KR20180119706A

KR20180119706A - 항종양 약물 제조에서의 알파 바이러스의 응용

Info

Publication number: KR20180119706A
Application number: KR1020187030942A
Authority: KR
Inventors: 광메이 얀; 샤오 샤오; 준 후; 카이 리; 지안카이 량; 유안 린; 하이펑 장; 수이젠 린
Original assignee: 광저우 바이로테크 파마슈티컬 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2014-08-26
Filing date: 2015-08-24
Publication date: 2018-11-02
Also published as: AU2015309403A1; CN107349226A; RU2016131756A; EP3187588A1; KR20160105523A; CN104814984A; CN107349226B; JP2019048863A; MY188734A; CN104814984B; IL247082B1; TWI609690B; CA2939535C; US11235011B2; US10517909B2; CN107456463B; CN107456463A; EP3187588B1; WO2016029833A1; US20170304380A1

Abstract

본 발명은 항종양 약물 제조에서 알파 바이러스의 응용이며, 상기 알파 바이러스는 M1 바이러스 또는 게타 바이러스이다. 또한, 상기 알파 바이러스 치료에 대해 민감한 특정 종양 유형을 설정하여, 항종양 약물 투여 방안에 대해 보다 안전하고 유효한 해결 방안을 제공하였다.

Description

항종양 약물 제조에서의 알파 바이러스의 응용{USE OF ALPHAVIRUS IN PREPARATION OF ANTITUMOR DRUGS}

본 발명은 생물 의약 분야에 속하며, 항(抗)종양 약물 제조 방면에서 알파 바이러스의 응용과 관련된다.

종양은 정상 세포 내 유전자와 후성 유전학의 축적된 변화에 기인하며, 이러한 변화는 정상 세포가 악성 종양으로 변하도록 촉진한다. 이 복잡한 병리학적 변화 과정이 다른 종양에서 발생, 유지 및 전이의 메커니즘의 다양성을 결정한다. 현재, 수술 절제, 화학 요법 및 방사선 요법이 종양 임상 치료의 상용 방법이지만, 수술로 종양을 절제하는 것은 재발하기 쉽고, 방사선 요법 및 화학 요법의 독성 및 부작용이 크다.

인간 암의 15~20%는 바이러스 감염과 관련이 있는데, 예를 들면 B형 간암 바이러스(HBV), C형 간암 바이러스(HCV)는 간암과 관련이 있고, 인간 유두종 바이러스(HPV)는 자궁경부암과 관련있다.

알파 바이러스속 바이러스는 토가바이러스과(togaviridae)에 속하며, 외피(envelope) 구조를 가진 싱글 스트랜드 RNA 바이러스이며, 주로 절지 동물을 매체로 전파된다. 29종 알파 바이러스 중 13종이 인간 및 동물의 질병을 일으킬 수 있다(David M. Knipe, Peter M. Howley, Chapter 23, Alphaviruses, Fields Virology 6^th edition: 651-685, 2013).

알파 바이러스의 베네수엘라 말 뇌염 바이러스는 벡터로서 수지상 세포를 형질 도입하여 종양을 치료할 수 있다(Moran TP, Burgents JE, Long B, et al: Alphaviral vector-transduced dendritic cells are successful therapeutic vaccines against neu-overexpressing tumors in wild-type mice. Vaccine 25: 6604-6612, 2007). 그러나, 이러한 바이러스는 인간에게 발열, 경련, 유산 및 심지어 사망을 초래한 바 있어, 선택성과 안전성 문제가 항종양 치료에 있어서 바이러스의 응용에 심각한 영향을 미친다.

본 발명은 안전하고 유효한 바이러스 항종양 약물을 제공함을 목적으로 한다.

본 발명의 추가적인 목적은 특정 종양 유형에 대해 안전하고 유효한 바이러스 항종양 약물을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가적인 목적은 특정 개체/종양에 대해 안전하고 유효한 바이러스 항종양 약물을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가적인 목적은 유효한 항종양 투여 시스템 및 투여 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가적인 목적은 더 유효한 항종양 약물 및 종양 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 아래 기술 방안을 통해 상기 목적을 달성한다.

본 발명은 항종양 약물 제조에서 알파 바이러스의 응용을 제공하며, 상기 알파 바이러스는 M1 바이러스 또는 게타(getah) 바이러스이다.

M1 바이러스(Alphavirus M1)는 알파 바이러스속(Alphavirus)에 속하며, 1964년에 중국 해남도 홍모기속(Culex)의 모기로부터 분리되었다(Li XD, et al: Isolation of Getah virus from mosquitos collected on Hainan Island, China, and results of a serosurvey. Southeast Asian J Trop Med Public Health 23: 730-734, 1992.). 2008년에 M1 바이러스의 전체 유전자 서열이 결정되었다(Zhai YG, et al: Complete sequence characterization of isolates of Getah virus (genus Alphavirus, family Togaviridae) from China. J Gen Virol 89: 1446-1456, 2008.). 그 획득 방법은 선택적이며, 상기 문헌 방법을 통해 획득하거나, 또는 아래 기탁 정보를 통해 획득하는 것에 한정하는 것은 아니다(기탁 번호: CCTCC V201423; 기탁 시간: 2014년 7월 17일; 분류명칭: Alphavirus M1; 기탁 기관: 중국전형배양물보관센터; 기탁 주소: 호북성 무한시 무창 락가산 무한대학).

본 발명의 연구자는 이전 M1 바이러스의 연구 결과에서, M1 바이러스는 랫(rat) 악성 신경교종 세포 C6, 인간 악성 신경교종 세포 U251 및 U-87과 같은 일부 종양 세포에 대해 살상 효과를 구비하지만; 인간 악성 신경교종 세포 T98G 와 같은 일부 종양 세포에 대해서는 살상 효과를 구비하지 못한다는 것을 밝혔다. 이들 연구는 M1 바이러스가 유효한 항종양 효과를 구비한다는 것을 확정할 수 없다.

본 발명은 추가적으로 이 바이러스가 적용되는 종양 유형을 제공하여, M1 바이러스가 항종양 약물로 사용될 때의 치료 유효성을 제고한다.

추가적으로 바람직하게, M1 바이러스를 항종양 약물로 사용하는 본 발명의 종양 유형은 간암(liver cancer), 결직장암(colorectal cancer), 방광암(bladder cancer), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 전립선암(prostate cancer), 신경교종(glioma), 흑색종(melanoma), 췌장암(pancreatic cancer), 인두암(nasopharyngeal carcinoma), 폐암(lung cancer) 및 위암(gastric cancer) 중의 1종 또는 다종(多種)을 포함한다.

발명자는 M1 바이러스가 각종 종양 세포에 대해 다른 정도의 세포 사망을 야기한다는 것을 발견하였다. M1 바이러스(MOI=10)를 종양 세포에 48시간 처리 시, 췌장암, 인두암, 전립선암 및 흑색종의 세포 사망률은 50%를 초과하며; 결직장암(LoVo, HCT-8, SW629 및 SW480), 간암(Hep3B, Huh-7 및 Hub-6), 방광암 및 유방암의 세포 사망률은 40%를 초과하며; 신경교종, 자궁경부암, 폐암의 세포 사망률은 30%를 초과하며; 위암의 세포 사망률은 20%를 초과한다. 상기 결과는 M1 바이러스가 항종양 약물로서 가장 현저한 효과를 가지는 암 유형은 췌장암, 인두암, 전립선암 및 흑색종이며; 그 다음은 결직장암, 간암, 방광암 및 유방암이고; 그 다음은 신경교종, 자궁경부암, 폐암이며; 그 다음은 위암인 것을 나타낸다.

M1 바이러스가 게타 바이러스와 유사한 바이러스에 속하는 것임을 고려하고, 게타 바이러스와 상동성이 97.8%에 달하기 때문에, 본 분야의 기술자는, M1 바이러스의 항종양 효과에 기초하여, 게타 바이러스도 유사하게 M1 바이러스와 유사한 작용 및 효과가 있다는 것을 인정할 수 있다.

추가적으로, 본 발명은 특정 개체/종양에 대해 더 정확하고 유효하게 치료 방안과 약물 치료의 방법, 그리고 특정 개체/종양에 대해 관련된 약물을 제공한다.

발명자는, 상기 바이러스가 ZAP 저발현 종양 또는 ZAP 음성 종양의 치료에 적합하며, 바람직하게 ZAP 저발현의 고형 종양(solid tumor) 또는 ZAP 음성 고형 종양의 치료에 적합하다는 것을 최초로 발견하였다.

M1 바이러스의 종양 치료의 유효성은 종양의 ZAP 발현 조절과 밀접하게 관련된다. M1 바이러스의 복제는 ZAP에 의해 억제되고, 또한 ZAP는 다종의 종양에서 저발현 또는 음성이다. M1 바이러스는 ZAP 저발현 또는 ZAP 음성의 종양/개체를 선택적으로 치료할 수 있다.

ZAP는 징크 핑거(zinc finger) CCCH형 항바이러스 단백질 1의 약칭이며, 그 영문명칭은 Zin finger CCCH-type antiviral protein 1이며, 이는 유전자 zc3hav1 로 코딩된다. 세포 내 ZAP는 RNA 분해 및 번역 억제를 유도하는 메카니즘을 통해 일부 바이러스, 예를 들면 에볼라(Ebola) 바이러스 또는 마버그(Marburg) 바이러스의 복제를 억제한다고 알려졌다. 그러나 ZAP는 기타 바이러스, 예를 들면 수포진성 구내염(vesicular stomatitis) 바이러스, 폴리오 바이러스 및 황열병 바이러스의 복제에 대해서는 억제 효과가 없다.

발명자는 M1 바이러스가 ZAP 저발현/ ZAP 음성의 세포주에서 세포 사망을 현저하게 야기할 수 있으며, M1 바이러스는 담암(tumor-bearing) 동물 체내에서 ZAP 저발현/ ZAP 음성의 종양 조직에 집중되고, 또한 종양 생장을 억제하며, 동시에 M1 바이러스가 ZAP 저발현/ ZAP 음성의 인간 체외(ex vivo) 활동성(living) 종양 조직의 생존을 억제한다는 것을 발견하였다.

발명자는 복수의 다른 종류의 종양에서, ZAP의 발현량이 종양 조직에서 암 주위(paracancerous) 비종양 조직보다 낮다는 것을 최초로 발견하였다. 다종의 임상 병리 종양 표본의 면역조직화학 분석은 간암 조직의 69%, 결직장암 조직의 52% 및 방광암 조직의 61%에서 ZAP 발현 수준이 서로 대응하는 암 주위 비종양 조직보다 현저하게 낮음을 나타냈다. M1 바이러스는 ZAP 저발현/ ZAP 음성의 종양을 선택적으로 치료하는데 사용할 수 있다.

발명자의 실험 결과는, M1 바이러스의 복제가 ZAP에 의해 억제되며, ZAP 발현 수준이 M1 바이러스가 종양 세포의 사망을 선택적으로 야기하고 종양 생장을 억제하는 결정 요소라는 것을 최초로 증명하였다. 발명자의 연구는 M1 바이러스 항종양 효과가 ZAP의 발현 수준과 직접 관련된다는 것을 발견하였다. 발명자는 ZAP를 녹다운(knockdown)한 후의 종양 세포에 M1 바이러스를 감염하면, 종양 세포의 생존율은 ZAP를 녹다운하지 아니한 세포와 비교하여 현저하게 떨어진다는 것을 발견하였다. 따라서, 하나의 선택 가능한 바람직한 치료 방안으로, 암환자에게 M1 바이러스 치료를 할 때, 동시에 또는 사전에 ZAP 억제제를 투여하여, M1 바이러스에 대한 종양의 민감성을 제고할 수 있다.

따라서, 항종양 약물로서 M1 바이러스의 치료 유효율을 제고하기 위해, 치료 방안을 선택할 때, 환자 종양의 ZAP 발현 정황을 먼저 판단하고, 그런 다음 M1 바이러스를 이용한 치료 방안을 구체적으로 제공함으로써, 치료 방안의 유효성을 제고하고, 무효한 투여로 인한 시간 지연과 약물 남용을 피할 수 있다. 예를 들면, 투여 전 환자의 종양 ZAP 발현 정황을 먼저 측정하여, 만약 ZAP 저발현/ ZAP 음성의 종양인 경우, M1 바이러스 치료를 직접 제공할 수 있으며; 만약 ZAP 정상 발현/ ZAP 고발현인 경우, M1 바이러스 투여 전 또는 동시에 ZAP 억제제(예를 들면, ZAP 발현 또는 기능 억제제, ZAP 간섭 단편, 또는 ZAP 항체 등)를 제공하여, M1 바이러스에 대한 종양의 민감성을 제고하고, 치료의 유효성을 제고할 수 있다. 종양 내의 ZAP 발현량의 고저(高低)는 M1 치료의 유효성에 직접 영향을 미친다. ZAP 발현량이 낮은 종양일수록 M1의 치료 효과에 더 유리하다. 어떤 개체/ 종양이 M1을 이용하여 치료를 진행하는 것이 유리한지를 판단하기 위해, 종양 ZAP 발현 수준을 먼저 측정할 수 있다. ZAP 발현 수준의 고저는 아래 방식이 바람직하나 이에 한정하지는 아니한다:

ZAP 저발현 또는 고발현은 2 그룹(개) 표본 간의 ZAP mRNA 또는 단백질량을 비교한 후 얻은 결론을 나타내며, 만약 1 그룹(개) 표본이 다른 1 그룹(개) ZAP mRNA 또는 단백질량에 비해 적거나 또는 많으면 그 표본은 ZAP 저발현 또는 고발현이라고 칭하며; ZAP 음성은 표본이 ZAP mRNA 또는 단백질을 완전히 발현하지 아니한 것을 나타낸다. ZAP mRNA 및 단백질 비교에 사용하는 표본은 종양 세포 및 정상세포, 종양 조직 및 암 주위 비종양 조직이거나, 또는 M1 치료가 유효한 종양과 M1 치료가 무효한 종양일 수 있다.

선택 가능한 방법으로서, 종양의 ZAP 고, 저 또는 음성 발현은 모두 종양 조직과 상응하는 암 주위 비종양 조직의 비교를 나타내며, ZAP mRNA 및 단백질의 양이 많고, 적고 또는 없음을 표현한다. 만약 전자의 ZAP mRNA 또는 단백질의 정규화(normalized) 발현량이 후자에 비해 적으면(즉, 암 주위 비종양 조직과 비교한 종양 조직의 ZAP 정규화 발현량의 비교값이 <1 이면), ZAP 저발현에 속하므로, M1을 이용하여 치료를 진행하는 것에 적합하다. 더욱 유효한 치료 대상은 암 주위 비종양 조직을 비교한 종양 조직의 ZAP 정규화 발현량의 비교값이 <0.8인 종양이며, 더욱 바람직하게는 <0.6, 더욱 바람직하게는 <0.4, 더욱 바람직하게는 <0.3, 더욱 바람직하게는 <0.2, 더욱 바람직하게는 0.1, 가장 바람직하게는 종양 조직의 ZAP가 음성인 것이다. 이들 종양 조직과 암 주위 비종양 조직은 병리 천자 수술 또는 외과 절제 수술에서 얻는 조직을 포함하지만, 이에 한정되지는 아니한다. 임상 조사를 통해, 일부 종양 조직 중의 ZAP 발현량은 심지어 암 주위 비종양 조직보다 높아, 이들 종양 또는 종양 환자는 직접 M1을 이용하여 치료를 진행하기에 부적합한 것을 발견하였다.

ZAP mRNA 또는 단백질의 검출 방법은 QRT-PCR, Northern Blot, 면역조직화학(immunohistochemistry), ELISA 등을 포함하지만 이에 한정되지는 아니한다. 다른 표본 간의 ZAP mRNA량 또는 단백질량의 차이를 정확히 판정하기 위해, 먼저 각 표본의 ZAP mRNA 또는 단백질의 정규화 발현량을 계산한다. 정규화 발현량은 각 표본의 ZAP mRNA 또는 단백질 발현값을 표본의 내부 참조(internal reference)의 mRNA 또는 단백질 발현값으로 나눈 것을 나타내며, 정규화 처리를 진행하여 그 표본의 ZAP 정규화 발현량을 획득한다. 다른 검측 방법 중에서 내부 참조는 다를 수 있으며, 그들의 공동 특징은 다른 세포 또는 조직 표본에서 내부 참조 발현량이 일치하는 것이므로, 이러한 정규화 처리를 거친 다른 표본의 ZAP 발현량은 비교성을 구비하여, 표본 간 ZAP mRNA 또는 단백질의 양의 차이를 판단하는데 사용한다.

본 발명의 예시적인 실시예(도 4)에서, M1 바이러스는 인간 체외 배양된 활동성 간암 조직과 결직장암 조직에 대해 다른 생장 억제 효과(표 2 및 표 3)를 구비하는데, 종양 생장 억제율이 10%를 초과하는 표본 합계는 32개에 달하며, 종양 생장 억제율이 10%보다 작거나 같은 것은 19개이다. 추가적으로 QRT-PCR 방법을 통해 이들 2개 그룹의 각 종양 조직의 ZAP 및 내부 참조 mRNA의 발현 수준(각각 2^{-Ct 값})을 분석하고, 각 표본의 2^-Ct-ZAP를 2^{-Ct-내부 참조}로 나누어 각각의 ZAP 정규화 발현량을 획득한다. 상기 2개 그룹 표본에 대한 ZAP 정규화 발현량의 통계 분석은, 억제율이 10%를 초과하는 표본 그룹의 ZAP 정규화 발현량이 0.117±0.890인 것을 발견하였다. 이는 억제율이 10% 보다 작거나 같은 그룹(0.791±0.108)보다 낮으며, 양자의 수치 비교값은 0.148이다.

다른 하나의 선택 가능한 방법으로, 종양의 ZAP 고, 저 또는 음성 발현은 종양 세포(예를 들면, 종양 환자의 배양 종양 세포에서 유래)와 정상 세포를 비교하여, ZAP mRNA 및 단백질의 양이 많고, 적고 또는 없는 발현을 나타낸다. 만약 전자의 ZAP의 mRNA 또는 단백질 정규화 발현량이 후자에 비해 적으면(즉, 정상 세포와 비교한 종양 세포의 ZAP 정규화 발현량 비교값이 <1 이면), ZAP 저발현에 속하여, M1을 이용하여 치료를 진행하는데 적합하다. 더욱 유효한 치료 대상은 정상 조직과 비교한 종양 조직의 ZAP 정규화 발현량 비교값이 <0.8인 종양이며, 더욱 바람직하게는 <0.6, 더욱 바람직하게는 <0.4, 더욱 바람직하게는 <0.3, 더욱 바람직하게는 <0.2, 더욱 바람직하게는 0.1, 가장 바람직하게는 종양 조직의 ZAP가 음성인 것이다.

본 발명의 예시적인 실시예(도 3c)에서, Western Blot 방법을 운용하여 HepG2 간암 세포 세포주와 L-02 정상 간 세포주의 ZAP 단백질 발현 수준 차이를 측정하고, 동시에 다른 표본간 발현량이 일치하는 표준 참조 β-actin을 측정하며, Western Blot 검측 밴드의 그레이 스케일(gray scale)은 검측된 분자의 양을 나타낸다. ZAP 정규화 단백질 발현량 = (ZAP 밴드 그레이 스케일 평균값)/ (β-actin 밴드 그레이 스케일 평균값). HepG2의 ZAP 정규화 단백질 발현량과 L-02의 비교값은 0.8이며, ZAP는 HepG2에서 저발현된다. M1 바이러스 감염 후, HepG2 세포의 생존율은 단지 70.4%±3.5%이며, 같은 처리를 한 L-02의 생존율은 100.3±10.0%로서, 양자의 생존율 차이는 통계학적 의의를 구비한다.

다른 하나의 예시적인 실시예(도 3a 및 도 3b)에서, 종양 세포주 T24, SCaBER, LoVo 및 Hep3B의 ZAP의 경우, mRNA(도 3a)와 단백질(도3b)은 모두 QRT-PCR 및 Western blot을 통해 검측한 후, 각각 각 내부 참조와 비교하여 정규화 발현량이 검출되지 아니하거나 또는 0(<0.1)에 근접하였다. 즉, ZAP 발현이 음성 또는 음성(<0.1)에 근접하였다; M1 감염 후 이들 종양 세포는 세포 사망이 야기되어, 세포 생존율이 T24 21.1%, SCaBER 11.5%, LoVo 6.9% 및 Hep3B 3.8%로 현저하게 하강하였다(표 1). 반면 도 3a 및 도 3b 중의 정상 세포 L-20 및 HEB의 ZAP의 경우, ZAP mRNA(도 3a) 또는 단백질의 정규화 발현량과 상기 종양 세포의 비교값은 1보다 크고, 이는 ZAP의 고발현에 속하며, M1 감염 후 이들 정상 세포 생존율은 명백히 하강하는 것을 야기하지 않았고, L-02는 100.3%, HEB는 98.8%이었다(표 1).

이에, 본 발명은 동시에 항종양 투여 시스템을 제공하며, 그 특징은 ZAP 발현 수준 검측 시약 및 알파 바이러스를 포함하는데 있으며; 상기 알파 바이러스는 M1 바이러스 또는 게타 바이러스이다. 먼저 환자 종양의 ZAP 발현 수준을 검측하고, 구체적으로 적합한 투여 방안을 채용한다.

동시에, 본 발명은 항종양 약물을 제공하며, 이는 알파 바이러스 및 ZAP 억제제를 포함하며; 상기 알파 바이러스는 M1 바이러스 또는 게타 바이러스이다. 상기의 ZAP 억제제는 ZAP 발현 또는 기능 억제제, ZAP 간섭 단편 또는 ZAP 항체 등이다.

M1 바이러스의 정상 세포에 대한 동시 살상 작용을 피하기 위해, 바람직하게, 투여하는 ZAP 억제제는 구체적으로 종양 세포에 투여하거나 종양 세포를 표적으로 하는 표적성 ZAP 억제제이다.

선택 가능한 실시 방안으로, 본 발명이 제공하는 항종양 약물은 주사제, 타블렛, 캡슐, 부착제 등일 수 있다. 바람직한 실시 방안으로, 본 발명의 종양 약물은 주사제이며; 바람직하게, 정맥 주사를 채용할 수 있다.

선택 가능한 투여 방식으로, 본 발명 M1 바이러스는 정맥 주사 또는 종양 내 주사 방식을 통해 투여할 수 있다. 종양 내 주사 방식은 매일 2×10⁵PFU/kg - 2×10⁹PFU/kg을 투여하며; 정맥 주사 방식은 매일 2×10⁶PFU/kg - 2×10¹⁰PFU/kg 을 투여한다. 용매 대조군(solvent control group)과 비교하여, M1 바이러스 그룹은 종양의 생장을 현저하게 억제하였다.

종래기술과 대비하여, 본 발명은 다음과 같은 유익한 효과를 구비한다:

본 발명이 제공하는 향종양 약물은, 다종의 종양을 치료하는데 사용할 수 있는데, 간암, 결직장암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 전립선암, 신경교종, 흑색종, 췌장암, 인두암, 페암, 위암을 포함한다. 세포학 실험은 M1 바이러스가 다종의 종양 세포의 사망을 야기함을 증명하며; 동물 실험은 M1 바이러스가 체내에서 간암, 결직장암의 생장을 현저하게 억제함을 증명하며; 인간 체외 활동성 종양 조직 배양 실험은 M1 바이러스가 간암 및 결직장암 조직의 생존을 현저하게 억제함을 증명한다.

본 발명이 제공하는 항종양 약물은, 바람직하게 ZAP 저발현/ ZAP 음성의 종양을 치료하며, 간암, 결직장암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 전립선암, 신경교종, 흑색종, 췌장암, 인두암, 페암, 위암을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다.

발명이 제공하는 항종양 약물은, 선택적 항종양 작용을 구비하며, 안전성이 양호하다. M1 바이러스는 종양 세포의 사망을 선택적으로 야기하며, 반면 정상 세포의 생존에는 영향이 없어, M1 바이러스가 종양 세포에 대해 선택성을 구비한다는 것을 나타내며; 담암 누드 마우스(tumor-bearing nude mouse) 체내에서, 꼬리 정맥 주사한 M1 바이러스는 종양 조직에 고도로 집중되는 반면, 정상 조직 내의 바이러스는 비교적 적으며, 양자의 바이러스 양 차이는 10² - 10⁶배로, M1 바이러스의 종양 선택성을 추가적으로 설명한다. 동시에 M1 바이러스의 투여는 누드 마우스의 체중과 정신에 영향을 미치지 아니하여, M1 바이러스의 안전성이 양호함을 나타낸다.

본 발명은 최초로 특정의 개체/ 종양에 대해 안전하고 유효한 바이러스 항종양 약물을 제공한다. 본 발명의 약물은 ZAP 저발현/ ZAP 음성의 종양을 선택적으로 치료함으로써, 용량 유효율을 제고하여, 무효한 투여 및 약물 남용을 방지한다.

본 발명은 더욱 유효한 투여 방법 및 투여 시스템을 제공한다. 먼저 환자 종양의 ZAP 발현 수준을 검측한 후, 특이적으로 약물 치료를 하거나, 또는 기타 수단을 보충하여 치료하여, M1 바이러스의 치료 전문성 및 유효성을 제고할 수 있다.

본 발명은 더욱 유효한 항종양 약물 및 종양 치료 방법을 제공한다; 투여 전 또는 투여와 동시에, ZAP 억제제를 보조로 사용하여, 약물에 대한 종양의 민감성을 제고할 수 있다.

도 1은 M1 바이러스가 종양 세포변성 효과를 현저하게 야기하는 것을 보여준다;
a)는 M1 바이러스의 감염이 종양 세포의 형태학적 변화를 야기하는 것을 보여준다;
b)는 M1 바이러스의 감염이 정상 세포주의 형태에 영향이 없음을 나타내고, Control은 OptiPRO^TM SFM 배지 대조군을 나타내며, M1은 M1 바이러스 감염의 실험 그룹을 나타낸다.
도 2는 M1 바이러스가 담암 마우스의 종양 생장을 유효하게 억제하는 것을 보여준다;
a)는 M1 바이러스의 종양 내 주사 후 Hep3B 담암 마우스의 종양 체적과 동물 체중의 영향을 보여주며, M1은 M1 바이러스 처리 그룹을 나타내고, 용제는 OptiPRO^TMSFM 배지 용제의 대조군을 나타낸다, (n=9);
b)는 M1 바이러스의 종양 내 주사 후 LoVo 담암 마우스의 종양 체적과 동물 체중의 영향을 보여준다, (n=11);
c)는 M1 바이러스의 정맥 주사 후 Hep3B 담암 마우스의 종양 체적과 동물 체중의 영향을 보여준다, (n=9);
d)는 QRT-PCR 검측을 통해 M1 바이러스를 정맥 주사한 후 Hep3B 담암 마우스의 조직 분포를 보여준다, (n=6);
종양 체적과 체중 데이터는 평균값±표준 편차로 나타내며, ANOVA 방법으로 통계한다; 화살표는 M1 바이러스 처리 그룹을 나타내고, 원은 OptiPRO^TM SFM 배지 대조군을 나타내고, ns는 통계학적 차이가 없음을 나타내며; i.t는 종양 내 주사를 나타내며; i.v는 정맥 주사를 나타내며; *는 M1 바이러스의 mRNA 발현을 검측하지 못한 것을 나타낸다.
도 3은 M1 바이러스가 ZAP 저발현/ ZAP 음성 종양 세포의 사망을 선택적으로 야기하는 것을 보여준다;
a)는 다른 세포에서 ZAP mRNA 발현량의 차등 발현을 보여주며; ND는 ZAP의 mRNA 발현을 검측하지 못한 것을 나타낸다;
b)는 다른 세포에서 ZAP 단백질 발현량의 차등 발현을 보여주며; β-actin은 내부 참조이다;
c)는 세포의 ZAP 단백질 수준과 M1 바이러스 감염이 야기하는 세포 생존율의 변화를 보여준다. β-actin는 내부 참조이며, students't 테스트 통계 분석이 수행된다, ** P <0.01;
d)는 M1 바이러스가 ZAP 수준 녹다운 후의 정상 세포 L-02, 종양 세포 PLC 및 HCT116의 사망을 현저하게 야기한 것을 보여준다. 중공 원(hollow circle)/ 중공 삼각형/ 중공 역삼각형은 ZAP 녹다운 간섭을 나타내며, 실심 원(solid circle)/ 실심 삼각형/ 실심 역삼각형은 메시 코드 간섭(messy code interference)의 음성 대조군을 나타낸다; students't 테스트를 채용하여 통계 분석을 하고, */#/＆는 P <0.05를 나타내고, ＆＆는 P <0.01을 나타내고, ns는 통계학적 차이가 없음을 나타낸다;
e)는 ZAP 녹다운 후의 정상 세포 L-02, 종양 세포 PLC 및 HCT116에서 M1 바이러스의 상대적인 역가(relative titer)가 증가함을 보여준다; students't 테스트를 채용하여 통계 분석을 하고, * 는 P <0.05를 나타낸다;
f)는 ZAP 녹다운 후의 정상 세포 L-02, 종양 세포 PLC 및 HCT116에서 M1 바이러스의 RNA 발현이 증가함을 보여준다; students't 테스트를 채용하여 통계 분석을 하고, * 는 P <0.05를 나타내고, ** 는 P <0.01을 나타낸다;
g)는 ZAP 녹다운의 정상 세포 L-02, 종양 세포 PLC 및 HCT116에서 M1 바이러스 단백질 NS3, E1 발현이 증가함을 보여준다; GAPDH는 내부 참조로 사용된다;
h)는 과발현 ZAP가 M1 바이러스가 야기하는 종양 세포 사망을 부분적으로 저지하는 것을 보여준다; students't 테스트를 채용하여 통계 분석을 하고, #는 P <0.05를 나타내고, ns는 통계학적 차이가 없음을 나타낸다;
i)는 과발현 ZAP의 종양 세포 중 M1 바이러스의 상대적인 역가가 감소함을 보여준다; students't 테스트를 채용하여 통계 분석을 하고, ** 는 P <0.01을 나타낸다;
j)는 과발현 ZAP의 종양 세포 중 M1 바이러스의 RNA가 감소함을 보여준다; students't 테스트를 채용하여 통계 분석을 하고, ** 는 P <0.01을 나타낸다;
k)는 과발현 ZAP의 종양 세포 중, M1 바이러스의 단백질 NS3 및 E1 발현이 증가함을 보여준다. β-actin을 내부 참조로 사용한다.
도 4는 인간 체외 종양 조직에 대한 M1 바이러스의 억제율이 ZAP mRNA 발현 수준과 부정적으로 관련됨을 보여준다.
QRT-PCR로 ZAP mRNA 발현을 검측하고, M1 바이러스 무효과 그룹(억제율 ≤10%) 과 M1 바이러스 유효 그룹(억제율 >10%)의 ZAP 상대적인 발현량의 차이를 비교한다. M1 바이러스 처리의 억제율이 10%보다 작거나 같은 종양 조직의 ZAP 정규화 발현량 중앙값(median)은 0.414이고, 10%보다 큰 종양 조직의 ZAP 정규화 발현량 중앙값은 0.075이다. Rank-sum 테스트를 채용하여 통계 분석을 한다, P <0.05.
도 5는 다종의 종양 임상 병리 종양 조직에서 ZAP 저발현을 보여준다;
a)는 면역조직화학 염색(staining)을 통해 임상 병리 종양 조직 중 ZAP의 발현 정황을 보여준다, N: 암 주위 비종양 그룹, T: 종양 그룹;
b)는 다종의 임상 병리 종양 조직에서, 종양 그룹의 ZAP 발현량이 암 주위 비종양 그룹보다 현저하게 낮은 것을 보여준다, N: 암 주위 비종양 그룹, T: 종양 그룹; N과 T 는 Rank-sum 테스트를 통해 통계 분석을 진행, *** P <0.001
c)는 다종의 임상 병리 종양 조직에서, 종양 조직의 ZAP 발현이 암 주위 비종양 조직보다 낮은 병례(病例) 비율을 나타낸다.

아래 실시 방식은 본 발명에 대한 진일보한 설명이다. 그러나 본 발명의 실시 방식은 아래의 실시예의 소개에 국한되지 아니하며, 본 발명의 원리 또는 이념에 따라 행하는 균등한 변화 또는 응용은 모두 본 발명의 보호 범주로 보아야 한다.

특별한 언급이 없는 경우, 본 발명이 채용하는 재료 및 실시 방법은 통상의 재료 및 방법이다.

실시예 1: M1 바이러스는 종양 세포의 사망을 선택적으로 야기함

1) M1 바이러스는 종양 세포의 형태학적 변화를 현저하게 야기함

재료:

간세포암 Hep3B, 인간 방광 이행 세포암 T24, 인간 결직장암 LoVo, 인간 불멸화 정상 간 세포주 L-02, M1 바이러스, 고포도당(high glucose) DMEM 배지, F-12 배지, 도립 위상차 현미경.

방법:

a) 세포의 배양: 인간 간세포암 세포주 Hep3B, 인간 방광 이행 상피 세포암 세포주 T24, 인간 불멸화 정상 간 세포주 L-02는 10% FBS, 100 U/ml 페니실린 및 0.1 mg/ml 스트렙토마이신이 함유된 DMEM 완전 배지 중에서 생장시켰으며; 인간 결직장암 세포주 LoVo는 10% FBS, 100 U/ml 페니실린 및 0.1 mg/ml 스트렙토마이신이 함유된 F-12 완전 배지 중에서 생장시켰다. 모든 세포주는 5% CO₂, 37℃ 항온 밀폐식 인큐베이터(상대 습도 95%) 내에 놓아 계대 배양(subculture)하였으며, 도립 현미경으로 생장 정황을 관찰하였다. 약 2~3일에 한번 계대하고, 대수 생장기(exponential growth phase)의 세포를 추출하여 정식 실험에 사용하였다.

b) 세포 현미경 하에서 관찰: 대수 생장기의 세포를 선택하여, DMEM 또는 F-12 완전 배지(10% 소 태아 혈청 및 1% 이중 항체를 함유)에 넣어 세포 현탁액을 만들고, 세포는 2.5×10⁴/웰의 밀도로 24웰 배양판 내에 접종하였다. M1 바이러스(MOI=1)를 사용하여 48시간을 감염한 후, 도립 위상차 현미경 하에서 세포 형태학적 변화를 관찰하였다.

결과:

위상차 현미경으로 세포 형태를 관찰한 결과, Hep3B 세포, T24 세포 및 LoVo 세포는 모두 단층 부착 생장하고, 또한 세포가 긴밀히 배열되며, 표현형(phenotype)이 균일하였다. 그러나 M1 바이러스 (MOI=1) 처리 48시간 후, 세포 형태는 명백한 변화가 발생하였는데, 대조군 세포와 비교하여, 바이러스 감염 그룹의 세포 수량이 명백히 감소하고, 세포체(cell body)는 구상(球狀)으로 수축되고, 굴절율은 명백히 증가되어, 도 1a와 같은 사망 병리학적 변화를 나타냈다. 도 1b는 정상 세포에 대한 M1 바이러스 감염의 영향을 나타내고 있는데, 동일한 역가를 채용한 M1 바이러스에 감염된 L-02 세포는, 세포 수량 및 형태에서 명백한 변화가 발견되지 아니하였다. 이 결과는 M1 바이러스가 종양 세포에 대해 세포 사망을 선택적으로 야기하며, 정상 세포의 생존에 대해서는 영향이 없다는 것을 나타냈다.

2) M1 바이러스는 종양 세포주의 생존을 선택적으로 떨어뜨림

재료:

34개의 종양 세포주 (표 1 참조), 3개의 인간 불멸화 정상 세포주(표 1 참조), M1 바이러스, 고포도당 DMEM 배지, F-12 배지, MTT(tetramethyl thiazolyl tetrazolium).

방법:

a) 세포 접종 및 투여 처리: 대수 생장기 세포를 선택하여, DMEM(또는 F-12) 완전 배지(10% 소 태아 혈청 및 1% 이중 항체를 함유)에 넣어 세포 현탁액을 만들고, 4×10³/웰의 밀도로 96웰 배양판 내에 접종하였다. 12시간 후 세포가 완전히 벽에 부착된 것을 확인하였다. 실험은 실험 그룹과 대조군으로 나누었으며, 실험 그룹은 M1 바이러스 (MOI=10) 감염 세포이고; 대조군은 고포도당 DMEM 용매 대조군이며, 양 그룹에는 5개의 복합 오리피스가 설치되었다.

b) MTT와 세포 내의 숙신산 탈수소 효소의 반응: 48h 배양 시, 각 웰에 MTT 15 μl (5 mg/ml) 넣고, 계속 4시간 배양하였다. 이때 활동 세포 내에 형성되는 과립형 남자색 포르마잔(formazan) 결정을 관찰할 수 있었다.

c) 포르마잔 입자의 용해: 조심스럽게 상층액(supernant)을 흡수하고, DMSO 100 μl/웰을 넣어 형성된 결정을 용해하고, 마이크로 오실레이터(Micro oscillator) 상에서 5분 동안 쉐이킹한 후, 효소 결합 검측기 상에서 파장 570nm을 사용하여 각 웰의 광학 밀도(OD 값)를 검측하였다. 각 그룹 실험은 3회 반복하였다. 세포 생존율=약물 처리 그룹 OD값/ 대조군 OD 값x 100%.

결과:

도 1에 도시된 바와 같이, M1 바이러스(MOI=10)로 종양 세포를 48시간 처리한 후, 췌장암, 인두암, 전립선암 및 흑색종 세포의 사망률이 50%를 초과하였으며; 결직장암(LoVo, HCT-8, SW620 및 SW480), 간암(Hep3B, Huh-7 및 Huh-6), 방광암 및 유방암 세포의 사망률은 40%를 초과하였으며; 신경교종, 자궁경부암, 폐암 세포의 사망률은 30%를 초과하였으며; 위암 세포의 사망률은 20%를 초과하였다. 반면, 3개의 정상 세포주(L-02, HEB 및 SV-HUC-1)와 PLC 및 HCT116 세포의 생존율은 통계학적으로 현저한 변화가 없었다. 이 결과는 M1 바이러스 감염이 대부분 종양 세포의 사망을 선택적으로 야기하는 것을 나타냈다.

표 1. M1 바이러스가 종양 세포의 생존율을 현저하게 떨어뜨림
세포주	소스	생존율 (%)	통계학적 의의
Hep3B	간암	3.8	-
Huh-7	간암	52.2±10.0	**
Huh-6	간암	59.0±8.9	**
Hep G2	간암	70.4±3.5	*
PLC	간암	80.5	-
HCT116	간암	81.3±4.3	ns
LoVo	결직장암	6.9	-
HCT-8	결직장암	35.4±5.2	**
SW620	결직장선암	43.7±6.7	**
SW480	결직장암	53.8±8.4	**
SCaBER	방광암	11.5±4.4	**
T24	방광암	21.1±3.8	**
UM-UC-3	방광암	39.8±19.6	**
5637	방광암	50.2±19.0	**
Capan-1	췌장암	40.4±10.1	**
PANC-1	췌장암	49.3±16.3	**
SW1990	췌장암	45.6±16.9	**
MIA PaCa-2	췌장암	49.1±13.2	**
U-87 MG	악성 신경교종	32.4	-
U-251	악성 신경교종	34.7±4.9	**
T98G	다형성 아교모세포종	38.2	-
U-138 MG	악성 신경교종	40.1	-
MGR2	신경교종	63.2	-
MDA-MB-468	유방암	43.7±10.1	**
MDA-MB-231	유방암	58.9±2.7	**
C-33 A	자궁경부암	14.8±1.8	**
HeLa	자궁경부암	66	-
22Rv1	전립선암	39.1	-
CNE-2	인두암	24.5	-
CNE-1	인두암	48.2	-
A-375	흑색종	47.3±19.2	*
A549	폐암	68.2	-
NCI-N87	위암	76.4±9.3	*
HGC-27	위암	79.2	-
L-02	정상 간 세포	100.3±10.0	ns
HEB	교질 세포	98.8	-
SV-HUC-1	수뇨관 상피 불멸화 세포	97.2	-

(주: ** p <0.01, * p <0.05, ns: 차이가 통계학적 의의를 구비하지 못함. 통계 방법: students't 테스트, - :통계 없음).

실시예 2: M1 바이러스는 종양 생장을 선택적으로 유효하게 억제함

1) 담암 마우스 체내에서 M1 바이러스는 종양 생장을 유효하게 억제함

재료:

M1 바이러스, 인간 간암 세포주 Hep3B, 인간 결직장암 세포주 LoVo, 58개 4주령 암컷 BALB/c 누드 마우스

방법:

a) 담암 마우스의 모델 제조: 5×10⁶Hep3B 또는 LoVo 세포를 4주령 암컷 BALB/c 누드 마우스 등측 피하에 주입하였다.

b) 종양 내 투여: Hep3B 종양 체적이 약 50 mm³에 도달하거나, 또는 LoVo 종양 체적이 약 70 mm³에 도달할 때, 종양 내 주사 투여를 시작하였고, 12일 내에 모두 6회(2×10⁶ PFU/회) M1 바이러스를 주사하였으며, OptiPRO^TM SFM 배지 주사가 용매 대조군이었다. 매 2일마다 종양의 길이 및 폭, 및 체중을 측정하였고, 종양의 체적은 길이 × 폭²/2의 공식에 의해 계산하였다.

c) 정맥 투여: Hep3B 세포 종양 체적이 약 50 mm³에 도달할 때, M1 바이러스(3×10⁷ PFU/회)를 정맥 주사하였고, 3일 후, 2차 정맥 주사하였다. OptiPRO^TM SFM 배지 주사가 용매 대조군이었다. 매 3일마다 체중 및 종양의 길이, 폭을 측정하였고, 종양의 체적은 길이 × 폭²/2의 공식에 의해 계산하였다.

결과:

BALB/c 누드 마우스 상에 피하 담암 Hep3B(도 2a 및 도 2c) 및 LoVo(도 2b) 누드 마우스 모델을 수립한 후에, 연속적으로 여러 차례 종양 내 주사(도 2a 및 2b) 또는 정맥 주사(도 2c)로 M1 바이러스를 투여하고, 누드 마우스 종양 체적 및 동물 체중 변화 상황을 관찰하였다. Hep3B 누드 마우스 모델에서, 도 2a와 같이 종양 내 주사 투여 방식을 채용하였다. 20일에 실험이 종료되었으며, 용매 대조군의 종양 체적 평균값은 0.368 ± 0.051 cm³이었고, M1 바이러스 그룹의 종양 체적 평균값은 0.172 ± 0.058 cm³이었다. 이 통계는 M1 바이러스가 Hep3B 담암 마우스의 종양 생장을 현저하게 억제함을 나타냈으며, 또한 M1 바이러스 그룹 누드 마우스 평균 체중(16.4±1.54 g)은 대조군 누드 마우스 평균 체중(17.0±1.16 g)과 비교하여 현저한 차이가 없고, 정신 상태도 양호하여, M1 바이러스의 안전성이 양호함을 나타냈다; LoVo 누드 마우스 모델에서, 도 2b와 같이 종양 내 투여 방식을 채용하였으며, 24일에 실험이 종료되었으며, 대조군의 종양 체적 평균값은 0.546±0.087 cm³이고, M1 바이러스 그룹 종양 체적 평균값은 0.389±0.049 cm³이었다. 이 통계는 M1 바이러스가 LoVo 담암 마우스의 종양 생장을 현저하게 억제함을 나타냈으며, 또한 M1 바이러스 그룹 누드 마우스 평균 체중(18.9±1.40 g)은 대조군 누드 마우스 평균 체중(19.4±1.86 g)과 비교하여 현저한 차이가 없고, 정신 상태도 양호하여, M1 바이러스의 안전성이 양호함을 나타냈다; Hep3B 누드 마우스 모델에서, 도 2c와 같이, 정맥 주사 투여 방식을 채용하였으며, 21일에 실험이 종료되었으며, 대조군의 종양 평균 체적은 0.247±0.067 cm³이었고, M1 바이러스 그룹의 종양 평균 체적은 0.134±0.057 cm³이었다. 이 통계는 M1 바이러스가 Hep3B 담암 마우스의 종양 생장을 현저하게 억제함을 나타냈으며, 또한 M1 바이러스 그룹 누드 마우스 평균 체중(17.2±2.50 g)은 대조군 누드 마우스 평균 체중(17.5±2.16 g)과 비교하여 현저한 차이가 없었고, 정신 상태도 양호하여, M1 바이러스의 안전성이 양호함을 나타냈다.

2) M1 바이러스가 종양 조직에 선택적으로 집중됨

재료:

24마리 4주령 암컷 BALB/c 누드 마우스, 간암 세포주 Hep3B, Trizol, 조직 균질기, 실시간 형광 정량 PCR 장치.

β-actin 프라이머(primer):

센스 스트랜드(Sense strand) (서열번호1: GATCATTGCTCCTCCTGAGC)

안티센스 스트랜드(Antisense strand) (서열번호2: ACTCCTGCTTGCTGATCCAC)

M1 바이러스 비구조 단백질 NS1 프라이머;

센스 스트랜드 (서열번호3: GTTCCAACAGGCGTCACCATC)

안티센스 스트랜드 (서열번호4: ACACATTCTTGTCTAGCACAGTCC)

방법:

4주령 누드 마우스 등측 피하에 5×10⁶Hep3B 세포를 주입하였다. 4일 후, 각 마우스의 꼬리 정맥에 M1 바이러스(3×10⁷PFU)를 주입하였다. 투여 후, 각각 1일, 2일, 3일, 4일에 누드 마우스를 죽여, 조직 샘플(종양, 심장, 간, 비장, 폐, 신장, 뇌, 근육)을 수집하고, 조직 RNA를 추출하였다. 그런 다음, QRT-PCR 방법을 사용하여 M1 바이러스의 량을 검측하여, M1 바이러스량을 나타내는 M1 바이러스 비구조 단백질 NS1을 검측하였다. 동시에 β-actin 내부 참조를 검측하고, 상대적 M1 바이러스 RNA 량은 2^{- (C} _t-NS1 ^-C _{t-내부 참조} ⁾의 공식에 따라 계산하였다. ^C _t-NS1 and^C _t-내부 _참조 는 Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System의 계기 판독값이다.

결론:

도 2d에 도시된 바와 같이, 누드 마우스 피하 Hep3B 종양 모델에서, 4개의 다른 시점에서, 종양 조직 내에서 M1 바이러스의 수량이 기타 기관 조직보다 10² - 10⁶배 이상을 초과하여, M1 바이러스가 종양 조직에 선택적으로 집중됨을 나타냈다.

실시예 3: M1 바이러스는 ZAP 저발현 / ZAP 음성 종양 세포의 사망을 선택적으로 야기함

M1 바이러스는 ZAP 저발현의 종양 세포의 사망을 선택적으로 야기하고, 정상 세포에 대해서는 영향이 없다. ZAP의 발현 수준은 M1 바이러스 선택성의 결정 요소이다. 정상 세포 및 ZAP 정상 발현/고발현의 종양 세포에서, RNA 간섭을 통해 ZAP 발현 수준을 녹다운한 후, M1 바이러스는 세포 사망을 현저하게 야기할 수 있었다. 동시에, 저발현 ZAP의 종양 세포에서, 과발현 ZAP는 M1 바이러스가 야기하는 종양 세포의 사망을 부분적으로 저지할 수 있었다.

1) M1 바이러스는 ZAP 발현 수준이 높은 정상 세포 및 종양 세포의 사망을 야기하지 아니함

재료:

M1 바이러스, 인간 간세포 L-02, 인간 교질 세포 HEB, 인간 방광암 세포 SCaBER 및 T24, 인간 간암 세포주 Hep3B 및 PLC, 인간 간암 세포주 Hep G2, 인간 결직장암 세포주 LoVo 및 HCT116;

Western bolt: 세포 총단백질 추출액(M-PER^® Mammalian Protein Extraction Reagent, Thermo), ZAP 항체(Thermo, USA), β-actin 항체 (Neomarker, USA);

RNA 추출 및 PCR: RNA 추출 시약 Trizol, 실시간 정량 PCR 장치 Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (Life, USA),

ZAP 프라이머:

ZAP 센스 스트랜드 (서열번호5: TCACGAACTCTCTGGACTGAA),

ZAP 안티센스 스트랜드(서열번호6: ACTTTTGCATATCTCGGGCATAA)

β-actin 프라이머는 실시예 2와 동일.

방법:

대수 생장기의 세포를 선택하여, DMEM 또는 F-12의 완전 배지(10%의 소 태아 혈청 및 1%의 이중 항체)에 넣어 세포 현탁액을 만들고, 세포는 2×10⁵/웰의 밀도로 35 mm 웰 내에 접종하였다. RNA를 추출하고, PCR로 세포 중의 ZAP mRNA 발현량을 검측하였다. 본 실험의 내부 참조는 β-actin 이었다. ZAP mRNA 정규화 발현량은 공식에 따라 진행하였다; ZAP 정규화 mRNA 발현량=2^-(C _t-ZAP ^-C _t-내부 _참조 ⁾. ^C _t _-ZAP 및 ^C _{t-내부 참조}는 Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System 장치의 계기 판독값이었고, PCR 증폭 과정 중에서, 형광 신호가 백그라운드에서 지수 증가(exponential growth) 단계로 진입하는 임계값에 상응하는 사이클 수를 표시한다.

세포 총단백질을 추출 및 정량하고, Western Blot 실험(전기 영동, 막 횡단, 블록킹, 1차 항체 및 2차 항체의 배양, 현상)을 진행하였다. 이미징 소프트웨어 Image Lab 을 통해 ZAP 및 내부 참조 β-actin 밴드 그레이 스케일을 스캐닝하여, 밴드 그레이 스케일을 검측하였다. ZAP 정규화 단백질 발현량은 다음 공식에 따라 계산을 진행하였다: ZAP 정규화 단백질 발현량= ZAP 밴드 그레이 스케일/내부 참조 밴드 그레이 스케일. 시험은 3차례 반복하고, 평균값을 취해 ZAP 정규화 단백질 발현량을 계산하였다.

결과:

도 3a 및 도 3b에 도시된 바와 같이, 종양 세포 SCaBER, T24, Hep3B 및 LoVo 에서 ZAP의 mRNA(도 3a) 및 단백질(도 3b) 정규화 발현량은 거의 검측하지 못했고, 정상 세포(L-02 및 HEB)와 종양 세포(PLC, HCT116) 보다 현저하게 낮았다.

M1 바이러스는 ZAP 저발현/음성의 종양 세포의 사망을 야기하였지만, ZAP 고발현의 종양 세포의 사망을 야기하지는 아니하였다. M1 바이러스 감염 후에, 정상 세포(L-02 및 HEB)와 부분 종양 세포(PLC, HCT116)의 생존율은 통계학적 의의가 있는 변화는 없었는데, L-02는 100.3%, HEB는 98.8%였다(표 1). 반면, 종양 세포 SCaBER, T24, Hep3B 및 LoVo 는, M1 바이러스 감염 후에, 세포 사망율이 T24 21.1%, SCaBER 11.5%, LoVo 6.9% 및 Hep3B 3.8%로 현저하게 하강하였다(표 1).

도 3c 및 표 1에 나타난 바와 같이, Hep G2 간암 세포의 ZAP 단백질 정규화 발현량은 L-02 정상 세포보다 낮으며, 비교값은 0.8이었다. M1 바이러스 감염 후의 L-02 세포의 생존율은 명백한 변화가 없으나, M1 바이러스 감염 후의 Hep G2 세포의 생존율은 70.4% 로 떨어져, 양자는 통계학적 차이를 구비했다. 이는 추가적으로 M1 바이러스가 ZAP 저발현의 종양 세포의 사망을 선택적으로 야기하는 것을 나타냈다.

2) M1 바이러스는 ZAP 수준의 녹다운 후의 정상 세포 및 종양 세포의 사망을 현저하게 야기함

재료:

M1 바이러스. 인간 간 세포 L-02, 인간 간암 세포 PLC, 인간 결직장암 세포 HCT116, ZAP RNA 간섭 단편, MTT (methyl thiazolyl tetrazolium), Lipofectamine™ RNAiMAX (invertrogen, USA) Western bolt: 세포 총단백질 추출액(M-PER^® Mammalian Protein Extraction Reagent, Thermo), ZAP 항체 (Thermo, USA), M1 바이러스 NS3 항체 (Beijing Protein Innovation), M1 바이러스 E1 항체 (Beijing Protein Innovation), GAPDH 항체 (CST, USA); RNA 추출 및 PCR: Trizol, 실시간 정량 PCR 장치(Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System), β-actin, M1 바이러스 비구조 단백질 NS1 프라이머는 실시예 2와 동일:

ZAP 간섭 단편(Si RNA)은 타겟 서열 서열번호7: 5'CCAAGAGTAGCACTTGTTA3'에 대해 설계

Si RNA 센스 스트랜드 (서열번호8:5'CAAGAGUAGCACUUGUUA dTdT 3')

Si RNA 안티센스 스트랜드 (서열번호9:3'dTdT GGUUCUCAUCGUGAACAAU 5')

ZAP 메시 코드 간섭 단편 대조(siNC): 센스 스트랜드와 안티센스 스트랜드의 뉴클레오티드(nucleotide) 비율은 Si RNA 단편과 동일하나, 배열 순서는 완전히 랜덤함.

방법:

대수 생장기의 세포를 선택하여, DEMEM 완전 배지(10%의 소 태아 혈청 및 1%의 이중 항체)에 넣어 세포 현탁액을 만들고, 세포는 1×10⁵/웰의 밀도로 6웰 플레이트에 접종하였다. 24시간 후, RNAiMAX로 포장된 Si RNA 단편을 넣었다. 48시간 후, M1 바이러스를 감염시켰다. 감염 48시간 후, 표본을 처리하였다.

각 웰에 MTT 20 μl (5 mg/ml)을 넣고, 4시간 후 흡광도값을 검측하고, 세포 생존율을 계산하였으며, siZAP 실험 그룹은 ZAP RNA 간섭 단편으로 처리하였고, siNC 대조군은 ZAP 메시 코드 간섭 단편으로 처리하였다.

a) 세포 상층액을 수집하고, TCID50 방법을 사용하여 바이러스 역가를 검측하였다.

b) RNA 표본을 추출하고, PCR로 M1 바이러스 비구조 단백질 NS1의 양을 검측함으로써 M1 바이러스량을 검사하였으며, β-actin이 내부 참조였다.

c) 단백질 표본을 추출하고, Western blot 로 ZAP 단백질 발현 및 M1 바이러스 단백질 NS3 및 E1을 검측하였으며, 내부 참조는 GAPDH였다. ZAP 정규화 발현량은, 내부 참조 GAPDH가 β-actin을 대체하는 것을 제외하고, 기타는 실시예 3의 1)과 동일하다.

d) 실험은 3차례 반복하였으며, 데이터는 평균값+표준 편차로 표시하였다; 각 대조군과 비교하여 students't 테스트 통계를 진행하였다. */#/＆ 는 P <0.05를 표시하고, **/＆＆ 은 P <0.01 을 표시하며, ns 는 통계학적 차이가 없음을 표시한다.

결과:

도 3d-3g에 도시된 바와 같이, ZAP RNA 간섭 단편으로 인간 정상 간세포 L-02, 인간 간암 세포 PLC 및 인간 결직장암 세포 HCT116를 처리한 후, ZAP 단백질 발현량은 검측하지 못할 정도로 하강하였으며(도 3g), M1 바이러스 단백질 NS3 및 E1 단백질은 명백히 증가하였으며; M1 바이러스 (MOI=100) 감염 후, ZAP 수준 녹다운 후의 L-02 세포(siZAP 그룹) 생존율은 69.7%±3.45% 로 떨어졌고, PLC 세포 생존율은 63.9%±11.5%로 떨어졌고, HCT116 세포 생존율은 49.6%±1.21%로 떨어졌다(도 3d); 도 3e에 도시된 바와 같이, M1 바이러스 감염 48시간 후, ZAP 녹다운의 L-02 세포(siZAP 그룹) 중의 상대적 M1 바이러스 역가는 상응하는 siNC 그룹의 4.10±1.38 배이고, HCT116 세포(siZAP 그룹)는 상응하는 siNC 그룹의 3.39±1.27 배이고, PLC 세포(siZAP 그룹)는 상응하는 siNC 그룹의 32.6±2.34 배였다. 동시에 도 3f에 도시된 바와 같이, M1 바이러스 감염 48시간 후 ZAP(siZAP 그룹) 녹다운의 L-02 세포에서, M1 바이러스 RNA 발현량은 상응하는 siNC 그룹의 16.3±8.20 배이고, HCT116 세포는 상응하는 siNC 그룹의 8.82±4.02 배이고, PLC 세포는 상응하는 siNC 그룹의 30.5±12.23 배였다; 이상의 결과는 M1 바이러스가 ZAP 수준의 녹다운 후의 정상 세포 및 종양 세포의 사망을 현저하게 야기함을 나타냈다.

3) 과발현 ZAP는 M1 바이러스가 야기하는 종양 세포 사망을 대항함

재료:

M1 바이러스, 인간 간암 세포 Hep3B, GFP를 발현하는 pReceiver-M02-GFP 플라스미드(불랭크 대조 플라스미드, Guangzhou Funeng Gene Co., Ltd.), ZAP를 발현하는 pReceiver-M02-ZAP 플라스미드(과발현 ZAP 플라스미드), FuGENE HD 트랜스펙션 시약(transfection reagent), MTT (methyl thiazolyl tetrazolium)

RNA 추출, PCR: Trizol, 실시간 정량 PCR 장치(Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System), β-actin, M1 바이러스 비구조 단백질 NS1 프라이머는 실시예 2와 동일함.

Western bolt: 세포 총단백질 추출액(M-PER^® Mammalian Protein Extraction Reagent, Thermo), ZAP 항체 (Thermo, USA), M1 바이러스 NS3 항체(Beijing Protein Innovation), M1 바이러스 E1 항체 (Beijing Protein Innovation), GAPDH 항체 (CST, USA).

방법:

대수 생장기의 세포를 선택하여, DEMEM 완전 배지(10%의 소 태아 혈청 및 1%의 이중 항체)에 넣어 세포 현탁액을 만들고, 세포는 1×10⁵/웰의 밀도로 6웰 플레이트에 접종하였다. 24시간 후, 각각 과발현 GFP 플라스미드 및 과발현 ZAP 플라스미드를 트랜스펙션하여, 녹색 형광 단백질을 발현하는 세포와 ZAP 과발현의 세포를 획득하였다. 48시간 후, M1 바이러스를 감염시키고, 감염 48시간 후, 표본을 처리하고 검측하였다:

a) MTT 방법으로 세포 생존율을 검측하였다. 각 웰에 MTT 20 μl (5 mg/ml)을 넣고, 4시간 후, 570 nM 파장으로 흡광도값을 검측하였다. 기타 처리는 실시예 1과 동일하였다.

b) 세포 상층액을 수집하고, TCID50 방법을 사용하여 바이러스 역가를 검측하였다.

c) 샘플의 총RNA 표본을 추출하고, QRT-PCR 방법으로 M1 바이러스의 RNA 발현량을 검측하고, 실시예 2의 방법에 따라 계산을 진행하였다.

d) 단백질 표본을 수집하고, Western blot 에 의해 ZAP 단백질 발현량 및 M1 바이러스 단백질 NS3, E1 단백질 발현량을 검측하였으며, 처리 방법은 실시예 3의 1과 동일하였다.

e) 각 실험은 3회 반복하였으며, 데이터는 평균값±표준 편차로 나타내었다. 각 대조군과 비교하여, students't 테스트를 채용하여 통계를 진행하였다. # 은 P <0.05를 표시하고, ** 은 P <0.01를 표시하고, ns 는 통계학적 의의를 구비하지 못함을 표시한다.

결과:

도 3k에 도시된 바와 같이, 인간 간암 세포 Hep3B 세포는 ZAP 저발현 플라스미드를 트랜스펙션한 후, Image Lab 소프트웨어를 통해 다른 표본의 ZAP 및 내부 참조 β-actin 밴드 그레이 스케일을 스캐닝한 후 각 ZAP 정규화 단백질 발현량을 계산하였다. ZAP 과발현 그룹의 ZAP 정규화 단백질 발현량은 1.61±0.05, 과발현 GFP 대조군은 0.03±0.01이었고, 전자의 평균값은 후자의 53.7배였고; M1 바이러스 단백질 NS3 및 E1 단백질은 현저하게 증가하였다.

도 3h에 도시된 바와 같이, 과발현 ZAP는 M1 바이러스 감염이 야기하는 Hep3B 세포 사망을 부분적으로 저지하였다. 다른 M1 바이러스 역가를 사용하여 감염 48시간 후, MOI=0.1 일 때, 과발현 ZAP 그룹 세포의 생존율 평균값은 74.7%±8.94%으로, 과발현 GFP 대조군 세포의 생존율(59.0%±6.27%)보다 현저하게 높았다; MOI=1 일 때, 과발현 ZAP 그룹 세포 생존율 평균값은 69.4%±6.95%로, 과발현 GFP 대조군 생존율(51.4%±5.31%)보다 현저하게 높았다; MOI=10 일 때, 과발현 ZAP 그룹 세포 생존율 평균값은 63.7%±6.04%로, 과발현 GFP 대조군 생존율(40.5%±3.19%)보다 현저하게 높았다.

도 3i에 도시된 바와 같이, M1 바이러스 감염 후 과발현 ZAP의 Hep3B 세포에서 M1 상대적 바이러스 역가는 상응하는 GFP 대조군의 31.5±11.6% 이었다. 동시에, M1 바이러스 감염 후 과발현 ZAP의 Hep3B 세포에서 M1 바이러스 RNA 발현량은 상응하는 과발현 GFP 대조군의 9.5±4.7% 이었다.

실시예 4: M1 바이러스는 ZAP 저발현 체외 활동성 종양 조직의 생장을 억제함(체외)

재료:

DMEM 고포도당 배지, TECIA (Tissue Culture-MTT Endpoint Computer Image Analysis Chemo-sensitivity Test), β-actin 및 ZAP 프라이머는 실시예 3의 1)과 동일함.

방법:

a) 인간 체외 활동성 간암 조직 및 결직장암 조직의 배양

체외 활동성 조직은 중산대학 종양 예방 치료 센터에서 수술 절제를 통해 획득하고, 4℃에서 보관하고, 4시간 내에 실험실로 보내 약물 민감성 시험을 진행하고, 모든 병례는 병리학 조직 검사를 통해 확진하였다. 무균 조건하에 종양 조직을 추출하여, 직경 0.5-1mm의 조직편으로 자르고, 24웰 배양판 상에 놓고, 각 웰에는 4~6편을 놓으며, 각 웰에는 1 ml DMEM 배지를 넣었다. 배양 1시간 후, 약물 민감성 시험 전용 이미지 분석기를 사용하여 종양 조직편의 투사 조명 이미지를 촬영하여, 각 웰 종양편 면적(area, A)을 측정 및 비교하여 M1 바이러스의 인간 체외 활동성 종양 조직의 억제 작용을 분석하였다.

b) 약물 처리 및 조직 활성 측정

종양 조직은 CO₂세포 배양 인큐베이터에서 12시간 배양하고, 상태가 안정된 후, 10⁷PFU의 M1 바이러스 및 음성 대조 약물 5-플루오로우라실(fluorouracil) (5-Fu, 10 mg/L)을 넣으며, 감염 96시간 후, MTT (5 mg/ml)를 50 μl/웰을 넣고, 3시간 배양을 하였다. 그 다음 약물 민감성 시험 전용 이미지 분석기를 사용하여 종양 조직편의 확산광 조명 이미지를 촬영하여, 각 웰 종양편의 포르마잔에 의한 남색 염색(blue dyed)의 면적 및 현색 정도(blue area, BA)를 측정하고, 다음 공식에 따라 조직 생존율(survival fraction, SF) 을 계산하였다:

종양 조직 억제율 (Cell inhibition, CI): CI=(1-SF)×100%, BA_약물 _처리는 M1 바이러스/5-Fu 처리 조직의 남색 염색된 면적을 나타내고, A_약물 _처리는 M1 바이러스/5-Fu 처리 조직의 종양편 면적을 나타내며, BA_대조 는 용제 대조 처리 그룹의 남색 염색된 면적을 나타내며, A_대조는 용제 대조 처리 그룹의 종양편 면적을 나타낸다.

c) ZAP mRNA 정규화 발현량 검측

M1 바이러스의 종양 억제율 10% 기준에 따라, 상기 전체 병례 조직을 2개 그룹으로 나눠, 각각 표본 RNA를 추출하고, QRT-PCR 방법으로 ZAP mRNA 및 β-actin (내부 참조) 수준을 검측하고, 양 그룹의 ZAP 정규화 발현량의 차이를 비교하였으며, Rank-sum 테스트를 사용하여 통계 분석을 하였다. ZAP 정규화 발현량 계산 방법은 실시예 3의 1)과 동일하다.

결과:

a) 표 2에 표시된 바와 같이, 간암 세포에서, 억제율이 10%를 초과하는 병례 비율은 M1 바이러스 그룹이 59.5%로, 5-Fu 그룹(53.8%)보다 높아, M1 바이러스가 유효율에서 현재의 임상 치료 간암의 약물 5-Fu보다 높은 것을 증명하였다.

표 2. M1 바이러스 및 5-Fu의 인간 체외 활동성 간암 조직 생존율의 억제
억제율 (% 대조)	M1 바이러스 처리 (%)	5-Fu 처리 (%)
＞10%	22(59.5%)	14(53.8%)
≤10%	15(40.5%)	12(46.2%)
병례 개수	37	26

b) 표 3에 표시된 바와 같이, 결직장암 조직 중에서, 억제율이 10%를 초과하는 병례 비율은 M1 바이러스 그룹이 71.4%로, 5-Fu 그룹(61.5%) 보다 높아, M1 바이러스가 유효율에서 현재의 임상 치료 결직장암의 약물 5-Fu보다 높은 것을 증명하였다.

표 3. M1 바이러스 및 5-Fu의 인체 체외 활동 결직장암 조직 생존율의 억제
억제율 (% 대조)	M1 바이러스 처리 (%)	5-Fu 처리 (%)
＞10%	10(71.4%)	8(61.5%)
≤10%	4(28.6%)	5(38.5%)
병례 개수	14	13

c) 상기 M1 바이러스 처리 후의 인체 체외 활동성 종양 조직을 억제율 10%를 기준으로 2개 그룹으로 나누고, 추가적으로 이들 조직 중 ZAP mRNA 발현 수준과 억제율의 상관성을 분석하였다. M1 바이러스 처리 억제율이 10%를 초과하는 표본 그룹의 ZAP 정규화 발현량은 0.117±0.890 로, 억제율이 10% 보다 작거나 같은 그룹(0.791±0.108) 보다 낮았으며, 양 그룹의 평균값 비교치는 0.148이었다. 도 4에 도시된 바와 같이, M1 바이러스 처리 억제율이 10% 보다 작거나 동일한 종양 조직 ZAP 정규화 발현량의 중앙값은 0.414로, 10%를 초과하는 M1 바이러스 처리 억제율을 가지는 그룹의 종양 조직 ZAP 정규화 발현량 중앙값은 0.075였다. Rank-sum 방법을 채용한 통계는 차이가 통계학적 의의, P <0.05를 구비하여, M1 바이러스가 ZAP 저발현/ZAP 음성의 종양에서 조직 사망을 선택적으로 야기할 수 있음을 설명하였다.

실시예 5: 다종의 종양 임상 병리 조직 중의 ZAP 저발현

재료:

506명 환자의 8장의 조직 조각(간암, 결직장암, 방광암 및 쌍(paired) 암 주위 조직 포함), ZAP 항체(Thermo, USA), APERIO 전자동 디지털 병리학 슬라이스 스캐너)

방법:

여러 센터의 8장의 조직 조각을 면역조직화학(IHC) 염색을 진행하고, APERIO 스캐너로 스캐닝하고, 매칭 스프트웨어로 염색 정도를 계산하여, ZAP 정규화 발현량을 검측하였다; ZAP 정규화 발현량=시야 내 ZAP 염색 강도/시야 내 세포 수량. 시야 내 세포 수량은 정규화 표준으로 사용됨.

결과:

조직 면역 화학 방법을 응용하여, 발명자는 다종의 인간 종양 병리 표본에서 ZAP 발현 정황을 검측하였다. 도 5a는 인간 간암, 결직장암, 방광암 병리 조직 표본에서 ZAP의 면역조직화학 염색 대표성 맵핑(mapping)을 나타내며, 종양 세포에서 ZAP 염색은 상응하는 암 주위 조직에 비해 연하다.

도 5b에 도시된 바와 같이, 간암, 결직장암, 방광암 및 상응하는 각 암 주위 비종양 조직의 ZAP 정규화 발현량 평균값에 대해 통계 분석을 진행하였다. 결과는 상기 각 종양 조직 중의 평균 ZAP 정규화 발현량이 각 암 주위 비종양 주변 조직보다 낮아, 종양 조직에서 ZAP 저발현을 나타냈다. 전체 간암 종양 조직의 평균 ZAP 정규화 발현량은 5.83±8.49 로, 상응하는 암 주위 비종양 조직(11.8±11.5) 보다 현저하게 낮았으며, 양자의 평균값 비교치는 0.494였다; 전체 결직장암 종양 조직의 평균 ZAP 정규화 발현량은 2.41±3.60으로, 상응하는 암 주위 비종양 조직(8.30±8.94)보다 현저하게 낮았으며, 양자의 평균값 비교치는 0.290이었다; 전체 방광암 종양 조직의 평균 ZAP 정규화 발현량은 2.93±4.63으로, 상응하는 암 주위 비종양 조직(10.3±8.36) 보다 낮았으며, 양자의 평균값 비교치는 0.284이었다.

도 5c에 나타난 바와 같이, 분석된 전체 간암 병례 중에서, ZAP 저발현의 병례 수량은 69%를 차지하고, 분석된 전체 결직장암 병례 중에서, ZAP 저발현의 병례 수량은 52%를 차지하고, 분석된 전체 방광암 병례 중에서, ZAP 저발현의 병례 수량은 61%를 차지하였다. 따라서 ZAP는 간암, 결직장암 및 방광암에 대한 M1 바이러스 항종양 치료의 선택성 분자 마커(marker)가 되었다.

실시예 6: M1 바이러스 제조 방법

재료:

아프리카 초록 원숭이 신장 세포 Vero, 고포도당 DMEM 배지, OptiPRO^TM SFM 배지(1x), M1 바이러스, 100 mm 세포 배양 접시, 원심분리기

방법:

대수 생장기의 세포를 선택하여, DEMEM 완전 배지(10%의 소 태아 혈청 및 1%의 이중 항체를 포함)에 넣어 세포 현탁액을 만들고, 세포를 100mm배양 접시 내에 접종하였다. 세포의 융합도가 80%-90%에 도달했을 때, OptiPRO^TM SFM 배지를 교체하였다. 다시 50 μl (MOI=0.01) M1 바이러스를 넣어 감염시키고, 세포에서 넓은 면적의 병리 변화가 나타날 때(약 36시간), 세포 상층액을 수집하였다. 2000-3000 RPM으로 5분 동안 원심 분리하고, 조심스럽게 상층액을 흡입하여, 잘 섞어 나눠 패키징한 후, -80℃ 냉장고에 보관하였다.

상기 실시예는 본 발명의 예시성 실시 방식 및 효과 설명이므로, 본 발명의 실시 방식은 상기 실시예의 제한을 받지 아니하며, 본 발명의 정신 실체 및 원리에 위배되지 아니하는 기타 어떠한 변화, 변경, 대체, 조합, 단순화는 본 발명의 내용에 벗어나지 아니하고, 모두 본 발명의 보호 범위 내에 포함된다.

<110> GUANGZHOU VIROTECH PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> USE OF ALPHAVIRUS IN PREPARATION OF ANTITUMOR DRUGS <130> 2018-FPA-9024D <150> PCT/CN2015/087945 <151> 2015-08-24 <150> CN 201410425510.3 <151> 2014-08-26 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> synthetic sequence <400> 1 gatcattgct cctcctgagc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> synthetic sequence <400> 2 actcctgctt gctgatccac 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> synthetic sequence <400> 3 gttccaacag gcgtcaccat c 21 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> synthetic sequence <400> 4 acacattctt gtctagcaca gtcc 24 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> synthetic sequence <400> 5 tcacgaactc tctggactga a 21 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> synthetic sequence <400> 6 acttttgcat atctcgggca taa 23 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> synthetic sequence <400> 7 ccaagagtag cacttgtta 19 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> synthetic sequence <400> 8 ccaagaguag cacuuguuat t 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> synthetic sequence <400> 9 uaacaagugc uacucuuggt t 21

Claims

적어도 하나의 알파 바이러스를 포함하는 종양의 치료용 약학적 조성물로서, 상기 알파 바이러스는 M1 바이러스 및 게타 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 종양은 인체 종양이며, 상기 종양은 간암, 결직장암, 방광암, 유방암, 전립선암, 흑색종, 췌장암, 인두암 또는 폐암인 것을 특징으로 하는 종양의 치료용 약학적 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 종양은 ZAP 저발현 종양 또는 ZAP 음성 종양인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 종양은 고형 종양인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서.
상기 약물은 주사제, 타블렛, 캡슐 또는 부착제인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
청구항 4에 있어서.
상기 약물은 주사제인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 적어도 하나의 알파 바이러스는 기탁 번호 CCTCC V201423으로 기탁된 M1 바이러스의 게놈과 적어도 97.8%의 뉴클레오티드 서열 상동성을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 적어도 하나의 알파 바이러스는 기탁 번호 CCTCC V201423으로 기탁된 M1 바이러스의 게놈과 100%의 뉴클레오티드 서열 상동성을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 적어도 하나의 알파 바이러스는 투여 후 종양 조직에 선택적으로 집중되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
ZAP 발현 수준 검측 시약 및 적어도 하나의 알파 바이러스를 포함하는 항종양 투여 시스템으로서, 상기 알파 바이러스는 M1 바이러스 및 게타 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 종양은 인체 종양이며, 상기 종양은 간암, 결직장암, 방광암, 유방암, 전립선암, 흑색종, 췌장암, 인두암 또는 폐암인 것을 특징으로 하는 항종양 투여 시스템.
청구항 9에 있어서,
상기 적어도 하나의 알파 바이러스는 기탁 번호 CCTCC V201423으로 기탁된 M1 바이러스의 게놈과 적어도 97.8%의 뉴클레오티드 서열 상동성을 갖는 것을 특징으로 하는 항종양 투여 시스템.
청구항 9에 있어서,
상기 적어도 하나의 알파 바이러스는 기탁 번호 CCTCC V201423으로 기탁된 M1 바이러스의 게놈과 100%의 뉴클레오티드 서열 상동성을 갖는 것을 특징으로 하는 항종양 투여 시스템.
적어도 하나의 알파 바이러스 및 ZAP 억제제를 포함하는 항종양 약물로서, 상기 알파 바이러스는 M1 바이러스 및 게타 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 종양은 인체 종양이며, 상기 종양은 간암, 결직장암, 방광암, 유방암, 전립선암, 흑색종, 췌장암, 인두암 또는 폐암이고, 상기 ZAP 억제제는 ZAP 발현 또는 기능 억제제, ZAP 간섭 단편 및 ZAP 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항종양 약물.
청구항 12에 있어서,
상기 ZAP 억제제는 종양 표적 ZAP 억제제인 것을 특징으로 하는 항종양 약물.
청구항 12 또는 청구항 13에 있어서,
상기 종양은 고형 종양인 것을 특징으로 하는 항종양 약물.
청구항 12 또는 청구항 13에 있어서,
상기 적어도 하나의 알파 바이러스는 기탁 번호 CCTCC V201423으로 기탁된 M1 바이러스의 게놈과 적어도 97.8%의 뉴클레오티드 서열 상동성을 갖는 것을 특징으로 하는 항종양 약물.
청구항 12 또는 청구항 13에 있어서,
상기 적어도 하나의 알파 바이러스는 기탁 번호 CCTCC V201423으로 기탁된 M1 바이러스의 게놈과 100%의 뉴클레오티드 서열 상동성을 갖는 것을 특징으로 하는 항종양 약물.
청구항 12 또는 청구항 13에 있어서,
상기 적어도 하나의 알파 바이러스는 투여 후 종양 조직에 선택적으로 집중되는 것을 특징으로 하는 항종양 약물.
ZAP 억제제를 이용하여 적어도 하나의 알파 바이러스 항종양 민감 증진제(sensitizer)/내약 역전제(resistance reverser)를 제조하는 방법으로서, 상기 알파 바이러스는 M1 바이러스 및 게타 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 종양은 인체 종양이며, 상기 종양은 간암, 결직장암, 방광암, 유방암, 전립선암, 흑색종, 췌장암, 인두암 또는 폐암이고, 상기 ZAP 억제제는 ZAP 발현 또는 기능 억제제, ZAP 간섭 단편 및 ZAP 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
청구항 18에 있어서,
상기 적어도 하나의 알파 바이러스는 기탁 번호 CCTCC V201423으로 기탁된 M1 바이러스의 게놈과 적어도 97.8%의 뉴클레오티드 서열 상동성을 갖는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
청구항 18에 있어서,
상기 적어도 하나의 알파 바이러스는 기탁 번호 CCTCC V201423으로 기탁된 M1 바이러스의 게놈과 100%의 뉴클레오티드 서열 상동성을 갖는 것을 특징으로 하는 제조 방법.