率负相关。

背景技术

现有技术报道了肿瘤是人体内局部组织的细胞在失去对其生长的正常调控能力后，异常增生与分化而形成的组织物。肿瘤一旦在体内形成，其增生不受机体的生理调节，并且破坏正常组织与器官的生理功能，这一点在恶性肿瘤中尤其明显。实践证实，恶性肿瘤生长速度快，恶性程度高，临床上患者易发生出血、坏死、溃疡等症状，并常发生多脏器的转移，造成人体正常生理功能的破坏以及严重的脏器功能受损，最终造成患者死亡。

大量的科学实验研究和临床治疗观察表明，恶性肿瘤的发生发展受到多方面因素的综合影响，包括化学、物理、生物等方面的外在因素和遗传、免疫、内分泌等具有个体差异性的内在因素，各种致癌因素可能以协同的方式引起细胞损害，从而激活原癌基因，改变其基因表达水平，进而影响细胞内的多种相关细胞信号通路，包括涉及细胞增殖、细胞凋亡、DNA修复等等过程的改变，使细胞的生理功能发生转变，呈现多克隆性增生和突变，经过一个多阶段演进过程获得浸润和转移能力，形成恶性肿瘤，给机体的生理健康造成重大影响和危害。

据统计，肺癌是世界上致死率最高的癌症之一，拥有极高的恶性程度和极差的预后效果，每年因肺癌而死亡的人数可超过因肝癌、乳腺癌、肠癌等癌症死亡人数的总和。目前医学界尚无针对肺癌的特效疗法，肺癌患者的5年生存率在过去的几十年间并无明显的提高。肿瘤转移是造成癌症临床治疗失败和致死的主要原因，这在肺癌患者中尤其明显。

研究显示，恶性肿瘤发生转移的方式包括蔓延到邻近部位、淋巴转移(由近及远、逆向转移等)、血行转移以及种植等等，无不严重影响机体组织和器官的正常生理功能，增加对机体的损害作用，造成不可逆损伤并且极度恶化，最终导致死亡，因此，对于肿瘤转移机制的深入研究和探索将有助于明确复杂而恶性的癌症的病因，为肿瘤的临床治疗和预防提供有力的支持，意义重大。

长链非编码RNA是生物体内长度大于200nt、不具有编码能力的一类RNA分子，近年来研究的显示，其具有多种重要的生理功能，能够参与到基因表达调控相关的多种生物学过程中，包括染色体沉默，染色质修饰，基因印记，转录激活，转录干扰，核内运输等等多种重要的调控过程。与此同时，长链非编码RNA与癌症的关联性是目前的一个研究重点，大量的长链非编码RNA分子被发现在人类的肿瘤细胞中基因表达产生改变，并且受到多种不同的癌基因或抑癌基因的调控，包括MYC,p53和NF-κB等等，其中，HOTAIR是一个典型的代表，其在乳腺癌、肝癌和肠癌等癌症细胞中被高度诱导表达，它是肿瘤恶化和转移的一个重要标志物。

研究表明，长链非编码RNA分子在生物体内发挥功能的作用机制多样，CeRNA(competing endogenous RNAs)机制是其中较为新颖而重要的一种。CeRNA假说是一种RNA分子间的相互作用机制，目前主要指体内的RNA分子与MicroRNA分子相互作用，影响MicroRNA的功能，从而改变细胞内相关分子的基因表达，调节各项生理过程的发生和发展。MicroRNA分子可以通过应答元件(microRNA response elements，MREs)结合机体内mRNA并导致基因沉默效应的发生，而具备一定功能的长链非编码RNA分子可以通过自身所含有的MicroRNA应答元件在体内竞争性地结合MicroRNA来调节基因表达，这揭示了体内一种从RNA分子到microRNA的调节通路，具有重要生物学意义。

还有研究表明，PTEN是一种重要的抑癌基因，其基因表达水平常在多种人类癌症中受到调控，Provero P.等人的研究显示，CNOT6L,VAPA和ZEB2等RNA分子可以ceRNA机制通过自身3’UTR的MRE竞争性结合作用于PTEN的MicroRNA分子，从而调节PTEN基因的表达，影响PI3K/AKT的信号通路和细胞的增殖等功能。Linc-MD1是一种具有肌肉组织表达特异性的长链非编码RNA分子，它能够通过拮抗MicroRNA-133和MicroRNA-135对于MAML1和MEF2C的抑制作用，从而激活肌肉组织相关的特异性基因的表达。HULC(Highly Up-regulated inliver cancer)是一种在肝癌中表达水平极高的长链非编码RNA分子，它能够通过ceRNA效应抑制MicroRNA-372，进而调控MicroRNA-372靶基因PRKACB的表达并进一步地激活了CREB，调节细胞内多种信号通路和并影响癌细胞的多项生理过程。此外，大量的研究还发现了MALAT1、KRAS1P、BRAFP1等等具有ceRNA效应的分子在细胞的生长、增殖、分化过程中发挥了重要作用。

大量的研究表明中草药藤黄酸其具有重要的抗肿瘤效用，并且在细胞内可能通过多种不同的靶分子发挥作用，改变细胞的多种生理功能，包括抑制细胞增殖，促进细胞凋亡等等，这些作用都有助于遏制肿瘤的恶化，维护机体正常的功能，其对于肿瘤细胞的遏制作用引起了研究者的关注，尝试探索其在肿瘤细胞迁移过程中的影响以及与长链非编码RNA之间可能的联系，为进一步阐明其作用机制和临床应用提供理论支持。

迄今，尚未见有关长链非编码RNA分子在肿瘤的发生发展过程中的作用尤其在恶性肿瘤的发展过程中如何参与并影响肿瘤细胞的转移及其具体的机制的报道。

基于现有技术的研究现状，本申请的发明人拟通过研究长链非编码RNA分子在肿瘤的发生发展过程中的作用以及参与并影响肿瘤细胞的转移的潜在机制，提供长链非编码RNA在制备抑制肿瘤细胞转移的制剂中的用途。

与本发明相关的现有技术有：

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发明内容

本发明的目的在于提供长链非编码RNA在制备抑制肿瘤细胞转移的制剂中的用途，尤其涉及长链非编码RNA BC009639及其在制备抑制肿瘤细胞转移的制剂中的用途。

具体而言，在第一方面，本发明在之前的研究基础上，进一步探讨长链非编码RNA在肿瘤细胞的迁移过程中所起的作用以及具体的作用机制；本申请中利用基因芯片在一对具有不同转移潜能的肺癌细胞株中筛选并验证了可能与肿瘤转移密切相关的长链非编码RNA BC0009639，划痕实验和Transwell实验表明其能够抑制肿瘤细胞的迁移，而MTT实验表明其能够抑制细胞的增殖能力；

本申请中还通过原位杂交实验分析了其亚细胞定位，通过进一步分析长链非编码RNA BC0009639的序列，结果显示其与IMPAD1 mRNA序列的3‘UTR密切相关，以及IMPAD1是MiR-96和MiR-155靶基因，其在RNA水平和蛋白水平均受到MiR-96和MiR-155的抑制作用，而长链非编码RNA BC0009639能够影响MiR-96和MiR-155对于IMPAD1的抑制作用，并且萤光素酶报告基因实验表明其影响作用与MiR-96和MiR-155的结合位点特异相关；

本申请进行的体内实验结果进一步表明长链非编码RNA BC0009639能够抑制肿瘤细胞的转移。

本申请还通过实验显示，长链非编码RNA BC0009639的表达受到藤黄酸的影响，并与肿瘤细胞的生存率负相关，表明其可能参与了藤黄酸的抗肿瘤作用。

本申请中将长链非编码RNA作为研究重点，从分别具有高低转移潜能的一对肺癌细胞株95D和95C中筛选出了长链非编码RNA BC009639作为研究对象，探索长链非编码RNA在肿瘤转移中的作用机制，研究结果显示，lncRNA BC009639通过自身序列的特点，在一定程度上阻止了microRNA-96和microRNA-155对于IMPAD1基因表达的抑制效应，保护了IMPAD1 mRNA的相对稳定性，防止被microRNA-96和microRNA-155结合而降解，这些数据说明了lncRNA BC009639的重要作用，研究结果还表明，LncRNA BC009639在肿瘤细胞中相对较高丰度的表达也是其能发挥ceRNA效应的基础，对于IMPAD1的进一步研究将有助于阐明lncRNA BC009639对于肿瘤细胞迁移能力影响的作用机制。

本发明提供了长链非编码RNA在制备抑制肿瘤细胞转移的制剂中的用途，尤其涉及长链非编码RNA BC009639及其在制备抑制肿瘤细胞转移的制剂中的用途，该长链非编码RNA BC009639能够抑制肿瘤细胞的迁移，以及抑制细胞的增殖能力，能够抑制肿瘤细胞的转移；该长链非编码RNA BC0009639的序列与IMPAD1 mRNA序列的3‘UTR密切相关，其的表达受到藤黄酸的影响，并与肿瘤细胞的生存率负相关。

附图说明

图1显示长链非编码RNA的四种典型作用机制。

图2显示了过表达lncRNA BC009639抑制了95C和95D细胞的愈合速度。

图3显示了lncRNA BC009639过表达显著抑制细胞的增殖能力。

图4显示了lncRNA BC009639完整序列呈现与IMPAD1 mRNA序列部分区域重合的特点，且它们的匹配区域主要在IMPAD1 mRNA序列的3’UTR区域。

图5显示了IMPAD1与lncRNA BC009639二者在肿瘤细胞的表达中存在明显的相关性。

图6显示了IMPAD1与lncRNA BC009639二者在肿瘤细胞的表达中存在明显的相关性。

图7显示了与长链非编码RNA BC009639匹配的区域存在MicroRNA-96-5p和MicroRNA-155-5p的作用位点。

图8显示了MicroRNA-96和MicroRNA-155过表达降低了IMPAD1蛋白的表达水平。

图9显示MicroRNA-96和MicroRNA-155与IMPAD1 mRNA 3’UTR共转染组的荧光素酶活性显著低于对照组。

图10显示了过表达BC009639能够一定程度上阻遏MicroRNA-96和MicroRNA-155对于IMPAD1 mRNA表达水平的抑制作用.

图11显示了同时过表达长链非编码RNA BC009639，IMPAD1 3’UTR序列的报告载体荧光素酶活性将保持正常水平。

图12显示了特异性结合位点突变的长链非编码RNA BC009639无法影响MicroRNA-96和MicroRNA-155对于IMPAD1 mRNA 3’UTR的报告载体荧光素酶活性的抑制作用。

图13显示了lncRNA BC009639并未与Vimentin或IMPAD1结合。

图14显示了，BC009639过表达组小鼠的死亡率低于对照组，而且肺和肝脏的转移灶数量同样低于对照组。

图15显示了给药处理并测定长链非编码RNA BC009639的表达量结果

图16显示了藤黄酸、苦参碱、异补骨脂素、五味子醇甲，统一终浓度为2μmol/L时，藤黄酸显著地促进长链非编码RNA BC009639的表达升高。

图17,18显示了藤黄酸能够明显抑制细胞的增殖，并且抑制作用具有时间和剂量依赖性。

图19显示了长链非编码RNA BC009639的表达水平与细胞生存率之间存在明显的负相关。

图20显示了过表达长链非编码RNA BC009639对于细胞生存率的影响，结果表明细胞的生存率显著下降.

具体实施方式

本发明的实施例中，采用下述材料和方法：

1细胞培养与处理

1.1细胞株

人肺癌巨细胞系细胞株95C、95D，人非小细胞肺癌细胞系细胞株A549，人大细胞肺癌细胞株H460，人肝癌细胞株7721、7404，人结直肠癌细胞株SW480和SW620由本实验室前期保存；长链非编码RNA BC009639过表达稳转A549细胞株及相应的对照质粒稳转细胞株由本实验室构建及保存；所有细胞株培养置于5％浓度二氧化碳、37度恒温条件下，根据ATCC(American Type Culture Collection)建议的最佳条件进行。

1.2细胞培养试剂耗材

1)1640培养基：

RPMI-1640培养基干粉购自Life Gibco公司，采用超纯水配制，每升培养加入2g碳酸氢钠，并以0.22μm滤器抽滤除菌，分装，4℃保存。

2)0.05％胰蛋白酶(Trypsin)：

上述体系充分混匀后，0.22μm无菌滤头过滤，分装后保存于4℃冰箱。

3)10X PBS:

4)试剂

新生牛血清：普通胎牛血清(FBS)，HyCLONE公司。二甲亚枫(DMSO)Sigma公司

无水乙醇，NaCl，Na2HPO4·12H2O，KCl，KH2PO4，EDTA-2Na等国药集团化学试剂有限公司，0.22μm滤膜购于上海实生生物有限公司。

10cm细胞培养皿，6cm细胞培养皿，6孔、24孔、96孔细胞培养板，耐思生物科技有限公司。

5)细胞培养主要仪器

1.3细胞培养及处理

细胞培养在含10％新生牛血清或胎牛血清的RPMI-1640培养基中，添加有100UI/mL青霉素和100μg/mL链霉素，于37℃，5％CO2的条件下培养。细胞传代时，使用胰蛋白酶进行消化，并根据需要以1∶2-4的细胞比例传代培养。

1.4瞬时转染

(1)在进行细胞转染前一天，将对数生长期的细胞接种到60mm培养皿中，培养24h以使转染时细胞融合达到50％-70％。

(2)分别平行配制转染试剂的无血清培养基稀释液和重组质粒的无血清培养基稀释液，质粒含量与转染试剂比为1：3，将重组质粒稀释液逐滴与转染试剂稀释液混合，室温静置孵育30分钟，以形成转染复合体。

(3)弃去原有的细胞培养液，换新鲜的细胞培养液。

(4)孵育结束后，将配制的转染复合体加入细胞培养皿中，混合均匀。37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养24h或48h。

2，质粒构建及转染

材料：

大肠杆菌(E.coli.)菌株Top10，本实验室保存。过表达质粒载体pcDNA3.1Promega公司。荧光素酶报告基因载体pGL3，Invitrogen公司。限制性内切酶HindⅢ、BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ、Hpa Ⅰ、Xho Ⅰ等，New England Biolab公司。T4DNA连接酶，PrimeStar DNA聚合酶，M-MLV RNaseH-逆转录酶，大连宝生物工程(TaKaRa)有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，上海捷瑞生物技术有限公司。质粒中提试剂盒，天根生物科技有限公司；

转染试剂，实验室配置：胰蛋白胨(Tryptone)和酵母抽提物(Yeast Extract)，购自OXOID LTD。

LB LB培养基的配置

LB LB固体培养基的配置

0.1mol/L CaCl2溶液

高压灭菌。

PCR片段的回收实验：

(1)在长波紫外灯下/观察条带，用干净刀片切下所需回收的DNA条带，切除不含DNA的凝胶；

(2)将切下含有DNA条带凝胶称重，加一到两倍体积溶胶结合液；

(3)56℃水浴至胶完全溶解，每1-2分钟涡旋震荡一次帮助加速溶解；

(4)将上一步所得溶液加入吸附柱中(吸附柱放入收集管)，12,000rpm，30-60秒，倒掉收集管中的废液；

(5)加入900μL漂洗液WB(检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm，1分钟，弃废液；

(6)将微量吸附柱放回空收集管中，12,000rpm，2分钟，尽量除去漂洗液，以免残留乙醇抑制下游反应；

(7)取出微量吸附柱，放到干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加15-30μL洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中加热效果更好，也可直接用去离子水洗脱)，室温放置2分钟，12,000rpm，1分钟。

DNA内切酶的酶切实验：

酶切体系如下：

PCR纯化产物于37℃酶切1－4小时，质粒DNA可适当延长时间至过夜。

连接反应：

16℃水浴，连接过夜，产物直接用于转化。

感受态细菌的制备：

(1)将Top 10菌株接种于无氨苄青霉素的LB平板，培养8h-12h。

(2)挑取单克隆到无氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃，220r/min震荡培养过夜。

(3)将上述培养菌液按1：100接种于200mL新鲜LB液体培养基中，37℃，220r/min震荡培养至对数生长期(OD值约0.6)。

(4)将培养后的菌液分装到50mL离心管中，冰浴30min。2400rmp离心10min，弃上清。

(5)加10mL 0.1mol/L预冷CaCl2悬浮细菌。2400rmp，弃上清。

(6)加10mL 0.1mol/L预冷CaCl2悬浮细菌,冰上30min，2400rmp，弃上清。

(7)加1mL 0.1mol/L预冷CaCl2悬浮细菌，分装100μL/EP管，-70℃冰箱中保存。

DNA细菌转化实验：

(1)将1-2μg质粒或连接产物加入感受态细菌中，冰浴30min。

(2)42℃热休克25s，后迅速转入冰上冷却5min。

(3)无菌条件下加入1mL不含抗生素的LB液体培养液，摇匀后37℃孵育培养45min。

(4)离心弃去部分上清，200μL剩余菌液涂在含AMP的LB平板上，将平板置于无菌台直至液体被吸收，37℃恒温培养箱倒置培养12-16h后观察，挑单个菌落进行扩增培养，或保存于4℃。

质粒DNA的抽提采用天根生化科技公司的试剂盒，按照说明书进行操作。

(1)接种新鲜的单个菌落到5mL含氨苄青霉素(Ampicillin)的LB培养基，37℃震荡培养过夜。室温10,000g离心1min，弃上清液；

(2)加入100μL溶液Ⅰ，涡旋振荡器彻底悬浮沉淀的细菌；

(3)加入100μL溶液Ⅱ，温和地上下翻转10次，使菌体充分裂解，菌液变得清亮粘稠；

(4)加入100μL溶液Ⅲ，立即温和地上下翻转10次，充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。12,000rpm，15分钟，将上清转移到新的干净的EP管中，尽量不要吸到沉淀；

(5)加入200μL异丙醇，室温放置2min。12,000rpm，离心3分钟，小心弃上清；

(6)加入500μL 70％酒精洗沉淀。12,000rpm离心3分钟，小心弃上清，干燥；

(7)加入30μL TB buffer溶解。

RNA提取和RT-PCR扩增：

相关试剂和耗材：

Trizol试剂，Invitrogen(USA)。M-MLV逆转录酶，TAKARA公司；氯仿(三氯甲烷)，国药集团化学试剂有限公司；异丙醇、无水乙醇，焦磷酸乙二酯(DEPC)，国药集团化学试剂有限公司；。Taq酶、dNTP等，上海鼎国生物有限公司；Tris、甘氨酸、溴化乙锭(EB)，AMRESCO。琼脂糖粉末，Biowest公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1)50X电泳缓冲液TAE

2)6X琼脂糖凝胶电泳上样缓冲液：0.25％溴酚兰，30％甘油水溶液。

1.4 RNA提取和PCR扩增相关仪器

RNA提取依据Trizol(Invitrogen)说明书进行:

(1)用预冷的PBS将培养在细胞培养板上的细胞洗3次；

(2)加入1mL Trizol在培养皿中，冰上10min；

(3)将细胞裂解液转移到无核糖核苷酸酶的1.5mL EP管，加入200μL氯仿，震荡混匀15s，室温放置5min，12,000rpm低温离心15min；

(4)吸取上层无色水相到另一1.5mL EP管中，加入等体积异丙醇，4℃放置10min后，12,000rpm离心10min；

(5)弃去上清，用75％的乙醇1mL洗涤，12,000rpm低温离心10min；

(6)彻底弃去上清，在室温下干燥10-15分钟，用40μL DEPC水溶解RNA；(7)计算浓度与纯度，并储存于-70度。

逆转录合成cDNA

预变性70℃10min，冰上至少5min

30℃15min，42℃1h，70℃10min，后保存于-20℃冰箱备用。

PCR反应

PCR反应条件：94℃5min，94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，25～35Cycles，72℃10min。

琼脂糖凝胶电泳：

(1)制胶：称取0.5g琼脂糖加入50mL 1×TAE buffer中，置于微波炉加热至沸腾，灌制凝胶板，待胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加入适量的1×TAE buffer至液面完全覆盖胶面；

(2)电泳：取PCR产物上样，5～6V/cm电压下电泳；

(3)凝胶成像仪成像并保存结果。

实时定量PCR：

(1)采用Bio-Rad公司的FXC-Connect荧光实时定量PCR仪进行实时定量PCR反应；

(2)反应体系

(3)反应程序

对各基因mRNA的表达进行定量分析：

反应结束后使用仪器自带软件对Real time PCR扩增曲线及熔解曲线进行数据分析处理，初始数据结果以Ct值(cycle threshold)表示，即每个反应体系内的信号达到设定的阈值所需要的循环数，采用ΔΔCT法计算各基因mRNA表达水平。

细胞蛋白提取及免疫印迹(Western Blot)：

相关试剂

10％分离胶

混匀后灌入玻璃板间，75％乙醇封顶液面。凝胶完全聚合需10-30min；

5％积层胶：

倒去分离胶上的乙醇，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合后备用；

相关仪器

蛋白提取：

预冷的PBS洗涤细胞3次。再加入1mL预冷的PBS，转移到1.5mL EP管中，低温，3000rpm离心5分钟，弃去液体。向EP管中加入相应体积的蛋白裂解液，轻轻吹打混匀，按1:1加入2×SDS上样缓冲液(含1.5％β-巯基乙醇)。沸水浴10min，即可上样或-70℃保存。

SDS-PAGE：

1)SDS-PAGE胶的制备

分离胶(10％)和浓缩胶(5％)的成分如前所示；分离胶混匀后灌入玻璃板间，以75％酒精封液面。凝胶完全聚合后酒精倒去，用滤纸小心吸干残留的酒精，加入混匀的浓缩胶，立即将梳子插入玻璃板间，待完全聚合后备用；

2)上样及电泳

在电泳槽中加入300mL，1×电泳缓冲液。样品室温平衡后，12,000×g离心5min。取上清作加入胶孔中，并加入3μL蛋白标准品作参照，连接电源，电泳时，浓缩胶恒压80V，分离胶恒压120V，电泳1.5h-2.5h；

3)转膜

取与胶尺寸相符的PVDF膜，置于甲醇溶液浸泡5min，后转移到转移缓冲液平衡。电泳完成后，切取含目的蛋白条带的胶。打开蛋白质转移槽的盖板，依次放入：转移缓冲液浸泡过的滤纸3张；切取的凝胶，并小心地赶走滤纸和胶之间气泡；PVDF膜；另3张用转移缓冲液浸泡过的滤纸；小心地合上转移槽的盖板。插入电极，300mA恒流转膜2-2.5h；

4)封闭及免疫印记

将膜置于8％脱脂奶粉溶液中，摇床上轻摇1h-2h。一抗4℃孵育过夜。去掉一抗溶液，并用PBST缓冲液洗膜6次，每次5min。二抗室温孵育2h后PBST洗膜6次，每次5min。最后膜经ECL kits处理，用自动凝胶成像仪检测蛋白条带。

划痕实验(wound healing)：

(1)将细胞种入培养皿中，进行所需处理，24h或48h后，细胞的融合率应已较高；

(2)将培养基弃去，PBS清洗细胞2～3次；

(3)用10μL枪头，在培养皿细胞表面划出相互平行的直线，用PBS冲洗1～2次，添加新的培养基，继续培养；

(4)在合适的时间点，0h、6h、18h、24h，每次选取相同的3～4个区域进行拍照(X10倍)记录分析。

细胞迁移实验：

(1)制备细胞悬液：可先让细胞在无血清的条件下饥饿12-24h，以去除血清的影响。消化细胞，用无菌的PBS洗1-2遍，再将细胞用无血清的培养基重悬，调整细胞密度；

(2)接种细胞：取100μL细胞悬液加入转移小室中。24孔板(下室)中加入500μL含10％胎牛血清的培养基，作为本次实验的趋化因子。继续培养12-48h。

(3)细胞计数：用棉签擦去转移小室内的细胞，0.1％结晶紫染色，正置显微镜进行观察和拍照，随机选取3-5个视野或整个膜计数细胞个数。

MTT实验：

(1)接种细胞：将对数生长期的细胞进行常规消化，细胞浓度调整为1.0×10⁴/ml，接种在96孔板上，每孔200μl；

(2)呈色反应：弃去培养液，每孔加入5mg/ml(0.5％)的MTT 20μl，37℃条件下培养4h，将上清液弃去，每孔加入DMSO(二甲基亚砜)200μl后低速振荡10min使结晶溶解，最后使用酶标仪570nm波长来测定各孔吸光度，取每组3孔的平均值进行计算。

原位杂交：

(1)玻片处理：采用多聚赖氨酸或APES，

(2)细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，长好后0.1M PBS(PH7.4)洗3次，

(3)细胞固定：固定液为4％多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2-7.4)，含有1/1000DEPC。室温固定20-30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃可保存2周以上，

(4)暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1mL 3％柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶)，37℃或室温消化5-120秒钟。0.5M TBS洗3次5分钟。蒸馏水洗1次，

(5)预杂交：按每张切片20μL加预杂交液。恒温37℃，2-4小时后吸取多余液体，不洗，

(6)杂交：用杂交稀释液稀释生物素标记的寡核苷酸探针，浓度一般0.5-2μg/mL。每张切片加20μL杂交液。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭掉后，盖在切片上。恒温箱37-40℃杂交过夜，

(7)杂交后洗涤：去掉盖玻片，30-37℃左右水温的2XSSC洗涤5分钟2次；0.5×SSC洗涤15分钟1次；0.2XSSC洗涤15分钟1次。必要时可重复0.2×SSC洗涤1次，

(8)滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗，

(9)滴加SABC-AP：37℃30分钟。0.5M TBS洗5分钟4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤，

(10)BCIP/NBT显色：BCIP/NBT(X20)按1：20的比例用0.01M TBS(PH9.5)稀释，混匀。显色液加至标本上。一般30-37℃显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。充分水洗，

(11)必要时核固红复染5-15分钟，水洗，

(12)水溶性封片剂封片。

荧光素酶报告基因检测：

荧光素酶的活性使用Luciferase Assay kit(Promega)试剂盒进行检测，实验过程参照试剂盒说明书，

(1)收集和裂解细胞：细胞转染后，用消毒的PBS清洗两次，加入Cell CultureLysis Reagent，室温下轻微振摇15min，

(2)用枪头反复吹打细胞，使细胞充分裂解，

(3)取10μL细胞裂解液转移到透光的200μL小EP管中，然后快速加入15μL的LAR II(Luciferase Assay Reagent II)；并在小EP管中吹打均匀，用阅读仪测量可见光强度10s；记录下所得到的数据进行分析。每组重复三次数据独立。

RNA pull-down：

单链pcDNA3.1b-BC模板制备

1)限制性内切酶EcoRⅠ酶切质粒pcDNA3.1b-BC，4h，制备长非 编码RNA-BC009639正链模板，酶切体系如下：

2)纯化酶切质粒：

在上述酶切体系中，加入等体积的氯仿：苯酚(1:1)，轻轻摇晃15s室温静置5min，取上层水相置另一新EP管中，加入等体积(50μL)的氯仿，轻轻摇晃15s，室温静置5min，取上层水相置另一新EP管中，加入1/10体积3M醋酸钠，混匀。加入两倍体积的预冷的无水乙醇，混匀,-20℃孵育1h，12,000rpm,4℃离心15min，移除上清，加入500μL 75％酒精洗沉淀，4℃，12,000rpm离心5min，移除上清，质粒，并测定浓度。

长非编码RNA-AY927503生物素标记，采用罗氏公司RNA生物素标记试剂和T7RNA聚合酶，方法按照说明书进行。

37℃孵育2h。加入2μL 0.2M EDTA，终止反应；加入2.5μL 4mol/L LiCl，75μL预冷的无水乙醇,-20℃孵育2h。12,000rpm,4℃，离心10min,移除上清。加入50μL预冷的70％酒精。4℃，12,000rpm离心10min，移除上清；充分干燥后，加入100μL DEPC水，1μLRecombinant RNase inhibitor，37℃，30min。测定浓度。

蛋白样品制备：

(1)10cm皿培养的细胞，弃去培养基，预冷PBS洗两遍，

(2)加入1mL预冷的PBS，刮下细胞，转移到1.5mL EP管中，低温，3000rpm离心5分钟，弃去液体，

(3)加入1mL RIPA缓冲液，10μL Protease inhibitor cocktail，冰上放置5min，充分裂解，-80℃保存。

RNA pull-down实验：

(1)洗涤珠子：20μL亲和素结合的珠子，加入100μL RIPA buffer,3000rpm离心1min，弃掉上层液体子，

(2)预澄清：在珠子中加入1mL细胞裂解液，4℃旋转1h。3000rpm离心1min，将上层液体转移到新的EP管中，

(3)加入探针：预澄清之后的细胞裂解液，每300μL分成一组，共分为3组，分别进行下列处理：

加入3μg生物素标记的全长长非编码RNA-BC009639探针；

不加任何探针；

加入3μg生物素标记的无意义探针。每种处理中均加入7.5mL Recombinant RNaseinhibitor,剩余留作Input，

(4)pull-down：4℃旋转2h，

(5)封闭珠子：取120μL珠子，加入600μL RIPA buffer，混匀后，3000rpm离心1min，弃掉上层液体。再加入120μL Northern block，4℃旋转1h，然后将其均分成3个EP管，每管40μL，3000rpm离心1min，弃掉上层液体，

(6)加入珠子：在3管珠子中，分别加入步骤3的三个处理组样品，4℃旋转1h，

(7)洗涤：每管中加入400μL新消毒的PBS，4℃旋转10min，3000rpm离心1min，弃掉上层液体。重复两次，

(8)加入40μL 2×loading buffer，煮沸5min，冻于-80℃保存。

RIP(RNA immunoprecipitation)实验：

参考MILLIPORE公司Magna RIP RNA-Binding Protein

Immunoprecipitation Kit：

裂解细胞：

(1)准备RIP Lysis Buffer：100mL RIP Lysis Buffer中加入0.5μL proteaseinhibitor，0.25μL RNase inhibitor，

(2)两个10cm培养皿培养的细胞，PBS洗两遍，

(3)加入1mL PBS，刮下细胞，转移到1.5mL EP管中，4℃,1500rpm离心5分钟，弃去液体，

(4)加入100μL准备好的RIP Lysis Buffer，混匀，冰上孵育5min。12,000rpm离心10min，取上清。保存在-80℃冰箱。

准备免疫沉淀的磁珠：

上下颠倒，混匀磁珠，目标抗体组和阴性对照组，每组EP管中各加入50μL充分混匀的磁珠；磁珠中加入500μL RIP Wash Buffer，混匀，将EP管置于磁力分离器上，待磁珠聚集后，弃去上清，重复一次；每管加入100μL RIP Wash Buffer重悬珠子，其中一个EP管中加入5μg目的抗体，另一EP管中加入5μg阴性对照抗体。室温旋转孵育30min；将EP管置于磁力分离器上，待磁珠聚集后，弃去上清。加入500μL RIP Wash Buffer，混匀，将EP管置于磁力分离器上，待磁珠聚集后，弃去上清，重复两次。

RNA与蛋白形成复合物：

准备RIP Immunoprecipitation Buffer，每组需要900μL(35μL 0.5M EDTA，5μLRNase inhibitor，860μLRIP Wash Buffer)，在上述步骤留下的珠子-抗体复合物中，每管加入900μL RIP Immunoprecipitation Buffer，加入杉树步骤中的100μL细胞裂解液，留取10μL作为Input，其余4℃旋转孵育3h；将EP管置于磁力分离器上，待磁珠聚集后，弃去上清。加入500μL RIP Wash Buffer，4℃旋转10min，将EP管置于磁力分离器上，待磁珠聚集后，弃去上清，重复五次。

RNA纯化：

(1)准备蛋白酶K Buffer，每组需150μL(117μL RIP Wash Buffer，15μL 10％SDS，8μL 10mg/mL蛋白酶K)，

(2)在洗涤完全的珠子中，加入150μL蛋白酶K Buffer，重悬，在留取的Input中，加入150μL蛋白酶K Buffer，55℃振荡孵育30min，

(3)将EP管置于磁力分离器上，待磁珠聚集后，将上清转移到新的EP管中，加入250μL RIP Wash Buffer，

(4)加入400μL苯酚：氯仿：异戊醇＝125:24:1，涡旋15s，室温，14,000rpm，离心10min，

(5)将350μL上层水相转移至新的EP管中，加入400μL氯仿，涡旋15s，室温，14,000rpm，离心10min。将300μL上层水相转移至新的EP管中，

(6)每管加入50μL Salt SolutionⅠ，15μL Salt SolutionⅡ，5μL PrecipitateEnhancer，850μL无水乙醇，混匀，-80℃，1h～过夜，沉淀RNA，

(7)4℃，14,000rpm，离心30min。弃上清。加入80％酒精洗沉淀，4℃，14,000rpm，离心15min，弃上清，

(8)空气中晾干，加入10～20μL RNase-free water。

裸鼠尾静脉注射观测体内肿瘤转移实验：

(1)健康雌性BALB/c裸鼠16只(上海斯莱克实验动物有限公司)，分为实验组和对照组各8只，约4-5周龄，在普通环境下(通风，恒温18—23℃，湿度60％)饲养，喂饲普通饲料，自由饮水；

(2)实验当天制备lncRNA BC009639过表达稳转细胞悬液和相应对照组细胞悬液，调整细胞浓度为1X10⁷/ml，放置冰欲中备用；

(3)固定裸鼠，暴露尾静脉，直接注射细胞悬液0.1ml；

(4)四周后，处死所有裸鼠，解剖并取出肝脏和肺脏，固定液固定后，置于相差显微镜下观察组织的肿瘤转移灶数目，并拍照计数。

实施例1长链非编码RNA BC009639抑制肺癌细胞迁移

1.1肺癌细胞长链非编码RNA表达芯片数据

选取一对具有不同转移潜能的肺癌细胞株95C和95D作为对比研究对象，其中95D的转移能力高于95C，利用长链非编码RNA芯片获得这一对细胞株中各自的长链非编码RNA表达数据，在获得的数据中，通过生物信息学分析手段，筛选在这一对细胞中具有相对较高的表达丰度，并且具有高度的表达差异性长链非编码RNA，其中，长链非编码RNA BC009639具有相对较高的表达水平，且更重要的是其在95C和95D的表达量差异非常显著，选取其作为进一步的研究对象；

1.2 RT-PCR验证BC009639在95C、D中表达

应用RT-PCR的手段，检测细胞中符合研究标准的lncRNA BC009639的表达水平，结果显示，95C细胞中lncRNA BC009639的表达水平显著高于95D细胞，与芯片的检测数据符合；

1.3 Real-time PCR检测BC009639在其他肿瘤细胞中的表达

选取多种肿瘤细胞，包括肺癌细胞95C、95D、A549、H460，肝癌细胞SMMC-7721、BEL-7404细胞，以及结直肠癌细胞SW480和SW620，结果表明，lncRNA BC009639在所述肿瘤细胞中，均具有相对较高的表达量，但是在具有高转移能力的95D细胞中，lncRNA BC009639的表达量显著低于95C细胞、A549、H460细胞，与前述RT-PCR的结果一致，提示lncRNA BC009639潜在的研究意义。

1.4 lncRNA BC009639对迁移的影响

构建lncRNA BC009639的表达载体，深入研究其在细胞中的作用，转染细胞使其过表达lncRNA BC009639，并进行划痕实验(Wound healing)和迁移实验以分析其对于细胞迁移能力的影响；

划痕实验中，分别观察并记录95C和95D细胞在lncRNA BC009639过表达之后，0H、6H、18H、24H的划痕愈合情况，综合对比结果显示，过表达lncRNA BC009639抑制了95C和95D细胞的愈合速度；在迁移实验中，过表达lncRNA BC009639之后，细胞穿越小室的能力显著下降，同样表明过表达lncRNA BC009639抑制了细胞的迁移能力，上述两个实验初步证明了lncRNA BC009639影响肿瘤细胞的迁移能力。

1.5 lncRNA BC009639对细胞生长的影响

分别用lncRNA BC009639表达载体转染细胞24小时，随后分析细胞的增殖能力，结果显示，lncRNA BC009639过表达显著抑制细胞的增殖能力，提示lncRNA BC009639还可能影响肿瘤细胞的增殖能力。

1.6 lncRNA BC009639在亚细胞的定位

设计lncRNA BC009639的原位杂交探针，分析其在细胞的分布位置，原位杂交的结果显示lncRNA BC009639主要分布于细胞核周围，提示其可能与转录后调控有关。

上述实验结果显示了：长链非编码RNA BC009639在具有不同转移潜能的肺癌细中差异表达，提示其可能与转移相关；长链非编码RNA BC009639抑制肺癌细胞迁移；长链非编码RNA BC009639影响肿瘤细胞的增殖能力；长链非编码RNA BC009639主要分布于细胞核周围。

实施例2 LncRNA BC009639影响MiR-96和MiR-155的功能实验

lncRNA BC009639序列分析

对lncRNA BC009639的序列进行分析，BLAST结果显示在人类基因数据库中，lncRNA BC009639与一个名为IMPAD1的mRNA序列高度匹配,lncRNA BC009639完整序列呈现与IMPAD1 mRNA序列部分区域重合的特点，且它们的匹配区域主要在IMPAD1 mRNA序列的3’UTR区域；

IMPAD1和lncRNA BC009639的相关性

基于IMPAD1基因对于生理发育的具有重要作用，进一步研究其在各种肿瘤细胞中的表达水平，通过real-time PCR检测它在肺癌、肝癌、结直肠癌等几种不同肿瘤细胞中表达水平，检测结果显示，其在各类肿瘤细胞中具有相对较高的表达量，基于IMPAD1与lncRNABC009639在碱基序列上的相关性，进一步通过通过二者的real-time PCR检测结果数据的相关性分析显示二者在肿瘤细胞的表达中存在明显的相关性；

针对IMPAD1的3’UTR区域，应用TargetScan、MircroRNA.org、miRBase等MicroRNA作用靶点预测工具分析该区域中，尤其是与长链非编码RNA BC009639匹配的区域可能存在的MicroRNA作用位点，综合分析结果，发现了在这个区域中MicroRNA-96-5p和MicroRNA-155-5p的作用位点；

MicroRNA-96和MicroRNA-155影响IMPAD1基因表达

分别构建MicroRNA-96和MicroRNA-155的过表达载体，并分别转染95D细胞，检测IMPAD1在MicroRNA-96和MicroRNA-155过表达后，在mRNA水平和蛋白水平所受到的影响；RT-PCR结果显示，MicroRNA-96和MicroRNA-155过表达降低了IMPAD1 mRNA的表达水平，而Western blot结果显示MicroRNA-96和MicroRNA-155过表达降低了IMPAD1蛋白的表达水平，结果表明，IMPAD1在mRNA水平和蛋白水平都受到了MicroRNA-96和MicroRNA-155和调控影响。

分析MicroRNA-96和MicroRNA-155对于IMPAD1 3’非翻译区(UTR)的影响作用：

构建包含IMPAD1 mRNA 3’UTR序列的报告载体siCheck2-IMPAD1-3’UTR，并分别与MicroRNA-96和MicroRNA-155共同转染细胞后检测荧光素酶活性，结果显示MicroRNA-96和MicroRNA-155与IMPAD1 mRNA 3’UTR共转染组的荧光素酶活性显著低于对照组，结果充分说明MicroRNA-96和MicroRNA-155靶向作用于IMPAD1 3’UTR，进而在mRNA水平和蛋白水平影响IMPAD1基因表达。

LncRNA BC09639影响MicroRNA-96和MicroRNA-155对于IMPAD1的抑制作用：

分别将MicroRNA-96表达载体、MicroRNA-155表达载体与LncRNA BC09639表达载体共同转染细胞，随后分析其对于IMPAD1 mRNA表达水平的影响，结果发现此外，我们进一步地利用萤光素酶报告基因系统，在分别将MicroRNA-96表达载体和MicroRNA-155表达载体与IMPAD1 mRNA 3’UTR序列的萤光素酶报告基因载体共同转染细胞的系统中，再同时转染长链非编码RNA BC009639的过表达载体，并分析IMPAD1 3’UTR报告载体的荧光素酶活性所受的影响，结果显示，MicroRNA-96和MicroRNA-155过表达能使IMPAD1 mRNA 3’UTR序列的报告载体荧光素酶活性显著降低，然而若在这个系统中同时过表达长链非编码RNABC009639，IMPAD1 3’UTR序列的报告载体荧光素酶活性又将保持正常水平(Figure2.5.2)，该结果提示长链非编码RNA BC009639能够影响MicroRNA-96和MicroRNA-155对于IMPAD1 3’UTR的抑制作用，进一步验证了长链非编码RNA BC009639能够通过ceRNA效应机制发挥作用。

LncRNA BC09639对于MicroRNA-96和MicroRNA-155作用的影响与其结合位点相关：

进一步构建了长链非编码RNA BC009639序列上MicroRNA-96结合位点突变的表达载体pcDNA3.1b-BC96mu和MicroRNA-155结合位点突变的表达载体pcDNA3.1b-BC155mu，分别各自改变了结合位点中的3个碱基序列，研究其对于两个MicroRNA功能的影响，结果显示，特异性结合位点突变的长链非编码RNA BC009639无法影响MicroRNA-96和MicroRNA-155对于IMPAD1 mRNA 3’UTR的报告载体荧光素酶活性的抑制作用。

寻找lncRNA BC009639可能结合的蛋白分子：

采用RNA pull-down的方法用lncRNA BC009639沉淀细胞中可能与其结合的蛋白分子，质谱分析选取目的蛋白分子进行研究验证，选取质谱得分最高的Vimentin和IMPAD1在RNA pull-down实验和RIP(RNA immunoprecipitation)实验中进行验证，实验结果显示lncRNA BC009639并未与Vimentin或IMPAD1结合。

LncRNA BC009639抑制体内转移实验

小鼠动物活体实验，用长链非编码RNA BC009639表达载体转染A549细胞，并在48h后用含有G418的培养基培养细胞，待细胞大面积死亡后，剩余存活细胞长成单克隆株时，挑出具有G418抗性的稳转单克隆细胞株单独培养备用；对两组免疫缺陷小鼠，每组各雌性8只，分别同时进行尾静脉注射经处理的lncRNA BC009639过表达A549稳转细胞株及相应对照A549稳转细胞株，并在随后的时间内隔日观察或对小鼠进行称重，30天后处死小鼠并解剖，取肺和肝脏观察肿瘤转移或病变情况，结果显示，BC009639过表达组小鼠的死亡率低于对照组，而且肺和肝脏的转移灶数量同样低于对照组，提示在体内过表达长链非编码RNABC009639可能抑制了肿瘤的转移并提高存活率。

上述实验结果表明：长链非编码RNA BC009639与IMPAD1(肌醇单磷酸激酶蛋白1)在基因序列和细胞表达水平上密切相关；MicroRNA-96和MicroRNA-155通过影响IMPAD1mRNA的稳定性，抑制其基因表达；长链非编码RNA BC009639能影响icroRNA-96和MicroRNA-155对于IMPAD1基因表达的抑制作用；长链非编码RNA BC009639对MicroRNA-96和MicroRNA-155功能的影响与其结合位点相关；长链非编码RNA BC009639抑制肺癌细胞在裸鼠体内的转移。

实施例3 LncRNA BC009639参与藤黄酸的作用机制研究

藤黄酸促进LncRNA BC009639的表达实验：

选取表1所示的多种不同的中草药成分及其对照品提取物，处理细胞并检测长链非编码RNA BC009639表达水平的改变情况(Figure 3.1)，结果显示藤黄酸(2μmol/L)、黄芩素(0.1mmol/L)、苦参碱(0.1mg/mL)、异补骨脂素(5μmol/L)、五味子醇甲(20μmol/L)、补骨脂、北五味子对A549中长链非编码RNA BC009639表达水平的影响较大，进一步选取藤黄酸、苦参碱、异补骨脂素、五味子醇甲，统一终浓度为2μmol/L，进行细胞培养、给药处理并测定长链非编码RNA BC009639的表达量结果显示，藤黄酸、苦参碱、异补骨脂素、五味子醇甲，统一终浓度为2μmol/L时，藤黄酸显著地促进长链非编码RNA BC009639的表达升高。

表1 13种中药提取物和19种对照品

利用不同浓度的藤黄酸处理A549和95D细胞，并检测长链非编码RNA BC009639的表达水平，结果表明，长链非编码RNA BC009639的表达水平受到藤黄酸的影响具有一定的浓度依赖性；

分析长链非编码RNA BC009639的表达水平与细胞生存率之间的相关性，结果显示，其与细胞的生存率存在明显的负相关，若去除具有细胞毒性的高浓度组，其在A549和95D细胞的相关性分析R²值分别为0.9735和0.9867；分析过表达长链非编码RNA BC009639对于细胞生存率的影响，结果表明，细胞的生存率显著下降，提示其确实影响了肿瘤细胞的生长和增殖。

上述实验结果表明，长链非编码RNA BC009639影响了肿瘤细胞的生长和增殖，其表达水平与细胞的生存率间存在明显的负相关，研究显示藤黄酸能够显著促进长链非编码RNA BC009639的表达，提示其表达水平受到藤黄酸的调控，而藤黄酸又具有较明确的抗肿瘤活性，能够抑制细胞的增殖和促进细胞的凋亡，因此长链非编码RNA BC009639可能参与了藤黄酸对细胞增殖能力的影响过程。

Claims (9)

1.长链非编码RNA在制备抑制肿瘤细胞转移的制剂中的用途。

2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的长链非编码RNA为长链非编码RNABC0009639。

3.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的长链非编码RNA BC0009639抑制肿瘤细胞的迁移。

4.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的长链非编码RNA BC0009639抑制细胞的增殖能力。

5.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的长链非编码RNA BC0009639抑制肿瘤细胞的转移。

6.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的长链非编码RNA BC0009639的序列与IMPAD1mRNA序列的3‘UTR密切相关。

7.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的长链非编码RNA BC0009639其表达受藤黄酸的影响。

8.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的长链非编码RNA BC0009639与肿瘤细胞的生存率负相关。

9.按权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤细胞为肺癌细胞。