JP6441372B2 - アルファウイルスの抗腫瘍薬の製造への応用 - Google Patents
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Description
実施例1 M1ウイルスの腫瘍細胞死亡への選択的な誘起
材料:
肝細胞癌Hep3B、ヒト膀胱移行上皮癌T24、ヒト結腸直腸癌LoVo、ヒト不死化正常肝細胞株L-02、M1ウイルス、高グルコースDMEM培地、F-12培地、倒立型位相差顕微鏡。
方法:
a)細胞培養:ヒト肝細胞癌細胞株Hep3B細胞株、ヒト膀胱移行上皮細胞癌細胞株T24、ヒト不死化正常肝細胞株L-02を10%FBS、100U/mlペニシリン及び0.1mg/mlストレプトマイシンを含有するDMEM完全培地で成長させ、ヒト結腸直腸癌細胞株LoVoを10%FBS、100U/mlペニシリン及び0.1mg/mlストレプトマイシンを含有するF-12完全培地で成長させる。すべての細胞株を5%CO2、37℃のクローズド型恒温器(相対湿度95%)に置いて継代培養し、倒立顕微鏡で成長状況を観察する。凡そ2〜3日に1回継代し、対数増殖期にある細胞を採取して正式な実験に用いる。
b)顕微鏡による細胞への観察:対数増殖期の細胞を採取し、DMEM或いはF-12完全培養液(10%ウシ胎児血清、1%二重抗体を含み)で細胞懸濁液を調製し、細胞を2.5×104/ウェルの密度で24ウェルの培養プレートに接種する。M1ウイルス(MOI=1)で48時間感染した後、倒立型位位相差顕微鏡で細胞の形態学的変化を観察する。
結果:
位相差顕微鏡で細胞の形態を観察した結果、Hep3B細胞、T24細胞及びLoVo細胞はどちらも単層で付着成長し、且つ細胞が密に配列し、表現型が均一である。一方、図1aに示すように、M1ウイルス(MOI=1)で48h処理した後、細胞の形態が顕著に変化して、対照細胞群に比べ感染ウイルス群細胞数は顕著に減少し、細胞体が球形に収縮し、屈折率が明らかに増加し、死亡様病変を呈する。図1bはM1ウイルス感染の正常細胞に対する影響を示し、同じである力価のM1ウイルスによりL-02細胞を感染した結果、細胞数、形態が顕著に変化することを発見しない。その結果は、M1ウイルスは腫瘍細胞に対して細胞死亡を選択的に誘起する一方、正常細胞の生存に影響を与えないことを示す。
材料:
34株の腫瘍細胞株(表1参照)、3株のヒト不死化正常細胞株(表1参照)、M1ウイルス、高グルコースDMEM培地、F-12培地、MTT(テトラメチルチアゾリルテトラゾリウム)。
方法:
a)細胞接種及び投与処理:対数増殖期の細胞を採取し、DMEM(又はF-12)完全培養液(10%ウシ胎児血清、1%二重抗体を含み)で細胞懸濁液を調製し、4×103/ウェルの密度で96ウェルの培養プレートに接種する。12時間後、細胞が完全に付着することを発見する。実験は実験群と対照群に分けられ、実験群:M1ウイルス(MOI=10)感染細胞、対照群:高グルコースDMEM溶媒対照群である。何れの群はpentaplicateで行われる。
b)MTTと細胞内のコハク酸デヒドロゲナーゼとの反応:48h培養した時、ウェル毎にMTT 15μl(5mg/ml)を加え、4時間培養し続けた後、顕微鏡により生細胞内で形成した粒子状の青紫色のホルマザン結晶が観察される。
c)ホルマザン粒子の溶解:澄みを慎重に抽出し、DMSOを100μl/ウェルで加えて、形成した結晶を溶解させた後、微小発振器で5min振動し、その後酵素結合検出器で波長570nmで各ウェルの光密度(OD値)を測定する。各群の実験を3回繰り返す。細胞生存率=薬物処理群OD値/対照群OD値×100%。
結果:
表1に示すように、M1ウイルス(MOI=10)で腫瘍細胞を48時間処理した結果、膵臓癌、鼻咽頭癌、前立腺癌及び黒色腫細胞の死亡率は50%を超え、結腸直腸癌(LoVo、HCT-8、SW620及びSW480)、肝臓癌(Hep3B、Huh-7及びHuh-6)、膀胱癌及び乳癌細胞の死亡率は40%を超え、神経膠腫、子宮頸癌、肺癌細胞の死亡率は30%を超え、胃癌細胞の死亡率は20%を超える。正常細胞(L-02、HEB及びSV-HUC-1)とPLC及びHCT116細胞の生存率には統計学的に有意な変化がない。その結果は、M1ウイルス感染は大部の腫瘍細胞死亡を選択的に誘起することを示す。
(注:**p<0.01,*p<0.05,ns:差異は統計学的意義無し、統計方法:students't検定、-:統計してない。)
実施例2 M1ウイルスは腫瘍成長を選択的且つ効果的に抑制する。
材料:
M1ウイルス、ヒト肝臓癌細胞株Hep3B、ヒト結腸直腸癌細胞株LoVo、4週齢の雌BALB/cヌードマウス58匹
方法:
a)担癌マウスモデルの構築:5×106Hep3B又はLoVo細胞を4週齢BALB/cヌードマウスの背側から皮下注射する。
b)腫瘍内投与:Hep3B腫瘍体積が約50mm3又はLoVo腫瘍体積が約70mm3に到した時、腫瘍内注射投与を始め、12日でM1ウイルスを合計6回(2×106PFU/回)注射する。OptiPROTMSFM培地注射を溶媒対照群とする。2日毎に腫瘍の長さ及び幅と体重を測定する。腫瘍の体積は、長さ×幅2/2により計算される。
c)静脈内投与:Hep3B細胞腫瘍体積が約50mm3に到した時、M1ウイルスを静脈内注射(3×107PFU/回)し、3日後、二回目の静脈内注射をする。OptiPROTMSFM培地注射を溶媒対照群とする。3日毎に体重と腫瘍の長さ及び幅を測定する。腫瘍の体積は、長さ×幅2/2により計算される。
結果:
BALB/cヌードマウスで皮下担癌Hep3B(図2a及び2c)及びLoVo(図2b)ヌードマウスのモデルを構築した後、連続的に複数回の腫瘍内注射(図2a及び図2b)又は静脈内注射(図2c)によりM1ウイルスを投与し、ヌードマウス腫瘍体積及び動物体重の変化状況を観察する。Hep3Bヌードマウスモデルにおいて、腫瘍内注射投与は図2aに示すように行い、20日目に実験を終了し、溶媒対照群腫瘍の体積平均値は0.368±0.051cm3で、M1ウイルス群の腫瘍体積平均値は0.172±0.058cm3であることから、M1ウイルスがHep3B担癌マウスの腫瘍成長を顕著に抑制し、且つM1ウイルス群ヌードマウスの平均体重(16.4±1.54g)と対照群ヌードマウスの平均体重(17.0±1.16g)とは顕著な差異がないことが分かり、そして、精神状態も良好であるから、M1ウイルスは安全性に優れることを示す。一方、LoVoヌードマウスモデルにおいて、腫瘍内投与は図2bに示すように行い、24日目に実験を終了し、対照群腫瘍の体積平均値は0.546±0.087cm3で、M1ウイルス群腫瘍の体積平均値は0.389±0.049cm3であることから、M1ウイルスがLoVo担癌マウスの腫瘍成長を顕著に抑制し、且つM1ウイルス群ヌードマウスの平均体重(18.9±1.40g)と対照群ヌードマウスの平均体重(19.4±1.86g)とは顕著な差異がないことが分かり、そして、精神状態も良好であるから、M1ウイルスは安全性に優れることを示す。Hep3Bヌードマウスモデルにおいて、静脈内注射投与は図2cに示すように行い、21日目に実験を終了し、対照群腫瘍の平均体積は0.247±0.067cm3、M1ウイルス群腫瘍の平均体積は0.134±0.057cm3であることから、M1ウイルスはHep3B担癌マウスの腫瘍成長を顕著に抑制し、且つM1ウイルス群ヌードマウスの平均体重(17.2±2.50g)と対照群ヌードマウスの平均体重(17.5±2.16g)とは顕著な差異がないことが分かり、そして、精神状態も良好であるから、M1ウイルスは安全性に優れることを示す。
材料:
4週齢雌性BALB/cヌードマウス24匹、肝臓癌細胞株Hep3B、Trizol、組織ホモジナイザー、リアルタイムPCR装置
β-actinプライマー:
センス鎖(SEQ ID No.1:GATCATTGCTCCTCCTGAGC)
アンチセンス鎖(SEQ ID No.2:ACTCCTGCTTGCTGATCCAC)
M1ウイルス非構造蛋白NS1プライマー:
センス鎖(SEQ ID No.3:GTTCCAACAGGCGTCACCATC)
アンチセンス鎖(SEQ ID No.4:ACACATTCTTGTCTAGCACAGTCC)
方法:
4週齢のヌードマウスの背側皮下に5×106 Hep3B細胞を注射する。4日後、各マウスにM1ウイルス(3×107PFU)を尾静脈注射する。投与後、それぞれ1、2、3及び4日目にヌードマウスを殺し、組織サンプル(腫瘍、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、脳、筋肉)を収集して、組織RNAを抽出する。さらに、QRT-PCRによりM1ウイルスの量を検出することにより、M1ウイルス非構造蛋白NS1をM1ウイルス量として検出し、同時にβ-actin内標準を検出し、相対M1ウイルスRNA量を、
により計算する。Ct-NS1、Ct-内標準はApplied Biosystems 7500Fast Real-Time PCR System装置から読み取って得られる。
結果:
図2dに示すように、ヌードマウス皮下Hep3B腫瘍モデルにおいて、異なる4つの時点でM1ウイルスの腫瘍組織における量は他の臓器・組織の102〜106倍以上であり、M1ウイルスは選択的に腫瘍組織に集中することを示す。
実施例3 M1ウイルスはZAP低発現/ZAP陰性腫瘍細胞の死亡を選択的に誘起する。
材料:
M1ウイルス、ヒト肝細胞L-02、ヒトグリア細胞HEB、ヒト膀胱癌細胞SCaBER及びT24、ヒト肝臓癌細胞株Hep3B及びPLC、ヒト肝臓癌細胞株Hep G2、ヒト結腸直腸癌細胞株LoVo及びHCT116;
Western bolt:細胞総タンパク質抽出液(M-PER(r) Mammalian Protein Extraction Reagent、Thermo)、ZAP抗体(Thermo、USA)、β-actin抗体(Neomarker、USA);
RNA、PCRの抽出:RNA抽出試薬Trizol、リアルタイムPCR装置 Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System(Life、USA)、
ZAPプライマー:
ZAPセンス鎖(SEQ ID No.5:TCACGAACTCTCTGGACTGAA)
ZAPアンチセンス鎖(SEQ ID No.6:ACTTTTGCATATCTCGGGCATAA)
β-actinプライマー:実施例2と同様。
方法:
対数増殖期の細胞を採取し、DMEM又はF-12完全培養液(10%のウシ胎児血清、1%の二重抗体を含み)で細胞懸濁液を調製し、細胞を2×105/ウェルの密度で35mmウェルの培養プレートに接種する。RNAを抽出し、PCRにより細胞におけるZAPmRNA発現量を検出する。本実験の内標準はβ-actinである。ZAP mRNA 均一化発現量は公式:
により計算される。Ct-ZAP、Ct-内標準はApplied Biosystems 7500Fast Real-Time PCR Systemから読み取って得られるものであり、PCR増幅過程における、蛍光信号がバックグラウンドから指数増殖段階に入り始まる閾値に対応する循環回数を示す。
細胞総タンパク質を抽出し定量し、Western Blot実験(電気泳動、膜貫通、密封、一抗と二抗の培養、顕象)を行う。イメージングソフトウェアImage LabによりZAP及び内標準β-actinバンド階調を走査し、バンド階調を検出し、ZAP均一化タンパク質発現量の計算は、公式:ZAP均一化タンパク質発現量=ZAPバンド階調/内標準バンド階調により行われる。試験は3回繰り返し、平均値をZAP均一化タンパク質発現量として計算する。
結果:
図3a及び3bに示すように、腫瘍細胞SCaBER、T24、Hep3B及びLoVoにおいて、ZAPのmRNA(図3a)及びタンパク質(図3b)均一化発現量がほとんど検出されず、正常細胞(L-02及びHEB)及び腫瘍細胞(PLC、HCT116)により明らかに低い。
M1ウイルスはZAP低発現/陰性の腫瘍細胞の死亡を誘起するが、ZAP高発現の細胞の死亡を誘起することがない。正常細胞(L-02及びHEB)及び腫瘍細胞(PLC、HCT116)の一部はM1ウイルスに感染した後、生存率が統計的有意性の変化がなく、L-02は100.3%、HEBへ98.8%である(表1)。一方、腫瘍細胞SCaBER、T24、Hep3B及びLoVoは、M1ウイルスに感染した後、細胞生存率がT24 21.1%、SCaBER 11.5%、LoVo 6.9%及びHep3B 3.8%に顕著に低減する(表1)。
図3c及び表1に示すように、Hep G2肝臓癌細胞のZAPタンパク質均一化発現量がL-02正常細胞より低く、比率が0.8である。L-02細胞はM1ウイルスに感染した後、生存率の顕著な変化がない一方、Hep G2細胞はM1ウイルスに感染した後、生存率が70.4%に低減するため、両方の細胞に対して、統計的差異がある。それは、さらに、M1ウイルスがZAP低発現の腫瘍細胞死亡を誘起することを証明できる。
材料:
M1ウイルス、ヒト肝細胞L-02、ヒト肝臓癌細胞PLC、ヒト結腸直腸癌細胞HCT116、ZAP RNA干渉断片、MTT(メチルチアゾリルテトラゾリウム)、LipofectamineTM RNAiMAX(invertrogen、USA)
Western bolt:細胞総タンパク質抽出液(M-PER(r) Mammalian Protein Extraction Reagent、Thermo)、ZAP抗体(Thermo、USA)、M1ウイルスNS3抗体(Beijing Protein Innovation)、M1ウイルスE1抗体(Beijing Protein Innovation)、GAPDH抗体(CST、USA);
RNA、PCRの抽出:Trizol、リアルタイムPCR装置(Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System)、β-actin、M1ウイルス非構造蛋白NS1プライマーは、実施例2と同様;
ZAP干渉断片(Si RNA)は標的配列SEQ ID No.7:5'CCAAGAGTAGCACTTGTTA3'のために設計される。
Si RNAセンス鎖(SEQ ID No.8:5'CCAAGAGUAGCACUUGUUA dTdT 3')
Si RNAアンチセンス鎖(SEQ ID No.9:3'dTdT GGUUCUCAUCGUGAACAAU 5')
ZAP文字化け干渉断片対照(siNC):センス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチド比率がSi RNA断片と同じであるが、配列順序が完全にランダムである。
方法:
対数増殖期の細胞を採取し、DMEM完全培養液(10%ウシ胎児血清、1%二重抗体)で細胞懸濁液を調製し、細胞を1×105/ウェルの密度で6ウェルの培養プレートに接種する。24時間後、RNAiMAXで包まれたSi RNA断片を加える。48時間後、M1ウイルスに感染させる。感染してから48時間後、試料を処理する。
ウェル毎にMTT 20μl(5mg/ml)を加え、4時間後、吸光度の値を測定し、細胞の生存率を計算し、siZAP実験群はZAP RNA干渉断片で処理し、siNC対照群はZAP文字化け干渉断片で処理する。
a)細胞澄み液を収集し、TCID50の方法によりウイルス力価を測定する。
b)RNA試料を抽出し、PCRによりM1ウイルス非構造蛋白NS1量を検出することでM1ウイルス量を検出し、β-actinは内標準である。
c)タンパク質試料を抽出し、Western blotによりZAPタンパク質発現及びM1ウイルスタンパク質NS3とE1を検出し、内標準はGAPDHである。ZAP均一化発現量の計算は、内標準としてβ-actinをGAPDHに変更した以外、実施例3の1)と同様である。
d)試験を3回繰り返し、データは平均値±標準偏差で表される。それぞれの対照群と比較してstudents't検定統計する。*/#/&はP<0.05、**/&&はP<0.01、nsは統計的差異無しであることを示す。
結果:
図3d-3gに示すように、ZAP RNA干渉断片でヒト正常肝細胞L-02、ヒト肝臓癌細胞PLC及びヒト結腸直腸癌細胞HCT116を処理した後、ZAPタンパク質発現量は検出不能であるほど顕著に低減する一方(図3g)、M1ウイルスタンパク質NS3及びE1タンパク質は顕著に増加する。M1ウイルス(MOI=100)に感染した後、ZAPレベルがノックダウンされたL-02細胞(siZAP群)の生存率が69.7%±3.45%、PLC細胞生存率が63.9%±11.5%、HCT116細胞生存率が49.6%±1.21%に低減することを顕著に誘起する(図3d)。図3eに示すように、M1ウイルスに感染してから48時間後、ZAPがノックダウンされた(siZAP群)のL-02細胞において、相対M1ウイルス力価は対応するsiNC群の4.10±1.38倍であり、HCT116細胞(siZAP群)において、対応するsiNC群の3.39±1.27倍であり、PLC細胞(siZAP群)において、対応するsiNC群の32.6±2.34倍である。又、図3fに示すように、M1ウイルスに感染してから48時間後、ZAPがノックダウンされた(siZAP群)L-02細胞において、M1ウイルスRNA発現量は対応するsiNC群の16.3±8.20倍であり、HCT116細胞において、対応するsiNC群の8.82±4.02倍であり、PLC細胞において、対応するsiNC群の30.5±12.23倍である。上記の結果から、M1ウイルスはZAPレベルがノックダウンされた正常細胞及び腫瘍細胞の死亡を顕著に誘起することが分かる。
材料:
M1ウイルス、ヒト肝臓癌細胞Hep3B、GFPを発現するpReceiver-M02-GFPプラスミド(ブランク対照プラスミド、広州複能遺伝子)、ZAPを発現するpReceiver-M02-ZAPプラスミド(ZAP過剰発現プラスミド)、FuGENE HDトランスフェクション試薬、MTT(メチルチアゾリルテトラゾリウム)
RNA、PCRの抽出:Trizol、リアルタイムPCR装置(Applied Biosystems 7500Fast Real-Time PCR System)、β-actin、M1ウイルス非構造蛋白NS1プライマーは、実施例2と同様。
Western bolt:細胞総タンパク質抽出液(M-PER(r) Mammalian Protein Extraction Reagent、Thermo)、ZAP抗体(Thermo、USA)、M1ウイルスNS3抗体(Beijing Protein Innovation)、M1ウイルスE1抗体(Beijing Protein Innovation)、GAPDH抗体(CST、USA)。
方法:
対数増殖期の細胞を採集し、DMEM完全培養液(10%のウシ胎児血清、1%の二重抗体)で細胞懸濁液を調製し、細胞を1×105/ウェルの密度で6ウェルの培養プレートに接種する。24時間後、GFP過剰発現対照プラスミド及びZAP過剰発現プラスミドをそれぞれトランスフェクションして、緑色蛍光タンパク質を発現する細胞及びZAP過剰発現の細胞を得る。48時間後、M1ウイルスに感染させる。感染してから48時間後、試料を処理して検出する。
a)MTT法により細胞生存率を検出し、ウェル毎にMTT 20μl(5mg/ml)を加え、4時間後570nM波長により吸光度の値を測定する以外の処理は実施例1と同様である。
b)細胞澄み液を収集し、TCID50の方法によりウイルス力価を検出する。
c)サンプルの総RNA試料を抽出し、QRT-PCR法によりM1ウイルスRNA発現量を測定し、計算は実施例2の方法により行われる。
d)タンパク質試料を収集し、Western blotによりZAPタンパク質発現量及びM1ウイルスタンパク質NS3、E1タンパク質発現量を検出し、処理方法は実施例3の1)と同様である。
e)各試験をそれぞれ3回繰り返し、データを平均値±標準偏差で表す。ぞれぞれの対照群と比較してstudents't検定統計する。#はP<0.05、**はP<0.01、nsは統計的差異無しであることを示す。
結果:
図3kに示すように、ヒト肝臓癌細胞Hep3BにZAP過剰発現プラスミドがトランスフェクションされた後、Image Labソフトウェアにより異なる試料のZAP及び内標準β-actinバンドについて階調走査を行った後、それぞれのZAP均一化タンパク質発現量を計算する。ZAP均一化タンパク質発現量ZAP過剰発現群は1.61±0.05、GFP過剰発現対照群は0.03±0.01であり、前者の平均値が後者の53.7倍であり、M1ウイルスタンパク質NS3及びE1タンパク質が顕著に増加する。
図3hに示すように、ZAPの過剰発現はM1ウイルス感染によるHep3B細胞の死亡を部分的に遮断する。異なるM1ウイルス力価で感染してから48時間後、MOI=0.1である時、ZAP過剰発現群の細胞生存率の平均値は74.7%±8.94%で、GFP過剰発現対照群の細胞生存率(59.0%±6.27%)より顕著に高い。MOI=1である時、ZAP過剰発現群の細胞生存率の平均値は69.4%±6.95%で、GFP過剰発現対照群の生存率(51.4%±5.31%)より顕著に高い。MOI=10である時、ZAP過剰発現群の細胞生存率の平均値は63.7%±6.04%で、GFP過剰発現対照群の生存率(40.5%±3.19%)より顕著に高い。
図3iに示すように、M1ウイルスに感染したZAP過剰発現のHep3B細胞におけるM1相対ウイルス力価は対応するGFP過剰発現対照群の31.5±11.6%である。また、M1ウイルスに感染したZAP過剰発現のHep3B細胞におけるM1ウイルスRNA発現量は対応するGFP過剰発現対照群の9.5±4.7%である。
材料:
DMEM高グルコース培地、TECIA(Tissue Culture-MTT Endpoint Computer Image Analysis Chemo-sensitivity Test)、β-actin及びZAP:実施例3の1)と同様。
方法:
a)ヒト体外生肝臓癌組織及び結腸直腸癌組織の培養
体外活組織は中山大学腫瘍防治中心での外科的切除により得られたもので、4℃の保存し、4時間以内に実験室に送られて薬物感受性試験を行い、すべての病例が病理組織検査により診断された。無菌条件下で腫瘍組織を取り出して、直径0.5〜1mmの組織ブロックに切り、ウェル毎に4〜6個で24ウェル培養プレートに置き、ウェル毎に1ml DMEM培地を入れる。1時間培養した後、薬剤感受性試験専用の画像分析器で腫瘍組織ブロックの投影照明映像を撮影し、各ウェルの腫瘍ブロックの面積(area、A)を測定し比較することにより、M1ウイルスのヒト体外生腫瘍組織に対する抑制作用を分析する。
b)薬物処理及び組織活性測定
腫瘍組織をCO2細胞インキュベーターで12時間培養し、安定した後、107PFUのM1ウイルス及び陽性対照薬物である5-フルオロウラシル(5-Fu、10mg/L)を添加し,96時間感染した後、MTT(5mg/ml)50μl/ウェルを加え、3時間培養し、その後、薬剤感受性試験専用の画像分析器で腫瘍組織ブロックの散乱光照明画像を撮影し、ウェル毎に腫瘍ブロックのホルマザンにより染色された面積及び着色度(blue area、BA)を測定し、以下の式に基づいて組織生存率(survival fraction、SF)を計算する。
腫瘍組織阻害率(Cell inhibition、CI):CI=(1-SF)×100%、BA薬物処理はM1ウイルス/5-Fu処理群の染色面積、A薬物処理はM1ウイルス/5-Fu処理群の腫瘍ブロック面積、BA対照は溶媒対照処理群の染色面積、A対照は溶媒対照処理群の腫瘍ブロック面積を示す。
c)ZAP mRNA均一化発現量の検出
M1ウイルスの腫瘍阻害率10%を基準として、前記すべての病例組織を2群に分け、それぞれ試料RNAを抽出し、QRT-PCR法によりZAP mRNA、β-actin(内標準)レベルを検出し、両方のZAP均一化発現量の差を比較し、順位和検定により統計分析する。なお、ZAP均一化発現量の計算方法は実施例3の1)と同様である。
結果:
a)表2に示すように、肝臓癌組織において、阻害率が10%を超えた病例の比率について、M1ウイルス群は59.5%で、5-Fu群(53.8%)より高いため、M1ウイルスの有效率は現在の肝臓癌の臨床治療薬である5-Fuより高い。
b)表3に示すように、結腸直腸癌組織において、阻害率が10%を超えた病例の比率について、M1ウイルス群は71.4%で、5-Fu群(61.5%)より高いため、M1ウイルスの有效率は現在の結腸直腸癌の臨床治療薬である5-Fuより高い。
c)前記M1ウイルス処理されたヒト体外生腫瘍組織を、阻害率10%を基準として2つの群に分け、さらにそれらの組織におけるZAP mRNA発現レベルと阻害率との相関性を分析する。M1ウイルス処理による阻害率が10%を超えるサンプル群のZAP均一化発現量は0.117±0.890で、阻害率が10%以下の群(0.791±0.108)より低く、両方の平均値の比が0.148である。図4に示すように、M1ウイルス処理による阻害率が10%以下の腫瘍組織のZAP均一化発現量のメジアンは0.414で、10%を超えた腫瘍組織のZAP発現量のメジアンは0.075である。順位和検定の方法により統計し、差異が統計学的に有意であることを示し、P<0.05は、M1ウイルスがZAP低発現/ZAP陰性の腫瘍組織の死亡を選択的に誘起できることを示す。
材料:
506人の患者由来の8枚の組織マイクロアレイ(肝臓癌、結腸直腸癌、膀胱癌及びペアの腫瘍周囲組織)、ZAP抗体(Thermo、USA)、APERIO完全自動デジタル病理切片スキャナー
方法:
複数のセンター由来の8枚の組織マイクロアレイに免疫組織化学染色(IHC)を行い、APERIOスキャナーにより走査して付属するソフトウェアにより染色密度を計算し、ZAP均一化発現量を検出する。ZAP均一化発現量=視野内ZAP染色強度/視野内細胞数、ただし、視野内細胞数を均一化標準とする。
結果:
本発明者らは、免疫組織化学方法によりZAPのヒトの複数種類の腫瘍病理試料での発現状況を検出した。図5aはヒト肝臓癌、結腸直腸癌、膀胱癌病理組織試料のZAPの免疫組織化学染色の代表的なマッピングを示し、ZAP染色は腫瘍組織で腫瘍周囲組織より浅い。
図5bに示すように、肝臓癌、結腸直腸癌、膀胱癌及びそれぞれの腫瘍周囲非腫瘍組織のZAPタンパク質均一化発現量の平均値を統計分析した結果、前記の各腫瘍組織におけるZAP蛋白均一化発現量の平均値はそれぞれの腫瘍周囲非腫瘍組織より顕著に低く、ZAPが腫瘍組織において低発現である。すべての肝臓癌腫瘍組織の平均ZAP均一化発現量は5.83±8.49で、対応する腫瘍周囲非腫瘍組織(11.8±11.5)より顕著に低く、両方の平均値の比は0.494であり、すべての結腸直腸癌腫瘍組織の平均ZAP均一化発現量は2.41±3.60で、対応する腫瘍周囲非腫瘍組織(8.30±8.94)より顕著に低く、両方の平均値の比は0.290であり、すべての膀胱癌腫瘍組織の平均ZAP均一化発現量は2.93±4.63で、腫瘍周囲非腫瘍組織(10.3±8.36)より低く、両方の平均値の比は0.284である。
図5cに示すように、分析されたすべての肝臓癌の病例に対して、ZAP低発現の病例数は69%であり、分析されたすべての結腸直腸癌の病例に対して、ZAP低発現の病例は52%であり、分析されたすべての膀胱癌の病例に対して、ZAP低発現の病例は61%である。従って、ZAPはM1ウイルスによる肝臓癌、結腸直腸癌及び膀胱癌に対する治療の選択的な分子マーカーとなる。
材料:
アフリカミドリザル腎臓細胞Vero、高グルコースDMEM培地、OptiPROTMSFM培地(1×)、M1ウイルス、100mm細胞培養皿、遠心分離機
方法:
対数増殖期の細胞を採取し、DMEM完全培地(10%ウシ胎児血清、1%二重抗体を含み)で細胞懸濁液を調製し、細胞を100mm細胞培養皿に接種する。細胞の融合度が80%〜90%に達する時に、OptiPROTMSFMに変更する。さらに、50μl(MOI=0.01)M1ウイルスを加え感染させ、細胞は大面積の病変(約36時間)が発生する時に、細胞澄みを収集する。2000〜3000RPMで5min遠心し、慎重に澄みを吸い出し、均一に混合して小分けして、-80℃で冷蔵庫に保存する。
Claims (26)
- 少なくとも1種のアルファウイルスの抗腫瘍薬の製造への使用であって、
前記少なくとも1種のアルファウイルスはM1ウイルス及びゲタウイルスから選択され、前記腫瘍がヒトの腫瘍であって、ZAP低発現腫瘍又はZAP陰性腫瘍であることを特徴とする使用。 - 前記腫瘍は固形腫瘍であることを特徴とする請求項1に記載の使用。
- 前記腫瘍は肝臓癌、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、前立腺癌、神経膠腫、黒色腫、膵臓癌、鼻咽頭癌、肺癌又は胃癌のうちの1種又は複数種であることを特徴とする請求項1又は2に記載の使用。
- 前記アルファウイルスは、寄託番号:CCTCC V201423のM1ウイルスとの相同性が少なくとも97.8%の遺伝子配列を有することを特徴とする請求項1乃至3のいずれかに記載の使用。
- 前記アルファウイルスは、寄託番号:CCTCC V201423のM1ウイルスとの相同性が100%の遺伝子配列を有することを特徴とする請求項1乃至4のいずれかに記載の使用。
- 前記アルファウイルスは、腫瘍組織に選択的に集中する特性を有することを特徴とする請求項1乃至5のいずれかに記載の使用。
- 前記抗腫瘍薬は注射剤、錠剤、カプセル又は貼付剤であることを特徴とする請求項1乃至6のいずれかに記載の使用。
- ZAP発現レベル検出試薬と少なくとも1種のアルファウイルスとを含む抗腫瘍投与システムであって、前記アルファウイルスはM1ウイルス及びゲタウイルスから選択され、前記腫瘍がヒトの腫瘍であることを特徴とする抗腫瘍投与システム。
- 前記腫瘍は固形腫瘍であることを特徴とする請求項8に記載の抗腫瘍投与システム。
- 前記腫瘍は肝臓癌、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、前立腺癌、神経膠腫、黒色腫、膵臓癌、鼻咽頭癌、肺癌又は胃癌のうちの1種又は複数種であることを特徴とする請求項8又は9に記載の抗腫瘍投与システム。
- 前記アルファウイルスは、腫瘍組織に選択的に集中する特性を有することを特徴とする請求項8乃至10のいずれかに記載の抗腫瘍投与システム。
- 前記アルファウイルスは、寄託番号:CCTCC V201423のM1ウイルスとの相同性が少なくとも97.8%の遺伝子配列を有することを特徴とする請求項8乃至11のいずれかに記載の抗腫瘍投与システム。
- 前記アルファウイルスは、寄託番号:CCTCC V201423のM1ウイルスとの相同性が100%の遺伝子配列を有することを特徴とする請求項8乃至12のいずれかに記載の抗腫瘍投与システム。
- 少なくとも1種のアルファウイルスとZAP阻害剤とを含む抗腫瘍薬であって、前記アルファウイルスはM1ウイルス及びゲタウイルスから選択され、前記腫瘍がヒトの腫瘍であり、前記ZAP阻害剤は、ZAP阻害抗体又はZAP阻害RNAiであることを特徴とする抗腫瘍薬。
- 前記腫瘍は固形腫瘍であることを特徴とする請求項14に記載の抗腫瘍薬。
- 前記腫瘍は肝臓癌、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、前立腺癌、神経膠腫、黒色腫、膵臓癌、鼻咽頭癌、肺癌又は胃癌のうちの1種又は複数種であることを特徴とする請求項14又は15に記載の抗腫瘍薬。
- 前記アルファウイルスは、寄託番号:CCTCC V201423のM1ウイルスとの相同性が少なくとも97.8%の遺伝子配列を有することを特徴とする請求項14乃至16のいずれかに記載の抗腫瘍薬。
- 前記アルファウイルスは、寄託番号:CCTCC V201423のM1ウイルスとの相同性が100%の遺伝子配列を有することを特徴とする請求項14乃至17のいずれかに記載の抗腫瘍薬。
- 前記アルファウイルスは、腫瘍組織に選択的に集中する特性を有することを特徴とする請求項14乃至18のいずれかに記載の抗腫瘍薬。
- 前記ZAP阻害剤は腫瘍標的化ZAP阻害剤であることを特徴とする請求項14乃至19のいずれかに記載の抗腫瘍薬。
- ZAP阻害剤の、アルファウイルスによる抗腫瘍の増感剤/薬剤耐性克服剤の製造への使用であって、
前記アルファウイルスはM1ウイルス及びゲタウイルスから選択され、前記腫瘍がヒトの腫瘍であり、前記ZAP阻害剤は、ZAP阻害抗体又はZAP阻害RNAiであることを特徴とする使用。 - 前記腫瘍は固形腫瘍であることを特徴とする請求項21に記載の使用。
- 前記腫瘍は肝臓癌、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、前立腺癌、神経膠腫、黒色腫、膵臓癌、鼻咽頭癌、肺癌又は胃癌のうちの1種又は複数種であることを特徴とする請求項21又は22に記載の使用。
- 前記アルファウイルスは、寄託番号:CCTCC V201423のM1ウイルスとの相同性が少なくとも97.8%の遺伝子配列を有することを特徴とする請求項21乃至23のいずれかに記載の使用。
- 前記アルファウイルスは、寄託番号:CCTCC V201423のM1ウイルスとの相同性が100%の遺伝子配列を有することを特徴とする請求項21乃至24のいずれかに記載の使用。
- 前記アルファウイルスは、腫瘍組織に選択的に集中する特性を有することを特徴とする請求項21乃至25のいずれかに記載の使用。
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