CN113304267B - 肺癌的治疗靶点及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了肺癌的治疗靶点及其应用,所述的靶点为p38K165甲基化位点。本发明提供了一种组合物,所述的组合物包括抑制p38K165位点甲基化的试剂。本发明提供了所述组合物在制备预防肺癌或治疗肺癌或抑制肺癌细胞增殖或抑制肺癌细胞转移的药物中的应用。本发明提供了一种非治疗目的的抑制肺癌细胞增殖或抑制肺癌细胞转移的方法。本发明还提供了一种用于筛选预防或治疗肺癌的候选药物的方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体涉及肺癌的治疗靶点及其应用。
背景技术
肺癌是当今威胁人类健康的严重疾病,与其他癌症的发生率和死亡率比较,皆高踞首位,无论是在全世界或其他大国如中国、美国的统计中,都是一样,这可能与自然环境日益受到破坏,空气污染日趋严重密切相关。以肺癌的病理细胞学分析,非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)最为常见,约占肺癌发生率的75~80%。由于肺癌起病隐匿,初起时症状无特异性,只见咳嗽、胸痛等,所以确诊时多属国际肺癌TNM分期的中晚期,癌瘤已经局部或远处转移,失去了用手术切除根治的机会,放疗的适应症也不多,所以化疗和分子靶向药物治疗成为西医治疗中晚期肺癌的首选方案。现今公认的一线化疗方案是含铂两药联合方案,即顺铂(cisplatin,DDP)或卡铂(carboplatin,CBP)联合一种第3代化疗药物:如吉西他滨(gemcitabine,GEM)、长春瑞滨(navelbine,NVB)、紫杉醇(paclitaxel,PTX)或多西他赛(docetaxel)等。多项研究指出各种化疗方案的疗效相若,总有效率为17%-22%,中位生存期7.4-8.1个月,1年生存率31%-34%,2年生存率10%-13%,多项疗效指标都到达平台期,即使延长疗程或增加药物,也很难再有突破进展。有研究显示,一线化疗的最佳疗程约为4至6周期,过多的周期(6周期或直至疾病进展)并不能延长患者的总生存期,反而增加毒性反应和导致生活质量下降。三药联合化疗与双药联合相比,没有显著提高疗效,反而增加细胞毒性。由于这些化疗方案皆使用细胞毒药物,杀灭癌细胞的同时也损害正常器官组织,所以有不同程度的毒副反应,包括骨髓抑制、胃肠道症状及肝肾毒性等,引致患者造血功能受损,出现贫血、白细胞减少、机体免疫力下降;恶心、呕吐、泄泻、食欲欠佳;肝、肾功能损害等,轻则影响患者的生存质量,严重者甚至要中断化疗疗程,或因毒性过重而缩短生存期。因此,寻找其他有效治疗肺癌的方法,一直是临床医生迫切的任务。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的用于治疗肺癌的药物。
为实现上述目的,本发明采用了如下技术方案:
本发明第一方面提供了一种组合物,所述的组合物包括抑制p38 K165位点甲基化的试剂。
进一步,所述的抑制p38 K165位点甲基化的试剂包括核苷类似物、小分子抑制剂、天然产物、抗体、寡核苷酸。
进一步,所述的抑制p38 K165位点甲基化的试剂包括通过基因突变技术将p38K165赖氨酸位点突变为除蛋氨酸以外的氨基酸的试剂。
所述的基因突变技术包括定点突变技术、随机突变技术。
进一步,所述的基因突变技术为定点突变技术。
所述的除蛋氨酸以外的氨基酸包括但不限于色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸。
进一步,所述的除蛋氨酸以外的氨基酸为精氨酸。
在本发明中,可以通过定点突变技术将p38 K165赖氨酸位点突变为除蛋氨酸以外的氨基酸。所述的定点突变技术包括但不限于寡核苷酸盒式诱变技术、寡核苷酸引物诱变技术、重叠延伸介导的定点诱变技术、大引物诱变法。
本发明第二方面提供了本发明第一方面所述的组合物在制备预防肺癌或治疗肺癌或抑制肺癌细胞增殖或抑制肺癌细胞转移的药物中的应用。
术语“预防”表示防止有患病风险的对象中的肺癌的出现或者已消失的肺癌的复发。
术语“治疗”表示控制、减轻或缓解肺癌的病理学进展和延长患病对象的存活期。
根据本发明进行治疗的患者包括任何温血动物(恒温动物),诸如但不限于人类、猴或其他低等灵长类动物、马、狗、兔、豚鼠或小鼠。例如,所述患者为人类。医学领域的技术人员能够轻易地鉴定受肺癌折磨及需要治疗的个体患者。
“抑制肺癌细胞增殖”是指防止或减缓肺癌细胞的增殖。
“抑制肺癌细胞转移”是指防止或减缓肺癌细胞的转移。
进一步,所述的肺癌包括非小细胞肺癌、小细胞肺癌。
进一步,所述的肺癌为非小细胞肺癌。
所述的非小细胞肺癌包括但不限于鳞状上皮细胞癌、肺腺癌(即,腺泡(acinar)、乳头状(papillary)和支气管肺泡(bronchoalveolar))、大细胞癌(即,巨细胞和透明细胞)、腺鳞癌和未分化癌。在本发明的具体实施例中,所述的非小细胞肺癌为肺腺癌。
本发明中所述的肺癌细胞包括但不限于NCI-H446细胞、NCI-H209细胞、NCI-H345细胞、DMS153细胞、NCI-H1688细胞、NCI-H460细胞、NCI-H661细胞、NCI-H520细胞、NCI-H1650细胞、NCI-H1975细胞、NCI-H1573细胞、16HBE细胞、A549细胞、SK-MES-1细胞、NCI-H460细胞、NCI-H1299细胞、NCI-H157细胞、NCI-H1975细胞、NCI-H838细胞、NCI-H2227细胞、NCI-H292细胞、NCI-H596细胞、NCI-H23细胞、NCI-H2087细胞、A427细胞、H125细胞、PG细胞、QG-56细胞、801-D细胞、SPC-A1细胞、LTPEP-a-2细胞、LTEP-a-2细胞、SK-MES-1细胞、Calu-3细胞、Calu-6细胞、Tul-1细胞、HFL-I细胞、PG49细胞、GLC-82细胞、HLAmP细胞、SK-LU-1细胞、LTEP-s细胞、LTEP-sm细胞、LTEP-P细胞、973细胞、95-C细胞、95-D细胞、A2细胞、Hs793.Sk细胞。
进一步,所述的肺癌细胞为肺腺癌细胞。
本发明中所述的肺腺癌细胞包括但不限于A549细胞、NCI-H1299细胞、NCI-H157细胞、NCI-H1975细胞、NCI-H1573细胞、NCI-H2087细胞、SPC-A1细胞、LTPEP-a-2细胞、LTEP-a-2细胞、Calu-3细胞、PG49细胞、GLC-82细胞、A2细胞、Hs 793.Sk细胞。在本发明的具体实施例中,所述的肺腺癌细胞为A549细胞。
本发明第三方面提供了一种非治疗目的的抑制肺癌细胞增殖或抑制肺癌细胞转移的方法,所述的方法包括向需要其的对象使用本发明第一方面所述的组合物。
进一步,所述的肺癌细胞为肺腺癌细胞。
进一步,所述的肺腺癌细胞为A549细胞。
本发明第四方面提供了一种试剂,所述的试剂包括能够检测样本中p38 K165位点甲基化水平的试剂。
进一步,所述的试剂包括通过甲基化芯片、甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法、荧光定量法、高通量测序、焦磷酸测序定量、DNA印迹法、限制性界标基因组扫描、单核苷酸引物延伸、CpG岛微阵列、单核苷酸引物延伸SNUPE、质谱检测p38 K165位点甲基化水平的试剂。
甲基化芯片是指一种甲基化特异性寡核苷酸芯片,其基本原理是利用亚硫酸氢盐处理DNA使其中未发生甲基化的胞嘧啶C转化为尿嘧啶U,之后进行PCR扩增,通过荧光标记使其产物带上荧光,U与A配对产生T,而甲基化的C不会被亚硫酸盐修饰,这样DNA中包含的甲基化信息就转变为具有差异的DNA序列,PCR产物与芯片上寡核苷酸杂交,通过检测荧光信号强度即可测得不同的基因位点甲基化状况。世界首款DNA甲基化芯片HumanMethylation27BeadChip于2009年推出,可检测人基因组2.7万个甲基化位点,之后又陆续推出了27K芯片升级版。基于芯片的甲基化图谱的分析,目前包括Agilent平台、Illumina平台、Roche NimbleGen平台等。而目前研究中最常见的甲基化芯片多为Illumina HumanMethylation 450K BeadChip和Infinium MethylationEPIC BeadChip(简称850k芯片)。
甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR,MS-PCR/MSP)是一种特异位点甲基化检测技术。其基本原理是指先对目的DNA片段用亚硫酸氢盐处理,然后分别针对目的位点甲基化和非甲基化的情况设计两种对应引物,这样目的DNA即可根据自身的甲基化状态分别在相应的PCR组中进行扩增,并将结果通过凝胶电泳图像显示出来。根据扩增条带出现的PCR组可判断该位点甲基化的状况,若该位点发生甲基化,则可利用甲基化引物扩增出条带,若未发生甲基化,则利用未甲基化引物扩增出条带。该方法灵敏度高,无需特殊仪器,因此,经济实用,是应用最为广泛的检测方法。
亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing,BS)是建立在MSP基础上进一步深入研究CpG岛各个位点甲基化情况的一种方法,其基本原理是重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变,行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG,以免受甲基化因素的影响)所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。最后,对PCR产物进行测序,并且与未经处理的序列比较,判断CpG位点是否发生甲基化。此方法是一种可靠性及精确度均很高的方法,能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态。在寻找有意义的关键性CpG位点上,有其他方法无法比拟的优点。测序法以CpG岛两侧不含CpG点的一段序列为引物配对区,所以能够同时扩增出甲基化和非甲基化靶序列。
联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(Combined bisulfite restrictionanalysis,COBRA)是一种不需预先知道CpG位点及样本序列,可进行甲基化水平的定量研究的方法,其基本原理是先对样本DNA行亚硫酸氢钠处理后,PCR扩增目的片段,随后用限制性内切酶消化,此酶识别序列中需包含CG序列,如BstUI(CGCG)。若其识别序列中的C发生完全甲基化(5mCG5mCG),则PCR扩增后保留为CGCG,BstU I能够识别并进行切割;若待测序列中,C未发生甲基化,则PCR后转变为TGTG,BstU I识别位点丢失,不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。Brena等联用COBRA和Agilent 2100Bioanalyzer对酶切产物进行直接分析,使COBRA的定量更快速、准确且无放射性污染。
本发明第五方面提供了本发明第四方面所述的试剂在制备可用于诊断肺癌的产品中的应用。
进一步,所述的肺癌包括非小细胞肺癌、小细胞肺癌。
进一步,所述的肺癌为非小细胞肺癌。
进一步,所述的非小细胞肺癌为肺腺癌。
本发明第六方面提供了一种用于筛选预防或治疗肺癌的候选药物的方法,所述的方法包括如下步骤:
用待筛选物质处理表达或含有p38 K165位点的体系;检测所述体系中p38 K165位点甲基化水平;其中,若所述待筛选物质可以降低p38 K165位点甲基化水平,则表明该待筛选物质是预防或治疗肺癌的候选药物。
进一步,所述的肺癌包括非小细胞肺癌、小细胞肺癌。
进一步,所述的肺癌为非小细胞肺癌。
进一步,所述的非小细胞肺癌为肺腺癌。
本发明第七方面提供了本发明第四方面所述的试剂在筛选预防或治疗肺癌的候选药物中的应用。
进一步,所述的肺癌包括非小细胞肺癌、小细胞肺癌。
进一步,所述的肺癌为非小细胞肺癌。
进一步,所述的非小细胞肺癌为肺腺癌。
除非另有定义,本发明上下文中的所使用的所有的技术和科学术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例,不是旨在于限制本发明,此外,对部分术语解释如下。
本文中使用的术语“甲基化”,是指一种DNA的天然修饰方式,在真核生物中,其主要是指在甲基化CpG结合蛋白(methyl CpG-binding domain,MBD)和DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase,DNMT)的作用下,CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶5位碳原子上连接一个甲基转变成为5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)的过程。DNA甲基化是表观遗传学中研究较为深入的一种形式,它具有多方面的生物学意义,DNA甲基化与胚胎的正常发育、基因表达调控、雌性个体X染色体失活、寄生DNA序列的抑制和印记基因及基因组结构稳定等密切相关,在DNA甲基化机制、DNA甲基转移酶、甲基化转录抑制机理、甲基化与肿瘤和疾病的关系及检测方法研究等方面取得了显著进展,DNA甲基化研究正成为疾病和肿瘤研究中的一个重要的前沿领域。
本发明的优点和有益效果:
本发明提供了一种组合物,所述的组合物包括抑制p38的K165位点甲基化的试剂。
本发明提供了所述组合物在制备预防肺癌或治疗肺癌或抑制肺癌细胞增殖或抑制肺癌细胞转移的药物中的应用,本发明为肺癌治疗提供了新方法。
本发明还提供了一种用于筛选预防或治疗肺癌的候选药物的方法。
附图说明
图1是Western Blot检测A549细胞中敲除KDM5D的蛋白表达实验结果图;
图2是过表达KDM5D的NCI-H1299细胞系蛋白验证实验结果图;
图3是Western Blot检测敲除KDM5D的A549细胞中相关蛋白磷酸化水平实验结果图,其中,图A是Western Blot检测敲除KDM5D对A549细胞中相关信号通路蛋白的影响实验图,图B是敲除KDM5D的A549细胞中相关信号通路蛋白的磷酸化水平变化的统计分析图;
图4是Western Blot检测过表达KDM5D的NCI-H1299细胞中相关蛋白磷酸化水平实验结果图,其中,图A是Western Blot检测过表达KDM5D对NCI-H1299细胞中相关信号通路蛋白的影响实验图,图B是过表达KDM5D的NCI-H1299细胞中相关信号通路蛋白的磷酸化水平变化的统计分析图;
图5是体外激酶实验检测外源性MEK3的激酶活性实验结果图;
图6是p38 K165甲基化位点质谱图;
图7是Co-IP实验检测p38 K165突变体的磷酸化水平实验结果图;
图8是检测Anisomycin对p38 K165突变体的激活能力实验结果图;
图9是实验小鼠皮下瘤重量及体积统计图,其中,图A是实验小鼠皮下瘤照片,图B是实验小鼠皮下瘤重量统计图,图C是实验小鼠皮下瘤体积统计图;
图10是实验小鼠肺组织转移瘤灶照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1敲除/过表达KDM5D对p38磷酸化水平的影响
一、实验材料
1、实验仪器:核酸电泳装置(Bio-Rad)、PCR仪(Bio-Rad)、凝胶成像系统(Bio-Rad)、旋涡震荡器(IKA)、摇床(IKA)、恒温干燥箱(Thermo Fisher)
2、实验试剂:Opti-MEM(gibco,31985-070)、聚凝胺(Solarbio,H8761)、T4DNALigase(TaKaRa,M0202S)
二、实验方法
1、构建KDM5D CRISPR/Cas9敲除质粒,侵染A549细胞获得稳转细胞系;构建pCDH-KDM5D过表达质粒,侵染NCI-H1299细胞获得过表达KDM5D的稳转细胞系。
具体步骤:
(1)构建sgRNACRISPR/Cas9敲除质粒、pCDH-KDM5D过表达质粒。
(2)慢病毒包装与侵染
①细胞接种:将HEK293T细胞离心重悬后进行细胞计数,在每个6cm的培养皿中接种1×106个细胞。将细胞置于恒温培养箱中培养,待细胞的密度达到90%左右进行转染。
②制备PEI-DNA复合物
a.取200μL的Opti-MEM培养基加入1.5mL的EP管中,将核心质粒与包装质粒(PAX和PMD)以4:3:1的比例分别加入到EP管,质粒的总量为8μg。用移液枪反复吹打混匀后进行瞬时离心,静置2min。
b.于此同时,另取200μL的Opti-MEM培养基加入1.5mL的EP管中,将20μL的PEI转染试剂加入到EP管,用移液枪反复吹打混匀后进行瞬时离心,室温静止2min。
c.2min后将PEI转染试剂全部加入到混合质粒的EP管中。用移液枪反复吹打混匀后进行瞬时离心,室温静置20min,以形成PEI-DNA复合物。
③细胞转染
a.弃去待转染细胞的培养基,重新加入4mL完全培养基。
b.20min时间到之后将400μL的PEI-DNA复合物轻轻滴加到细胞培养皿中,轻轻晃动培养皿使复合物分散均匀。
c.将细胞放入培养箱中培养,6-8h后更换完全培养基。
d.细胞在恒温培养箱中培养48-72h后,收集含有慢病毒的上清,500rpm离心5min,将上清转移至新的离心管中。
e.用0.45μm的滤器过滤除杂并收集慢病毒上清,用1.5mL的EP管分装慢病毒上清。
f.将慢病毒上清放置于-80℃保存,避免反复冻融。
④病毒侵染:
a.观察铺于24孔板中的待侵染细胞密度为30%左右时,加入慢病毒上清进行细胞的侵染,同时以1:1000的比例在培养基中加入聚凝胺。
b.每次侵染12h,然后换成完全培养基,共侵染2次。
c.侵染完之后加入合适浓度的嘌呤霉素进行细胞筛选,然后提取蛋白检测表达情况。
(3)筛选嘌呤霉素的最佳浓度
①分别消化A549和NCI-H1299细胞进行细胞计数。将细胞以每孔5000个的数量接种于96孔板中,置于恒温培养箱中培养。
②配制含有以下嘌呤霉素浓度的培养基:0ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、5μg/mL和10μg/mL。24h后,弃去细胞培养基,每孔分别加入100μL含有上述嘌呤霉素浓度的培养基,每组做3个复孔。
③在显微镜下经常观察细胞的状态,每天更换两次嘌呤霉素筛选培养基,除去已经死亡的细胞。
④在A549细胞完全死亡的最低浓度1μg/mL(NCI-H1299为5ng/mL)的嘌呤霉素作为培养慢病毒侵染的稳定细胞株的最佳浓度。
(4)单克隆细胞株的筛选
①将稳定细胞株从培养箱取出后弃去上清,加入适量的PBS清洗细胞,然后加入2mL胰酶消化细胞。待细胞分离后弃去胰酶,加入2mL培养基终止消化。
②用移液枪将细胞转移至15mL离心管中500rpm,5min离心。弃去上清,加入2mL培养基吹打均匀后可进行细胞计数。
③用倍比稀释法取600个细胞至已经加入1mL培养基的1.5mL EP管中,混匀后滴加到10cm培养皿中,晃动均匀后放入细胞培养箱中培养。
④在10天左右单个细胞可生长至肉眼可见的单克隆细胞群落,用安装小号枪尖的移液器轻轻挑取细胞,转移至添加有适当浓度嘌呤霉素的1mL完全培养基的24孔板。
⑤细胞生长密度为90%可以取一半细胞提取蛋白用来检测敲除或者过表达的效果。
2、通过Western Blot检测敲除/过表达KDM5D对MAPK、PI3K等信号通路中关键蛋白的影响。
具体步骤:
(1)细胞总蛋白的提取
在配置好细胞裂解液,将生长到合适密度的细胞从培养箱中取出。弃去细胞的培养基,加入2mL预冷的PBS清洗细胞一次,弃去PBS。将培养皿放在冰块上,均匀滴加200μL的细胞裂解液。用细胞刮快速将细胞全部刮下,转移至1.5mL的EP管中,置于4℃涡旋仪上转动30min使细胞中的蛋白充分裂解,期间将离心机预冷至4℃。然后将细胞于12000rpm离心20min,将上清转移至新的1.5mL的EP管中,测蛋白浓度。
(2)BCA法测定蛋白浓度
按照Thermo公司BCA蛋白定量试剂盒说明书的方法,进行蛋白浓度的测定。
(3)煮样:蛋白定量结束后,向蛋白裂解液中加入相应体积的5×Loading Buffer混匀样品。将蛋白样品煮沸10min,然后12000rpm离心5min,置于-20℃冰箱保存备用。
(4)制胶:用洗净的WB玻璃杯配制相应浓度的分离胶,并用异丙醇液封使分离胶的液面平整。室温放置30min待分离胶凝固后,弃掉上层的异丙醇,用吸水纸吸干。然后配制浓缩胶,加入浓缩胶后应立即插上配套的梳子,注意不能有气泡。
(5)上样:从冰箱中拿出蛋白样品,融化后瞬离,摆好蛋白上样顺序。根据蛋白样品的浓度计算所需体积,上样时注意样品不能溢出。
(6)电泳:电压调为80V,蛋白样品到分离胶后,调整电压至120V,根据蛋白大小合理选择电泳时长,完成电泳。
(7)转膜:提前配制1×转膜液预冷备用。先将NC膜提前放在转膜液中充分浸泡,将板子撬开,把分离胶浸泡在转膜液中。按照“黑色海绵-白色海绵-三层滤纸-胶-NC膜-三层滤纸-白色海绵-黑色海绵”的顺序安装转膜夹,注意每层之间不能有气泡。置于转膜槽中,电源调至恒流280mA,转膜2h。在转膜槽中放入冰盒用来吸收转膜过程中产生的热量。
(8)封闭:将膜放入TBST中洗净转膜液,置于含有5%脱脂奶粉的TBST中,在摇床上室温封闭1h。
(9)一抗孵育:用含有5%脱脂奶粉的TBST稀释抗体,将膜剪至合适大小,放于制作好的抗体孵育板上,正面朝上,抗体滴加到膜上,4℃过夜。
(10)二抗孵育:第二天,将一抗回收,把膜放于TBST中,摇床上快速洗三次,每次10min。洗好后封相应的二抗,室温孵育1h后再在TBST中,摇床上快速洗三次,每次10min。
(11)曝光:用镊子小心取出膜,用吸水纸吸去多余的TBST,放于化学发光仪中,正面朝上,发光液A、B液按1:1体积比例提前配好,避光,向膜上均匀滴加发光液后开始曝光,调整目的蛋白条带强弱后,标记好本次实验的名称、蛋白样品的上样顺序、日期,保存图片进行后续分析。
三、实验结果
1、如图1、图2所示,成功构建敲除KDM5D的A549细胞系(sgRNA1、sgRNA2)、过表达KDM5D的NCI-H1299细胞系(KDM5D)。
2、如图3、图4所示,敲除KDM5D后,p38的磷酸化水平明显上调;过表达KDM5D后,p38的磷酸化水平明显下调。图中**表示P<0.01,*表示P<0.05,n.s.表示P>0.05。
实施例2 KDM5D影响p38的激酶活性机制研究
一、实验方法:
通过体外激酶实验检测外源性MEK3的激酶活性。
具体步骤:
1、取0.2mg在HEK293T细胞中过表达的外源性Flag-KDM5D和Flag-MEK3蛋白,用Flag-磁珠进行免疫沉淀4h,经IP洗涤缓冲液洗去非特异结合。
2、用激酶缓冲液洗2次,每次5分钟。
3、加入40μL激酶缓冲液,ATP lμL,以及0.5ug蛋白纯化的GST-p38为底物,30℃反应90分钟。
4、加入10μL 5×loadingbuffer,煮沸10分钟,然后进行免疫印迹检测。
二、实验结果:
如图5所示,当存在过表达外源性KDM5D时,外源性MEK3磷酸化下游蛋白激酶p38的能力下降,p38的磷酸化明显降低,该实验结果表明KDM5D能够抑制MEK3对p38的激酶活性。
实施例3 p38 K165位点甲基化水平对p38磷酸化水平的影响
一、实验方法:
1、质谱鉴定p38 K165存在甲基化修饰。
2、将p38 K165位点突变为p38 K165R抑制p38 K165位点的甲基化,将p38 K165突变为p38 K165M模拟p38 K165位点的甲基化,构建p38 K165R、p38 K165M的突变体,通过Co-IP实验技术检测MEK3对p38 K165R、p38 K165M和p38磷酸化的调控能力。
二、实验结果:
1、如图6所示,p38 K165为甲基化位点。
2、如图7所示,当p38 K165位点突变为p38 K165 R时,MEK3对p38磷酸化水平的调控能力减弱,但是当p38 K165位点突变为p38 K165M时,能够恢复MEK3对p38磷酸化水平的调控能力,该实验结果表明p38 K165位点的甲基化调控其磷酸化。
实施例4 p38 K165R降低Anisomycin对p38的激活能力
一、实验方法
Anisomycin是一种p38的激活剂,能够通过激活p38的磷酸化水平来启动细胞信号传导,还能增加心肌中葡萄糖的转运。通过对p38和p38 K165R添加Anisomycin,检测Anisomycin对p38和p38 K165R的激活能力。
二、实验结果
实验结果如图8所示,随着Anisomycin作用时间的增加,p38和p38 K165R的磷酸化水平逐渐升高,但是在相同的作用时间内Anisomycin对p38 K165R的激活能力比Anisomycin对p38的激活能力有很明显的减弱。
实施例5 p38 K165甲基化对肿瘤的影响
一、实验方法
动物模型建立方法如下:
1、Balb/C免疫缺陷小鼠购买于北京维通利华,将小鼠分为3组,每组五只,将稳定过表达p38-WT、p38-K165R、p38-K165M的A549细胞通过皮下接种到小鼠的前肢腋下,每只小鼠接种8*106个细胞,接种细胞15天后,检测小鼠体重和皮下瘤体积,并每隔两到三天测量一次;大约接种1个月后,利用麻醉机麻醉小鼠,随后脱颈处死小鼠,解剖取小鼠腋下瘤并对肿瘤进行称重和拍照。
2、Balb/C免疫缺陷小鼠购买于北京维通利华,将小鼠分为3组,每组五只,将稳定过表达p38-WT、p38-K165R、p38-K165M的A549细胞尾静脉接种小鼠,每只小鼠接种2*106个细胞,随后通过监测小鼠体重监测小鼠的生存状态,大约接种3个月后,利用麻醉机麻醉小鼠,随后脱颈处死小鼠,解剖取小鼠肺组织,观察小鼠肺组织的肿瘤转移情况并进行拍照。
二、实验结果
1、如图9所示,皮下接种A548细胞的小鼠中,p38-WT组、p38-K165M组皮下瘤的重量、体积均显著高于p38-K165R组,图中**表示P<0.01,*表示P<0.05,n.s.表示P>0.05。该实验结果证明,抑制p38 K165位点甲基化可以抑制肺癌细胞增殖。
2、如图10所示,尾静脉接种A549细胞的小鼠中,p38-WT组、p38-K165M组肺组织的转移瘤灶比p38-K165R组明显增多,该实验结果证明,抑制p38 K165位点甲基化可以抑制肺癌细胞转移。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (11)
1.一种组合物在制备预防肺癌或治疗肺癌或抑制肺癌细胞增殖或抑制肺癌细胞转移的药物中的应用,其特征在于,所述的组合物包括将p38 K165赖氨酸位点突变为精氨酸的试剂。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的突变为定点突变。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的肺癌包括非小细胞肺癌、小细胞肺癌。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述的肺癌为非小细胞肺癌。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述的非小细胞肺癌为肺腺癌。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的肺癌细胞为肺腺癌细胞。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述的肺腺癌细胞为A549细胞。
8.一种非治疗目的的抑制肺癌细胞增殖或抑制肺癌细胞转移的方法,其特征在于,所述的方法包括向需要其的对象使用一种组合物,所述的组合物包括将p38 K165赖氨酸位点突变为精氨酸的试剂。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述的突变为定点突变。
10.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述的肺癌细胞为肺腺癌细胞。
11.根据权利要求10所述的方法,其特征在于,所述的肺腺癌细胞为A549细胞。
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