JP6980762B2 - 抗腫瘍薬の調製におけるｖｃｐ阻害剤及び腫瘍溶解性ウイルスの使用 - Google Patents

Description

本開示は、生物医学の分野に属し、抗腫瘍薬の調製におけるＶＣＰタンパク質阻害剤、腫瘍溶解性ウイルス又はその組み合わせの使用に関する。

腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞に感染してそれを殺すことができる複製可能なウイルスである。一部の腫瘍溶解性ウイルスは、正常細胞にほとんど又は全く感染することなく、癌細胞に選択的に感染することができる。一部の腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞及び正常細胞の両方に感染する可能性があるが、癌細胞に対してより大きい又は速い致死性を示す。腫瘍溶解性ウイルス療法は、革新的な腫瘍標的療法であり、天然の又は遺伝子組み換えウイルス（又はそれらの組み合わせ）を使用して腫瘍細胞に感染させ、これらのウイルスを腫瘍細胞中で複製させることにより、正常細胞にほとんど又は全く損傷を与えずに、腫瘍細胞を標的として溶解及び殺傷する効果を達成することができる。

Ｍ１ウイルス（アルファウイルスＭ１）は、アルファウイルス属に属し、抗腫瘍薬の製造に適用され得る。例えば、中国特許出願Ｎｏ．２０１４１０４２５５１０．３には、Ｍ１ウイルスは正常細胞の生存に影響を与えることなく腫瘍細胞の死を選択的に引き起こすことができるため、抗腫瘍分野において潜在的な用途を有することが開示されている。しかし、異なる腫瘍はＭ１ウイルスに対する感受性が異なる。特定の腫瘍に対して、Ｍ１ウイルスは単独で投与する場合に十分な腫瘍溶解効果を発揮することができない。中国特許出願Ｎｏ．２０１４１０４２５５１０．３における、Ｍ１ウイルス及び他のウイルスによる腫瘍の治療についての説明、並びに異なる腫瘍型及び治療レベル／方法論による異なる結果についての説明は、本明細書中に参考として援用される。同出願には、異なる種類の腫瘍に対してＭ１の治療有効性が異なることが開示されている。具体的には、Ｍ１ウイルスは、膵がん、鼻咽頭がん、前立腺がん及び黒色腫に対する治療効果がもっとも有効であり、大腸がん、肝臓がん、膀胱がん及び乳がんに対する治療効果が低くなり、神経膠腫、子宮頸がん、肺がんの場合には、治療効果がより一層低くなり、胃がんに対する治療効果が最も低いことが記載されている。

腫瘍に対する腫瘍溶解性ウイルスの治療効果を増大させる化合物のスクリーニングは、腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍スペクトル及び抗腫瘍強度を増大できる化合物を同定するために進行されている。本発明者によって提出された中国特許ＣＮ２０１５１０９９０７０５．７には、クリソファノール及びその誘導体はＭ１ウイルスの抗腫瘍相乗剤として使用され、両者の併用は腫瘍細胞の生存率を３９．６％に減少させることができることが開示されている。しかし、この組み合わせの作用機序はまだ明確に開示されていない。そこで、ウイルス−相乗剤の組み合わせによるより高い抗腫瘍強度の達成、及び／又は正常細胞に対する影響がより低いか若しくはないことの達成、及び／又は作用機序がより明確な組み合わせの使用が望ましい。

本発明は、腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍相乗剤の調製におけるＶＣＰ阻害剤の使用を提供する。

本発明は、腫瘍溶解性ウイルスが高致死率及び／又は低副作用のようなより良い抗腫瘍効果を示すことを可能にする抗腫瘍医薬組成物をさらに提供する。

本発明は、腫瘍溶解性ウイルスに対して感受性ではない腫瘍に向けられる、腫瘍溶解性ウイルスとの相乗的な抗腫瘍薬の組み合わせをさらに提供する。

本発明は、個性的な投与システム及び方法をさらに提供する。

本発明は、上記の治療的組み合わせの投与を含む、固形腫瘍又は血液系（即ち、血液）腫瘍の治療方法をさらに提供する。

本開示は、がんに対する有効及び／又は安全な治療法を実証することができる相乗剤及び相乗剤−ウイルスの組み合わせを記載する。

異なる処理を受けた肝細胞の切片の顕微鏡写真を示す。 図２ａ及び２ｂは、肝臓腫瘍細胞の生存率と、イーアレスタチン（Ｅｅｙａｒｅｓｔａｔｉｎ）Ｉ又はＣＢ−５０８３とＭ１の併用の場合の濃度との関係を示す。 図３ａ〜３ｃは、肝臓がん細胞に対するウエスタンブロットの様々な治療効果を示す。 図４ａ〜４ｄは、肝臓がん細胞に対するウエスタンブロットの様々な治療効果を示す。 図５ａ〜５ｂは、Ｈｅｐ３Ｂ細胞の種々の処理についてのウエスタンブロットの結果を示す。 図６ａ〜６ｄは、Ｈｅｐ３Ｂ及びＨｕｈ７腫瘍に対する経時的な治療効果を示すグラフ及び写真である。

用語
他に説明がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないと示さない限り、複数の指示対象を含む。同様に、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、単語「又は」は「及び」を含むことを意図している。さらに、核酸又はポリペプチドについて与えられたすべての塩基サイズ又はアミノ酸サイズ、及びすべての分子量又は分子量の値は近似値であり、説明のために提供されていることを理解されたい。「概ね」、「約」、「実質的」などの用語は、説明されている文脈及びパラメータに基づいて当業者人によって理解されるように値／説明を修飾し、理解されるためにさらなるガイダンスが必要とされる場合、５％の値が挙げられ得る。本明細書に記載のものと類似又は同等の方法及び材料を本開示の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。用語「含む」は「含有する」ことを意味する。略語「ｅ．ｇ．」はラテン語の例示に由来し、本明細書では非限定的な例を示すために使用される。したがって、略語「ｅ．ｇ．」は「例えば」と同義である。記載されたパーセント配列同一性は、参照配列と同一である、それぞれ所与のＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質内の核酸残基又はアミノ酸残基の百分率を指す。

矛盾がある場合は、本明細書（用語の説明を含む）が優先するものとする。さらに、すべての材料、方法、及び実施例は例示的なものであり、本発明を限定するものではない。

ＶＣＰ阻害剤
ＶＣＰ阻害剤は、腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍溶解効果を増強できることが見出された。適切なＶＣＰ阻害剤は、ＶＣＰの活性（ＡＴＰアーゼ活性など）を低下させること、ＶＣＰタンパク質を分解すること、及び／又は細胞によるＶＣＰの発現を低下させることにより作用することができる。

ＶＣＰ（バロシン含有タンパク質）は、Ｐ９７とも呼ばれ、多くの細胞で広く発現されるＡＴＰアーゼである。ＶＣＰは、小胞体ストレス関連分解経路における重要な要素として働き、ユビキチン化タンパク質を識別して分解のためにプロテアソームに送達することにより、細胞におけるタンパク質恒常性を確保にする。ＶＣＰは腫瘍細胞中で高度に発現され、ＶＣＰを阻害することにより腫瘍細胞の死を顕著に誘導可能であることがいくつかの文献（１、２）には報告されている。

いくつかの実施形態において、ＶＣＰの干渉断片（ＳｉＲＮＡ）を用いて遺伝子の発現を阻害することにより、対応するタンパク質の発現量を減少させた。結果は、ＶＣＰ発現の阻害又は非阻害のいずれも単独では細胞形態の病理学的変化を引き起こさなかった。また、Ｍ１ウイルスの単独使用は、細胞形態の病理学的変化を引き起こさなかった。しかし、ＶＣＰ発現の阻害とＭ１ウイルスの使用との組み合わせは、細胞形態の病理学的変化を引き起こした。

さらに、上述したように、腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍溶解効果は、ＶＣＰを阻害することにより顕著に増強されることができる。本明細書に開示されるように、イーアレスタチンＩ、ＮＭＳ−８７３又はＣＢ−５０８３などのＶＣＰ活性を阻害する化合物と、Ｍ１ウイルスなどの腫瘍溶解性ウイルスとの組み合わせは、腫瘍細胞を攻撃するために使用することができる。結果は、抗腫瘍効果が、イーアレスタチンＩ、ＮＭＳ-８７３もしくはＣＢ-５０８３又はそれらの組み合わせを腫瘍溶解性ウイルスとの併用により増強され得ることを示す。

本開示のいくつかの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍相乗剤及び／又は薬剤耐性逆転剤に適用可能なＶＣＰ阻害剤を使用する。

薬剤耐性逆転剤については、腫瘍溶解性ウイルスを、腫瘍溶解性ウイルスに感受性ではない腫瘍、又は腫瘍溶解性ウイルスに対して耐性である腫瘍を治療する抗腫瘍薬として使用する場合に、腫瘍の耐性能力を逆転させるために、ＶＣＰ阻害剤を腫瘍溶解性ウイルス耐性逆転剤として腫瘍溶解性ウイルスと併用することができる。

本開示のいくつかの実施形態において、ＶＣＰ阻害剤は、腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍相乗剤／薬剤耐性逆転剤の調製に使用される。

適切なＶＣＰ阻害剤として、限定されないが、イーアレスタチンＩ（式１）、ＮＭＳ−８７３（式２）又はＣＢ−５０８３（式３）などの、ＶＣＰタンパク質の活性を阻害する化合物が挙げられる。腫瘍溶解相乗剤として使用できる上記ＶＣＰ阻害剤は、化学合成、生物学的材料からの分離、バイオテクノロジー法などの任意の適切な方法によって得ることができる。

本発明のいくつかの例において、ＶＣＰタンパク質阻害剤は、イーアレスタチンＩ、ＮＭＳ−８７３、ＣＢ−５０８３又はそれらの組み合わせであり得る。

いくつかの実施形態において、ＶＣＰ阻害剤は、ＶＣＰタンパク質の活性を阻害する化合物を含み得る。いくつかの実施形態において、ＶＣＰ阻害剤は、イーアレスタチンＩ、ＮＭＳ−８７３若しくはＣＢ−５０８３、又はそれらの組み合わせ、好ましくは、イーアレスタチンＩ、ＮＭＳ−８７３又はそれらの組み合わせを含むか、それらからなるか、又は実質的にからなることができる。いくつかの実施形態において、ＶＣＰ遺伝子の発現を阻害するための遺伝的手段は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ、遺伝子編集剤又は遺伝子ノックアウト剤を含み得る。

ＶＣＰ阻害剤は、ＶＣＰ遺伝子の発現を阻害するための遺伝的手段をさらに含み得る。上記遺伝的手段は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ、遺伝子編集剤又は遺伝子ノックアウト剤を含むが、これらに限定されない。

ＶＣＰ阻害剤は、例えば、ＶＣＰの発現を減少又は除去する小さな阻害性核酸分子（低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム及びショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）など）のものをさらに含む。

このような小さな阻害性核酸分子は、互いにハイブリダイズして１つ以上の二本鎖領域を形成する第１鎖及び第２鎖を含み得る。各鎖の長さは、約１８〜２８個のヌクレオチド、好ましくは約１８〜２３個のヌクレオチド、より好ましくは約１８，１９，２０，２１又は２２個のヌクレオチドである。或いは、ｓｈＲＮＡ分子のように、一本鎖には、互いにハイブリダイズして二本鎖領域を形成することができる領域を含んでもよい。

このような小さな阻害性核酸分子は、ＶＣＰ発現を減少又は除去する能力を維持しながら修飾ヌクレオチドを含み得る。修飾ヌクレオチドは、安定性、活性及び／又は生物学的利用能などのインビトロ又はインビボの特性を改善するために含まれ得る。例えば、このような小さな阻害性核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子に存在する総ヌクレオチドに対して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の修飾ヌクレオチドを含み得る。このような修飾ヌクレオチドは、例えば、デオキシヌクレオチド、２'−Ｏ−メチルヌクレオチド、２'−デオキシ−２'−フルオロヌクレオチド、４'−チオヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、及び／又は２'−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチドを含み得る。ｓｉＲＮＡなどの小さな阻害性核酸分子は、エキソヌクレアーゼによる分解を防ぐために、例えば「５−及び／又は３」−キャップ構造を含んでもよい。

いくつかの実施形態において、上記小さな阻害性核酸分子は、平滑末端を有する二本鎖核酸又はオーバーハングヌクレオチドを含み得る。存在する他のヌクレオチドは、例えば、ミスマッチ、バルジ、ループ、又はゆらぎ塩基対をもたらすヌクレオチドを含み得る。上記小さな阻害性核酸分子は、例えばリポソームに封入すること、又は生分解性ポリマー、ヒドロゲルもしくはシクロデキストリンなどの他の担体に組み込むことによって、投与用に製剤化することができる。

様々な実施形態において、上記ＶＣＰ阻害剤は、ＶＣＰの遺伝子発現をノックダウンするか若しくはそれに影響を及ぼすか、又はＶＣＰのタンパク質量若しくはタンパク質活性を減少させるための物質（例えば、化合物、アミノ酸配列、又はヌクレオチド配列）又は遺伝的手段として作用することができる。当業者は、得られる物質がＶＣＰ阻害効果を有すれば、これらの化合物又は遺伝的手段を阻害剤として修飾、置換及び／又は変更することができる。

本発明の他の実施形態において、上記ＶＣＰタンパク質阻害剤は、ＶＣＰの干渉ＲＮＡ断片又はＶＣＰに対する抗体であってもよい。

本発明の好適な実施形態において、上記ＶＣＰタンパク質阻害剤は、ＶＣＰの干渉ＲＮＡ断片又はＶＣＰに対する抗体である。いくつかの実施形態において、上記ＶＣＰ阻害剤は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：７４１５に記載のＶＣＰに対して有効であるか、それを標的とするか、それを用いて調製されるか、又はそれに対して特異的である。他の実施形態において、上記ＶＣＰ阻害剤は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：７４１５に記載のＶＣＰの変異体に対して有効であるか、それを標的とするか、それを用いて調製されるか、又はそれに対して特異的である。変異体ＶＣＰタンパク質は、例えば、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：７４１５に記載のＶＣＰタンパク質と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一のアミノ酸配列を有することができる。

いくつかの実施形態において、上記ＶＣＰ阻害剤は抗体である。この抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び／又はＶＣＰに結合する抗体断片であり得る。上記抗体は、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植抗体、又はヒト抗体であってもよい。上記抗体断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、又はＶＬ若しくはＶＨドメインであってもよい。抗体は、例えばタグ、検出可能な標識、又は細胞毒性薬に結合した結合物の形態であり得る。上記抗体は、アイソタイプＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ又はＩｇＤであり得る。

上記ＶＣＰ阻害剤は、例えば、ＶＣＰの発現を減少又は除去する小さな阻害性核酸分子（低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、及びショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）など）をさらに含む。

このような小さな阻害性核酸分子は、互いにハイブリダイズして１つ以上の二本鎖領域を形成する第１鎖及び第２鎖を含み得る。各鎖の長さは、約１８〜２８個のヌクレオチド、好ましくは約１８〜２３個のヌクレオチド、より好ましくは約１８、１９、２０、２１又は２２個のヌクレオチドである。或いは、ｓｈＲＮＡ分子のように、一本鎖には、互いにハイブリダイズして二本鎖領域を形成することができる領域を含んでもよい。

このような小さな阻害性核酸分子は、ＶＣＰ発現を減少又は除去する能力を維持しながら修飾ヌクレオチドを含み得る。修飾ヌクレオチドは、安定性、活性及び／又は生物学的利用能などのインビトロ又はインビボの特性を改善するために含まれ得る。例えば、このような小さな阻害性核酸分子は、ｓｉＲＮＡ分子に存在する総ヌクレオチドに対して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％ｏｒ １００％の修飾ヌクレオチドを含み得る。このような修飾ヌクレオチドは、例えば、デオキシヌクレオチド、２'−Ｏ−メチルヌクレオチド、２'−デオキシ−２'−フルオロヌクレオチド、４'−チオヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、及び／又は２'−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチドを含み得る。ｓｉＲＮＡなどの小さな阻害性核酸分子は、エキソヌクレアーゼによる分解を防ぐために、例えば「５−及び／又は３」−キャップ構造を含んでもよい。

いくつかの実施形態において、上記ＶＣＰ阻害剤は、配列番号１−２に記載の核酸と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一の核酸である。

ｓｉＶＣＰ＃１： ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１： ＧＧＡＧＧＴＡＧＡＴＡＴＴＧＧＡＡＴＴ
ｓｉＶＣＰ＃２： ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２： ＧＧＣＣＡＡＡＧＣＣＡＴＴＧＣＴＡＡＴ

いくつかの実施形態において、上記小さな阻害性核酸分子は、平滑末端を有する二本鎖核酸又はオーバーハングヌクレオチドを含み得る。存在する他のヌクレオチドは、例えば、ミスマッチ、バルジ、ループ、又はゆらぎ塩基対をもたらすヌクレオチドを含み得る。上記小さな阻害性核酸分子は、例えばリポソームに封入すること、又は生分解性ポリマー、ヒドロゲルもしくはシクロデキストリンなどの他の担体に組み込むことによって、投与用に製剤化することができる。

腫瘍溶解性ウイルス

本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルス（アルファウイルス属（例えば、Ｍ１ウイルス及びゲタウイルス）、アデノウイルス属、ワクシニアウイルス、麻疹ウイルス、水胞性口炎ウイルス及び単純ヘルペスウイルス）は、これらの腫瘍溶解性ウイルスに加えて、ウイルスの腫瘍溶解活性に影響を与えないこれらの腫瘍溶解性ウイルスの修飾形態（例えば、自然変異、突然変異（自然、強制又は選択的）、又は遺伝的修飾（例えば、配列の一部の付加、欠失又は置換）を受けたこれらのウイルスの形態）を含んでもよい。Ｍ１ウイルスは、ゲタ様ウイルスに属し、ゲタウイルスとの相同性が発見された関連ウイルスにおいて９７．８％と高いことが報告されている（Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ． ２００７； ３５ （３） ： ５９７−６０３）。

例えば、Ｍ１ウイルス及びゲタウイルスに関する情報は、中国特許１０４８１４９８４Ａを参照することができる。

上記腫瘍溶解性ウイルスは、例えば、遺伝子バンク登録番号ＥＦ０１１０２３に記載のＭ１ウイルス、又は遺伝子バンク登録番号ＥＦ０１１０２３に記載のヌクレオチド配列との同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％であるゲノムを有するウイルスであり得る。

いくつかの実施形態において、上記腫瘍溶解性ウイルスは、２０１４年７月１７日に中国典型培養物保蔵センターに寄託されたＭ１ウイルス（寄託番号：ＣＣＴＣＣ Ｖ２０１４２３）である。腫瘍溶解性ウイルスは、寄託番号ＣＣＴＣＣ Ｖ２０１４２３の上記Ｍ１ウイルスのゲノムヌクレオチドとの同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％であるゲノムを含んでもよい。

さらに、上記腫瘍溶解性ウイルスは、遺伝子バンク登録番号ＥＵ０１５０６２に記載のゲタウイルスであってもよいか、又は遺伝子バンク登録番号ＥＵ０１５０６２に記載のゲノムヌクレオチド配列との同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％であるゲノムを有するウイルスであってもよい。

場合により、単一の腫瘍溶解性ウイルス株が使用される。他の実施形態において、複数の株及び／又は種類の腫瘍溶解性ウイルスが使用される。

医薬組成物

本開示は、腫瘍を治療するための医薬組成物をさらに提供する。上記組成物は、１つ以上のＶＣＰ阻害剤及び１つ以上の腫瘍溶解性ウイルスを含む。本開示は、１つ以上のＶＣＰ阻害剤及び１つ以上の腫瘍溶解性ウイルスを含む腫瘍を治療するための医薬品キットをさらに提供する。上記医薬品キットは、医薬品キットにおいてＶＣＰ阻害剤と腫瘍溶解性ウイルスとが混在することではなく、別々の剤形（例えば、ＶＣＰ阻害剤を含む丸剤、カプセル、錠剤又はアンプル、及び腫瘍溶解性ウイルスを含む丸剤、カプセル、錠剤又はアンプル）で提供される点で組成物と異なる。いくつかの実施形態において、上記剤形（腫瘍溶解性ウイルス、ＶＣＰ阻害剤、又は腫瘍溶解性ウイルスとＶＣＰ阻害剤の組み合わせ）には、１つ以上のアジュバントを含んでもよい。上記アジュバントは、医薬組成物中の薬物の治療効果を促進することができるものを指す。医薬品キットは、別々の剤形で提供されるＶＣＰ阻害剤及び腫瘍溶解性ウイルスを含んでもよい。医薬品キットにおけるＶＣＰ阻害剤及び腫瘍溶解性ウイルスは、同時に又は任意の順序で投与することができる。例えば、ＶＣＰ阻害剤を腫瘍溶解性ウイルスの前に投与する場合、腫瘍溶解性ウイルスをＶＣＰ阻害剤の前に投与する場合、又はＶＣＰ阻害剤と腫瘍溶解性ウイルスを同時に投与する場合を含む。様々な実施形態において、患者は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトであってもよい。

単一のＶＣＰ阻害剤を使用してもよく、或いはいくつかを組み合わせて同時に又は連続して使用してもよい。ＶＣＰ阻害剤及び／又は腫瘍溶解性ウイルスは、１つ以上の阻害剤、１つ以上の担体、賦形剤、希釈剤、薬学的に許容される担体、安定剤、緩衝剤、防腐剤、非イオン性洗剤、酸化防止剤、及び他の添加物を含む組成物の形態であり得る。上記医薬組成物は、経口投与、経皮投与、皮下投与、鼻腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、髄腔内投与、局所投与などの様々な投与経路で患者に投与することができる。一般的に、上記ＶＣＰ阻害剤は、経口的、非経口的、静脈内的又は皮下的に患者に投与される。ＶＣＰ阻害剤は、腫瘍溶解性ウイルスと組成物中に混在してもよく、又は別の組成物中に存在してもよい。

ＶＣＰ阻害剤及び腫瘍溶解性ウイルスの用量

様々な実施形態において、上記ＶＣＰ阻害剤（例えば、イーアレスタチンＩ、ＮＭＳ−８７３又はＣＢ−５０８３）は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇの範囲で存在することができる。いくつかの実施形態において、用量は、０．０１〜１、１〜１０、１０〜１００、１００〜２００ｍｇ／ｋｇであってもよい。いくつかの好適実施形態において、イーアレスタチンＩ、ＮＭＳ−８７３又はＣＢ−５０８３の用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。いくつかのより好適な実施形態において、イーアレスタチンＩ、ＮＭＳ−８７３又はＣＢ−５０８３の用量は、１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。

様々な実施形態において、上記腫瘍溶解性ウイルスは、ＭＯＩ（感染多重度）の範囲が１０^３〜１０^９（ＰＦＵ／ｋｇ）になるような力価で存在することができる。いくつかの実施形態において、１０^３〜１０^４、１０^４〜１０^５、１０^５〜１０^６、１０^６〜１０^７、１０^７〜１０^８、又は１０^８〜１０^９ＰＦＵ／ｋｇのＭＯＩを提供する用量を用い得る。いくつかの好適実施態様において、腫瘍溶解性ウイルスの用量は、ＭＯＩの範囲が１０^４〜１０^９（ＰＦＵ／ｋｇ）になるような力価を提供することができる。他の実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスの用量は、ＭＯＩの範囲が１０^５〜１０^９（ＰＦＵ／ｋｇ）になるような力価を提供することができる。

上記組成物／医薬品キットにおいて、腫瘍溶解性ウイルスに対するＶＣＰ阻害剤の割合は、０．０１〜２００ｍｇ：１０^３〜１０^９ＰＦＵ（プラーク形成単位）、好ましくは０．１〜２００ｍｇ：１０^４〜１０^９ＰＦＵ、より好ましくは０．１〜１００ｍｇ：１０^５〜１０^９ＰＦＵであり得る。

上記組成物／医薬品キットにおいて、腫瘍溶解性ウイルスに対するイーアレスタチンＩ、ＮＭＳ−８７３又はＣＢ−５０８３の割合は、０．０１〜２００ｍｇ：１０^３〜１０^９ＰＦＵ（プラーク形成単位）、好ましくは０．１〜２００ｍｇ：１０^４〜１０^９ＰＦＵ、より好ましくは０．１〜１００ｍｇ：１０^５〜１０^９ＰＦＵであり得る。

一実施形態において、上記腫瘍溶解性ウイルスは、Ｍ１ウイルス、ゲタウイルス、アデノウイルス属、ワクシニアウイルス、麻疹ウイルス、水胞性口炎ウイルス及び単純ヘルペスウイルスからなる群より選択される。好ましくは、上記腫瘍溶解性ウイルスは、Ｍ１ウイルス又はゲタウイルスである。様々な実施形態において、ＶＣＰ阻害剤と腫瘍溶解性ウイルスとの組み合わせは、様々な種類の腫瘍の治療に適用できる。適切な腫瘍は、固形腫瘍及び血液腫瘍を含む。いくつかの実施形態において、上記固形腫瘍は、肝臓がん、大腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵がん、鼻咽頭がん、肺がん又は胃がんである。好適な実施形態において、上記腫瘍は、腫瘍溶解性ウイルスに感受性ではない所用である。より好適な実施形態において、上記腫瘍は、Ｍ１腫瘍溶解性ウイルスに感受性ではない腫瘍である。

腫瘍の治療方法

本開示は、腫瘍の治療方法にも関する。いくつかの実施形態において、１つ以上のＶＣＰ阻害剤及び１つ以上の腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍を罹患している被験体に投与される。上記腫瘍は、固形腫瘍又は血液腫瘍であり得る。好ましくは、上記固形腫瘍は、肝臓がん、大腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵がん、鼻咽頭がん、肺がん又は胃がんである。より好ましくは、上記腫瘍は、腫瘍溶解性ウイルスに感受性ではない腫瘍である。より好ましいくは、上記腫瘍は、腫瘍溶解性ウイルスに感受性ではない肝臓がん、大腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵がん、鼻咽頭がん、肺がん又は胃がんである。上記ＶＣＰ阻害剤は、本明細書の腫瘍溶解性ウイルスと同時に投与してもよいか、腫瘍溶解性ウイルスの投与の前後に投与してもよい。さらに、上記ＶＣＰ阻害剤及び／又は腫瘍溶解性ウイルスは、週に１回又は数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）投与することができる。上記ＶＣＰ阻害剤及び／又は腫瘍溶解性ウイルスは、１週間又は数週間（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）、１ヶ月間又は数ヶ月間（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上）投与することができる。

いくつかの実施形態において、イーアレスタチンＩ、ＮＭＳ−８７３、ＣＢ−５０８３又はそれらの組み合わせは、注射により投与することができるか、又は錠剤、カプセル剤、パッチ剤の形態で投与することができる。いくつかの実施形態において、イーアレスタチンＩ、ＮＭＳ−８７３、ＣＢ−５０８３又はそれらの組み合わせは、キットの一部であり得る。他の実施形態において、ＶＣＰ阻害剤と腫瘍溶解性ウイルスの組み合わせは、注射、好ましくは静脈内注射により投与することができる。

さらに、本開示は、いくつかの実施形態において、ＶＣＰタンパク質のレベルの低減により、腫瘍溶解性ウイルスで処理された腫瘍細胞の生存率を顕著に増加できることを示す（実施例４を参照）。本開示は、いくつかの実施形態において、ＶＣＰのレベル（活性）が調節されない場合に、ＶＣＰの発現がイーアレスタチンＩと腫瘍溶解性ウイルスの組み合わせの抗腫瘍効果と正に相関することを示す（実施例５） ， 例えば、ＶＣＰの発現は、イーアレスタチンＩと腫瘍溶解性ウイルスの組み合わせの抗腫瘍効果に影響を与えることができる。いくつかの実施形態において、ＶＣＰは、ＶＣＰ阻害剤と腫瘍溶解性ウイルスの組み合わせのバイオマーカーとして用いられ得る。イーアレスタチンＩとＭ１ウイルスの組み合わせの抗腫瘍効果の有効性は、腫瘍におけるＶＣＰの発現レベルに密接に関連する。ＶＣＰは様々な腫瘍細胞において高度に発現されることができ、イーアレスタチンＩと腫瘍溶解性ウイルスの組み合わせは、ＶＣＰ発現レベルが高い腫瘍／個体を選択的に治療するために使用することができる。

腫瘍治療方法の一実施形態において、まず、患者の腫瘍におけるＶＣＰの発現を決定し、次いで、検出されたＶＣＰのレベルに基づいて腫瘍溶解性ウイルスを使用する治療スキームを具体的に提供することができる。このようなアプローチは、いくつかの実施形態において、治療スキームの有効性を改善し、薬物の無駄を回避し、薬物の無効な投与による時間遅延を回避することができる。例えば、患者の腫瘍におけるＶＣＰの発現が投与前に検出され得ることにより、腫瘍がＶＣＰ低発現又はＶＣＰ陰性である実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスを使用する療法を直接提供することができる。腫瘍がＶＣＰ正常発現又はＶＣＰ高発現である実施形態では、ＶＣＰ阻害剤（例えば、ＶＣＰ発現若しくは機能阻害剤、ＶＣＰ干渉断片、又はＶＣＰ抗体）は、腫瘍溶解性ウイルスの投与と同時に、又は腫瘍溶解性ウイルスの投与の前後に投与することができる。これにより、腫瘍溶解性ウイルスに対する腫瘍の感受性を改善し、治療の有効性を改善することができる。いくつかの実施形態において、腫瘍におけるＶＣＰの発現量は、腫瘍溶解療法の有効性に直接影響を及ぼす。いくつかの実施形態において、腫瘍におけるＶＣＰの低発現量は、腫瘍溶解性ウイルスの治療効果に有利である。いくつかの実施形態において、腫瘍中のＶＣＰの発現レベルを検出することにより、特定の個体／腫瘍が腫瘍溶解性ウイルスを直接使用する（ＶＣＰ阻害剤を使用しない）治療法に適しているかどうかを判断することができる。

したがって、本開示は、ＶＣＰ検出試薬又は検出システム及び腫瘍溶解性ウイルスを含む抗腫瘍投与システムを提供する。上記腫瘍溶解性ウイルスは、アルファウイルス属、アデノウイルス属、ワクシニアウイルス、麻疹ウイルス、水胞性口炎ウイルス及び単純ヘルペスウイルスからなる群より選択される１つ以上であり得る．

上記ＶＣＰ検出試薬又は検出システムは、ＶＣＰの発現レベルの検出に用いられる試薬又はシステムである。ＶＣＰを検出するための適切なシステムは、遺伝子又はアミノ酸配列を検出する公知のもの、例えば、ウエスタンブロット（実施例４参照）、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、ＱＲＴ-ＰＲＣが挙げられるが、これらに限定されない。

腫瘍におけるＶＣＰのレベルは、ＶＣＰ阻害剤と腫瘍溶解性ウイルスを使用する併用療法の有効性に直接影響を与える。いくつかの実施形態において、腫瘍におけるＶＣＰレベルが高い場合に、ＶＣＰ阻害剤と腫瘍溶解性ウイルスを使用する併用療法のような治療スキームにより適している。特定の個体／腫瘍がＶＣＰ阻害剤と腫瘍溶解性ウイルスを使用する併用療法に適しているかどうかを判断するために、腫瘍におけるＶＣＰの発現レベルを検出することができる。

いくつかの実施形態において、ＶＣＰレベル（高、正常、低、陰性）の検出は、がん組織のＶＣＰレベルを関連する非がん組織（関連する臓器の非癌性部分、関連器官、関連タイプの組織（例えば、長筋組織、骨組織）など）のＶＣＰレベルと比較することにより行うことができる。様々な実施形態において、ＶＣＰレベルは、関与する種類の組織のＶＣＰレベルを検出するための任意の方法により検出することができる。いくつかの実施形態において、２つの試料群又は２つの試料の間でＶＣＰ ｍＲＮＡ又はＶＣＰタンパク質の量を比較することができる。１つの腫瘍試料群又は腫瘍試料におけるＶＣＰ ｍＲＮＡ又はＶＣＰタンパク質のレベルが他の試料（対照）群又は他の試料（対照）よりも少ないか多い場合、この腫瘍試料群又は腫瘍試料は、それぞれＶＣＰ低発現又はＶＣＰ高発現の腫瘍試料群又は腫瘍試料と呼ばれる。ＶＣＰ陰性とは、試料中にＶＣＰ ｍＲＮＡ又はＶＣＰタンパク質を含まない試料を指す。試験目的のために、高発現試料は、対照よりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、又は少なくとも１００％多いＶＣＰ ｍＲＮＡ又はＶＣＰタンパク質を有し、低発現試料は、対照よりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％少ないＶＣＰ ｍＲＮＡ又はＶＣＰタンパク質を有し、同じ発現レベル（同じＶＣＰレベル）を有する試料は、高発現レベルと低発現レベルとの間のレベルのＶＣＰ ｍＲＮＡ又はＶＣＰタンパク質を有する。ＶＣＰ陰性試料は１０％未満のＶＣＰ ｍＲＮＡ又はＶＣＰタンパク質のレベルを有する。ＶＣＰ ｍＲＮＡ及びタンパク質の量を比較するための試料は、腫瘍細胞及び正常（対照）細胞、腫瘍組織及び傍癌性非腫瘍性（対照）組織、又は腫瘍溶解性ウイルスを使用する治療に有効な腫瘍及び腫瘍溶解性ウイルスを使用する治療に効果がない腫瘍（３）であり得る。

任意の方法として、腫瘍におけるＶＣＰの高、低又は陰性発現とは、腫瘍組織におけるＶＣＰ ｍＲＮＡ及び／又はＶＣＰタンパク質の量が、対応する傍癌性非腫瘍性組織よりも多い、少ない、又はないことを意味する。

腫瘍組織におけるＶＣＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質の正規化発現量が対応する傍癌性非腫瘍性組織よりも少ない（言い換えれば、傍癌性非腫瘍性組織に対する腫瘍組織におけるＶＣＰの正規化発現量の割合が＜１である）場合に、該腫瘍組織はＶＣＰ低発現に該当する。この場合では、腫瘍溶解性ウイルスとＶＣＰ阻害剤との併用は治療に適していない可能性がある。

腫瘍組織におけるＶＣＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質の正規化発現量が対応する傍癌性非腫瘍性組織よりも多い（言い換えれば、傍癌性非腫瘍性組織に対する腫瘍組織におけるＶＣＰの正規化発現量の割合が＞１である）場合に、該腫瘍組織は、ＶＣＰ高発現に該当し、ＶＣＰ阻害剤と腫瘍溶解性ウイルスの組み合わせによる治療（併用療法）に適している。いくつかの実施形態において、併用療法は有用であり、いくつかの実施形態においては、ＶＣＰ阻害剤の投与なしの腫瘍溶解性ウイルス治療よりも有効である。他の実施形態において、併用療法（即ち、腫瘍溶解性ウイルス及びＶＣＰ阻害剤）は、傍がん組織ＶＣＰレベルに対する腫瘍ＶＣＰレベルが１．５、２、２．５、３、３．５又は４よりも大きい被験体に適用できる。いくつかの実施形態において、上記腫瘍組織及び上記傍癌性非腫瘍性組織は、病理学的穿刺又は外科的切除から得られるか、又は他の適切な手段によって得られる組織サンプルであり得る。

様々な実施形態において、ＶＣＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質の検出方法は、組織におけるＶＣＰレベルを定量又は比較することができる任意の適切な方法であり得る。このような方法は、ＱＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ウエスタンブロット、免疫組織化学又はＥＬＩＳＡを利用する方法を含むが、これらに限定されない。異なる試料間のＶＣＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質の量の差を正確に検出するために、まず各試料中のＶＣＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質の正規化発現量を計算する。正規化発現量とは、各試料のＶＣＰのｍＲＮＡ又はタンパク質の値を、試料の内部標準のＶＣＰのｍＲＮＡ又はタンパク質の値で除し、正規化したものである。異なる検出方法には、内部標準が異なるが、それらの共通の特徴は、異なる細胞又は組織試料における内部標準の発現量が同一であることである。このように正規化処理された異なる試料におけるＶＣＰの発現量は、試料間のＶＣＰ ｍＲＮＡ又はタンパク質量の差異の検出に使用することができる。

好ましくは、上記アルファウイルス属は、Ｍ１ウイルス及びゲタウイルスから選択される少なくとも１つを含むか、又はそれらからなる。

好ましくは、上記腫瘍は、固形腫瘍又は血液腫瘍である。

より好ましくは、上記固形腫瘍は、肝臓がん、大腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵がん、鼻咽頭がん、肺がん、又は胃がんである。

さらに、本開示は、腫瘍溶解性ウイルスを含む抗腫瘍薬をさらに提供する。上記腫瘍溶解性ウイルスは、アルファウイルス属、アデノウイルス属、ワクシニアウイルス、麻疹ウイルス、水胞性口炎ウイルス及び単純ヘルペスウイルスからなる群より選択される１つ以上であり得る。いくつかの実施形態において、上記抗腫瘍薬は、ＶＣＰ陰性腫瘍又はＶＣＰ低発現腫瘍の治療に適用できる。いくつかの好適実施態様において、上記ＶＣＰ陰性腫瘍又はＶＣＰ低発現腫瘍は、肝臓がん、大腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵がん、鼻咽頭がん、肺がん又は胃がんであり得る。

好ましくは、上記アルファウイルス属は、Ｍ１ウイルス及びゲタウイルスから選択される少なくとも１つである。

いくつかの実施形態において、治療される腫瘍はＶＣＰ高発現腫瘍である場合に、併用療法（例えば、腫瘍溶解性ウイルスの投与及びＶＣＰ阻害剤の投与）は適用できる。いくつかの好適実施態様において、上記腫瘍は、ＶＣＰ陰性腫瘍又はＶＣＰ低発現腫瘍である場合に、Ｍ１ウイルス単独を使用する（ＶＣＰ阻害剤を投与しない）治療法は適用できる。

他の実施形態において、上記腫瘍は、肝臓がん、大腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵がん、鼻咽頭がん、肺がん又は胃がんであり得る。

いくつかの実施形態において、本明細書で開示された投与システムは、腫瘍溶解性ウイルス投与の有効性を個性的に改善することができる。

本明細書に記載の投与システムは、例えば、個体の腫瘍組織におけるＶＣＰの発現レベルを検出するためのＶＣＰ検出剤及び抗腫瘍薬を含むキットを指す。上記抗腫瘍薬は、腫瘍溶解性ウイルス、好ましくは、少なくとも１つの腫瘍溶解性ウイルス及び少なくとも１つのＶＣＰ阻害剤を含む。本明細書で提供された投与システムは、腫瘍溶解性ウイルス、又は腫瘍溶解性ウイルスとＶＣＰ阻害剤との併用による治療計画を採用する前に、まず腫瘍のＶＣＰ発現レベルを検出することにより、腫瘍を有する個体に対して正確な治療計画を提供することができる。

個体の腫瘍細胞／腫瘍組織がＶＣＰ高発現である場合に、腫瘍溶解性ウイルスとＶＣＰ阻害剤の併用による治療計画を採用することができる。本開示によれば、このような併用は、ＶＣＰ低発現の場合に比べて、より高い有効性をもたらすためである。例えば、このような併用は、より高い腫瘍細胞のアポトーシス率及び／又は腫瘍組織阻害率をもたらすことができる．

以下、本発明のさらなる好ましい実施形態を説明する。

本明細書に開示されるように、ＶＣＰ阻害剤、好ましくは、イーアレスタチンＩ及び／又はＣＢ−５０８３は、腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍効果を増強することができることにより、抗腫瘍薬としての腫瘍溶解性ウイルスの治療有効性を改善することができる。後述するように、細胞学的実験により、Ｍ１ウイルスとイーアレスタチンＩ及び／又はＣＢ−５０８３との組み合わせは、腫瘍細胞の形態学的病変を引き起こすことで腫瘍細胞増殖を顕著に阻害することが実証されている。

イーアレスタチンＩ又はＣＢ−５０８３がＭ１ウイルスと組み合わせてヒト肝臓がんＨｅｐ３Ｂ細胞株に投与される場合に、腫瘍細胞の形態学的病変は顕著に増加し、腫瘍細胞の生存率は顕著に低下した。いくつかの例では、腫瘍細胞の形態変化は、細胞の膨張、核凝縮、細胞の断片化、及びアポトーシスを含む。例えば、本発明の実施例では、肝臓がん細胞の処理にＭ１ウイルス（ＭＯＩ＝０．００１）を単独で使用する場合に、腫瘍細胞の生存率は８３．０％であった。５μＭのイーアレスタチンＩを単独で使用する場合に、腫瘍細胞の生存率は７８．２％であった。これに対して、５μｍのイーアレスタチンＩ又はＣＢ−５０８３を同じＭＯＩを有するＭ１ウイルスと併用する場合に、腫瘍細胞の生存率は２１．６％に急激に減少した。比較すると、５μＭのイーアレスタチンＩの単独では、細胞数が１２．８％減少した。従って、Ｍ１ウイルス単独の抗腫瘍効果と比較して、イーアレスタチンＩとＭ１の併用は、腫瘍溶解効果を顕著に改善した。

中国特許ＣＮ２０１５１０９９０７０５．７には、クリソファノール腫瘍溶解性ウイルスに対する（非ＶＣＰ阻害性抗腫瘍相乗剤）と腫瘍溶解性ウイルスの併用実験では、ＶＣＰ阻害剤と腫瘍溶解性ウイルスの併用に比べて、腫瘍細胞の生存率を低下させる有効性が低いことが示された。例えば、５０μＭのクリソファノールをＭ１ウイルス（ＭＯＩ＝０．００１）と併用する場合に、腫瘍細胞の生存率は３９．６％であった。５μＭのイーアレスタチンＩ又はＣＢ−５０８３をＭ１ウイルス（ＭＯＩ＝０．００１）と併用する場合に、腫瘍細胞の生存率は２１．６％であった。クリソファノール及びその誘導体と比較すると、Ｍ１に対するイーアレスタチンＩ又はＣＢ−５０８３抗腫瘍相乗剤は、腫瘍細胞の生存率を顕著に低下させた。さらに、イーアレスタチンＩ及びＣＢ−５０８３は、クリソファノールのわずか１０分の１の薬学的有効量で使用されても、作用時間がクリソファノールの３分の２（クリソファノールによる処理に７２時間に対して、イーアレスタチンＩによる処理に４８時間）であり、顕著な利点を示した。

本開示によれば、イーアレスタチンＩ又はＣＢ−５０８３を腫瘍溶解性ウイルスと併用して腫瘍細胞を処理する場合に、腫瘍細胞に対する殺傷効果は、同じ濃度のイーアレスタチンＩ又はＣＢ−５０８３単独から得られた効果よりも顕著に高い。例えば、５μＭのイーアレスタチンＩで腫瘍細胞を処理する場合に、腫瘍細胞の生存率は８７．２％であった。Ｍ１ウイルス（ＭＯＩ＝０．００１）単独で肝臓がん細胞を処理する場合に、腫瘍細胞の生存率は８３．０％であった。これに対して、５μＭのイーアレスタチンＩをＭ１ウイルス（ＭＯＩ＝０．００１）と併用する場合に、腫瘍細胞の生存率は２１．６％に急激に減少した。従って、大幅に増強した腫瘍溶解効果は、イーアレスタチンＩの抗腫瘍メカニズムではなく、イーアレスタチンＩとＭ１の相乗作用メカニズムに基づくイーアレスタチンＩとＭ１の併用により生じたものである。

以下、図面について詳しく説明する。

図１は、異なる処理を受けた肝細胞切片の顕微鏡写真を示す。ここで、イーアレスタチンＩ及びＭ１ウイルスは、ヒト肝臓がん細胞株の形態学的病変を顕著に増大させる。

図２ａ及び２ｂは、肝臓腫瘍細胞の生存率と、イーアレスタチンＩ又はＣＢ−５０８３及びＭ１（ＭＯＩ＝０．００１）の濃度との関係を示す。ここで、イーアレスタチンＩ／ＣＢ−５０８３とＭ１ウイルスの併用処理は、ヒト肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂの生存率（ＭＴＴアッセイにより測定）を顕著に低下させる。図２ａは、イーアレスタチンＩとＭ１ウイルスの併用処理がヒト肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂの生存率を顕著に低下させることを示す。図２ｂは、ＣＢ−５０８３とＭ１ウイルスの併用処理がヒト肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂの生存率を顕著に低下させることを示す。

図３ａは、１２．５μＭのＶＣＰを標的とするｓｉＲＮＡで肝臓がん細胞を処理したウエスタンブロット結果を示す。図３ｂは、１２．５μＭのＶＣＰを標的とするｓｉＲＮＡ及び０．００１ＭＯＩのＭ１ウイルスで肝臓がん細胞を処理した顕微鏡スライド写真を示す。図３ｃは、１２．５μＭのＶＣＰを標的とするｓｉＲＮＡ及び０．００１ｍｏｉのＭ１ウイルスで処理した肝臓がん細胞の相対生存率を示す。図３ａ−ｃは、ＶＣＰのノックダウンが肝臓がん細胞に対するＭ１の腫瘍溶解効果を増強できることを示す。図３ａは、処理からのＶＣＰタンパク質のノックダウンを示す。図３ｂは、ＶＣＰのノックダウンがヒト肝臓がん細胞株の形態学的病変を顕著に増大できることを示す。図３ｃは、ＶＣＰのノックダウンが２株の肝臓がん細胞に対する腫瘍溶解性ウイルスＭ１の腫瘍溶解効果を増強できることを示す。

図４ａは、肝臓がん細胞（バックグラウンド発現）のウエスタンブロット結果を示す。

図４ｂは、異なる腫瘍細胞の処置についての、ＶＣＰ濃度対時間の曲線下面積の相対差のグラフを示す。図４ｃは、経時的なＶＣＰ濃度対ＶＣＰの相対発現レベルの曲線下面積の相対差のグラフを示す。図４ａ−ｃは、ＶＣＰのタンパク質発現と、ＶＣＰ阻害剤及びＭ１ウイルスを用いた併用療法の抗癌効果との間の正の相関関係を示す。図４ａは、複数の肝臓がん細胞及び正常細胞におけるＶＣＰのタンパク質発現量を示す。図４ｂは、複数の肝臓がん細胞及び正常細胞の生存率に対するイーアレスタチンＩとＭ１ウイルスの組み合わせの影響を示す。図４ｃは、ＶＣＰのタンパク質発現と、イーアレスタチンＩ及びＭ１ウイルスの併用との相関分析を示す。

図５ａ−ｂは、ＶＣＰ阻害剤とＭ１ウイルスとの組み合わせが、不可逆的な小胞体ストレスを誘発することによって腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こすことを示す。図５ａは、ＶＣＰ阻害剤とＭ１ウイルスの組み合わせは、ＩＲＥ１−ＸＢＰ１の経路を阻害できることを示す。図５ｂは、ＶＣＰ阻害剤とＭ１ウイルスの組み合わせが小胞体ストレス媒介細胞アポトーシスを促進できることを示す。

図６ａ−ｄは、イーアレスタチンＩとＭ１ウイルスの併用処理がヒト肝臓がん細胞株の移植性腫瘍の増殖を顕著に阻害することを示す。図６ａ及び図６ｂは、イーアレスタチンＩとＭ１ウイルスの併用処理がヒト肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂの移植性腫瘍の増殖を顕著に阻害することを示す。図６ｃ及び図６ｄは、イーアレスタチンＩとＭ１ウイルスとの併用処理がヒト肝臓がん細胞株Ｈｕｈ７の移植性腫瘍の増殖を顕著に阻害することを示す。

図中の記号の説明

ＥｅｒＩ：イーアレスタチンＩ処理群； ＣＢ−５０８３：ＣＢ−５０８３処理群
Ｍ１＋ＥｅｒＩ： Ｍ１ウイルス／イーアレスタチンＩ併用処理群； Ｍ１＋ＣＢ−５０８３： Ｍ１ウイルス／ＣＢ−５０８３併用処理群

実施例

以下、実施例により本発明をさらに説明する。本発明の実施形態は、以下の実施例に限定されない。本発明の原理又は精神に従ってなされたあらゆる同等の変更又は修正は、本発明の保護範囲内にあると見なされるべきである。

特に明記しない限り、本発明で使用される材料及び実験方法は従来の材料及び方法である。

実施例１． イーアレスタチンＩ及びＭ１ウイルスは、ヒト肝臓がん細胞株の形態学的病変を顕著に増加させる。

材料

ヒト肝臓がん細胞Ｈｅｐ３Ｂ（ＡＴＣＣから購入）、Ｍ１ウイルス（ＣＣＴＣＣ Ｖ２０１４２３から取得）、高グルコースＤＭＥＭ培地（４．５ｇ／ｌグルコース）（から購入Ｃｏｒｎｉｎｇ）、倒立位相差顕微鏡

方法

ａ）細胞培養
ヒト肝臓がん細胞Ｈｅｐ３Ｂを、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）完全培地中で増殖された。全ての細胞株を５％ＣＯ_２、３７℃の恒温密閉インキュベーター（相対湿度９５％）に入れて継代培養した。細胞株の増殖を倒立顕微鏡で観察した。細胞を約２〜３日毎に継代し、対数増殖期にある細胞を正式な実験のために採取した。

ｂ）細胞処理及び形態観察
対数増殖期にある細胞を選択してＤＭＥＭ完全培地（１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む）に入れ、細胞懸濁液を調製した。細胞を２．５×１０^４／ウェルの密度で２４ウェル培養プレートに接種した。次いで、各ウェルにイーアレスタチンＩ（５μＭ）、Ｍ１ウイルス（ＭＯＩ＝０．００１）、又はイーアレスタチンＩ（５μＭ）とＭ１ウイルス（ＭＯＩ＝０．００１）を加えて処理し、イーアレスタチンＩ及びＭ１ウイルスを加えなかったものを対照とした。処理の４８時間後、倒立位相差顕微鏡を用いて細胞の形態変化を観察した。

結果

図１に示すように、位相差顕微鏡により細胞の形態を観察した結果、対照群のＨｅｐ３Ｂ細胞は、単一層で接着増殖し、同一な表現型で緊密に並んでいた。イーアレスタチンＩ（５μＭ）又はＭ１ウイルス（ＭＯＩ＝０．００１）単独で４８時間処理した後、細胞の形態は、顕著に変化しなった。しかし、イーアレスタチンＩ（５μＭ）及びＭ１ウイルス（ＭＯＩ＝０．００１）で４８時間併用処理した後、対照群及び各処理群の細胞と比較すると、併用処理群の生細胞の数は顕著に減少し、生細胞の形態は細胞体が球形に収縮するように著しく変化し、屈折率は顕著に増加し、生細胞又は死細胞にも関わらず、アポトーシスの形態学的徴候を示した。

実施例２． イーアレスタチンＩ又はＣＢ−５０８３とＭ１ウイルスとの併用処理は、ヒト肝臓がん細胞株の生存率を顕著に低下させる。

材料

ヒト肝臓がん細胞Ｈｅｐ３Ｂ、Ｍ１ウイルス、高グルコースＤＭＥＭ培地、酵素免疫測定法のための自動マイクロプレートリーダー。細胞、ウイルス、培地及び試薬は実施例１と同じ供給源に由来する。

方法

ａ）細胞接種及び投与処理
実施例１の対数増殖期にある細胞を選択してＤＭＥＭ完全培地（１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））に加え、細胞懸濁液を調製した。細胞を４×１０^３／ウェルの密度で９６ウェル培養プレートに接種した。１２時間後、細胞は壁に完全に付着した。ウェルを薬及びウイルスで処理しなかった対照群、イーアレスタチンＩ単独処理群又はＣＢ−５０８３単独処理群、Ｍ１単独感染群、イーアレスタチンＩ／Ｍ１併用処理群又はＣＢ−５０８３／Ｍ１併用処理群に分けた。用量は、細胞に感染したＭ１ウイルス（ＭＯＩ＝０．００１）、ＥｅｒＩ（０、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０μＭ）又はＣＢ−５０８３（０、０．１２５、０．２５、０．５、１、２μＭ）であった。

ｂ）ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）と細胞内のコハク酸デヒドロゲナーゼとの反応
培養４８時間後、２０μｌのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに加え、さらに４時間インキュベートした。インキュベートした後、生細胞中に形成された粒状の青紫色ホルマザン結晶を顕微鏡検査により観察した。

ｃ）細胞内で形成されたホルマザン粒子の溶解
上澄みを注意深く吸い取って捨てた後、１００μｌ／ウェルでＤＭＳＯを加えて形成された結晶を溶解し、マイクロ振動機で５分間振盪した。次いで、酵素結合検出器を用いて５７０ｎｍの波長で各ウェルの光学密度（ＯＤ値）を測定した。実験は各群につき３回繰り返した。細胞の生存率＝薬物処理群のＯＤ値／対照群のＯＤ値×１００％

ｄ）グラフ作成・解析ソフトウェアｏｒｉｇｉｎ ８（Ｃｏｒｐ．，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて非線形曲線フィッティングを行い、図２ａ及び図２ｂのように、ＶＣＰ阻害剤用量をｘ軸、細胞の相対生存率をｙ軸とし２つの用量反応曲線（１つはイーアレスタチンＩ又はＣＢ−５０８３単独処理群の用量反応曲線、もう１つはイーアレスタチンＩ又はＣＢ−５０８３／Ｍ１ウイルス併用処理群の用量反応曲線）を描いた。２つの曲線のＡＵＣの差（ＤＡＵＣ）を計算して図２ａ及び図２ｂに網掛けで示した。曲線下面積の差が大きければ大きいほど、薬物の相乗効果がより高いことを示す。実施例１と同様に細胞の相対生存率を計算した。図２ａ及び図２ｂには、統計的差異を示す一元配置分散分析の結果を示した。ここで、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１を示す。

結果

図２ａに示すように、Ｍ１ウイルス（ＭＯＩ＝０．００１）単独での処理では、Ｈｅｐ３Ｂ細胞の相対生存率は比較的大きく（８３．０％）、５μＭのイーアレスタチンＩ単独で処理した腫瘍細胞の相対生存率は８７．２％であった。しかし、のＭ１（ＭＯＩ＝０．００１）と５μＭのイーアレスタチンＩの組み合わせ（イーアレスタチンＩ／Ｍ１）で処理したＨｅｐ３Ｂ細胞は、相対生存率が２１．６％に急激に低下した。より高い用量のイーアレスタチンＩ（１０μＭ）及びＭ１ウイルス（ＭＯＩ＝０．００１）で処理する場合、腫瘍細胞Ｈｅｐ３Ｂの相対生存率はさらに低下した。

図２ｂに示すように、ＣＢ−５０８３単独での処理も、０．１２４〜２μＭのＣＢ−５０８３／腫瘍溶解性ウイルスＭ１（ＭＯＩ＝０．００１）の併用処理（ＣＢ−５０８３単独処理と同じ濃度）と比較して顕著に高い相対生存率を示した。従って、ＶＣＰ阻害剤の存在はＭ１ウイルスの腫瘍溶解作用を増強する。

実施例３． ＶＣＰ発現レベルのノックダウンは肝臓がん細胞に対する腫瘍溶解性ウイルスＭ１の腫瘍溶解効果を増強できる。

材料

Ｍ１ウイルス、ヒト肝臓がん細胞Ｈｅｐ３Ｂ、ヒト肝臓がん細胞Ｈｕｈ７（ＡＴＣＣから購入）、ＶＣＰのＲＮＡ干渉断片（ＳｉＲＮＡ）（Ｒｉｂｏｂｉｏから購入；配列番号１−２）、ＭＴＴ（ＭＰｂｉｏから購入）、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）ウエスタンブロット：細胞の総タンパク質抽出物（Ｍ−ＰＥＲ^ＴＭ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ， ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ， ＵＳＡ）、ＶＣＰ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｄａｎｖｅｒｓ， ＭＡ， ＵＳＡ）、ＧＡＰＤＨ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｄａｎｖｅｒｓ， ＭＡ， ＵＳＡ）。Ｍ１ウイルス、Ｈｅｐ３Ｂ及び培地は、実施例１と同じ供給源に由来する。

方法

Ｈｅｐ３Ｂについて実施例１と同様に細胞を増殖させた。対数増殖期にある細胞を選択してＤＭＥＭ完全培地（１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＩＣＯ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む）に加え、細胞懸濁液を調製した。細胞を１×１０^５／ウェルの密度で６ウェルプレートに接種した。２４時間後、ＲＮＡｉＭＡＸで包まれたＳｉ ＲＮＡ断片を加えた。４８時間後、細胞をＭ１ウイルスに感染させた。感染の４８時間後、試料を処理した。対照をＳｉ ＲＮＡ又はＲＮＡｉＭＡＸで未処理のままにして、Ｍ１ウイルス処理対照及びＭ１ウイルス未処理対照を得た。

ａ）２０μｌ（５ｍｇ／ｍｌ）のＭＴＴを各ウェルに加えた。４時間後、吸光度を測定し、細胞の生存率を計算した。ｓｉＶＣＰ実験群を１２．５μＭのＶＣＰのＲＮＡ干渉断片で処理し、ｓｉＮＣ対照群をＶＣＰの非標的化ｓｉＲＮＡ（Ｒｉｂｏｂｉｏから購入）で処理した。

ｂ）タンパク質試料を抽出し、内部標準としてＧＡＰＤＨを使用して、ウエスタンブロットによりＶＣＰのタンパク質発現を検出した。

ｃ）実験を３回繰り返し、データを図３ｃに平均±標準偏差で表した。スチューデントｔ検定の統計は、それぞれの対照群と比較することによって実施した。ここで、＊＊は図３ｃにおいてＰ＜０．０１を示す。

結果

図３ａに示すように、ヒト肝臓がん細胞Ｈｅｐ３Ｂ及びＨｕｈ７をＶＣＰのＲＮＡ干渉断片したところ、ＭＴＴ結果は、ＶＣＰのタンパク質発現量は顕著に低下したことを示す。

図３ｂに示すように、位相差顕微鏡により細胞の形態を観察した。対照群（図３ｂでは「ＮＴｉ」と表示されている）及び干渉ＶＣＰで処理した各群（ＶＣＰｉ＃１群及びＶＣＰｉ＃２群）のＨｅｐ３Ｂ及びＨｕｈ７は、単一層で接着増殖し、同一な表現型で緊密に並んでおり、細胞の形態は、顕著に変化しなった。一方、干渉ＶＣＰ（ＶＣＰｉ＃１又はＶＣＰｉ＃２）で処理し、Ｍ１ウイルス（ＭＯＩ＝０．００１）に感染した各併用処理群では、Ｈｅｐ３Ｂ及びＨｕｈ７の細胞数は顕著に減少し、細胞の形態は細胞体が球形に収縮するように顕著に変化し、屈折率は顕著に増加し、アポトーシスの病理学的徴候を示した。

図３ｃに示すように、併用処理（干渉ＶＣＰ（ＶＣＰｉ＃１又はＶＣＰｉ＃２）／Ｍ１ウイルス（ＭＯＩ＝０．００１））を受けた細胞の相対生存率は、干渉ＶＣＰ単独処理群（ＶＣＰｉ＃１群及びＶＣＰｉ＃２群）と比較して顕著に低下した。この結果は、細胞Ｈｅｐ３Ｂ及び細胞Ｈｕｈ７の両方において見られた。相対生存率のこの差は、統計的差異を示した（ここで、＊＊はＰ＜０．０１を示す）。Ｍ１ウイルス（ＭＯＩ＝０．００１）感染後、ＶＣＰレベルをノックダウンした後の肝臓がんＨｅｐ３Ｂ細胞（ＶＣＰｉ＃１群及びＶＣＰｉ＃２群）の生存率は、顕著に２２．５％及び２２．１％に低下し、肝臓がんＨｕｈ７細胞（ＶＣＰｉ＃１群及びＶＣＰｉ＃２群）の生存率は、顕著に３１．８％及び４０．８％に低下した。上記結果は、ＶＣＰのノックダウンが肝臓がん細胞に対する腫瘍溶解性ウイルスＭ１の腫瘍溶解効果を増強できることを示した。

実施例４． ＶＣＰのタンパク質発現と、ＶＣＰ阻害剤及びＭ１ウイルスを用いた併用療法の抗癌効果との間の正の相関

材料
Ｍ１、ヒト肝臓がん細胞Ｈｅｐ３Ｂ、ヒト肝臓がん細胞Ｈｕｈ７、ヒト肝臓がん細胞Ｓｋ−Ｈｅｐ−１（ＡＴＣＣから購入）、ヒト肝臓がん細胞ＳＮＵ−３８７（ＡＴＣＣから購入）、ヒト肝臓がん細胞ＳＮＵ−４４９（ＡＴＣＣから購入）、ヒト肝臓がん細胞ＳＮＵ−１８２（ＡＴＣＣから購入）、ヒト肝臓がん細胞ＰＬＣ（ＡＴＣＣから購入）、ヒト正常肝細胞Ｌ０２（ＡＴＣＣから購入）、ヒト初代単離肝細胞（ＨＨ）（ ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入）、ウエスタンブロット：細胞の総タンパク質抽出物（Ｍ−ＰＥＲ^ＴＭ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ， ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ， ＵＳＡ）、ＶＣＰ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｄａｎｖｅｒｓ， ＭＡ， ＵＳＡ）、ＧＡＰＤＨ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｄａｎｖｅｒｓ， ＭＡ， ＵＳＡ）。Ｍ１ウイルス、Ｈｅｐ３Ｂ及び培地は、実施例１と同じ供給源に由来し、Ｈｕｈ７は、実施例３と同じ供給源に由来する。

方法
Ｈｅｐ３Ｂについて実施例１と同様に細胞を増殖させた。対数増殖期にある細胞を選択してＤＭＥＭ完全培地（１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む）に加え、細胞懸濁液を調製した。細胞を１×１０^６／ウェルの密度で６０ｍｍ細胞培養ディッシュに接種し、２４時間培養した。

１．ウエスタンブロットによるＶＣＰのタンパク質発現の検出

ａ）細胞の総タンパク質を抽出して定量し、ウエスタンブロット実験（電気泳動、膜貫通、シーリング、一次抗体と二次抗体のインキュベーション、現像）を行った。

ｂ）ＶＣＰ及び内部標準ＧＡＰＤＨのストラップのグレーレベルをＩｍａｇｅ Ｌａｂ^ＴＭ ２．０ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）によりスキャンして検出し、ＶＣＰの正規化タンパク質発現量を下式に従って計算した。ＶＣＰの正規化タンパク質発現量＝ＶＣＰのストラップのグレーレベル／内部標準ＧＡＰＤＨのストラップのグレーレベル。

ｃ）相対ＶＣＰタンパク質発現量＝異なる細胞におけるＶＣＰの正規化タンパク質発現量／ＨＨ細胞におけるＶＣＰの正規化タンパク質発現量。

２．非線形曲線フィッティングによりＭ１ウイルス単独の用量反応曲線及びイーアレスタチンＩとＭ１ウイルスの組み合わせでの用量反応曲線を描いた。

ａ）細胞接種及び投与処理
対数増殖期にある細胞を選択してＤＭＥＭ完全培地（１０％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む）に加え、細胞懸濁液を調製した。細胞を４×１０^３／ウェルの密度で９６ウェル培養プレートに接種した。１２時間後、細胞は壁に完全に付着した。試験を対照群、イーアレスタチンＩ単独処理群、Ｍ１感染群、イーアレスタチンＩ／Ｍ１併用処理群に分けた。イーアレスタチンＩの用量は５μＭであり、Ｍ１ウイルスについて異なる用量勾配を設定した。

ｂ）ＭＴＴと細胞内のコハク酸デヒドロゲナーゼとの反応
培養７２時間後、２０μｌのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに加え、さらに４時間インキュベートした。インキュベートした後、生細胞中に形成された粒状の青紫色ホルマザン結晶を顕微鏡検査により観察した。

ｃ）ホルマザン粒子の溶解
上澄みを注意深く吸い取って捨てた後、１００μｌ／ウェルでＤＭＳＯを加えて形成された結晶を溶解し、マイクロ振動機で５分間振盪した。次いで、酵素結合検出器を用いて５７０ｎｍの波長で各ウェルの光学密度（ＯＤ値）を測定した。実験は各群につき３回繰り返した。細胞の生存率＝薬物処理群のＯＤ値／対照群のＯＤ値×１００％

ｄ）Ｏｒｉｇｉｎ ８を用いて非線形曲線フィッティングを行い、２つの用量反応曲線（１つはイーアレスタチンＩ単独処理、もう１つはイーアレスタチンＩ／Ｍ１ウイルス併用処理）を描いた。２つの曲線のＡＵＣの差を計算して倍数で示した。（ＡＵＣ_{イーアレスタチンＩ単独処理}-ＡＵＣ_{イーアレスタチンＩ／Ｍ１ウイルス併用処理}）／ＡＵＣ_{イーアレスタチンＩ／Ｍ１ウイルス併用処理}）。差が大きければ大きいほど、薬物の相乗効果がより高いことを示す。

ｅ）相対ＡＵＣ及び相対ＶＣＰ発現をピアソン相関分析の方法によって計算した。ここで、ｒは相関係数を表し、ｒが１に近いほど、正の相関が大きいことを意味します。

結果

図４ａに示すように、ウエスタンブロットの写真の下部は、異なる細胞の相対ＶＣＰタンパク質発現量を示し、これは異なる細胞においてＶＣＰのタンパク質発現レベルが異なることを示している。ヒト肝臓がん細胞Ｈｅｐ３Ｂ及びＨｕｈ７のＶＣＰ発現量は、ヒト初代正常細胞ＨＨの７倍以上であり、ヒト肝臓がん細胞Ｓｋ−Ｈｅｐ−１、ＳＮＵ−３８７、ＳＮＵ−４４９又はＳＮＵ−１８２のＶＣＰ発現量は、ヒト初代正常細胞ＨＨの３倍以上であり、ヒト肝臓がん細胞ＰＬＣのＶＣＰ発現量は、ヒト初代正常細胞ＨＨの２倍であった。

図４ｂ及び４ｄに示すように、２つ用量反応曲線を描き、Ｏｒｉｇｉｎ ８を用いて非線形曲線フィッティングを行い、相対ＤＡＵＣ（曲線下面積の差）値を測定してグラフ化した。腫瘍細胞の相対ＤＡＵＣ値は、正常細胞よりも顕著に高いことで、イーアレスタチンＩとＭ１ウイルスの併用がＶＣＰ高発現の腫瘍細胞において顕著な殺傷効果を達成したが、ＶＣＰ低発現の正常細胞の生存率には有意な影響を及ぼさなかったことを示している。

図４ｃに示すように、ピアソン相関分析法の統計により、ＶＣＰの発現は、イーアレスタチンＩ及びＭ１ウイルスを用いた併用療法の効果と正の相関があることが分かった。従って、ＶＣＰのタンパク質発現は、ＶＣＰ阻害剤及びＭ１ウイルスを用いた併用療法の抗がん作用と正の相関がある。これは、ＶＣＰＶＣＰ阻害剤とＭ１ウイルスの組み合わせによる治療のためのバイオマーカーとして適用できることを示している。

実施例５．ＶＣＰ阻害剤とＭ１腫瘍溶解性ウイルスの組み合わせは、不可逆的な小胞体ストレスを誘導することにより腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こす。

材料

Ｍ１ウイルス、ヒト肝臓がん細胞Ｈｅｐ３Ｂ、モノクローナル抗体（ＩＲＥ１ （３２９４ｓ， Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＸＢＰ１（Ｓ）（１２７８２ｓ， Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＢｉＰ（３１７７ｓ， Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐ−ＰＥＲＫ（ｓｃ−３２５７７， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐ−ｅＩＦ２α（３３９８ｓ， Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＡＴＦ６（ｓｃ−２２７９９， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐｏｌｙ−ｕｂ（３９３３ｓ， Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＧＡＰＤＨ（ＡＰ００６０； Ｂｉｏｗｏｒｌｄ）、ｃａｓｐａｓｅ−１２（ａｂ６２４８４， Ａｂｃａｍ）、ＣＨＯＰ（２８９５ｓ， Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐ−ＪＮＫ（９２５５ｓ， Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））。Ｍ１ウイルス及びＨｅｐ３Ｂは実施例１と同じ供給源に由来する。

方法

Ｈｅｐ３Ｂについて実施例１と同様に細胞を増殖させた。対数増殖期にある細胞を選択してＤＭＥＭ完全培地に加え、細胞懸濁液を調製した。細胞を１×１０^６／ウェルの密度で６０ｍｍ細胞培養ディッシュに接種した。１２時間後、細胞は壁に完全に付着した。試験を対照群、イーアレスタチンＩ単独処理群、Ｍ１感染群、イーアレスタチンＩ／Ｍ１併用処理群に分けた。用量は、細胞に感染したＭ１ウイルス（ＭＯＩ＝０．００１）、イーアレスタチンＩ（５μＭ）であった。

薬物治療の時間を設定した後、蛋白質試料を収集し、ウエスタンブロットにより小胞体ストレスのマーカー（ＩＲＥ１、ＸＢＰ１（Ｓ）、ＢｉＰ、ｐ−ＰＥＲＫ、ｐ−ｅＩＦ２α、ＡＴＦ６、ｐｏｌｙ−ｕｂ）及び小胞体ストレス関連アポトーシス経路の活性化（カスパーゼ１２、ＣＨＯＰ、ｐ−ＪＮＫ）状況を検出した。ウエスタンブロット試験の結果を図５ａ及び図５ｂに示す。

結果

イーアレスタチンＩ（５μＭ）単独の使用は、小胞体ストレス関連アンフォールドタンパク質応答経路を上方制御することができた。図５ａに示すように、イーアレスタチンＩ（５μＭ）は、小胞体ストレス関連マーカー（ＩＲＥＩ、ＸＢＰＩ（Ｓ）、ｐ−ＰＥＲＫ、ｐ−ｅＩＦ２α）の増加を誘導することができた。腫瘍溶解性ウイルスＭ１（ＭＯＩ＝０．００１）の単独使用は、他の経路に影響を及ぼすことなく、ＩＲＥＩ、ＸＢＰＩ（Ｓ）を阻害することができた。本発明者らは、イーアレスタチンＩ（５μＭ）をＭ１ウイルスと併用する場合に、Ｍ１ウイルスは、イーアレスタチンＩによって引き起こされるＩＲＥＩ及びＸＢＰＩ経路の上方制御を遮断することにより、強い小胞体ストレスを促進し、カスパーゼ１２及びＪＮＫ経路を活性化し、細胞アポトーシスを誘導することができた。

実施例６．イーアレスタチンＩとＭ１ウイルスの組み合わせは、ヒト肝臓がん細胞株の移植性腫瘍の増殖を顕著に阻害する。

材料

Ｍ１ウイルス、ヒト肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂ、ヒト肝臓がん細胞株Ｈｕｈ７、４週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（南京大学モデル動物研究センター）。Ｍ１ウイルス及びＨｅｐ３Ｂは実施例１と同じ供給源に由来する。Ｈｕｈ７は実施例３と同じ供給源に由来する。

方法

無作為化単盲検試験を実施した。各対象マウスについて、５×１０^６個のＨｅｐ３Ｂ又はＨｕｈ７細胞を４週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの背部に皮下注射した。

腫瘍の大きさが５０ｍｍ^３に達した後、マウスを未処理対照群、イーアレスタチンＩ単独処理群（ｉ．ｐ．２ｍｇ／ｋｇ／ｄ）、Ｍ１単独処理群（Ｍ１ウイルスを５×１０^５ ＰＦＵ／回で尾静脈注射する）、及びイーアレスタチンＩ／Ｍ１併用処理群（イーアレスタチンＩ及びＭ１ウイルスを、イーアレスタチンＩ単独及びＭ１単独の場合と同じ方法及び同じ用量で投与する）に分け、注射を６回連続して行った（６〜８日目、及び１２〜１４日目に６回注射した）。腫瘍の重量、長さ及び幅を２日ごとに測定し、腫瘍体積を式：（長さ×幅^２）／２に従って計算した。腫瘍体積を測定した後、一元配置分散分析統計を行った。ここで、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。

結果

腫瘍の体積を測定するために、ヒト肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂ及びヒト肝臓がん細胞株Ｈｕｈ７の移植性腫瘍を有する動物において病理解剖学を行った。結果は、対照群と比較して、イーアレスタチンＩ単独処理群及びＭ１単独感染群が腫瘍体積のわずかな縮小を引き起こした一方、イーアレスタチンＩ／Ｍ１併用処理群が腫瘍体積の著しい縮小を引き起こした（図６ｂ及び図６ｄを参照）。ヒト肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂのモデルを用いた実験の終わりに、対照群の腫瘍体積は１４６３．６ｍｍ^２、イーアレスタチンＩ単独処理群及びＭ１単独感染群の腫瘍体積はそれぞれ１１８９．７ｍｍ^２及び１１１７．５ｍｍ^２、イーアレスタチンＩ／Ｍ１併用処理群の腫瘍体積は４０４．３ｍｍ^２であった。ヒト肝臓がん細胞株Ｈｕｈ７のモデルを用いた実験の終わりに、対照群の腫瘍体積は４０１．６ｍｍ^２、イーアレスタチンＩ単独処理群及びＭ１単独感染群の腫瘍体積はそれぞれ２７９．５ｍｍ^２及び３４６．２ｍｍ^２、イーアレスタチンＩ／Ｍ１併用処理群の腫瘍体積は１２８．３ｍｍ^２であった。一元配置分散分析統計により、統計的差異があることが示された（図６ａ及び図６ｃ）。

上記実施例は、本発明の例示的な実施形態にすぎない。本発明の実施形態は、上記実施例に限定されない。本発明の精神及び原理から逸脱することなく他のいかなる変更、修正、置き換え、組み合わせ、及び簡単化は、全て本発明の保護範囲に含まれる。

1. S. Yamamoto, Y. Tomita, S. Nakamori, Y. Hoshida, H. Nagano, K. Dono, K. Umeshita, M. Sakon, M. Monden, K. Aozasa, Elevated expression of valosin-containing protein (p97) in hepatocellular carcinoma is correlated with increased incidence of tumor recurrence. J Clin Oncol 21, 447-452 (2003) .
2. Y. Tsujimoto, Y. Tomita, Y. Hoshida, T. Kono, T. Oka, S. Yamamoto, N. Nonomura, A. Okuyama, K. Aozasa, Elevated expression of valosin-containing protein (p97) is associated with poor prognosis of prostate cancer. Clin Cancer Res 10, 3007-3012 (2004) .
3. K. Li, H. Zhang, J. Qiu, Y. Lin, J. Liang, X. Xiao, L. Fu, F. Wang, J. Cai, Y. Tan, W. Zhu, W. Yin, B. Lu, F. Xing, L. Tang, M. Yan, J. Mai, Y. Li, W. Chen, P. Qiu, X. Su, G. Gao, P. W. Tai, J. Hu, G. Yan, Activation of Cyclic Adenosine Monophosphate Pathway Increases the Sensitivity of Cancer Cells to the Oncolytic Virus M1. Mol Ther 24, 156-165 (2016) .

Claims (11)

1. ＶＣＰ阻害剤を含むアルファウイルスの抗腫瘍相乗剤又は薬剤耐性改善剤であって、
   前記アルファウイルスは、Ｍ１ウイルスである、ＶＣＰ阻害剤を含み、
   前記ＶＣＰ阻害剤は、イーアレスタチンＩ及びＣＢ−５０８３から選択される１つ以上の化合物、又はＶＣＰタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段であり、
   前記ＶＣＰタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段は、ＶＣＰ遺伝子に対するＲＮＡ干渉、マイクロＲＮＡ、遺伝子編集又は遺伝子ノックアウトである、アルファウイルス抗腫瘍相乗剤又は薬剤耐性改善剤。
2. （ａ）少なくとも１つのＶＣＰ阻害剤と、
   （ｂ）少なくとも１つの腫瘍溶解性ウイルスと、を含む医薬組成物又はキットであって、
   前記医薬組成物又はキットは、腫瘍を治療するための組成物であり、
   前記腫瘍溶解性ウイルスは、アルファウイルスであり、前記アルファウイルスは、Ｍ１ウイルスであり、
   前記ＶＣＰ阻害剤は、イーアレスタチンＩ及びＣＢ−５０８３から選択される１つ以上、又はＶＣＰタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段であり、
   前記ＶＣＰタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段は、ＶＣＰ遺伝子に対するＲＮＡ干渉、マイクロＲＮＡ、遺伝子編集又は遺伝子ノックアウトである、医薬組成物又はキット。
3. 腫瘍の治療において腫瘍溶解性ウイルスと併用するためのＶＣＰ阻害剤であって、
   前記腫瘍溶解性ウイルスは、アルファウイルスであり、前記アルファウイルスは、Ｍ１ウイルスであり、
   前記ＶＣＰ阻害剤は、イーアレスタチンＩ及びＣＢ−５０８３から選択される１つ以上の化合物、又はＶＣＰタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段であり、
   前記ＶＣＰタンパク質のレベルを低下させる遺伝的手段は、ＶＣＰ遺伝子に対するＲＮＡ干渉、マイクロＲＮＡ、遺伝子編集又は遺伝子ノックアウトである、ＶＣＰ阻害剤。
4. 前記ＶＣＰ阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又は抗体である請求項１〜３のいずれか１項に記載のアルファウイルスの抗腫瘍相乗剤、薬剤耐性改善剤、医薬組成物若しくはキット、又はＶＣＰ阻害剤。
5. 前記ＶＣＰ阻害剤は、腫瘍標的化ＶＣＰ阻害剤である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアルファウイルスの抗腫瘍相乗剤、薬剤耐性改善剤、医薬組成物若しくはキット、又はＶＣＰ阻害剤。
6. 前記ＶＣＰ阻害剤は、合成ＶＣＰ阻害剤である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアルファウイルスの抗腫瘍相乗剤、薬剤耐性改善剤、医薬組成物若しくはキット、又はＶＣＰ阻害剤。
7. 前記アルファウイルスは、寄託番号ＣＣＴＣＣ Ｖ２０１４２３で寄託されているＭ１ウイルスのゲノムに対して、少なくとも９７．８％のヌクレオチド配列同一性を有し、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアルファウイルスの抗腫瘍相乗剤、薬剤耐性改善剤、医薬組成物若しくはキット、又はＶＣＰ阻害剤。
8. 前記アルファウイルスは、寄託番号ＣＣＴＣＣ Ｖ２０１４２３で寄託されているＭ１ウイルスのゲノムに対して、少なくとも１００％のヌクレオチド配列同一性を有し、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアルファウイルスの抗腫瘍相乗剤、薬剤耐性改善剤、医薬組成物若しくはキット、又はＶＣＰ阻害剤。
9. 前記腫瘍は、固形腫瘍又は血液腫瘍である、請求項１、３〜８のいずれか１項に記載のアルファウイルスの抗腫瘍相乗剤、薬剤耐性改善剤、医薬組成物若しくはキット、又はＶＣＰ阻害剤。
10. 前記固形腫瘍は、肝臓がん、大腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵がん、鼻咽頭がん、肺がん、又は胃がんである、請求項９に記載のアルファウイルスの抗腫瘍相乗剤、薬剤耐性改善剤、医薬組成物若しくはキット、又はＶＣＰ阻害剤。
11. 前記腫瘍は、腫瘍溶解性ウイルスに感受性ではない腫瘍であり、或いは
    前記腫瘍は、ＶＣＰ高発現腫瘍である、請求項１、３〜１０のいずれか１項に記載のアルファウイルスの抗腫瘍相乗剤、薬剤耐性改善剤、医薬組成物若しくはキット、又はＶＣＰ阻害剤。

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