CN106177961B - Vcp抑制剂和溶瘤病毒在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及VCP(valosin‑containing protein,VCP)抑制剂和溶瘤病毒在制备抗肿瘤药物的应用。本发明首次发现VCP抑制剂可以用于制备溶瘤病毒抗肿瘤增效剂。发明同时涉及一种包含VCP抑制剂以及溶瘤病毒的药物组合物，包含VCP抑制剂及溶瘤病毒的药品套装，以及VCP抑制剂与溶瘤病毒在治疗肿瘤，特别是对所述溶瘤病毒不敏感的肿瘤中的用途。发明还涉及一种抗肿瘤用药系统，其特征在于包括VCP表达水平检测试剂以及溶瘤病毒。

Description

VCP抑制剂和溶瘤病毒在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及VCP蛋白抑制剂与溶瘤病毒的联合在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
溶瘤病毒(oncolytic virus)是一类选择性的感染并杀伤肿瘤细胞，而不损伤正常细胞的可复制病毒。溶瘤病毒疗法(oncolytic virotherapy)是一种创新的肿瘤靶向治疗策略，它利用天然的或经基因工程改造的病毒选择性的感染肿瘤细胞，并在肿瘤细胞中复制，达到靶向性溶解、杀伤肿瘤细胞的作用，但是对正常细胞没有损伤。
M1病毒(Alphavirus M1)属于甲病毒属(Alphavirus)，其在制备抗肿瘤药物方面具有较好的应用效果。例如中国发明专利申请201410425510.3公开了M1病毒能选择性引起肿瘤细胞死亡而不影响正常细胞存活，其在抗肿瘤方面具有非常好的应用前景。然而，不同肿瘤对M1病毒的敏感性不一，对于某些肿瘤，M1病毒单独用药时，溶瘤作用还不够理想。例如中国发明专利申请201410425510.3所记载的，M1作为抗肿瘤药物使用时，对于结直肠癌、肝癌、膀胱癌和乳腺癌的效果不如胰腺癌、鼻咽癌、前列腺癌和黑色素瘤明显；而胶质瘤、宫颈癌、肺癌则更其次；而胃癌则最不显著。
筛选增加溶瘤病毒肿瘤治疗效果的化合物有望增加溶瘤病毒的抗瘤谱及抗瘤强度。发明人此前申请的专利201510990705.7中，将大黄酚及其衍生生物作为溶瘤病毒的抗瘤增效剂，二者组合可以将肿瘤细胞的存活率降低至39.6％，但其抗癌强度存在很大的进步空间，此外，这种联合应用的作用机制尚不明确。本发明的目的在于提供一种基于精确机制的溶瘤病毒抗癌增效剂，能够选择性 的增强M1病毒对肿瘤细胞的杀伤作用，而不影响正常细胞。本发明提供了一种更精准更安全的溶瘤病毒增效疗法。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种VCP抑制剂在制备溶瘤病毒抗瘤增效剂方面的应用。
本发明的另一个目的在于提供一种抗瘤药物组合物，其可以使得溶瘤病毒发挥更好的抗瘤效果。
本发明的另一个目的在于提供一种针对溶瘤病毒不敏感的肿瘤，安全有效的溶瘤病毒增效药物。
本发明的另一个目的在于提供一种个性化的用药系统和方法。
发明通过以下技术方案实现上述目的：
发明人通过研究、筛选发现，VCP抑制剂可以增强溶瘤病毒的溶瘤效果。
所述的VCP抑制剂为抑制VCP蛋白活性的物质、或降解VCP蛋白的物质、或降低VCP蛋白水平的基因工具。
VCP(valosin containing protein,VCP)，又称P97，是一种细胞内广泛表达的ATP酶，它作为内质网应激相关降解通路的重要组成元件，负责识别和递呈泛素化蛋白，并将这些蛋白转运至蛋白酶体进行降解，以保证细胞内蛋白质稳态。已有多篇文献报道VCP在肿瘤细胞中高表达，抑制VCP能够显著的诱导肿瘤细胞死亡。
发明人通过用VCP干扰片段(Si RNA)抑制这个基因的表达，降低相应蛋白的表达量，结果发现，单独干扰VCP和未干扰并未引起细胞形态病变，同时单独应用M1病毒也不引起细胞形态病变，只有干扰VCP联合应用M1病毒组引起了显著细胞形态病变。
进一步地，发明人的进一步实验验证了通过抑制VCP可以显著增强溶瘤病毒的溶瘤效应。发明人采用了抑制VCP活性的化合物Eeyarestatin I、NMS-873 或CB-5083协同溶瘤病毒例如M1病毒作用于肿瘤细胞，实验结果发现，Eeyarestatin I、NMS-873或CB-5083或其组合，均可以协同溶瘤病毒增强抗肿瘤效应。
本发明首次发现，VCP抑制剂可以作为溶瘤病毒的抗瘤增效剂/耐药逆转剂。
本发明提供了VCP抑制剂在制备溶瘤病毒抗瘤增效剂/耐药逆转剂方面的应用。
所述的VCP抑制剂包括但不限于Eeyarestatin I(式1)、NMS-873(式2)、CB-5083(式3)等抑制VCP蛋白活性的化合物。化合物的获取方式可选但不限于：自己化学分离或合成或者从商业途径购买。
在本发明优选的实施例中，VCP蛋白抑制剂为Eeyarestatin I、CB-5083或他们的组合。
VCP抑制剂还包括针对VCP基因表达抑制工具，包括但不限于RNA干扰(RNAi)microRNA以及基因编辑或敲除等工具手段。
在本发明另一优选的实施例中，VCP蛋白抑制剂为VCP的干扰RNA片段。
所述的溶瘤病毒选自M1病毒、盖塔病毒、腺病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、水泡口炎病毒、和单纯性疱疹病毒中的一种或多种；优选M1病毒、盖塔病毒或者他们的组合。
本发明所说的溶瘤病毒(甲病毒(例如M1病毒、盖塔病毒等)、腺病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、水泡口炎病毒、和单纯性疱疹病毒等)可以尤其地指目前已有的溶瘤病毒，但也不排除一些可能发生的自然变异或者进行了突变、修饰、序列增加、减少等的病毒，只要这些变异、突变、修饰、序列增加或减少等的变化并不影响所说的溶瘤病毒发挥本发明所述的作用，则属于本发明所述的同质的病毒。所说的VCP抑制剂为能起到敲低或影响VCP基因表达或者降低VCP蛋白量或蛋白活性的物质(例如化合物、或氨基酸序列、核苷酸序列等)或工具等。本领域技术人员可以对其抑制化合物或者基因工具进行修饰、替换、改变等，但只要起到上述抑制VCP的作用的，则属于本发明的VCP抑制剂，属于上述物质、化合物或工具等的同质替换。
本发明还提供一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其包含VCP抑制剂以及溶瘤病毒。本发明还提供用于治疗肿瘤的药品套装，其包含VCP抑制剂，以及溶瘤病毒。药品套装区别于组合物的地方在于，在药品套装中，VCP抑制剂未必、并且通常不与溶瘤病毒混合存在，而是通常地被分开包装。分开包装的溶瘤病毒与VCP抑制剂也可含有其各自的佐剂。所述的佐剂是指在药学中，可辅助药物疗效的手段。药品套装也可以包含独立包装的VCP抑制剂，以及独立包装的溶瘤病毒。药物套装中VCP抑制剂，以及溶瘤病毒的施用，可以是同时施用或者是以任意的前后顺序施用，其中患者先用一种药物治疗，然后再给以另一种药物。所述的患者是指哺乳动物受治疗者，尤其是人类。
所述的VCP抑制剂包括但不限于Eeyarestatin I(式1)、NMS-873(式2)、CB-5083(式3)等这一类的抑制VCP蛋白活性的化合物。或者针对VCP基因表达抑制工具，包括但不限于RNA干扰(RNAi)microRNA以及基因编辑或敲除等工具手段。优选Eeyarestatin I、CB-5083或它们的组合。
所述的溶瘤病毒选自M1病毒、盖塔病毒、腺病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、水泡口炎病毒、和单纯性疱疹病毒中的一种或多种；优选M1病毒和盖塔病毒的至少一种。
在组合物或药品套装中，Eeyarestatin I或NMS-873或CB-5083与溶瘤病毒的配比可选地为：0.01～200mg:103～109PFU；优选0.1～200mg:104～109PFU；进一步优选0.1～100mg:105～109PFU。
优选使用剂量为：Eeyarestatin I或NMS-873或CB-5083使用范围为0.01mg/kg至200mg/kg，同时溶瘤病毒使用滴度为MOI从103至109(PFU/kg)；优选Eeyarestatin I或NMS-873或CB-5083使用范围为0.1mg/kg至200mg/kg，同时溶瘤病毒使用滴度为MOI从104至109(PFU/kg)；更优选Eeyarestatin I或NMS-873或CB-5083使用范围为0.1mg/kg至100mg/kg，同时溶瘤病毒使用滴度为MOI从105至109(PFU/kg)。
在一个实施方式中，所述溶瘤病毒选自M1病毒、盖塔病毒、腺病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、水泡口炎病毒和单纯性疱疹病毒。优选地，所述溶瘤病毒为M1病毒和盖塔病毒中的至少一种。M1病毒属于盖塔相似病毒，据报道在已发现的相关病毒中，这两者的同源性高达97.8％。
在一个实施例中，采用的溶瘤病毒为保藏编号CCTCC V201423(具体信息如中国专利104814984A所记载)的M1病毒。
在一个实施方式中，所述肿瘤为实体瘤或血液瘤。在一个实施方式中，所述实体瘤为肝癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌、或胃癌。在优选的实施方式中，所述肿瘤为对溶瘤病毒不敏感的肿瘤。在更优选的实施方式中，所述肿瘤为对M1溶瘤病 毒不敏感的肿瘤。
作为可选的实施方案，本发明所提供的Eeyarestatin I或NMS-873或CB-5083或其组合可以是注射剂、片剂、胶囊、贴剂、试剂盒等。作为优选的实施方案，本发明的增效药物是注射剂；优选地，可采用静脉注射。
另外，本发明还发现，降低VCP蛋白水平，可显著增加溶瘤病毒处理后肿瘤细胞的生存率(实施例4)；在不对VCP水平予以干预的情况下，发现VCP的表达与Eeyarestatin I联合溶瘤病毒的抗肿瘤效应呈正相关(实施例5)，VCP表达水平的高低会对Eeyarestatin I联合溶瘤病毒抗肿瘤效应产生关联性的影响，VCP可以作为VCP抑制剂与溶瘤病毒联用的生物标记物。Eeyarestatin I/M1病毒联合抗肿瘤效应的有效性，与肿瘤VCP表达水平密切相关，VCP在多种肿瘤细胞中高表达，Eeyarestatin I联合溶瘤病毒抗肿瘤可选择性地治疗VCP高表达的肿瘤/个体。
因此，为了进一步提高所述溶瘤病毒作为抗肿瘤药物治疗的有效率，在治疗方案的选择中，可以首先判断患者肿瘤的VCP表达情况，再针对性地给予溶瘤病毒的治疗方案，以此来提高治疗方案的有效性，避免无效给药所造成的时间上的拖延和药物滥用。例如，在给药前先测定患者肿瘤VCP表达情况，如果是VCP低表达或VCP阴性的肿瘤，可直接给以溶瘤病毒治疗；如果是VCP正常表达/VCP高表达肿瘤，则可在溶瘤病毒给药前或同时或之后给予VCP抑制剂(例如VCP表达或功能抑制剂，VCP干扰片段，或者VCP抗体等)，以提高肿瘤对溶瘤病毒的敏感性，提高治疗有效性。肿瘤VCP表达量的高低直接影响到溶瘤治疗的有效性。VCP表达量越低的肿瘤越有利于溶瘤病毒的治疗效果。判断某个体/肿瘤是否适于利用所述溶瘤病毒直接进行治疗，可先检测肿瘤VCP的表达水平。
因此本发明提供了一种抗肿瘤用药系统，包括VCP检测试剂或检测系统，以及溶瘤病毒；所述的溶瘤病毒选自甲病毒、腺病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、水泡口炎病毒、和单纯性疱疹病毒中的一种或多种。
VCP检测试剂或检测系统可以是任意的可用于对VCP表达水平进行的试剂/系统。本领域技术人员可以通过常规的基因或蛋白量检测分析手段进行选择，具体方法包括但不限于Western Blot(参考实施例4)、免疫组化、ELISA、QRT-PCR。
肿瘤VCP表达量的高低直接影响到VCP抑制剂联合溶瘤病毒治疗的有效性。VCP表达量越高的肿瘤越适用以下治疗方案：VCP抑制剂联合溶瘤病毒的联合疗法。判断某个体/肿瘤是否适于利用VCP抑制剂联合溶瘤病毒进行治疗，可先检测肿瘤VCP的表达水平。
判断VCP表达水平高低可以优选但不限于以下方式：
VCP低或高表达是指两组(个)样本之间VCP mRNA或者蛋白质数量比较后得出的结论，如果一组(个)样本比另外一组(个)VCP mRNA或者蛋白质数量少或多称为该样本VCP低或高表达；VCP阴性是指样本完全不表达VCP mRNA或蛋白。用于VCP mRNA和蛋白质的数量比较的样本可以是肿瘤细胞和正常细胞、肿瘤组织与癌旁非瘤组织，或者溶瘤病毒治疗有效与无效的肿瘤。
作为一种可选的方式，肿瘤的VCP高、低或阴性表达均指肿瘤组织与相应癌旁非瘤组织比较，VCP mRNA和蛋白质的数量多、少或者无表达。
若肿瘤组织的VCP的mRNA或蛋白质均一化表达量比相应癌旁非瘤组织少(即肿瘤组织较癌旁非瘤组织的VCP均一化表达量比值<1)，则属于VCP低表达，可以利用溶瘤病毒直接进行治疗。
若肿瘤组织的VCP的mRNA或蛋白质均一化表达量比相应癌旁非瘤组织高(即肿瘤组织较癌旁非瘤组织的VCP均一化表达量比值＞1)，则属于VCP高表达，适于利用VCP抑制剂联合溶瘤病毒进行治疗(联合疗法)。对于以下治疗对象，联合疗法将更为必要：肿瘤组织较癌旁非瘤组织的VCP相对表达量即均一化表达量比值＞1.5的肿瘤，尤其是＞2，尤其是＞2.5，尤其是＞3，尤其是＞3.5，尤其是＞4。这些肿瘤组织与相应癌旁非瘤组织包括但不限于病理穿刺手术或外科切除手术来源组织样本。
VCP mRNA或蛋白检测方法包括但不限于QRT-PCR、Northern Blot、 WesternBlot、免疫组织化学、ELISA等。为准确判定不同样本之间VCP mRNA或蛋白数量的差异，首先计算出每一个样本VCP mRNA或蛋白的均一化表达量。均一化表达量是指每个样本的VCPmRNA或蛋白值和样本内参VCP mRNA或蛋白平相除，进行均一化处理得出该样本VCP均一化表达量。在不同检测方法中内参可以不同，其共同特征是在不同细胞或组织样本中内参表达量一致，这样经过均一化处理的不同样本的VCP表达量才具备可比性，用于判断样本之间VCP mRNA或蛋白的数量差异。
优选地，所述的甲病毒选自M1病毒和盖塔病毒中的至少一种；
优选地，所述的肿瘤为实体瘤或血液瘤；
更优选地，所述的实体瘤为肝癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。
同时本发明还提供了一种抗肿瘤药物，包括溶瘤病毒，所述溶瘤病毒选自甲病毒、腺病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、水泡口炎病毒、和单纯性疱疹病毒中的一种或多种，并且，其尤其针对于VCP阴性或VCP低表达肿瘤；
优选地，所述的甲病毒选自M1病毒和盖塔病毒中的至少一种；
更优选地，所述的肿瘤为VCP高表达的肿瘤时，采用联合疗法；所述的肿瘤为VCP阴性或低表达的肿瘤时，采用M1病毒单独治疗。
更优选地，所述的肿瘤为肝癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。
本发明所采用的用药系统将可以个性化地提高溶瘤病毒的用药有效性。
作为本发明进一步优选的实施方案：
本发明发现了VCP抑制剂，尤其是Eeyarestatin I和CB-5083可以增加溶瘤病毒的抗肿瘤效应，以提高溶瘤病毒作为抗肿瘤药物时的治疗有效性。细胞学实验证明M1病毒分别和Eeyarestatin I、CB-5083联合应用，可显著引起肿瘤细胞的形态学病变，从而显著增强对肿瘤细胞的抑制作用。
我们联合Eeyarestatin I或CB-5083和M1病毒作用于人肝细胞癌Hep3B株， 出人意料的发现抗病毒化合物Eeyarestatin I或CB-5083和M1病毒联合应用时，显著增加肿瘤细胞形态病变，显著降低肿瘤细胞生存率。例如在本发明的一个实施例中，当M1病毒(MOI＝0.001)单独处理肝癌细胞时，肿瘤细胞存活率为83.0％，而当以5μM的Eeyarestatin I或CB-5083与同样MOI的M1病毒联用时，肿瘤细胞存活率大幅下降至21.6％。与单用M1病毒的抗肿瘤效果相比，Eeyarestatin I与M1联用时，溶瘤效果显著提升。
发明人此前将大黄酚及其衍生物作为M1病毒的抗癌增效剂，经试验发现，50μM的大黄酚与(MOI＝0.001)M1病毒联用后，肿瘤细胞的存活率下降至39.6％，而本发明发现，将5μM的Eeyarestatin I或CB-5083与M1病毒联用后，肿瘤细胞的存活率显著下降至21.6％。与大黄酚及其衍生物相比，本发明的M1抗肿瘤增效剂显著提高了肿瘤的杀伤率，同时，Eeyarestatin I或CB-5083在药物有效剂量上仅为大黄酚的十分之一，并且作用快速，用时为大黄酚的三分之二(大黄酚处理72h，Eeyarestatin I处理48h)，具备显著优越性。
本发明发现，Eeyarestatin I或CB-5083与溶瘤病毒联合应用处理肿瘤细胞，对肿瘤细胞杀伤作用显著优于单用相同浓度的Eeyarestatin I或CB-5083，例如当同样例如以5μM的Eeyarestatin I处理肿瘤细胞时，肿瘤细胞存活率仍高达87.2％，当以5μM的Eeyarestatin I与M1病毒联用时，肿瘤细胞存活率大幅下降至21.6％。可见，EeyarestatinI与M1联用时大幅提升的溶瘤效果，是得益于Eeyarestatin I与M1病毒之间的协同性机制，并非简单地通过Eeyarestatin I的抗肿瘤机制发挥作用。
附图说明
图1Eeyarestatin I与M1病毒显著增加人肝细胞癌株形态学病变。
图2Eeyarestatin I/CB-5083与M1病毒联合处理显著降低人肝细胞癌株生存率；
其中，图2a Eeyarestatin I与M1病毒联合处理显著降低人肝细胞癌株Hep3B生存率；图2b CB-5083与M1病毒联合处理显著降低人肝细胞癌株Hep3B生存率。
图3敲低VCP可以增强溶瘤病毒M1在肝癌细胞上的溶瘤效应；
其中，图3a VCP蛋白敲低的效率；图3b敲低VCP显著增加人肝细胞癌株形态学病变；图3c敲低VCP增强溶瘤病毒M1在两株肝癌细胞上的溶瘤效应。
图4VCP的蛋白表达与VCP抑制剂和M1病毒联合疗法的抗癌效应呈正相关；
其中，图4a在多种肝癌细胞和正常细胞中，VCP的蛋白表达量；图4b EeyarestatinI与M1病毒联合使用对多种肝癌细胞和正常细胞上的生存率影响；图4c Eeyarestatin I与M1病毒联合使用与VCP蛋白表达的相关性分析。
图5VCP抑制剂协同M1病毒通过诱导不可逆内质网应激引起肿瘤细胞凋亡；
其中，图5a VCP抑制剂协同M1病毒能够抑制IRE1-XBP1通路；图5b VCP抑制剂协同M1病毒能够促进内质网应激介导的细胞凋亡。
图6 Eeyarestatin I与M1病毒联合处理显著抑制人肝细胞癌株移植瘤生长；其中其中，图6a和b Eeyarestatin I与M1病毒联合处理显著抑制人肝细胞癌株Hep3B移植瘤生长；图6c和d Eeyarestatin I与M1病毒联合处理显著抑制人肝细胞癌株Huh 7移植瘤生长.
图标说明：
EerI：Eeyarestatin I处理组；CB-5083：CB-5083处理组；M1+EerI：M1病毒与Eeyarestatin I联用处理组；M1+CB-5083：M1病毒与CB-5083联用处理组。
具体实施方式
以下实施方式是对本发明作进一步说明，但本发明的实施方式不局限于以下的实施例介绍，凡依照本发明的原理或理念所作的等同的变化或变通都应视为本发明保护的范畴。
在没有特别指明的情况下，本发明采用的材料及实验方法为常规材料及方法。
实施例1Eeyarestatin I与M1病毒显著增加人肝癌细胞株形态学病变
材料：
人肝细胞癌Hep3B，M1病毒，高糖DMEM培养基，倒置相差显微镜。
方法：
a)细胞的培养：人肝细胞癌Hep3B生长在含10％FBS、100U/ml青霉素及0.1mg/ml链霉素的DMEM完全培养基中；所有细胞株均置于5％CO2,37℃恒温密闭式孵箱(相对湿度95％)内培养传代，倒置显微镜观察生长情况。大约2～3天传代一次，取处于对数生长期的细胞用于正式实验。
b)细胞处理和形态学观察：选择对数生长期细胞，DMEM完全培养液(含10％胎牛血清、1％双抗)制成细胞悬液，细胞以2.5×104/孔的密度接种在24孔培养板内。用Eeyarestatin I(5μM)单独处理、M1病毒(MOI＝0.001)感染细胞、M1病毒(MOI＝0.001)联合Eeyarestatin I(5μM)处理细胞，以不加M1病毒和Eeyarestatin I为对照，48时后在倒置相差显微镜下观察细胞形态学的变化。
结果：
如图1所示,相差显微镜下观察细胞形态，对照组Hep3B细胞是单层贴壁生长，并且细胞紧密排列，表型一致，并且分别单独使用Eeyarestatin I(5μM)或M1病毒(MOI＝0.001)处理48h后，细胞形态没有显著改变。而Eeyarestatin I(5μM)与M1病毒(MOI＝0.001)联合处理细胞48h后，与对照组以及各单独处理组比较，联合处理组细胞数目明显减少，并且细胞的形态发生了明显改变，胞体收缩成球状，折光率明显增强，呈死亡病变样。
实施例2Eeyarestatin I或CB-5083与M1病毒联合处理显著降低人肝癌细胞株生存率
材料：
人肝细胞癌Hep3B，M1病毒，高糖DMEM培养基，自动酶联检测酶标仪。
方法：
a)接种细胞、给药处理：选择对数生长期细胞，DMEM完全培养液(含10％胎牛血清、1％双抗)制成细胞悬液，以每孔4×103/孔的密度接种在96孔培养 板内。12小时后见细胞完全贴壁，实验分无药物与病毒处理的对照组、单独Eeyarestatin I或者CB-5083组，M1单独感染组和Eeyarestatin I/M1联用组或者CB-5083/M1联用组。所用剂量为：所用剂量为：M1病毒(MOI＝0.001)感染细胞；Eeyarestatin I或CB-5083设不同的剂量梯度。
b)MTT与细胞内的琥珀酸脱氢酶反应：培养至48h时，每孔加入MTT 20μl(5mg/ml)，继续孵育4小时，此时镜检可观察到、活细胞内形成的颗粒状蓝紫色甲臜结晶。
c)溶解甲臜颗粒：小心吸去上清，加DMSO 100μl/孔溶解形成的结晶，在微型振荡器上震荡5min，然后在酶联检测仪上用波长570nm检测各孔的光密度(OD值)。每组实验重复3次。细胞存活率＝药物处理组OD值/对照组OD值×100％。
d)用origin 8进行非线性曲线拟合，以药物剂量为横坐标，相对细胞存活率为纵坐标绘制两条量效曲线，即Eeyarestatin I或CB-5083单用的量效曲线以及EeyarestatinI或CB-5083与M1病毒联用的量效曲线，计算两条曲线的曲线下面积差值，即图中DAUC(Differnence in Area Under the Curve,DAUC)，该差值越大说明药物协同越显著。各种不同处理后细胞的存活率除以无药物与病毒处理的对照组存活率作为相对细胞存活率,并以倍数表示。One way ANOVA统计，表明具有统计学差异时*表示P<0.05、**表示P<0.01。
结果:
如图2a所示，M1病毒(MOI＝0.001)单独处理对肿瘤细胞Hep3B具有较小的生存率抑制作用，肿瘤细胞相对细胞存活率达到83.0％，5μM的Eeyarestatin I处理组肿瘤细胞相对细胞存活率仍高达87.2％，然而，当同样的5μM的Eeyarestatin I与M1病毒(MOI＝0.001)联用(Eeyarestatin I+M1)时，肿瘤细胞相对细胞存活率大幅下降至21.6％。与单用处理比较，浓度0.625μM至10μM的Eeyarestatin I分别与M1病毒(MOI＝0.001)联合应用都显著降低肿瘤细胞Hep3B存活率。
如图2b显示，与单用相应浓度CB-5083处理比较，0.125μM至2μM CB-5083分别联合溶瘤病毒M1(MOI＝0.001)显著降低肿瘤细胞Hep3B存活率。在细胞水平说明了VCP抑制剂可以增强M1病毒的溶瘤效应。
实施例3敲低VCP表达水平可以增强溶瘤病毒M1在肝癌细胞上的溶瘤效应
材料：
M1病毒、人肝细胞癌Hep3B、人肝癌细胞Huh 7、VCP干扰片段(Si RNA)、MTT(甲基偶氮唑蓝)、LipofectamineTM RNAiMAX(invertrogen，USA)Western bolt：细胞总蛋白抽提液(Mammalian Protein Extraction Reagent，Thermo)、VCP抗体(CST，USA)、GAPDH抗体(CST，USA)；
方法：
选择对数生长期细胞，DMEM完全培养液(10％胎牛血清、1％双抗)制成细胞悬液，细胞以1×105/孔的密度接种在6孔板内。24小时后，加入RNAiMAX包裹的Si RNA片段。48小时后，感染M1病毒。感染48小时后，处理样本。
a)每孔加入MTT 20μl(5mg/ml)，4小时后检测吸光度值，计算细胞存活率，siVCP实验组以VCP RNA干扰片段处理，siNC对照组以VCP乱码干扰片段处理。
b)抽提蛋白质样本，Western blot检测VCP蛋白表达，内参是GAPDH。
c)试验重复3次，数据以平均值±标准差表示；与各自对照组比较进行students’t检验统计，**表示P<0.01。
结果:
如图3a所示，以VCP RNA干扰片段处理人肝癌细胞Hep3B和Huh 7后，VCP蛋白表达量显著下降。
如图3b所示，相差显微镜下观察细胞形态，对照组(NTi)以及各干扰VCP处理组(VCPi#1和VCPi#2组)的Hep3B和Huh 7是单层贴壁生长，并且细胞紧密排列，表型一致，细胞形态没有显著改变。而各干扰VCP处理(VCPi#1 和VCPi#2)并感染M1病毒(MOI＝0.001)的联合处理组Hep3B和Huh 7细胞数目明显减少，并且细胞的形态发生了明显改变，胞体收缩成球状，折光率明显增强，呈死亡病变样。
如图3c所示，与单独干扰VCP处理组(VCPi#1和VCPi#2组)比较，各干扰VCP处理(VCPi#1和VCPi#2)并感染M1病毒(MOI＝0.001)的联合处理组Hep3B和Huh 7细胞存活率显著下降，具有统计学差异。Hep3B和Huh 7在感染M1病毒(MOI＝0.001)后，显著引起敲低VCP水平后的肝癌Hep3B细胞(VCPi#1和VCPi#2组)存活率降低为22.5％和22.1％，Huh 7细胞(VCPi#1和VCPi#2组)存活率降低为31.8％和40.8％；以上结果表明敲低VCP可以增强溶瘤病毒M1在肝癌细胞上的溶瘤效应。
实施例4VCP的蛋白表达与VCP抑制剂和M1病毒联合疗法的抗癌效应呈正相关
材料：M1病毒、人肝细胞癌Hep3B、人肝癌细胞Huh 7、人肝癌细胞Sk-Hep-1、人肝癌细胞SNU-387、人肝癌细胞SNU-449、人肝癌细胞SNU-182、人肝癌细PLC、人正常肝细胞L02、人原代分离正常肝细胞HH、Western blot：细胞总蛋白抽提液(MammalianProtein Extraction Reagent，Thermo)、VCP抗体(CST，USA)、GAPDH抗体(CST，USA)；
方法：选择对数生长期细胞，DMEM完全培养液(10％胎牛血清、1％双抗)制成细胞悬液，细胞以1×106/孔的密度接种在60mm细胞培养皿内，培养24小时。
1.Western blot检测VCP蛋白表达。
a)抽提细胞总蛋白、定量，进行Western Blot实验(电泳、转膜、封闭、孵育一抗和二抗、显影)。
b)通过成像仪软件Image Lab 2.0软件对VCP和内参GAPDH条带灰度扫描，检测条带灰度，计算VCP均一化蛋白表达量按照以下公式进行：VCP均一化蛋 白表达量＝VCP条带灰度/内参条带灰度。
c)相对VCP蛋白表达＝不同细胞的VCP均一化蛋白表达量/HH细胞的VCP均一化蛋白表达量。
2.非线性拟合曲线发绘制M1病毒单用和Eeyarestatin I联合M1病毒的量效曲线。
a)接种细胞、给药处理：选择对数生长期细胞，DMEM完全培养液(含10％胎牛血清、1％双抗)制成细胞悬液，以每孔4×103/孔的密度接种在96孔培养板内。12小时后见细胞完全贴壁，实验分对照组，单独Eeyarestatin I组，M1感染组和Eeyarestatin I/M1联用组。所用剂量为：Eeyarestatin I(5μM)；M1病毒设不同的剂量梯度。
b)MTT与细胞内的琥珀酸脱氢酶反应：培养至72h时，每孔加入MTT 20μl(5mg/ml)，继续孵育4小时，此时镜检可观察到、活细胞内形成的颗粒状蓝紫色甲臜结晶。
c)溶解甲臜颗粒：小心吸去上清，加DMSO 100μl/孔溶解形成的结晶，在微型振荡器上震荡5min，然后在酶联检测仪上用波长570nm检测各孔的光密度(OD值)。每组实验重复3次。细胞存活率＝药物处理组OD值/对照组OD值×100％。
d)用origin 8软件进行非线性曲线拟合，绘制两条量效曲线：1.Eeyarestatin I单用；2.Eeyarestatin I与M1病毒联用，计算两条曲线的曲线下面积差值，并以倍数表示(Eeyarestatin I单用曲线下面积-Eeyarestatin I与M1病毒联用曲线下面积/Eeyarestatin I与M1病毒联用曲线下面积)，即相对曲线下面积差异倍数。图4b中DAUC表示不同细胞中相对曲线下面积差异倍数，该数值越大说明药物协同越显著。
e)相对曲线下面积与相对VCP表达采用pearson相关性分析法计算，r表示相关系数,r值越接近于1说明正相关性越强。
结果:
如图4a所示，Western blot图片底部显示不同细胞相对VCP蛋白表达值，表明VCP的蛋白表达水平在不同细胞中不一样。其中，人肝癌细胞Hep3B和Huh 7的VCP表达量是人原代正常细胞HH的7倍以上；人肝癌细胞Sk-Hep-1、SNU-387、SNU-449、SNU-182的VCP表达量是人原代正常细胞HH的3倍以上；人肝癌细胞PLC的VCP表达量是人原代正常细胞HH的2倍。
如图4b所示，通过绘制两条量效曲线，采用origin 8软件非线性拟合表明，在肿瘤细胞中相对曲线下面积的差值(DAUC)倍数显著高于正常细胞，这表明，Eeyarestatin I与M1病毒联用在VCP高表达的肿瘤细胞中引起显著的杀伤作用，但是对VCP低表达的正常细胞存活率无显著影响。
图4c所示，通过pearson相关性分析方法统计，发现VCP的表达与Eeyarestatin I/M1病毒联合疗法的效应呈正相关。因此VCP的蛋白表达与VCP抑制剂和M1病毒联合疗法的抗癌效应呈正相关，表明VCP可以作为VCP抑制剂与M1病毒联用的生物标记物。
实施例5VCP抑制剂协同M1溶瘤病毒通过诱导不可逆内质网应激引起肿瘤细胞凋亡
材料：
M1病毒，人肝癌细胞Hep3B，单克隆抗体(IRE1，XBP1(S),BiP,p-PERK,p-eIF2α，ATF6，poly-ub，GAPDH，caspase-12，CHOP，p-JNK)。
方法：
选择对数生长期细胞，DMEM完全培养液调制成细胞悬液，细胞以1×106的密度接种在60mm培养皿内。12小时后见细胞完全贴壁，实验分对照组，单独Eeyarestatin I组，M1感染组和Eeyarestatin I/M1联用组。所用剂量为：所用剂量为：M1病毒(MOI＝0.001)感染细胞；Eeyarestatin I(5μM)。
药物处理设定时间后，收集蛋白质样本，进行Western blot检测内质网应激marker(IRE1，XBP1(S),BiP,p-PERK,p-eIF2α，ATF6，poly-ub)；内质网应激 相关凋亡通路激活情况(caspase-12，CHOP，p-JNK)。
结果:
单独使用Eeyarestatin I(5μM)能够上调内质网应激相关的未折叠蛋白反应通路(unfold protein response)，如图5a所示，Eeyarestatin I(5μM)能够诱导升高IRE1，XBP1(S)，p-PERK,p-eIF2α等内质网应激相关的标志物。而单独使用溶瘤病毒M1(MOI＝0.001)能够抑制IRE1，XBP1(s)，同时不影响其他通路。我们观察到当Eeyarestatin I(5μM)与M1病毒联合使用时，M1病毒能够阻断由Eeyarestatin I引起的IRE1、XBP1通路的上调，从而促进剧烈的内质网应激，激活caspase-12和JNK通路(图5b)，诱导细胞的凋亡。
实施例6Eeyarestatin I与M1病毒联合应用显著抑制人肝细胞癌株移植瘤生长。
材料：
M1病毒、人肝癌细胞株Hep3B、人肝癌细胞株Huh 7、4周龄雌性BALB/c裸鼠。
方法：
本实验采用随机的、单盲的设计。将5×106Hep 3B或者Huh 7细胞注入到4周龄BALB/c裸鼠背侧皮下。
当肿瘤大小达到50mm3时分组，包括不处理的对照组、单独应用Eeyarestatin I组(腹腔注射2mg/kg/d)、单独应用M1感染组(尾静脉注射M1病毒5×105PFU/次)和Eeyarestatin I/M1联用组(相同方式给予相同剂量的Eeyarestatin I和M1病毒)，连续注射6次。每两天测量肿瘤的长宽和体重，肿瘤的体积依据公式(长×宽2)/2。测量肿瘤体积后进行One way ANOVA统计，***表示p<0.001。
结果:
在人肝癌细胞株Hep3B、人肝癌细胞株Huh 7两种肿瘤细胞移植瘤动物体内，病理解剖测定肿瘤体积表明，和对照组比较，单独应用Eeyarestatin I组和单独M1感染组只能引起肿瘤体积轻微的缩小，Eeyarestatin I/M1联用组能引起肿瘤体积 显著地缩小(图6b和6d)，在实验终点，人肝癌细胞株Hep3B模型中对照组肿瘤体积是1463.6mm2，单独应用Eeyarestatin I组和单独M1感染组肿瘤体积是1189.7mm2和1117.5mm2，而Eeyarestatin I/M1联用组肿瘤体积是404.3mm2。人肝癌细胞株Huh 7模型中对照组肿瘤体积是401.6mm2，单独应用Eeyarestatin I组和单独M1感染组肿瘤体积是279.5mm2和346.2mm2，而Eeyarestatin I/M1联用组肿瘤体积是128.3。运用One way ANOVA统计表明差异具备统计学意义(图6a和6c)。
本发明所记载的实施方式仅为阐释性例子，本发明的实施方式并不受上述的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等同的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (49)

1.VCP抑制剂在制备溶瘤病毒抗肿瘤增效剂或耐药逆转剂方面的应用；所述溶瘤病毒选自M1病毒。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的VCP抑制剂为抑制VCP蛋白活性的物质、或降解VCP蛋白的物质、或降低VCP蛋白水平的基因工具。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的抑制VCP蛋白活性的物质选自Eeyarestatin I、NMS-873和CB-5083中的一种或几种。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的降低VCP蛋白水平的基因工具为RNA干扰、microRNA、基因编辑或基因敲除。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的VCP抑制剂为肿瘤靶向VCP抑制剂。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述M1病毒选自保藏号CCTCC V201423的M1病毒。
7.如权利要求1-6任一所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为实体瘤或血液瘤。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的实体瘤为肝癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为对M1病毒不敏感的肿瘤；或者所述的肿瘤为VCP高表达的肿瘤。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。
11.一种药物组合物，包含：
(a)VCP抑制剂；
所述的VCP抑制剂为抑制VCP蛋白活性的物质、或降解VCP蛋白的物质、或降低VCP蛋白水平的基因工具；
(b)M1病毒。
12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述的抑制VCP蛋白活性的物质选自Eeyarestatin I、NMS-873和CB-5083中的一种或几种。
13.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述的降低VCP蛋白水平的基因工具为RNA干扰、microRNA、基因编辑或基因敲除。
14.如权利要求11所述组合物，其特征在于，所述的VCP抑制剂为肿瘤靶向VCP抑制剂。
15.如权利要求11所述组合物，其特征在于，所述M1病毒选自保藏号CCTCC V201423的M1病毒。
16.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。
17.如权利要求16所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物为冻干粉针、注射剂、片剂、胶囊或贴剂。
18.如权利要求11-17任一所述的药物组合物，其特征在于，为治疗肿瘤的药物组合物，所述的肿瘤为实体瘤或血液瘤。
19.如权利要求18所述的药物组合物，其特征在于，所述的实体瘤为肝癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。
20.如权利要求18所述的药物组合物，其特征在于，所述的肿瘤为对M1病毒不敏感的肿瘤；或者所述的肿瘤为VCP高表达的肿瘤。
21.如权利要求20所述的药物组合物，其特征在于，所述肿瘤为肝癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。
22.一种药品套装，包含：
(a)VCP抑制剂；
所述的VCP抑制剂为抑制VCP蛋白活性的物质、或降解VCP蛋白的物质、或降低VCP蛋白水平的基因工具；
(b)M1病毒；
在所述的药品套装中VCP抑制剂和M1病毒被分开包装。
23.如权利要求22所述的药品套装，其特征在于，所述的抑制VCP蛋白活性的物质选自Eeyarestatin I、NMS-873和CB-5083中的一种或几种。
24.如权利要求22所述的药品套装，其特征在于，所述的降低VCP蛋白水平的基因工具为RNA干扰、microRNA、基因编辑或基因敲除。
25.如权利要求22所述的药品套装，其特征在于，所述的VCP抑制剂为肿瘤靶向VCP抑制剂。
26.如权利要求22所述的药品套装，其特征在于，所述M1病毒选自保藏号CCTCCV201423的M1病毒。
27.如权利要求22-26任一所述的药品套装，其特征在于，为治疗肿瘤的药品套装，所述的肿瘤为实体瘤或血液瘤。
28.如权利要求27所述的药品套装，其特征在于，所述的实体瘤为肝癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。
29.如权利要求27所述的药品套装，其特征在于，所述的肿瘤为对M1病毒不敏感的肿瘤；或者所述的肿瘤为VCP高表达的肿瘤。
30.如权利要求29所述的药品套装，其特征在于，所述肿瘤为肝癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。
31.VCP抑制剂及M1病毒的组合在制备治疗肿瘤药物中的应用；
所述的VCP抑制剂为抑制VCP蛋白活性的物质、或降解VCP蛋白的物质、或降低VCP蛋白水平的基因工具。
32.如权利要求31所述的应用，其特征在于，所述M1病毒选自保藏号CCTCC V201423的M1病毒。
33.如权利要求31所述的应用，其特征在于，所述的抑制VCP蛋白活性的物质选自Eeyarestatin I、NMS-873和CB-5083中的一种或其组合。
34.如权利要求31所述的应用，其特征在于，所述的降低VCP蛋白水平的基因工具为RNA干扰、microRNA、基因编辑或基因敲除。
35.如权利要求31所述的应用，其特征在于，所述的VCP抑制剂为肿瘤靶向VCP抑制剂。
36.如权利要求31-35任一所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为实体瘤或血液瘤。
37.如权利要求36所述的应用，其特征在于，所述的实体瘤为肝癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。
38.如权利要求36所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为对M1病毒不敏感的肿瘤；或者所述的肿瘤为VCP高表达的肿瘤。
39.如权利要求38所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。
40.如权利要求12、23任一所述的组合物或药品套装，其特征在于所述的EeyarestatinI、NMS-873或CB-5083与M1病毒的配比为：0.01～200mg:103～109PFU。
41.如权利要求40所述的组合物或药品套装，其特征在于，所述的Eeyarestatin I、NMS-873或CB-5083与M1病毒的配比为0.1～200mg:104～109PFU。
42.如权利要求40所述的组合物或药品套装，其特征在于，所述的Eeyarestatin I、NMS-873或CB-5083与M1病毒的配比为0.1～100mg:105～109PFU。
43.如权利要求40所述的组合物或药品套装，其特征在于，使用剂量为：EeyarestatinI、NMS-873或CB-5083使用范围为0.01mg/kg至200mg/kg，同时M1病毒使用滴度为MOI从103至109PFU/kg。
44.如权利要求40所述的组合物或药品套装，其特征在于，使用剂量为：EeyarestatinI、NMS-873或CB-5083使用范围为0.1mg/kg至200mg/kg，同时M1病毒使用滴度为MOI从104至109PFU/kg。
45.如权利要求40所述的组合物或药品套装，其特征在于，使用剂量为：EeyarestatinI、NMS-873或CB-5083使用范围为0.1mg/kg至100mg/kg，同时溶瘤病毒使用滴度为MOI从105至109PFU/kg。
46.一种抗肿瘤药物系统，其特征在于包括VCP检测试剂、VCP抑制剂以及M1病毒。
47.如权利要求46所述的药物系统，其特征在于，所述M1病毒选自保藏号CCTCCV201423的M1病毒。
48.如权利要求46-47任一所述的药物系统，其特征在于，所述的肿瘤为实体瘤或血液瘤。
49.如权利要求48所述的药物系统，其特征在于，所述的实体瘤为肝癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。
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